CN103110801B - 川贝母地上部分提取物及其提取纯化方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种川贝母地上部分提取物及其提取纯化方法和用途。本实验通过药理学实验验证川贝母地上茎叶提取物具有同地下鳞茎部位相同甚至更好的止咳、祛痰、平喘功效，这对开发瓦布贝母的非药用部位，增加川贝母的药用范围提供了有效的理论依据，为扩大川贝母的药源提供了可能，降低了对贝母植物资源的浪费，带来巨大的经济效益和社会效益同时，极大促进生态环境保护和资源的持续利用；本发明川贝母地上部分提取物的制备方法，能够有效富集贝母生物碱类化合物，操作简便，方法稳定，具有良好的工业应用前景。

Description

川贝母地上部分提取物及其提取纯化方法和用途

技术领域

本发明涉及川贝母地上部分提取物，及其提取纯化方法和用途。

背景技术

川贝母，为百合科（Liliaceae）川贝母FritillariacirrhosaD．Don、暗紫贝母FritillariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsia、甘肃贝母FritillariaprzewalskiiMaxim.、梭砂贝母FritillariadelavayiFtanch.或太白贝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li、瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsiavar.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen的干燥鳞茎，具有止咳化痰、清热散结的功效。

目前川贝母的入药部位习用鳞茎，其有效部位为异甾类的生物碱成分。由于长期形成的用药习惯，川贝母的地上部分基本弃之不用，导致了贝母药材资源的浪费。随着川贝母栽培面积的迅速扩大，其地上部位的开发利用价值迅速受到关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种川贝母地上部分提取物及其提取纯化方法和用途。

本发明提供了川贝母地上部分的提取纯化方法，它包括如下步骤：

（1）取川贝母地上部分，加入30-95%乙醇提取后，提取液调节pH至2-5，取上清液，浓缩，再调节pH至7-12，即得上样液；

（2）将步骤（1）制备的上样液上大孔吸附树脂，先用水洗至洗脱液无色，弃去水洗液，再用乙醇、酸性水溶液或酸性醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得川贝母地上部分提取物。

其中，所述川贝母为瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen。

进一步地，步骤（1）中采用70-75%v/v乙醇提取，提取液调节pH至2-3，取上清液，浓缩，再调节pH至8.5-9。

更进一步地，步骤（1）中，乙醇提取物的具体操作如下：

以川贝母地上部分25倍量v/w的75%v/v乙醇浸泡药材1.5h后，85℃提取2次，每次1.0h。

进一步地，步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为非极性或中极性树酯，用pH2.5-3.5且含醇量45%或75%v/v的酸性醇溶液、或45-55%v/v乙醇进行洗脱。

更进一步地，步骤（2）中，所述大孔吸附树脂为D101、X-5或D-301型树酯；酸性醇溶液的pH为3，含醇量为70%v/v。

其中，所述酸性醇溶液的用量为50倍柱体积。

本发明还提供了一种川贝母地上部分提取物，该提取物中，总生物碱含量大于15%w/w。

进一步地，所述提取物是以上述方法制备得到的。

本发明还提供了上述川贝母地上部分提取物在制备止咳化痰、平喘、清热散结的药物或保健品中的用途。

本实验通过药理学实验验证川贝母地上茎叶提取物具有同地下鳞茎部位相同甚至更好的止咳、祛痰、平喘功效，这对开发瓦布贝母的非药用部位，增加川贝母的药用范围提供了有效的理论依据，为扩大川贝母的药源提供了可能，降低了对贝母植物资源的浪费，带来巨大的经济效益和社会效益同时，极大促进生态环境保护和资源的持续利用；本发明川贝母地上部分提取物的制备方法，能够有效富集贝母生物碱类化合物，操作简便，方法稳定，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1乙醇浓度对提取率的影响

图2乙醇用量对提取率的影响

图3提取时间对提取率的影响

图4提取温度对提取率的影响

图5动态吸附量考察

图6上样pH值考察

图7洗脱液浓度考察

图8洗脱液用量的考察

图9洗脱液pH值的考察

具体实施方式

实施例1本发明瓦布贝母地上部分提取物制备方法

用瓦布贝母地上部位，加入25倍量浓度为75%的乙醇溶液浸泡药材1.5h后提取2次，每次1.0h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，得浓缩液。浓缩液中加入1mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.5，X-5型号的大孔树脂进行吸附，再用浓度为75%、pH值=3的酸性乙醇溶液50倍量洗脱。经测定，该提取物中总生物碱含量为18%。

实施例2本发明瓦布贝母地上部分提取物制备方法的筛选

1仪器与材料

1.1仪器

超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UV1100紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），高效液相色谱仪1200型（美国安捷伦公司），UPT-I-10T型优谱UPT系列超纯水器（成都超纯科技有限公司），BS124S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），旋转蒸发仪R-201恒温水浴锅W201B（上海申胜生物技术有限公司），循环水式多用真空泵SHB-III（郑州长城科技工贸有限公司），便携式酸度计pHB-1型（杭州奥立利龙仪器有限公司）

1.2材料

贝母地上部位（成都新荷花饮片有限公司提供），贝母乙素对照品（四川省食品药品检验所，批号：MUST-11012001）色谱甲醇（迪马公司）D101、D301、S-8、X-5型大孔吸附树脂（成都科龙化工试剂厂）溴甲酚绿、重蒸水、95%乙醇、甲醇、三氯甲烷，浓盐酸，浓硫酸，氢氧化钠等，以上分析醇试剂均购自成都科龙化工试剂厂。

2.实验步骤

2.1总生物的含量测定

2.1.1标准曲线的绘制

取贝母乙素对照品约2.5mg，精密称定，用三氯甲烷溶解并定容至50ml的容量瓶中，精密吸取对照品母液3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml，分别置于60ml分液漏斗中，补加三氯甲烷至10.0ml，精密加水5ml，再精密加0.05%溴甲酚绿缓冲液（取溴甲酚绿0.05g，用0.2mol/L氢氧化钠溶液6ml使溶解，加磷酸二氢钾1g，加水使溶解并稀释至100ml，即得）2ml，剧烈振摇，静置30min，三氯甲烷层通过干滤纸过滤于10ml容量瓶中，水层再用三氯甲烷洗涤，合并三氯甲烷层，定容至刻度。随行空白试验，在200-800nm范围内进行全波长扫描，扫描结果在414nm处有最大吸光度，因此在414nm处分别测定其吸光度。得回归方程：y=6.5182x+0.1546，r=0.9991，贝母乙素在0.1482-0.247mg范围内线性关系良好。

2.1.2提取液中总生物碱含量的测定

提取液回收溶剂至干后，用2%的HCl溶解，过滤，滤液用NaOH溶液调PH至11，用三氯甲烷每次20ml萃取滤液至透明，收集三氯甲烷层，减压回收溶剂，浸膏转移至10ml的容量瓶中，再用三氯甲烷定容至刻度，得供试品，备用。吸取1ml供试品溶液至分液漏斗中，按标准曲线项下操作，测定吸光度，按回归方程计算总生物碱的含量。

2.2提取工艺研究

2.2.1浸泡时间的考察

称取5份药材，每份约10g，置于圆底烧瓶中，分别加入25倍量75%的乙醇后浸泡1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h后，85℃回流提取2次，每次2h，过滤，收集滤液，按照2.1.2项下提取液中总生物碱含量的测定方法测定总生物碱的含量。结果如表1，药材浸泡1.0h后的吸光度最大，选择浸泡药材1.5h进行试验。

表1浸泡时间对提取率的影响

2.2.2乙醇浓度考察

称取5份药材，每份约10g，置于圆底烧瓶中，分别加入25倍量55%、65%、75%、85%、95%的乙醇后浸泡1.5h后，85℃回流提取2次，每次2h，过滤，收集滤液，按照2.1.2项下提取液中总生物碱含量的测定方法测定总生物碱的含量。结果如图1，在乙醇浓度为70%-80%时吸光度较大，综合考虑经济因素和提取效果，选择75%乙醇浓度进行试验

2.2.3乙醇用量的考察

称取5份药材，每份约10g，置于圆底烧瓶中，分别加入15、20、25、30、35倍量75%的乙醇浸泡1.5h后，85℃回流提取2次，每次2h，过滤，收集滤液，按照2.1.2项下提取液中总生物碱含量的测定方法测定总生物碱的含量。结果如图2，料液比在25-30倍时吸光度最大，因此选择25倍量进行试验。

2.2.4回流时间考察

称取5份药材，每份约10g，置于圆底烧瓶中，分别加入25倍量75%的乙醇浸泡1.5h后，分别于85℃回流提取1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，每份药材提取2次，过滤，收集滤液，按照2.1.2项下提取液中总生物碱含量的测定方法测定总生物碱的含量。结果如图3，提取时间在1.0h和2.5h时吸光度较大，综合经济因素和提取效果考虑，选择1.0h为回流提取时间进行试验。2.2.5回流温度考察

称取5份药材，每份约10g，置于圆底烧瓶中，分别加入25倍量75%的乙醇浸泡1.0h后，分别于85℃回流提取1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，每份药材提取2次，过滤，收集并合并滤液，按照2.1.2项下提取液中总生物碱含量的测定方法测定总生物碱的含量。结果如图4，提取温度在85℃时吸光度最大，因此选择85℃作为提取温度进行试验。

2.3纯化工艺研究

2.3.1上样液的制备

称取2.5kg药材，按照提取条件单因素考察的结果（25倍量75%的乙醇浸泡药材1.0h后，85℃提取2次，每次1.0h）进行提取，提取液浓缩至5000-6000ml，加入浓HCl调节pH至2-3，3000r/min离心30min，收集上清液，再用pH为2-3酸水溶液洗涤沉淀，离心，合并上清液，浓缩至4500ml，加入5mol/L的浓NaOH溶液调节浓缩液pH至中性，得到含生药0.45g/ml的上样液。

2.3.2树脂类型筛选

根据文献，选择极性不同的4种型号的大孔树脂D101、X-5、S-8、D-301，各称取5g至锥形瓶中，加入过量的已知浓度的上样液40ml，进行交换吸附，调节流速为2mL·min-1，收集流出液，流出液在进行交换吸附至流出液不再变浅，测定吸光度，计算吸附量和吸附率。用已吸附完全的大孔树脂装柱，用蒸馏水洗涤至澄清，加入95%乙醇洗脱至无颜色，减压回收溶剂，加入三氯甲烷萃取，染色，测定吸光度，计算解吸率。结果如表2，结合吸附率最大和解吸率最小，选择X-5大孔树脂为纯化树脂。

表2不同树脂吸附率和解析率考察

2.3.3动态吸附量考察

量取一定量的上样液，加入5mol/L的NaOH调pH为10，备用。称取大孔树脂10g，加入已制备好的上样溶液100ml，保温静置24h后，进行交换吸附，调节流速为1ml/min，收集流出液，每10ml收集1次，共收集10份，分别加入三氯甲烷萃取至终点，染色，测定吸光度，计算总生物碱含量，当总生物碱含量不再减少时，认为吸附饱和，该点即为最大上样量。结果如图5，随着交换吸附的逐渐饱和，吸光度趋于平衡，在编号9时，吸光度达到最大0.58，计算可得最大吸附量为5.221mg/g。

2.3.4上样pH值考察

量取40ml上样液，用5mol/L的NaOH溶液分别调pH为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，备用。称取5g大孔树脂至锥形瓶中，加入已调好pH的上样液，进行交换吸附至流出液颜色不再变浅。收集流出液，三氯甲烷萃取至终点，减压回收溶剂定容至10ml，取10ml溶液染色，在波长414nm处测定吸光度，当吸光度越小时，剩余总生物碱含量越低，说明被交换吸附的生物碱越多。如图6，当上样pH值为8.5时，大孔树脂的吸附量最大，即交换吸附的生物碱最多，因此选择8.5为上样液pH。

2.3.5洗脱液种类考察

量取50ml已调pH为8.5的上样液与5gX-5大孔树脂进行交换吸附后，再用蒸馏水以2ml/min的流速冲洗树脂至流出液无色，再分别用50%的乙醇、pH=3的50%的酸醇、pH=3的酸水各200ml进行解吸附，以改良碘化铋钾试剂检测终点，收集各种类洗脱液。各种类洗脱液调pH为10后用三氯甲烷萃取至终点，减压回收溶剂并用三氯甲烷定容至10ml，取0.5ml染色测定吸光度，计算洗脱液中总生物的含量。结果如表3，当用pH=3的50%的酸醇洗脱时，总生物碱含量最高，解吸量最大，表明用酸性乙醇作为洗脱溶液效果较好。因此选择酸性乙醇作为洗脱溶液。

表3洗脱液种类考察

2.3.6洗脱液浓度考察

同3.2.5项下操作，洗脱溶液分别为30%、45%、60%、75%、90%的乙醇溶液，取1.0ml溶液染色后测定吸光度，计算不同浓度的洗脱液中总生物碱的含量。结果如图7，当用45%和75%的乙醇溶液对已上样的大孔树脂解吸附时，洗脱液中总生物碱含量均较高，表明45%和75%的乙醇溶液洗脱效果均较好。综合试验因素，选择浓度为75%的乙醇溶液为洗脱溶液进行试验。

2.3.7洗脱液用量的考察

同3.2.5项下操作，分别用50ml、100ml、150ml、200ml、250ml浓度为75%的乙醇溶液解吸附已上样的大孔树脂，取0.5ml溶液染色测吸光度，计算不同用量洗脱液中总生物碱的含量。结果如图8，随着洗脱溶液体积的增加，洗脱液中总生物碱的含量逐渐增加，当洗脱量达到250-350ml时总生物碱含量增长逐渐趋于平稳。考虑经济因素和纯化效果，选择250ml即大孔树脂50倍量75%的乙醇为洗脱液的用量。

2.3.8洗脱液pH值的考察

同3.2.5项下操作，分别用250ml浓度为75%的酸性乙醇（分别用浓盐酸调pH为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）溶液解吸附已上样的大孔树脂，取适量溶液染色测吸光度，计算不同pH值洗脱液中总生物碱的含量。结果如图9，当pH=3时，洗脱液中总生物碱的含量远远大于其他pH值的酸性乙醇，表

明此时的解吸量最大，因此选择pH=3的酸性乙醇为洗脱溶液。

3.结果与讨论

3.1纯化实验中，经过重复验证试验，洗脱液浓度在45%和75%时洗脱液中总生物碱含量均较高，这可能是不同极性的生物碱被解吸附的时间不同造成的。从工艺化生产的角度考虑，本实验选择75%的乙醇为洗脱溶剂，进行充分洗脱，以保证不同极性的生物碱都可以被解吸附，从而达到纯化的目的。

3.2结果：

本发明最佳制备方法为：用贝母地上部位，加入25倍量浓度为75%的乙醇溶液浸泡药材1.5h后提取2次，每次1.0h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，得浓缩液。浓缩液中加入1mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.5，X-5型号的大孔树脂进行吸附，再用浓度为75%、pH值=3的酸性乙醇溶液50倍量洗脱。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例1本发明川贝母地上部分提取物的药效实验

1.材料

1.1样品

瓦布贝母地上茎叶部分和地下鳞茎部分，由成都新荷花有限公司提供，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiaoet K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.chen。

提取物制品：瓦布贝母地上茎叶部分2kg，粉碎为粗粉，加入25倍量浓度为75%的乙醇溶液浸泡药材1.5h后提取2次，每次1.0h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，得浓缩液。浓缩液中加入1mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.5，X-5型号的大孔树脂进行吸附，再用浓度为75%、pH值=3的酸性乙醇溶液50倍量洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干，得到总生物碱含量为18%的提取物5.0g，即每克提取物相当于生药400g。

提取物高剂量制品：称取提取物制品约0.5g，加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液定容至1000ml，得到生物碱含量为0.09mg/ml，生药浓度为0.2g/ml的提取物高剂量溶液。

提取物中剂量制品：量取提取物高剂量制品约500ml，加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液稀释1倍，即得生物碱含量为0.045mg/ml，生药浓度为0.1g/ml的提取物中剂量溶液。

提取物低剂量制品：量取提取物中剂量制品约500ml，加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液稀释1倍，即得生物碱含量为0.0225mg/ml，生药浓度为0.05g/ml的提取物低剂量溶液。

川贝母鳞茎水提取液制品：称取瓦布贝母地下鳞茎约2g，加入100ml蒸馏水煎煮1h，过滤，滤液加水定容至100ml，即得生药浓度为0.02g/ml的水提液制品。

1.2动物。昆明种I级小鼠（雌雄各半，体重20-25g）Hartly种豚鼠（雌雄各半，体重300-350g），均购于成都达硕生物科技有限公司。

1.3试剂与样品。

磷酸可待因（购于四川省温江区第五人民医院）；硫酸沙丁胺（江苏亚邦爱普森药业有限公司，批号：1206112）；氯化铵（成都市科龙化工试剂有限公司，批号：20120303）；氨水(成都科龙化工试剂有限公司，批号：20120321)；酚红(成都科龙化工试剂厂有限公司，批号：20120501)；磷酸组胺（上海迈坤化工有限公司，批号：20121130）；氯化乙酰胆碱（上海静荣科技有限公司，批号：20120303）；亚硫酸钠(成都科龙化工试剂厂有限公司，批号：20120706)；浓硫酸(成都科龙化工试剂厂有限公司，批号：20111101)。

1.4仪器

UV-1100型紫外分光光度仪（上海天美科学仪器有限公司），980型超声雾化器(上海天缘医用生物有限公司)标仪(Thermo Electron Corporation,型号：100-240vac)，BS124S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），旋转蒸发仪R-201，恒温水浴锅W201B（上海申胜生物技术有限公司）；定量加液器，96孔板，手术器械等。

2方法和结果

2.1急性毒理实验

瓦布贝母地上部分提取物，加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液得到高浓度的瓦布贝母地上部分提取物制品，计算得此时的总生物碱含量为0.36mg/ml。

取小鼠20只，雌雄各半，性别随机分为2组，每组10只，一组灌胃提取物，一组作为对照组灌胃生理盐水。实验前禁食16小时，然后按照0.2ml/10g剂量给药，当日2次，间隔8h，连续观察1周，结果两组小鼠活动、饮食、二便皮毛光泽度等无明显差异。

2.2小鼠酚红祛痰实验

2.2.1酚红标准曲线的绘制

称取分析纯酚红约0.1g，精密称定，加入碱性生理盐水（生理盐水：1mol/L的NaOH=20：1）配制成浓度为101.2mg/L的酚红溶液，分别取0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1、2ml定容至10ml，得到浓度为0.1012、0.2024、1.012、2.024、5.06、10.12、20.24μg/ml的溶液，在200-800nm下进行全波长扫描，得到最大吸收波长为433nm。在433nm下测定不同浓度酚红溶液的吸光度值，以浓度（单位：μg/ml）为横坐标，吸光度值为纵坐标，求得酚红溶液的标准曲线为y=0.0583x+0.0021，r=0.999。

2.2.2气管酚红冲洗法

取氯化铵0.5g，加入100ml蒸馏水溶解，制得浓度为5mg/ml的氯化铵溶液。

取体重18-22g的昆明种小鼠48只，雌雄各半，按照体重和性别随机分为生理盐水组、提取物高、中、低剂量组、川贝母鳞茎水提液组、氯化铵组共6组，每组8只，连续ig给药3d，末次给药前禁食不禁水12h，末次给药后1h按照0.02ml/g的剂量腹腔注射0.5%的酚红溶液，0.5h后处死小鼠，仰位固定于手术板上，剪开颈正中皮肤，分离气管，剪下自甲状软骨至气管分支处一段气管，放入加有2ml生理盐水（生理盐水：1mol/L的NaOH=20：1）的试管中，浸泡过夜，于433nm处测定吸光度值。

根据标准曲线，将吸光度值换算成酚红含量，将数据进行成组t检验比较，比较结果见表4。

表4不同制品对小鼠酚红分泌量的影响（X土S）

注：﹡﹡表示P＜0.01，﹡表示P＜0.5。

由表4可以看出，瓦布贝母地上部分提取物对小鼠有明显的祛痰作用，能显著增加小鼠酚红的分泌量。其中，与生理盐水组相比较，高剂量瓦布贝母地上部分提取物和中剂量瓦布贝母地上部分提取物对小鼠酚红分泌量有显著差异，且高剂量组效果优略微于中剂量组，而低剂量组与生理盐水组相比较则无显著差异。瓦布贝母地上部分提取物的剂量为鳞茎部分提取物剂量的一半，但效果略优于鳞茎部分提取物。

2.3镇咳实验

2.3.1氨水引咳实验

取磷酸可待因0.25g，加入100ml蒸馏水配制成浓度为2.5mg/ml的磷酸可待因溶液。

取体重18-22g的小鼠48只，雌雄各半，按照体重和性别随机分为生理盐水组、提取物高、中、低剂量组、川贝母鳞茎水提液组与磷酸可待因组共6组，每组8只，除磷酸可待因组为第3d腹腔注射给药外，其余为按照0.02ml/g连续灌胃给药3d，给药剂量为0.2ml/10g，末次给药前禁食不禁水12h，末次给药后1h（磷酸可待因组为0.5h），将小鼠置于500ml烧杯内，用1ml注射器吸取0.2ml氨水注入烧杯内放的棉球中，观察小鼠咳嗽潜伏期，记录小鼠咳嗽潜伏期和10min内的咳嗽次数，小鼠咳嗽以收腹、仰头、张大口为特征。

将小鼠咳嗽潜伏期和10min内咳嗽次数进行成组t检验比较，比较结果见表5。

表5不同制品对由氨水引起小鼠咳嗽的影响（X土S）

注：﹡﹡表示P＜0.01，﹡表示P＜0.5。

由表5可以看出，瓦布贝母地上部分提取物对由氨水引起的小鼠咳嗽有明显的止咳作用，能显著延长小鼠咳嗽潜伏期，降低小鼠的咳嗽次数。其中，与生理盐水组相比较，高剂量瓦布贝母地上部分提取物和中剂量瓦布贝母地上部分提取物对小鼠由氨水引发的咳嗽潜伏期和咳嗽次数有显著差异，且高剂量阻止咳效果显著优于中剂量组，而低剂量组与生理盐水组相比较则无显著差异。瓦布贝母地上部分提取物的剂量为鳞茎部分提取物剂量的一半，但效果明显优于鳞茎部分提取物。

2.3.2SO₂引咳实验

取小鼠48只，雌雄各半，分为6组，给药途径和给药剂量同2.3.1。将亚硫酸钠和浓硫酸装入气体发生器中生成二氧化硫气体，再用注射器收集一定量的二氧化硫气体刺激小鼠。小鼠给药后1h，放入250ml广口瓶内，定量注入5ml二氧化硫气体，观察小鼠咳嗽的潜伏期，然后记录其咳嗽潜伏期和10min内咳嗽次数。

将小鼠咳嗽潜伏期和10min内咳嗽次数进行成组t检验比较，比较结果见表6。

表6不同制品对由SO₂引起小鼠咳嗽的影响（X土S）

组别	剂量/d	咳嗽潜伏期/s	10min内咳嗽次数
				高剂量组	生药0.2g/kg	42土1﹡﹡	59土5﹡﹡
中剂量组	生药0.1g/kg	35土3﹡	63土5﹡
				低剂量组	生药0.05g/kg	29土2	74土8
生理盐水组	0.02ml/g	28土1	79土7

鳞茎水提液组	生药0.4g/kg	38土5﹡	64土2﹡
				磷酸可待因组	0.05g/kg	44土3﹡﹡	48土9﹡﹡

注：﹡﹡表示P＜0.01，﹡表示P＜0.5。

由表6可以看出，瓦布贝母地上部分提取物对由SO₂引起的小鼠咳嗽有明显的止咳作用。其中，与生理盐水组相比较，高剂量瓦布贝母地上部分提取物和中剂量瓦布贝母地上部分提取物均有较显著的差异，但高剂量组差异较中剂量组显著，而低剂量组与生理盐水组相比较则无显著差异。瓦布贝母地上部分提取物的剂量为鳞茎部分提取物剂量的一半，但效果明显优于鳞茎部分提取物。

2.4平喘实验

取硫酸沙丁胺醇药片，研钵研细，加入100ml蒸馏水配制成浓度为0.25g/ml的硫酸沙丁胺醇溶液。

取体重300±50g左右的豚鼠，雌雄各半，正式实验前先进行筛选，将豚鼠放入4L密闭玻璃钟罩内，用超声雾化器喷入0.2%的磷酸组胺与2%氯化乙酰胆碱的等体积混合溶液，喷雾时间为10s，观察并记录豚鼠从喷雾开始到出现抽搐、跌倒的时间，作为哮喘潜伏期。筛选出哮喘潜伏期大于120s的豚鼠视为不敏感而剔除。挑选合格的豚鼠按哮喘潜伏期的长短将动物进行分层，随后按随机区组法将动物随机分成生理盐水组、硫酸沙丁胺醇组、提取物高、低剂量组，每组8只。各组均连续给药3d，给药剂量为2ml/100g。末次药1h后，同法喷雾并观察记录豚鼠哮喘潜伏期（超过5min无反应者视为哮喘潜伏期为5min）及从喷雾开始计时10min内的哮喘次数，结果见表7.

表7不同制品对豚鼠咳哮喘的影响（X土S）

注：﹡﹡表示P＜0.01，﹡表示P＜0.5。

由表7可以看出，瓦布贝母地上部分提取物对由SO₂引起的小鼠咳嗽有较为明显的平喘作用。其中，与生理盐水组相比较，高、中、低剂量瓦布贝母地上部分提取物的哮喘潜伏期均有较显著的差异，但低剂量组差异较高、中剂量组显著。同生理盐水组相比较，高、低剂量组的哮喘次数均有较显著的差异，中剂量组与生理盐水组相比较则无显著差异。瓦布贝母地上部分提取物的剂量为鳞茎部分提取物剂量的一半，但效果明显优于鳞茎部分提取物。

综上所述，本实验通过药理学实验验证川贝母地上茎叶提取物具有同地下鳞茎部位相同甚至更好的止咳、祛痰、平喘功效，这对开发瓦布贝母的非药用部位，增加川贝母的药用范围提供了有效的理论依据，为扩大川贝母的药源提供了可能，降低了对贝母植物资源的浪费，带来巨大的经济效益和社会效益同时，极大促进生态环境保护和资源的持续利用；本发明川贝母地上部分提取物的制备方法，能够有效富集贝母生物碱类化合物，操作简便，方法稳定，具有良好的工业应用前景。

Claims (8)

1.川贝母地上部分的提取纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取川贝母地上部分，加入70-75％乙醇提取后，提取液调节pH至2-3，取上清液，浓缩，再调节pH至8.5-9，即得上样液；

(2)将步骤(1)制备的上样液上大孔吸附树脂，先用水洗至洗脱液无色，弃去水洗液，再用乙醇、酸性水溶液或酸性醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得川贝母地上部分提取物；所述大孔吸附树脂为非极性或中极性树酯，用pH2.5-3.5且含醇量45％或75％v/v的酸性醇溶液、或45-55％v/v乙醇进行洗脱。

2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：所述川贝母为瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen。

3.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，乙醇提取物的具体操作如下：

以川贝母地上部分25倍量v/w的75％v/v乙醇浸泡药材1.5h后，85℃提取2次，每次1.0h。

4.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为D101、X-5或D-301型树酯；酸性醇溶液的pH为3，含醇量为70％v/v。

5.根据权利要求3或4所述的提取纯化方法，其特征在于：所述酸性醇溶液的用量为50倍柱体积。

6.一种川贝母地上部分提取物，其特征在于：该提取物中，总生物碱含量大于15％w/w。

7.根据权利要求6所述的川贝母地上部分提取物，其特征在于：所述提取物是以权利要求1-5任意一项所述方法制备得到的。

8.权利要求6或7所述川贝母地上部分提取物在制备止咳化痰、平喘、清热散结的药物或保健品中的用途。