CN102451362A - 一种具有止咳平喘作用的喷雾剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了川贝母总生物碱及其喷雾剂的制备方法。川贝母总生物碱的制备方法川贝母采用HCl-乙醇水溶液进行提取，提取物经大孔吸附树脂纯化。本发明提取工艺收率高、药效高，且制备的喷雾剂可以持续定量喷出。
Description
技术领域
本发明涉及一种川贝母总生物碱的制备方法，以及用川贝母总生物碱制成的具有止咳平喘作用的喷雾剂。
背景技术
川贝母为百合科植物川贝母Fritillaria.cirrhosa D.Don、暗紫贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母F.przewalskiiMaxim.或梭砂贝母F.delavayi Franch.的干燥鳞茎，具有清热润肺止咳的功效，用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、咯痰带血。生物碱类是其主要成分，具有显著的镇咳效果。
《中国实验方剂学杂志》2003年第3期公布了“均匀设计法优选川贝母渗漉提取工艺”，《中医学院学报》第2005年第1期公布了“川贝母提取工艺研究”二者均采用乙醇渗漉发提取，该方法提取时间长，耗时耗能；《中国中药杂志》第2005年第8期公开了“中药川贝母定量分析方法研究”，优选用氨水碱化药材1h，然后采用氯仿-甲醇回流提取，该方法提取率低且氯仿为有毒溶剂，易对环境造成污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种川贝母总生物碱的制备方法；
本发明的另一个目的在于提供一种川贝母喷雾剂；
本发明的另一个目的在于提供一种川贝母喷雾剂的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明川贝母总生物碱的制备方法包括如下步骤：
步骤1：取川贝母采用酸醇溶液进行提取；
步骤2：取步骤1得到的提取物经大孔吸附树脂纯化。
优选地，所述步骤1的酸醇溶液为HCl-乙醇水溶液；
优选地，所述步骤1的酸醇溶液为HCl-乙醇水溶液，其中HCl浓度为0.3-0.8％，乙醇浓度为60-90％；
优选地，所述步骤1的酸醇溶液为HCl-乙醇水溶液；其中HCl浓度为0.5％，乙醇浓度为60-90％；溶剂用量为6-8倍量(质量体积比)；提取次数为2-4次，每次1-2小时。
优选地，步骤2中提取物制成相当生药浓度为0.5-1.5g药材/mL的川贝母上样液，调节上样液pH至碱性。所述相当生药浓度为0.5-1.5g药材/mL的川贝母上样液，是指每ml川贝母上样液的量由0.5-1.5g川贝母提取。
优选地，步骤2中，大孔吸附树脂纯化时，先用低浓度乙醇解吸附，再用高浓度醇进行洗脱；低浓度乙醇为10-50％；
优选地，所述步骤2中的大孔吸附树脂为非极性大孔树脂；
优选地，所述步骤2中上样液pH为8-11；解吸附乙醇浓度为40-60％，用量为3-5倍柱体积。
本发明所述川贝母总生物碱的制备方法，优选包括如下步骤：
步骤1：取川贝母，采用HCl-乙醇水溶液进行提取，提取液浓缩，干燥，得浸膏；
步骤2：取步骤1得到的浸膏，制成生药浓度为0.5-1.5g药材/mL的川贝母上样液，调节上样液pH至碱性，过大孔吸附树脂纯化，用低浓度乙醇除杂，再用高浓度醇进行洗脱，收集高浓度乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得川贝母总生物碱。
本发明川贝母总生物碱的制备方法进一步优选为：
步骤1：取川贝母，加6-9倍量(0.3-0.8％)HCl-(60-80％)乙醇水溶液，于70-90℃水浴加热回流提取2-5次，每次1-3h，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用1-5％HCl研溶，加入硅藻土，过滤，滤液用1-5％HCl稀释，得生药浓度为1g药材/mL的川贝母样品液；用NaOH溶液调节样品液pH为8-10，以1-3BV/h的流速动态吸附，再用6-9BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用3-6BV的20-50％浓度乙醇以1-3BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用75-95％乙 醇进行洗脱；收集75-95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，真空干燥得川贝母总生物碱。
本发明川贝母总生物碱的制备方法进一步优选为：
步骤1：取川贝母，加7倍量0.5％HCl-75％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取3次，每次1.5h，合并3次提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤，滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节样品液pH为9，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用4BV的50％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱；
本发明川贝母总生物碱的制备方法进一步优选为：
步骤1：取川贝母，加6倍量0.5％HCl-60％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤。滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1.0g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节上样溶液pH为7，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用2BV的30％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱；
本发明川贝母总生物碱的制备方法进一步优选为：
步骤1：取川贝母，加8倍量0.5％HCl-90％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取4次，每次1h，合并提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤。滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1.0g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节样品液pH为11，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用6BV的70％浓度乙醇以2BV/h 的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱；
上述川贝母总生物碱可按常规工艺加入常规辅料制成片剂、胶囊、喷雾剂、颗粒剂等临床可接受的剂型。
本发明提供一种川贝母喷雾剂，该喷雾剂的原料组主要成为：
川贝母总生物碱、增溶剂、抛射剂；
所述川贝母总生物碱的量以其制成喷雾剂来计，每mL喷雾剂中含川贝母总生物碱的量相当于1-4.0g川贝母，具体是指每mL喷雾剂中含川贝母总生物碱的量相当于由1-4.0g川贝母提取的量。
所述增溶剂加入量为总体积的5-20％；所述增溶剂为吐温-80、吐温-20、1，2-丙二醇、丙三醇中的任意一种，优选为丙二醇，加入量为总体积的5-15％；
所述川贝母总生物碱的量每mL喷雾剂中含川贝母总生物碱的量相当于1.2-3.0g生药材；
抛射剂的量为喷雾剂每100ml加入5-15g抛射剂；
所述喷雾剂的原料中还可以加入喷雾剂的常规辅料，选自甜味剂、矫味剂、防腐剂中的任一一种或几种；
所述川贝母总生物碱的制备方法包括如下步骤：
步骤1：取川贝母采用酸醇溶液进行提取；
步骤2：取步骤1得到的提取物经大孔吸附树脂纯化。
优选地，所述步骤1的酸醇溶液为HCl-乙醇水溶液；
优选地，所述步骤1的酸醇溶液为HCl-乙醇水溶液，其中HCl浓度为0.3-0.8％，乙醇浓度为60-90％；
优选地，所述步骤1的酸醇溶液为HCl-乙醇水溶液；其中HCl浓度为0.5％，乙醇浓度为60-90％；溶剂用量为6-8倍量(质量体积比)；提取次数为2-4次，每次1-2小时。
优选地，步骤2中提取物制成生药浓度为0.5-1.5g药材/mL的川贝母上样液，调节上样液pH至碱性。
优选地，步骤2中，大孔吸附树脂纯化时，先用低浓度乙醇解吸附，再用 高浓度醇进行洗脱；
优选地，所述步骤2中的大孔吸附树脂为非极性大孔树脂；
优选地，所述步骤2中上样液pH为7-11；除杂乙醇浓度为40-60％，用量为3-5倍柱体积。
所述川贝母喷雾剂的制备方法包括如下步骤：
取处方的川贝母总生物碱与甜味剂、矫味剂、防腐剂中的任意一种或几种共同溶解于增溶剂中，加入注射用水，充分摇匀，静置，装入气雾瓶中，向瓶内压入抛射剂，灌装，灭菌，即得；
所述川贝母总生物碱由如下方法制备而成：步骤1：取川贝母，采用酸醇溶液进行提取，提取液浓缩，干燥，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，制成生药浓度为0.5-1.5g药材/mL的川贝母上样液，调节上样液pH至碱性，过大孔吸附树脂纯化，用低浓度乙醇除杂，再用高浓度醇进行洗脱，收集高浓度乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得川贝母总生物碱。
优选为，所述步骤1的酸醇溶液为HCl-乙醇水溶液；其中HCl浓度为0.5％，乙醇浓度为60-90％；溶剂用量为6-8倍量(质量体积比)；提取次数为2-4次，每次1-2小时。所述步骤2中的大孔吸附树脂为非极性大孔树脂；上样液pH为7-11；除杂乙醇浓度为40-60％，用量为3-5倍柱体积。
进一步优选为，步骤1：取川贝母，加7倍量0.5％HCl-75％乙醇，于80℃水浴加热回流提取3次，每次1.5h，合并3次提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤，滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节样品液pH为9，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用4BV的50％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱；
或，步骤1：取川贝母，加6倍量0.5％HCl-60％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤。 滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1.0g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节上样溶液pH为7，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用2BV的30％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱；
或，步骤1：取川贝母，加8倍量0.5％HCl-90％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取4次，每次1h，合并提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤。滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1.0g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节样品液pH为11，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用6BV的70％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱。
本发明进一步提供川贝母提取物或其喷雾剂在制备拮抗磷酸组胺、氯化乙酰胆碱或卵蛋白致气管平滑肌收缩药物中的应用。
本发明采用先提取川贝母总生物碱部位再将其制为喷雾剂的工艺，克服了将川贝母粉碎成超微粉直接制成气雾剂时，工艺收率低(仅为65％)以及药粉易粘结，难以持续定量喷出的缺点。
具体是实施方式
实验例1川贝母总生物碱提取工艺研究
(一)川贝母总生物碱提取方法的优选
方法1：0.5％HCl乙醇提取
取干燥的川贝母(瓦布贝母)鳞茎巧40g各5份，粉碎成粗粉，用0.5％HCl乙醇800ml，于95℃水浴加热回流提取3次，每次3h，合并3次提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，浸膏得率为23.72％，按总生物碱含量测定法，测得总生物碱含量为0.360％。
方法2：氯仿∶甲醇(4∶1)有机溶剂直接进行提取
取干燥的川贝母(瓦布贝母)鳞茎巧40g各5份，粉碎成粗粉，用氯仿∶甲醇(4∶1)800ml，于80℃水浴加热回流提取3次，每次3h，合并3次提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，平均提取物得率为4.65％，按总生物碱含量测定法，测得总生物碱含量为0.364％。
方法3：0.5％HCl酸水渗漏
取干燥的川贝母(瓦布贝母)鳞茎巧40g各5份，粉碎成粗粉，0.5％HCl酸水800ml，以1～2ml/min速率进行渗漏，减压浓缩，60℃真空干燥2h，平均提取物得率为23.95％，按总生物碱含量测定法，测得总生物碱平均含量为0.360％。三种方法比较见表1。
表1三种提取方法的比较
结论：由上表可见，提取总生物碱的含量差异较小，而渗漏的方法提取时间较长，且提取物难以浓缩。酸醇提取方法较易浓缩，回收乙醇还可以循环利用，且避免了有机溶剂的提取药材，因此，选取酸醇提取的方法。
(二)川贝母总生物碱酸乙醇提取工艺优化
1正交试验设计：采用四因素三水平正交试验设计，以乙醇浓度、时间、料液比、提取次数对贝母总生物碱提取的影响为三个因素，按L9(34)正交表进行试验，正交表头设计见表2。
表2正交试验表头设计
2正交试验结果：方差分析结果表明，因素A对试验结果有极显著影响，因D有显著影响，因素B、C无显著影响，选取显著因素的最好水平，得到最佳工艺为A3D3，次要因素B及C可根据节约原则选取B1C1，因此最佳工艺为A3D3B1C1，即75％乙醇，7倍量，提取3次，每次1.5小时。正交试验结果和方差分析见表3-4。
表3方差分析
F0.1(2，18)＝2.62，F0.05(2，18)＝3.55，F0.01(2，18)＝6.01。
表4正交试验结果
3验证试验
根据上述实验结果，按照最佳优化条件进行3次平行实验，测定总生物碱含量，结果见表5。
表5样品生物碱含量
由此可知，提取川贝母总生物碱优化结果的方法稳定可靠，工艺稳定及重现性好。
(三)川贝母总生物碱的大孔吸附树脂纯化工艺研究
1吸附与洗脱参数优选
1.1正交试验设计
采用三因素三水平正交试验设计，对影响湖北贝母总生物碱在D101型大孔吸附树脂上吸附与洗脱的主要因素：上样pH、除杂用乙醇浓度和除杂用乙醇用量进行L9(34)正交试验。因素水平表见表6。
表6大孔吸附树脂吸附洗脱的正交因素水平设计
将D101型大孔吸附树脂用95％乙醇浸泡24h后，湿法装柱，并用95％乙醇冲洗树脂至流出液与水(1∶5)混合不产生混浊，再用适量水冲洗至流出液无醇味并排除气泡后，备用。
称取9份经过预处理的D101型大孔吸附树脂，每份约70g，进行大孔吸附树脂预处理。量取10g川贝母酸醇提取浓缩的浸膏，用2％HCl研溶，并加入20g硅藻土，过滤。滤液用2％HCl定容至适量，得川贝母样品液(折合生药浓度为1g药材/mL)。依表6所示，用5％NaOH溶液调节上样溶液pH后，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色。然后用适量的低浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点。收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重，精密称量其重量，并测定其总生物碱质量，计算保留率和样品中生物碱含量。
保留率(％)＝样品中总生物碱含量(g)/湖北贝母药材中总生物碱重量(g)
样品中总生物碱含量(％)＝样品中总生物碱质量(g)/样品重量(g)
1.2正交试验结果
从产品中总生物碱含量结果分析，最佳工艺条件是：A2B3C3。三因素对实验的影响大小为：B＞C＞A，即低浓度乙醇浓度＞低浓度乙醇用量＞上样pH，因 素B和C影响显著。
从产品中总生物碱保留率结果分析，最佳工艺条件是：A3B1C1。三因素对实验的影响大小为：A＞B＞C，即上样pH＞低浓度乙醇浓度＞低浓度乙醇用量。三因素影响均不显著。
鉴于上样pH、低浓度乙醇浓度和低浓度乙醇用量对产品中总生物碱保留率均无显著性影响，故主要考察各因素对产品中总生物碱含量的影响，最终确定最佳工艺组合为A2B3C3，即上样pH9.0、低浓度乙醇浓度50％和低浓度乙醇用量4BV。正交试验结果和方差分析见表7-9。
表7大孔吸附树脂吸附洗脱的正交实验表
表8树脂吸附洗脱生物碱含量方差分析
表9树脂吸附洗脱保留率方差分析
2最佳上样量的选择
2.1试验方法：按表10所示，分别取适量的贝母样品液按上述的工艺流程进行吸附洗脱，收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重，精密称量其重量，并分别计算其总生物碱含量和保留率。结果见表10。
表10最佳上样量选样
(最大吸附容量：133.5mg/g，pH＝9)
2.2试验结果：样品中生物碱的含量随着上样量的增加而增加，生物碱的保留率随着上样量的增加而降低。由于样品中生物碱含量均大于50％，满足中药五类新药要求，故主要以保留率作为最佳上样量的考察指标。综合考虑保留率与大孔吸附树脂在工业化生产中的使用效率，确定最佳上样量为50％柱最大吸附容量，即66.75mg/g。
3工艺重复性实验
根据上述实验结果，按照最佳优化条件进行3次平行实验，测得样品中的总生物碱含量和保留率。结果见表11。从结果可见，工艺稳定及重现性好。
表11工艺重复性实验
| 实验一 | 实验二 | 实验三 | 平均值 | |
| 含量/％ | 73.1 | 75.5 | 74.1 | 74.2 |
| 保留率/％ | 82.5 | 83.0 | 82.4 | 82.6 |
综合上述实验结果，确定了D101大孔吸附树脂分离纯化贝母总生物碱的最佳吸附洗脱条件为：上样量为50％柱最大吸附容量(最大吸附容量：133.5mg/g，pH＝9)，上样pH为pH 9.0，低浓度乙醇浓度为50％，低浓度乙醇用量为4BV。
实验例2川贝母喷雾剂制备工艺的研究
(一)增溶剂种类和用量的确定
1增溶剂种类的确定
精确吸取按优选提取工艺获得的药材浸膏20份，每份0.2g，分别以吐温-80、吐温-20、1，2-丙二醇、丙三醇为增溶剂与适量薄荷脑在碾钵中碾匀，用注射用水少量多次的转移到渗流液中，定容为10mL，观察4种增溶剂的增溶效果，结果见表12。
表12四种增溶剂增溶效果的比较
| 样品名称 | 样品数量 | 加用量 | 增容效果 |
| 吐温-80 | 5 | 0.2 | 较浑浊 |
| 吐温-20 | 5 | 0.2 | 较浑浊 |
| 1，2-丙二醇 | 5 | 2.0 | 较澄清 |
| 丙三醇 | 5 | 2.0 | 浑浊 |
由表12可知，4种增溶剂中以1，2-丙二醇增溶效果最好
2增溶剂基本用量的确定
精确吸取按优选提取工艺获得的浸膏9份，每份0.2g装于20mL试管中。分别加入丙二醇1mL、2mL、3mL与适量薄荷脑在碾钵中碾匀，用注射用水少量多次的转移到渗流液中，定容为10mL，，进行外观考察，结果见表13。
表13丙二醇用量的考察
由表13可知：一定范围内，随着丙二醇浓度的增加，溶液中的粘度明显增大，当丙二醇浓度超过10％，其对外观与丙二醇含量相关性小，而随着粘度的增加会影响到喷出雾粒的大小综合考虑，丙二醇的加入量应在10％左右。
实验例3含量测定试验
1.仪器与试药
仪器：
对照品：西贝母碱，溴甲酚绿
2溶液的制备
对照品溶液的制备：精密称取西贝母碱对照品，加三氯甲烷置水浴上微热使溶解，制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密量取1ml样品溶液50ml量瓶中，挥干，加三氯甲烷溶液置刻度，摇匀，即得供试品溶液；
空白溶液的制备：以三氯甲烷为空白溶液；
溴甲酚绿缓冲液的制备：精密称取溴甲酚绿约0.050g，加入6ml 0.2mol·L-1氢氧化钠溶液使溶解，定量转移至100ml量瓶中，再加入1.0g磷酸二氢钾和适量水使溶解，用水稀释到刻度，摇匀，滤过，即得溴甲酚绿缓冲液。
3最大吸收波长的确定
精密吸取对照品溶液1ml、供试品溶液2ml，水浴蒸干，残渣用三氯甲烷溶解，转移至10ml量瓶中，加三氯甲烷至刻度；另取三氯甲烷10ml置具塞瓶中，作为空白液。各加蒸馏水5ml，加0.05％溴甲酚绿缓冲液2.0ml，密塞，剧烈振摇3分钟后，移入至分液漏斗中，静置20～30分钟。分取三氯甲烷层，以干燥滤纸滤过，取续滤液置比色皿中，在200～760nm波长范围内扫描，选取最大吸收波长作为测定波长(415±2nm)。
4标准曲线的制备
精密量取对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6与1.0ml分别置10ml量瓶中，自“加三氯甲烷至刻度”起，至“取续滤液至比色皿中”，同“最大吸收波长的确定”项下方法操作。照紫外分光光度法(一部附录VA)，在最大吸收波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，计算回归方程为：Y＝33.124X-0.0244。
5精密度考察
精密量取0.25mg·ml-1的对照品溶液0.4ml于50ml具塞锥形瓶中，自“加三氯甲烷至刻度”起，至“取续滤液至比色皿中”，同“最大吸收波长的确定”项下方法操作。于415nm处重复测定其吸收度5次，RSD为1.9％，表明精密度良好。
6稳定性考察
在室温下每隔30min测定供试品溶液，连续测定其吸收度6次，结果表明供试品溶液在180min内稳定，RSD为1.5％。
7加样回收率试验
取已知总生物碱含量的太白贝母(总生物碱含量为0.0081％)6份，精密称定，取西贝母碱对照品10.10mg置10ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度 (1.01mg/ml)，精密吸取1.0ml、0.80ml、0.60ml加入样品中，制样并测定，并计算加样回收率。求得平均回收率为98.76％(n＝5)，RSD为2.5％。
8样品测定
精密吸取样品溶液1～2ml，加三氯甲烷至10ml，自“加三氯甲烷至刻度”起，至“取续滤液至比色皿中”，同“最大吸收波长的确定”项下方法操作，于415nm处测定吸光度。从标准曲线上读出对照品溶液西贝母碱的重量(μg)，计算，即得。结果见表14。
表14.试制样品测定
实验例4川贝母喷雾剂稳定性研究
1样品：川贝母喷雾剂(自制，批号090729、090727和090728)
2方法：根据《药品注册管理办法》、《中华人民共和国药典》(2010年版二部附录XIX C药物稳定性试验指导原则)和《中华人民共和国药典》(2000年版一部)规定的新药稳定性考察项目和要求，并以本品试验中的条件和方法对本品进行了稳定性室温留样考察及对样品进行了加速稳定性试验。
2.1室温留样试验
取样品(批号为100727、100728和100729)置室温(10℃～30℃)条件下留样观察。分别于0月末(2010年7月28日)、3月末(2010年10月29日)和6月末(2011年1月29日)共3次取样，同上述进行检测。稳定性室温留样考察目前共进行了6个月。以鉴别和含量测定为考察项目，并将结果与初始0月相比较。
2.2加速稳定性试验
川贝母气雾剂三批样品(批号为100727、100728和100729)，在温度为40℃、相对湿度为75％条件下放置，分别于0月(2010年7月28日)、1月(2010年8月29日)、2月(2010年9月29日)、3月(2010年10月29日)、6月(2011年1月29日)共5次取样，对鉴别和含量测定进行考察， 并将结果与初始0月相比较。
3结果
3.1鉴别：
进行了供试品的TLC鉴别(以硅胶G薄层板；以环己烷-乙酸乙酯-二乙胺(6∶5∶1)为展开剂；展开后置日光下检视)。
3.2含量测定：
即用溴甲酚绿比色法对本品主要有效成分总生物碱进行含量测定。
4结论
4.1室温留样：本品在室温条件下放置，连续考察6个月，其鉴别和含量测定指标均未明显变化，质量基本稳定，说明该制剂初步稳定性考察符合要求，室温长期存放的定性正在继续考察。
4.2加速试验：本品在温度为40℃、相对湿度为75％条件下放置，连续考察6个月，其鉴别和含量测定指标均未见明显变化，表明质量较稳定，具体结果见表15。其中样品名称：川贝母气雾剂批号：100729生产日期：10年7月
表15川贝母喷雾剂加速稳定性实验结果
实验例5川贝母喷雾剂对小鼠体外支气管平滑肌的舒张作用
1材料与仪器
1.1药物与试剂磷酸组胺，上海蓝季科技发展有限公司，批号：20081009；氯化乙酰胆碱，北京化学试剂公司，批号：20080715；卵蛋白，Sigma公司，批号：20090124；川贝母喷雾剂，按本发明实施例1制备得到。改良Krebs液：纯化水1000mL中含氯化钠7.5g，氯化钾0.35g，氯化钙0.24g，氯化镁0.05g，磷酸二氢钠0.1g，碳酸氢钠1.15g，葡萄糖1.0g。实验前用5％二氧化碳和95％氧气混合气体饱和。
1.2实验动物健康豚鼠，雌雄兼并，体质量400～500g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供。动物合格证号：SCXK(川)2004-16。
1.3实验仪器SQG4型四腔器官水浴系统，HSS-1(B)型浴槽，RM6240BD型多道生物信号采集处理系统，JZJIO1H张力换能器，以上仪器均由成都仪器厂生产。
2方法
2.1豚鼠卵蛋白致敏哮喘模型的制备豚鼠于第1、第8天分别以4％卵蛋白溶于0.9％氯化钠溶液0.2mL后腿肌内注射；4％氢氧化铝混悬液0.2mL腹腔注射致敏。第15天起将豚鼠置于4L钟罩内，用加压雾化器通人1％卵蛋白(溶于0.9％氯化钠溶液)激发，时间5min。若豚鼠出现腹肌收缩及抽搐则立即取出。隔日1次，连续7次，最后1次激发后，次日开始实验。
2.2豚鼠体外气管螺旋条的制备取正常或哮喘豚鼠，猛击头部致死。迅速切开皮肤，分离气管，从甲状软骨包骨下至气管下端分叉处将整段气管剪下，放人盛有Krebs营养液的培养皿中，剔除气管周围的结缔组织。将气管剪成20mmx3mm的螺旋条。
2.3川贝母喷雾剂剂剂对药物致气管平滑肌收缩活动的影响将浴槽固定在器官水浴系统中，并将温度设定在37℃。气管条两端用细线结扎，将其放人体积20mL的器官浴槽中，加入Krebs营养液20mL。细线的一端结扎在靠近浴槽底部，另一端附着在张力换能器上，用RM6240BD型多道生物信号采集处理系统记录实验过程中张力的变化。每15min换营养液1次，平衡1h后，分别 加入200g/mL磷酸组胺或200g/mL氯化乙酰胆碱0.3mL。气管平滑肌张力收缩出现平台后1h，用Krebs营养液冲洗2次作为对照。每15min换1次营养液。60min后，再加入相同磷酸组胺或氯化乙酰胆碱，平台出现5min后，每隔5min加入川贝母喷雾剂0.2mL，共加4次。使浴槽中川贝母喷雾剂剂剂浓度分别为2，4，8，10g/L(生药)。观察比较各标本给药3min后曲线下降幅度，并计算解痉百分率。解痉百分率＝(给药前张力-给药后张力)/给药前张力×100％。
2.4川贝母喷雾剂剂剂对卵蛋白致敏引起的豚鼠气管平滑肌收缩作用将浴槽固定在设定在37℃的器官水浴系统中，加入Krebs营养液20mL。取卵蛋白致敏豚鼠气管条按上述方法固定在浴槽中。每15min换营养液1次，平衡1h后，加入1％卵蛋白(溶于0.9％氯化钠溶液)0.2mL。平台出现后，每隔5min加入川贝母喷雾剂剂剂0.2mL，共加4次。使浴槽中川贝母喷雾剂浓度分别为2，4，8，10g/L。观察比较各标本给药3min后曲线下降幅度，并计算解痉百分率。
2.5川贝母喷雾剂剂剂对正常和哮喘豚鼠静息状态下气管平滑肌的舒张作用将浴槽固定在设定在37℃的器官水浴系统中，加入Krebs营养液20mL。取正常或卵蛋白致敏豚鼠气管条按上述方法固定在浴槽中。每15min换营养液1次，平衡1h后，每隔5min加入川贝母喷雾剂剂剂0.2mL，共加4次。使浴槽中川贝母喷雾剂浓度分别为2，4，8，10g/L。观察比较各标本给药3min后曲线的变化情况，以给药前张力为基线，计算给药后气管平滑肌松弛幅度(g)。
2.6统计学方法实验数据以均数±标准差(x±s)表示，数据统计学处理采用SPSS11.5软件，多组之间的比较采用方差分析。
3结果
3.1川贝母喷雾剂对磷酸纽胺、氯化乙酰胆碱和卵蛋白致豚鼠气管平滑肌收缩的舒张作用川贝母喷雾剂不同浓度对磷酸组胺、氯化乙酰胆碱和卵蛋白致豚鼠气管平滑肌收缩有明显的拮抗作用。并且在2～10g/L范围内，其对气管螺旋条的舒张作用存在明显的量效关系。结果见表17。
表17川贝母喷雾剂对豚鼠器官平滑肌收缩的解痉率％，x±S
3.2川贝母喷雾剂对正常和哮喘豚鼠静息状态下气管平滑肌的舒张作用川贝母喷雾剂不同浓度能明显舒张正常和哮喘豚鼠静息状态下气管平滑肌。在2～10g/L范围内，具有明显的量效关系。且对哮喘型气管平滑肌的作用比正常的气管平滑肌作用强，见表18。
表18川贝母喷雾剂对正常和哮喘豚鼠静息状态下器官平滑肌张力的松弛幅度％，x±S
4结论
川贝母喷雾剂对磷酸组胺和氯化乙酰胆碱引起的豚鼠气管平滑肌收缩和卵蛋白致敏引起的豚鼠气管平滑肌的收缩都有明显拮抗作用，且川贝母喷雾剂在2～10g/L对气管平滑肌的舒张作用存在明显的量效关系。提示川贝母喷雾剂可能通过非竞争性抑制，降低磷酸组胺和氯化乙酰胆碱对H1和M受体的兴奋作用，或通过拮抗某些炎性递质对气管平滑肌的收缩作用。
实验例6川贝母喷雾剂止咳祛痰平喘作用研究
1实验材料
1.1药物及试剂：川贝母喷雾剂，按本发明实施例1制备得到。喘乐宁气雾剂，批号：000801A.由重庆葛兰素威康制药有限公司出品。氨水(25％～ 28％，成都长联化工试剂有限公司，批号20090412)，酚红(成都科龙化工试剂厂，批号02-04-16)，碳酸氢钠(自贡市化学试剂厂)，羧甲基纤维素钠，无水乙醇(成都科龙化工试剂厂，批号20031121)。
1.2动物：NIH小鼠，豚鼠，均由四川省医学科学院实验动物研究所提供。动物合格证号：SCXK(川)2004-16。
1.3仪器：402超声雾化治疗器(上海四菱医疗器械厂)。
2方法与结果
2.1对小鼠氨雾致咳反应的影响：小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为5组，每组10只，正常对照组、喘乐宁对照组、川贝母喷雾剂高、中、低剂量组，分组及给药剂量见表1。2次/d雾化吸入给药，连续3d，末次给药0.5h，每鼠恒压喷雾氨水15s，观察小鼠咳嗽的潜伏期，井记录2min内小鼠咳嗽次数。结果见表19。结果表明，川贝母喷雾剂生药高、中剂量组有明显延长小鼠咳嗽潜伏期，减少小鼠咳嗽次数的作用
表19.川贝母喷雾剂对小鼠止咳作用的比较(x±s)
注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
2.2小鼠呼吸道酚红排泌量的影响：小鼠5O只，雄性，体重18～22g，随机分为5组，每组10只。正常对照组、氯化铵对照组、川贝母喷雾剂高、中、低剂量组，分组及给药剂量见表2。2次/d雾化吸入给药(氯化铵灌胃给药)，连续4d。末次药后0.5h，鼠腹腔注射5％酚红溶液0.5ml/只，3Omin后处死动物，以5％的NaHCO3溶液冲洗呼吸道3次，每次0.6ml，收集灌洗液，用722光 栅分光光度计于波长546nm处测OD值，并计算酚红质量浓度(mg/L)结果见表20。结果表明，川贝母喷雾剂高、中剂量均有明显增加小鼠呼吸道酚红排泌量的作用。
表20.川贝母喷雾剂对小鼠止咳作用的比较(x±s)
注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
2.3对豚鼠过敏性哮喘的影响
2.3.1动物哮喘模型的建立和筛选
采用药物引喘法(喷雾致喘法)，将豚鼠(体重小于250g)放人密闭的玻璃钟罩内，用定量雾化器喷人2％磷酸组胺和0.4％氯化乙酰胆碱(2∶1)混合液1mL，喷雾停止后豚鼠引起呼吸急促、喘息，甚至窒息，从而出现抽搐或跌倒等，即为动物性豚鼠哮喘模型建立成功。从喷雾开始到抽搐、跌倒的时间，称为引喘潜伏期。实验前一天进行诱喘实验，若引喘潜伏期＞120s则为不敏感而落选。
2.3.2随机分组实验
挑选合格豚鼠随机分为正常对照组、喘乐宁对照组、川贝母喷雾剂高、中、低剂量组，每组10只，分组及给药见表21。2次/d雾化吸入给药(氯化铵灌胃给药)，连续3d，末次药后0.5h，用定量雾化器按预选时的同样条件喷入2％磷酸组胺和0.4％氯化乙酰胆碱(2∶1)混合液1mL，观察并记录引喘潜伏期及发生跌倒的动物数。
表21.川贝母喷雾剂对哮喘豚鼠引喘潜伏期和跌倒数的影响(x±s)
注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表3可知，川贝母喷雾剂能显著延长引喘潜伏期，减少跌倒的动物数，具有良好的平喘作用。
3.结论
川贝母喷雾剂具有良好的止咳、祛痰和平喘作用。其中临床等效剂量效果最优。
下述实施方式均能实现上述实验例的效果
具体实施方式
实施例1
步骤1：取川贝母，加7倍量0.5％HCl-75％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取3次，每次1.5h，合并3次提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤，滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节样品液pH为9，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用4BV的50％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱。
实施例2
步骤1：取川贝母，加6倍量0.6％HCl-85％乙醇水溶液，于75℃水浴加热回流提取2次，每次1.5h，合并提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤，滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1.1g药材/mL的川贝母样品液；用NaOH溶液调节样品液pH为9.5，以2.3BV/h的流速动态吸附，再用7.5BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用4BV的50％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用90％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集90％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱。
实施例3
步骤1：取川贝母，加8倍量0.4％HCl-85％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取4次，每次1.5h，合并提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤，滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节样品液pH为9，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用4BV的50％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱。
实施例4
步骤1：取川贝母，加6倍量0.5％HCl-60％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤。滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1.0g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节上样溶液pH为7，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用2BV的30％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾 试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱；步骤3：取步骤2得到的总生物碱与0.6mg/ml蔗糖、适量薄荷脑、0.05％尼泊金和0.25％苯甲酸钠共同溶解于10％的丙二醇中，加入适量的注射用水，充分摇匀，静置，装入气雾瓶中，向瓶内压入抛射剂F12，灌装，灭菌，即得川贝母喷雾剂。
实施例5
步骤1：取川贝母，加8倍量0.5％HCl-90％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取4次，每次1h，合并提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用2％HCl研溶，加入硅藻土，过滤。滤液用2％HCl稀释，得生药浓度为1.0g药材/mL的川贝母样品液；用5％NaOH溶液调节样品液pH为11，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用6BV的70％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重得川贝母总生物碱；步骤3：取川贝母总生物碱，加入常规辅料，采用常规工艺制成颗粒剂。
实施例6
取处方中药材川贝母，加7倍量0.5％HCl75％乙醇水溶液，于80℃水浴加热回流提取3次，每次1.5h，合并3次提取液，减压浓缩，60℃真空干燥2h，得浸膏。量取适量川贝母酸醇提取浓缩的浸膏，用2％HCl研溶，并加入20g硅藻土，过滤。滤液用2％HCl定容至适量，得川贝母样品液(折合生药浓度为1g药材/mL)。用5％NaOH溶液调节上样溶液pH为9后，以2BV/h的流速动态吸附，再用8BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色。然后用4BV的50％浓度乙醇以2BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用95％乙醇进行洗脱，以改良碘化铋钾试剂检测终点。收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，于60℃条件下真空干燥至恒重。将0.6mg/ml蔗糖、0.05％尼泊金和0.25％苯甲酸钠溶解于10％的丙二醇中，加入适量的注射用水中，充分摇匀，静置，装入气雾剂瓶中，向瓶内压入经微孔滤膜滤过的抛射剂F12，灌装，火菌，即得。
Claims (10)
1.川贝母总生物碱的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤1：取川贝母采用HCl-乙醇水溶液进行提取；
步骤2：取步骤1得到的提取物经大孔吸附树脂纯化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1中HCl-乙醇水溶液，其中HCl浓度为0.3-0.8％，乙醇浓度为60-90％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2中提取物制成相当生药浓度为0.5-1.5g药材/mL的川贝母提取物上样液，调节上样液pH至碱性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤2中大孔吸附树脂纯化时，先用低浓度乙醇解吸附，再用高浓度乙醇进行洗脱；所述大孔吸附树脂为非极性。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在所述步骤2中上样液pH为8-11；解吸附乙醇浓度为40-60％，用量为3-5倍柱体积。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤1：取川贝母，加6-9倍量0.3-0.8％HCl-60-80％乙醇水溶液，于70-90℃水浴加热回流提取2-5次，每次1-3h，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得浸膏；步骤2：取步骤1得到的浸膏，用1-5％HCl研溶，加入硅藻土，过滤，滤液用1-5％HCl稀释，得生药浓度为1g药材/mL的川贝母样品液；用NaOH溶液调节样品液pH为8-10，以1-3BV/h的流速动态吸附，再用6-9BV的蒸馏水以相同流速冲洗树脂至流出液为无色；然后用3-6BV的20-50％浓度乙醇以1-3BV/h的流速进行解吸附，洗脱完成后，再用75-95％乙醇进行洗脱；收集75-95％乙醇洗脱液，减压浓缩后，真空干燥得川贝母总生物碱。
7.如权利要求1-6任一所述方法制备的川贝母总生物碱。
8.川贝母喷雾剂的制备方法，其特征在于将权利要求1-6任一所述方法制备的川贝母总生物碱与甜味剂、矫味剂、防腐剂中的任一一种或几种共同溶解于增溶剂中，加入注射用水，充分摇匀，静置，装入气雾瓶中，向瓶内压入抛射剂，灌装，灭菌，制成喷雾剂。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
川贝母总生物碱的量以其制成喷雾剂来计，每mL喷雾剂中含川贝母总生物碱的量相当于由1-4.0g川贝母提取而得的川贝母总生物碱；
所述增溶剂加入量为总体积的5-20％；所述增溶剂为吐温-80、吐温-20、1，2-丙二醇、丙三醇中的任意一种。
10.如权利要求1-6任一方法制备的川贝母总生物碱在制备拮抗磷酸组胺、氯化乙酰胆碱或卵蛋白致气管平滑肌收缩药物中的应用。
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