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一种伊贝母提取物的制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种伊贝母提取物的制备方法和用途，该方法将伊贝母干燥、粉碎，加浓氨水溶液浸润，加入乙醇回流提取，过滤，减压回收至无醇味；将通过Amberlite FPC 22Na或Amberlite 200大孔强酸性阳离子吸附树脂，用含氨水的乙醇溶液通过大孔强酸性阳离子吸附树脂，将树脂上吸附的生物碱洗脱下来，收集洗脱液并减压回收浓缩，将浓缩的提取液置于干燥箱内干燥，得到伊贝母提取物；通过本发明所述方法获得的伊贝母提取物能够在延长咳嗽潜伏期、减少咳嗽次数、促进酚红分泌方面组间具有显著性差异（<i>P</i><0.01）；具有镇咳化痰功效，本发明所述方法避免了使用石油醚、氯仿等有机溶剂的问题。

Description

一种伊贝母提取物的制备方法和用途
技术领域
本发明属于植物提取加工领域，具体涉及一种伊贝母提取物的制备方法和用途。
背景技术
伊贝母是百合科植物伊贝母(FritillariapallidifloraSchrenk)或新疆贝母(FritillaniawalujewiiRegel)的干燥鳞茎，其植物主产地为新疆，前者分布在新疆西北部伊宁、绥定、霍城一带，后者分布在新疆天山地区。伊贝母已收载于《中国药典》(2000年版)一部，《维吾尔药志》上册。古代维吾尔医用当地贝母治疗疾病，18世纪后期，在维吾尔医药中有临床使用历史。
贝母具有清热润肺，化痰止咳等功效，主要活性成分为西贝素和西贝素苷等甾体生物碱，伊贝母生物碱含量在同类贝母中相对较高，为0.11-0.27％之间，抗病力强和药材价格低廉，近年来，对伊贝母的研究倍受关注。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种伊贝母提取物的制备方法和用途，该方法将伊贝母干燥、粉碎；加浓氨水溶液浸润，加入乙醇回流提取，过滤，减压回收至无醇味；将提取液通过AmberliteFPC22Na或Amberlite200大孔强酸性阳离子吸附树脂；然后分别用含氨水的乙醇溶液通过大孔强酸性阳离子吸附树脂，将树脂上吸附的生物碱洗脱下来，收集洗脱液并减压回收浓缩；将浓缩的提取液置于干燥箱内干燥，得到伊贝母提取物。本发明所述方法不仅避免了使用石油醚、氯仿等有机溶剂的问题，而且通过该方法获得的伊贝母提取物经过对小鼠咳嗽、化痰模型的影响试验表明：在止咳化痰能够在延长咳嗽潜伏期、减少咳嗽次数、促进酚红分泌方面组间比较具有显著性差异(P<0.01)；此外，在延长咳嗽潜伏期方面组间比较具有统计学意义(P<0.01)。该伊贝母提取物具有一定镇咳化痰功效，具有进一步研究和开发的价值。
本发明所述的一种伊贝母提取物的制备方法，按下列步骤进行：
a、将伊贝母干燥、粉碎过60目筛，得伊贝母药材粉末；
b、将步骤a得到的粉末加入浓度为25％氨水溶液浸润12小时，再加入5-30倍量体积浓度为60-95％的乙醇回流提取1-4次，每次0.5-3小时，过滤，合并滤液，减压回收至无醇味，得提取液；
c、将步骤b得到的提取液通过AmberliteFPC22Na或Amberlite200大孔强酸性阳离子吸附树脂，然后用3-6倍量树脂的去离子水除杂，再将含1-3mol/L氨水的体积浓度为65％-95％乙醇溶液，2-5倍量树脂/小时的流速，6-10倍量树脂的用量洗脱树脂上吸附的生物碱，将树脂上吸附的生物碱洗脱下来，收集洗脱液并减压回收浓缩至浸膏；
d、将步骤c所得浸膏置于干燥箱内以温度40-55℃干燥72小时，得到伊贝母提取物。
所述的方法获得的伊贝母提取物在制备治疗止咳祛痰的药物中的用途。
通过本发明所述方法获得的伊贝母提取物中伊贝母总生物碱重量含量为1.5-2.5％。
本发明的制备方法避免了使用石油醚、氯仿等有机溶剂的问题。
本发明的制备方法适合于新疆贝母、托里贝母、裕民贝母和砂贝母等贝母的任意品种提取物的制备。
附图说明
图1为本发明对浓氨水诱发小鼠咳嗽潜伏期的影响，其中平均值±标准偏差；n＝12；**P<0.01，vs空白对照；
图2为本发明对浓氨水诱发小鼠咳嗽次数的影响，其中平均值±标准偏差；n＝12；**P<0.01，vs空白对照；
图3为本发明对小鼠气管段酚红分泌量的影响，其中平均值±标准偏差；n＝8；**P<0.01，vs空白对照。
具体实施方式：
实施例1：
a、将伊贝母药材3Kg干燥、粉碎过60目筛，得伊贝母药材粉末；
b、将步骤a得到的粉末加入浓度为25％氨水溶液浸润12小时，再加入5倍量体积浓度为95％的乙醇回流提取1次，时间3小时，过滤，合并滤液，减压回收至无醇味，得提取液；
c、将步骤b得到的提取液通过AmberliteFPC22Na大孔强酸性阳离子吸附树脂，然后用3倍量树脂的去离子水除杂，再将6倍量树脂的含1mol/L氨水的体积浓度为95％乙醇溶液，以2倍量树脂/小时的流速洗脱树脂上吸附的生物碱，收集洗脱液并减压回收浓缩至浸膏；
d、将步骤c所得浸膏置于干燥箱内以温度40℃干燥72小时，得到含生物碱为1.5-2.5％的伊贝母提取物。
实施例2
a、将伊贝母药材3Kg干燥、粉碎过60目筛，得伊贝母药材粉末；
b、将步骤a得到的粉末加入浓度为25％氨水溶液浸润12小时，再加入10倍量体积浓度为60％的乙醇回流提取2次，每次0.5小时，过滤，合并滤液，减压回收至无醇味，得提取液；
c、将步骤b得到的提取液通过Amberlite200大孔强酸性阳离子吸附树脂，然后用4倍量树脂的去离子水除杂，再将7倍量树脂的含2mol/L氨水的体积浓度为65％乙醇溶液，以3倍量树脂/小时的流速洗脱树脂上吸附的生物碱，收集洗脱液并减压回收浓缩至浸膏；
d、将步骤c所得浸膏置于干燥箱内以温度45℃干燥72小时，得到含生物碱为1.5-2.5％的伊贝母提取物。
实施例3
a、将伊贝母药材3Kg干燥、粉碎过60目筛，得伊贝母药材粉末；
b、将步骤a得到的粉末加入浓度为25％氨水溶液浸润12小时，再加入20倍量体积浓度为70％的乙醇回流提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收至无醇味，得提取液；
c、将步骤b得到的提取液通过AmberliteFPC22Na大孔强酸性阳离子吸附树脂，然后用6倍量树脂的去离子水除杂，再将8倍量树脂的含3mol/L氨水的体积浓度为95％乙醇溶液，以4倍量树脂/小时的流速洗脱树脂上吸附的生物碱，收集洗脱液并减压回收浓缩至浸膏；
d、将步骤c所得浸膏置于干燥箱内以温度50℃干燥72小时，得到含生物碱为1.5-2.5％的伊贝母提取物。
实施例4
a、将伊贝母药材3Kg干燥、粉碎过60目筛，得伊贝母药材粉末；
b、将步骤a得到的粉末加入浓度为25％氨水溶液浸润12小时，再加入30倍量体积浓度为70％的乙醇回流提取4次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压回收至无醇味，得提取液；
c、将步骤b得到的提取液通过Amberlite200大孔强酸性阳离子吸附树脂，然后用5倍量树脂的去离子水除杂，再将10倍量树脂的含1mol/L氨水的体积浓度为75％乙醇溶液，以5倍量树脂/小时的流速洗脱树脂上吸附的生物碱，收集洗脱液并减压回收浓缩至浸膏；
d、将步骤c所得浸膏置于干燥箱内以温度55℃干燥72小时，得到含生物碱为1.5-2.5％的伊贝母提取物。
实施例5
伊贝母提取物的止咳化痰作用研究：
实验动物：
品系：昆明小鼠，数量：112只，体重：22-30克，性别：雌雄各半，来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016，使用许可证号：SYXK(沪)2013-0058，等级：SPF级；
饲养条件：饲养于正压净化通风动物房内，室温22.0±1.0℃，湿度20.0-50.0％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水；
实验仪器：
名称：电子天平，型号：SartoriusBS110S，厂家：北京赛多利斯天平有限公司
名称：精密天平，型号：PGL，厂家：艾德姆衡器(武汉)有限公司
名称：台式高速冷冻离心机，型号：5427R，厂家：eppendorf
名称：全波长多功能酶标仪，型号：VarioskanFlash，厂家：ThermoFisherScientificChina；
实验试剂：
名称：复方氢溴酸右美沙芬糖浆；包装：100毫升；性状：棕黄色澄清液体；厂家：湖北凤凰白云山药业有限公司；批号：140805；
名称：复方桔梗氯化铵口服溶液；包装：100毫升；性状：棕色液体；厂家：上海美优制药有限公司；批号：150302；
名称：苯酚红；规格：AR；包装：25克；性状：暗红色粉末；厂家：天津市致远化学试剂有限公司；批号：20151101；
名称：碳酸氢钠；规格：AR；包装；500克；性状：白色结晶粉末；厂家：国药集团化学试剂有限公司；批号：20130509；
名称：二甲亚砜；规格：500毫升；性状：无色液体；厂家：国药集团化学试剂有限公司；批号：20150122；
实验方法：
镇咳实验：
分组及给药：分组：空白对照组(n＝12，0.1毫升/10克)、阳性对照组(右美沙芬，n＝12，4.25毫升/千克)、伊贝母提取物(n＝12，0.5克/千克、0.25克/千克、0.125克/千克、0.0625克/千克)；灌胃给药，给药体积均为0.1毫升/10克，连续给药5天；
处理及观察指标：
末次给药1小时后，将浓氨水0.3毫升用注射器注入棉花团内，盖上500毫升烧杯一定时间(约10秒)后放入小鼠，观察小鼠出现咳嗽的潜伏期以及3分钟内的咳嗽次数；
化痰实验：
分组及给药：分组：空白对照组(n＝8，0.1毫升/10克)、阳性对照组(氯化铵，n＝8，6毫升/千克)、伊贝母提取物(n＝12，0.5克/千克、0.25克/千克、0.125克/千克)；灌胃给药，给药体积均为0.1毫升/10克，连续给药3天。
处理及观察指标：
酚红标准曲线的制备：精密称取酚红2.5毫克，用体积浓度5％的碳酸氢钠溶液配制至100毫升作为储备液，分别精密量取50微升、10微升、5微升、1微升、0.5微升、0.1微升的酚红储备液，加入浓度5％的碳酸氢钠溶液的量管中并定容至2.5毫升，将上述配制好的系列标准溶液，以浓度5％的碳酸氢钠溶液为空白，用酶标仪于546纳米处测定吸光度值(OD)，每个浓度平行测定2次，取其平均值，以平均绝对吸光度值(减空白后)对质量浓度(C)进行线性回归，得酚红标准曲线方程：Y＝0.01944X；
实验前禁食不禁水18小时，末次给药后30分钟，腹腔注射2.5％酚红，0.5毫升/只，30分钟后处死小鼠，分离气管，用手术线分别在甲状腺软骨下缘处和气管分岔处结扎，自结扎处剪取气管，剪取甲状软骨上缘至双侧胸锁乳突肌交叉处的气管，放入2.5毫升的5％碳酸氢钠溶液中浸泡约2小时后，以3500转/分钟离心5分钟，吸取上清液后用紫外分光光度计于波长546纳米测吸光度值，代入标准曲线方程中计算酚红的浓度。
结果统计：
所有数据均以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析，组间比较采用SNK检验，以P<0.05为差异比较具有统计学意义。
实验结果：
镇咳结果：如图1、图2、表1所示：右美沙芬以及伊贝母提取物(0.5克/千克、0.25克/千克)能够显著延长咳嗽潜伏期，组间差异比较具有统计学意义(P<0.01)。右美沙芬以及伊贝母提取物(0.5克/千克)能够显著降低3分钟内咳嗽次数，组间差异比较具有统计学意义(P<0.01)。
表1、伊贝母提取物对浓氨水诱发小鼠咳嗽的影响(平均值±标准偏差)
注：**P<0.01，vs空白对照
化痰结果：如图3、表2所示，氯化铵以及伊贝母提取物(0.5克/千克)能够显著增加小鼠气管酚红的排泌量，组间差异比较具有统计学意义(P<0.01)。
表2、伊贝母提取物对小鼠气管段酚红分泌量的影响(平均值±标准偏差)
注：**P<0.01，vs空白对照。

Claims (2)

1.一种伊贝母提取物的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、将伊贝母干燥、粉碎过60目筛，得伊贝母药材粉末；
b、将步骤a得到的粉末加入浓氨水溶液浸润12小时，再加入5-30倍量60-95%的乙醇回流提取1-4次，每次0.5-3小时，过滤，合并滤液，减压回收至无醇味，得提取液；
c、将步骤b得到的提取液通过AmberliteFPC22Na或Amberlite200大孔强酸性阳离子吸附树脂，然后用3-6倍量树脂的去离子水除杂，再将含1-3mol/L氨水的体积浓度为65%-95%乙醇溶液，2-5倍量树脂/小时的流速，6-10倍量树脂的用量洗脱树脂上吸附的生物碱，将树脂上吸附的生物碱洗脱下来，收集洗脱液并减压回收浓缩至浸膏；
d、将步骤c所得浸膏置于干燥箱内以温度40-55℃干燥72小时，得到伊贝母提取物。
2.根据权利要求1所述的方法获得的伊贝母提取物在制备治疗止咳祛痰的药物中的用途。
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