CN107714802B - 一种治疗非酒精性脂肪肝的药物及其制法与检测方法 - Google Patents
一种治疗非酒精性脂肪肝的药物及其制法与检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107714802B CN107714802B CN201711217187.0A CN201711217187A CN107714802B CN 107714802 B CN107714802 B CN 107714802B CN 201711217187 A CN201711217187 A CN 201711217187A CN 107714802 B CN107714802 B CN 107714802B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- medicinal extract
- extraction
- cape jasmine
- gained
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/58—Meliaceae (Chinaberry or Mahogany family), e.g. Azadirachta (neem)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/74—Rubiaceae (Madder family)
- A61K36/744—Gardenia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N30/14—Preparation by elimination of some components
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
- A61K2236/15—Preparation or pretreatment of starting material involving mechanical treatment, e.g. chopping up, cutting or grinding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
- A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation, decoction
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
- A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
- A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/065—Preparation using different phases to separate parts of sample
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N30/14—Preparation by elimination of some components
- G01N2030/146—Preparation by elimination of some components using membranes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Botany (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Extraction Or Liquid Replacement (AREA)
Abstract
本发明公开了一种治疗非酒精性脂肪肝的药物,属于中药领域,该药物由以下重量份的药味原料药制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份制成。本发明产品经过动物药效实验以及临床实践表明,在改善非酒精性单纯性脂肪肝的血生化指标、恢复正常体重以及脂肪肝等方面具有显著的效果,本发明产品采用中药配伍不仅达到较好的治疗效果,而且毒副作用小。本发明的技术得到了河北省科技攻关计划项目的支持,项目名称为肝癌前病变肝细胞增殖与凋亡影响的研究,项目编号:162777242。
Description
技术领域
本发明属于中药领域,涉及一种治疗脂肪肝的药物,特别涉及一种治疗非酒精性单纯性脂肪肝的药物及其制备方法。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征,与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势,非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因,普通成人非酒精性脂肪性肝病患病率达到10%~30%,其中10%~20%为NASH,非酒精性脂肪性肝病除可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发外,还可影响其他慢性肝病的进展,并参与II型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。代谢综合征相关恶性肿瘤、动脉硬化性心脑血管疾病以及肝硬化为影响非酒精性脂肪性肝病患者生活质量和预期寿命的重要因素。为此,非酒精性脂肪性肝病是当代医学领域的新挑战,近期内非酒精性脂肪性肝病对人类健康的危害仍将不断增加。
目前主要的临床治疗方法分为3类:(1)控制体重,缺点在于难以坚持,且不能完全控制病情的进展;(2)药物治疗,缺点在于大部分替代药物如噻唑烷二酮类、降脂药等不能有效的缓解肝组织学炎性病变的情况,且毒副作用大,多具有肝毒性;(3)肝移植手术,缺点在于费用高昂,复发率高。因此,寻找一种有效、安全的非酒精性单纯性脂肪肝病的治疗药物已经成为医药学界的当务之急。
中成药三子散,由诃子、川楝子、栀子制成,具有清热凉血,解毒的功效;用于温热,血热,新久热。该药品也是2015版《中国药典》一部所收载的品种(第489-490页)。本专利的发明人是河北省秦皇岛市海港医院中医科的一线医务人员和药学科研人员,在中医内科具有多年的临床实践经验,曾在中国科技统计源核心期刊上发表过数篇论文,尤其在中医内科的胃病、肝病治疗上,具有非常丰富的实践经验。作为主要作者,本专利的发明人2017年7月在中国科技统计源核心期刊《世界中西医结合杂志》上发表了的论文《中西医防治胃癌前病变的临床研究进展》,该论文发表后,在中国知网、万方等数据的下载量迅速过百次,对推动学术进步起到了一定的推动作用。
本专利的发明人在治疗肝病的在临床实践中偶然发现中成药三子散对非酒精性单纯性脂肪肝有一定的治疗效果,但其效果并不理想,在此基础上,医疗技术人员与药物制剂工程师共同对此技术进行攻关,经过数年潜心研究后,终于得到的了本发明的创新技术。同时,本发明的技术还得到了河北省科学技术厅的科技攻关计划项目的支持,项目名称为肝癌前病变肝细胞增殖与凋亡影响的研究,项目编号:162777242。
同时,本专利的创新技术已经与河北省和江苏省的几个制药企业达成意向性合作协议,已经为本专利的创新技术开发出新药做好了前期的准备工作。据不完全统计,我国治疗非酒精性单纯性脂肪肝药物的市场容量,每年约三十亿元,本发明的创新技术开发新药成功后,初步预测每年的市场销售额在三亿元以上,对促进我国中药产业实体经济的发展,将起到非常大的推动作用。
发明内容
为了解决背景技术中存在的技术问题,本发明的目的之一是提供一种治疗非酒精性单纯性脂肪肝效果好的药物。
本发明的另一目的是提供该治疗非酒精性单纯性脂肪肝药物的制备方法。
本发明还提供该治疗非酒精性单纯性脂肪肝药物的检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种治疗非酒精性单纯性脂肪肝的药物,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份。
所述的药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内35~45℃烘干3~5h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1800~2000kPa,进料速度为230~250r·min-1,分级频率为30~40Hz,粉碎时间为20~30min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取6~10h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加5~7倍量的70%~80%乙醇回流提取1~3次,每次提取1~3小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加6~10倍量60%~70%的丙酮,于65~75℃水浴回流提取1~3次,每次提取80~100min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:7~9,上样体积8~10BV,用pH 2~4的盐酸水溶液10~14BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用20%~40%的丙酮水溶液8~12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯8~12BV进行洗脱,流速为2~4BV·h-1,收集洗脱液,然后在70~80℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得。
该药物优选采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得。
所述的药物按照中药药剂学中的常规工艺,加入常规辅料,制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、滴丸剂或口服液。
一种治疗非酒精性单纯性脂肪肝的药物的检测方法,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内35~45℃烘干3~5h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1800~2000kPa,进料速度为230~250r·min-1,分级频率为30~40Hz,粉碎时间为20~30min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取6~10h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加5~7倍量的70%~80%乙醇回流提取1~3次,每次提取1~3小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加6~10倍量60%~70%的丙酮,于65~75℃水浴回流提取1~3次,每次提取80~100min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:7~9,上样体积8~10BV,用pH 2~4的盐酸水溶液10~14BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用20%~40%的丙酮水溶液8~12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯8~12BV进行洗脱,流速为2~4BV·h-1,收集洗脱液,然后在70~80℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
采用高效液相色谱法同时测定该药物中的京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:色谱柱:Atlantis C18;流动相:乙腈-0.10moL·L-1~0.20moL·L-1磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,洗脱顺序为:从0至20min,乙腈从50%线性上升至70%,0.10moL·L-1~0.20moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从50%线性下降至30%,从21至40min,乙腈从70%线性上升至80%,0.10moL·L-1~0.20moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从30%线性下降至20%;流速:1.0~2.0mL·min-1;0至20min时,检测京尼平苷、栀子酮苷;检测波长为:230~240nm;21至40min时,检测异槲皮苷、高北美圣草素,检测波长为:265~275nm;柱温:30~35℃;进样量:5~20μL;
(2)混合对照品储备液的制备:精密称取对照品异槲皮苷2.0~4.0mg、高北美圣草素2.0~4.0mg、京尼平苷3.0~5.0mg、栀子酮苷3.0~5.0mg,置于25~50mL量瓶中,加乙腈定容至刻度,即得含有异槲皮苷0.10~0.20mg·mL-1、高北美圣草素0.10~0.20mg·mL-1、京尼平苷0.10~0.20mg·mL-1、栀子酮苷0.10~0.20mg·mL-1混合对照品储备液;
(3)供试品溶液的制备:取样品,研细,精密称取40~60mg,置25~50mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
(4)测定:精密吸取混合对照品储备液、供试品溶液各5~20μL,注入高效液相色谱仪,进行测定。
所述的药物的检测方法,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
采用高效液相色谱法同时测定该药物中的京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的含量,优选的测定方法如下:
(1)色谱条件:色谱柱:Atlantis C18,规格:150mm×4.6mm,5μm;流动相:乙腈-0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,洗脱顺序为:从0至20min,乙腈从50%线性上升至70%,0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从50%线性下降至30%,从21至40min,乙腈从70%线性上升至80%,0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从30%线性下降至20%;流速:1.5mL·min-1;0至20min时,检测京尼平苷、栀子酮苷;检测波长为:236nm;21至40min时,检测异槲皮苷、高北美圣草素,检测波长为:268nm;柱温:32℃;进样量:10μL;
(2)混合对照品储备液的制备:精密称取对照品异槲皮苷3.0mg、高北美圣草素3.0mg、京尼平苷4.0mg、栀子酮苷4.0mg,置于25mL量瓶中,加乙腈定容至刻度,即得含有异槲皮苷0.12mg·mL-1、高北美圣草素0.12mg·mL-1、京尼平苷0.16mg·mL-1、栀子酮苷0.16mg·mL-1混合对照品储备液;
(3)供试品溶液的制备:取样品,研细,精密称取50mg,置25mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
(4)测定:精密吸取混合对照品储备液、供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,进行测定。
一种治疗非酒精性单纯性脂肪肝的药物的检测方法,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内35~45℃烘干3~5h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1800~2000kPa,进料速度为230~250r·min-1,分级频率为30~40Hz,粉碎时间为20~30min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取6~10h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加5~7倍量的70%~80%乙醇回流提取1~3次,每次提取1~3小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加6~10倍量60%~70%的丙酮,于65~75℃水浴回流提取1~3次,每次提取80~100min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:7~9,上样体积8~10BV,用pH 2~4的盐酸水溶液10~14BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用20%~40%的丙酮水溶液8~12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯8~12BV进行洗脱,流速为2~4BV·h-1,收集洗脱液,然后在70~80℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
采用气相色谱法同时测定该药物中的4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛的含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:SUPELCO的WAX-10石英毛细管色谱柱,进样口温度210~230℃,进样量1~5μL,分流比为6~8:2~4,柱温160~180℃,载气流速4.0~5.0mL·min-1,检测器温度260~280℃,尾吹气流量40.0~50.0mL·min-1,FID氢气流量35~45mL·min-1,空气流量330~370mL·min-1;
(2)内标溶液的制备:取水杨酸甲酯对照品20~30mg,置25~50mL量瓶中,加比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,制成每1mL含水杨酸甲酯0.5~2.0mg的溶液,摇匀,作为内标溶液;
(3)混合对照品溶液的制备:取4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯对照品10~30mg、2-乙基-2-己烯醛对照品20~30mg,置25~50mL量瓶中,加入比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,再从中精密吸取5~10mL,置25~50mL量瓶中,再加入比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液;
(4)供试品溶液制备:取待测样品1~2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入内标溶液20~40mL,称定重量,超声处理35~45min,超声功率280~320W,超声频率35~45kHz,放冷,再称定重量,用比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过;精密吸取续滤液5~10mL,置10~25mL量瓶中,精密加入比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,即得供试品溶液;
(5)测定:精密吸取内标溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各1~2μL,注入气相色谱仪,进行测定。
所述的药物的检测方法,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
采用气相色谱法同时测定该药物中的4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛的含量,优选的测定方法如下:
(1)色谱条件:SUPELCO的WAX-10石英毛细管色谱柱,规格:30m×0.32mm,0.5μm,进样口温度220℃,进样量1μL,分流比为7:3,柱温170℃,载气流速4.5mL·min-1,检测器温度270℃,尾吹气流量45.0mL·min-1,FID氢气流量40mL·min-1,空气流量350mL·min-1;
(2)内标溶液的制备:取水杨酸甲酯对照品25mg,置25mL量瓶中,加比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,制成每1mL含水杨酸甲酯1mg的溶液,摇匀,作为内标溶液;
(3)混合对照品溶液的制备:取4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯对照品20mg、2-乙基-2-己烯醛对照品25mg,置25mL量瓶中,加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,再从中精密吸取5mL,置25mL量瓶中,再加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液;
(4)供试品溶液制备:取待测样品1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入内标溶液20mL,称定重量,超声处理40min,超声功率300W,超声频率40kHz,放冷,再称定重量,用比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过;精密吸取续滤液5mL,置10mL量瓶中,精密加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,即得供试品溶液;
(5)测定:精密吸取内标溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各1μL,注入气相色谱仪,进行测定。
一种药物组合物在制备治疗非酒精性单纯性脂肪肝药物中的应用,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
采用高效液相色谱法同时测定药物中的京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:色谱柱:Atlantis C18,规格:150mm×4.6mm,5μm;流动相:乙腈-0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,洗脱顺序为:从0至20min,乙腈从50%线性上升至70%,0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从50%线性下降至30%,从21至40min,乙腈从70%线性上升至80%,0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从30%线性下降至20%;流速:1.5mL·min-1;0至20min时,检测京尼平苷、栀子酮苷;检测波长为:236nm;21至40min时,检测异槲皮苷、高北美圣草素,检测波长为:268nm;柱温:32℃;进样量:10μL;
(2)混合对照品储备液的制备:精密称取对照品异槲皮苷3.0mg、高北美圣草素3.0mg、京尼平苷4.0mg、栀子酮苷4.0mg,置于25mL量瓶中,加乙腈定容至刻度,即得含有异槲皮苷0.12mg·mL-1、高北美圣草素0.12mg·mL-1、京尼平苷0.16mg·mL-1、栀子酮苷0.16mg·mL-1混合对照品储备液;
(3)供试品溶液的制备:取样品,研细,精密称取50mg,置25mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
(4)测定:精密吸取混合对照品储备液、供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,进行测定;
采用气相色谱法同时测定药物中的4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛的含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:SUPELCO的WAX-10石英毛细管色谱柱,规格:30m×0.32mm,0.5μm,进样口温度220℃,进样量1μL,分流比为7:3,柱温170℃,载气流速4.5mL·min-1,检测器温度270℃,尾吹气流量45.0mL·min-1,FID氢气流量40mL·min-1,空气流量350mL·min-1;
(2)内标溶液的制备:取水杨酸甲酯对照品25mg,置25mL量瓶中,加比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,制成每1mL含水杨酸甲酯1mg的溶液,摇匀,作为内标溶液;
(3)混合对照品溶液的制备:取4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯对照品20mg、2-乙基-2-己烯醛对照品25mg,置25mL量瓶中,加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,再从中精密吸取5mL,置25mL量瓶中,再加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液;
(4)供试品溶液制备:取待测样品1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入内标溶液20mL,称定重量,超声处理40min,超声功率300W,超声频率40kHz,放冷,再称定重量,用比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过;精密吸取续滤液5mL,置10mL量瓶中,精密加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,即得供试品溶液;
(5)测定:精密吸取内标溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各1μL,注入气相色谱仪,进行测定。
本发明通过以下实验研究验证本发明的有益效果,但是并不限制本发明权利要求的保护范围。
实验一:对小鼠非酒精性单纯性脂肪肝治疗作用的药物筛选实验研究
本研究用高糖高脂饲料喂养小鼠建立非酒精性单纯性脂肪肝模型,研究筛选对非酒精性单纯性脂肪肝具有突出治疗作用的药物。
1仪器与试药
1.1试药
1.1.1受试药物I:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,即得受试药物I。
1.1.2受试药物II:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:将处方量的柯子、川楝子、栀子,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇,得浸膏,浓缩,干燥,即得受试药物II。
1.1.3受试药物III:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:将处方量的柯子、川楝子、栀子,加10倍量的水回流提取2次,每次提取2小时,合并水提取液,滤过,滤液浓缩,干燥,即得受试药物III。
1.1.4受试药物IV:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得。
1.1.5受试药物V:三子散,处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:以上三味,粉碎成粗粉,过筛,混匀,即得。由阜新蒙药有限责任公司生产,批准文号:国药准字Z21020301,规格:每袋装18g,批号:20151223。购于秦皇岛市天贺药店。
1.1.6阳性药物:壳脂胶囊,由内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司生产,批准文号:国药准字Z20050665,规格:每粒装0.25g,批号:201600623-4。
1.2试剂与仪器
全自动生化分析仪,由南昌普朗医疗设备有限公司制造,批号:20160312;丙二醛(MDA)检测试剂盒,由南京信帆生物技术有限公司制造,批号:20160215-6;超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒,由南京信帆生物技术有限公司制造,批号:2160128-2;光学显微镜,由重庆奥特光学仪器有限公司制造。
1.3动物
昆明种小鼠,SPF级,♂,体质量(22±3)g,购自河北医科大学实验动物中心,实验动物许可证号:SCXK(冀)2008-1-003。给予标准食物,自由饮水,保持光照和避光循环饲养;实验开始前保持室内饲养5天。
2方法
2.1非酒精性单纯性脂肪肝小鼠模型的建立
将小鼠随机分为2组,正常对照组小鼠(25只)喂饲普通饲料,其余小鼠(75只)喂饲高脂饲料(35%普通饲料粉、25%猪油、20%蛋黄粉、5%奶粉、10%蔗糖、3%胆固醇、2%胆酸钠),自由摄食、饮水。连续喂养5周后,从正常对照组和脂肪肝模型组分别处死5只小鼠,比较2组小鼠的血清和肝脏生化指标,以及肝脏组织病理切片,判断非酒精性单纯性脂肪肝模型小鼠是否建立成功。
2.2分组与给药
将造模成功小鼠70只随机分为7组,每组10只,分别为模型对照组、阳性药物组(壳脂胶囊50mg·kg-1,1次·d-1)、受试药物I组、受试药物II组、受试药物III组、受试药物IV组、受试药物V组,给药剂量均为50mg·kg-1,1次·d-1;连续给药5周,正常对照组(10只)和模型对照组(10只)给予等量蒸馏水。给药期间,除正常对照组标准鼠料饲养外,其余各组继续给予高脂饮食,直到实验结束。所有小鼠在末次给药后,禁食不禁水12h,小鼠眼球取血,分离血清,采用全自动生化分析仪检测血清谷总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)含量和丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性。取血后处死小鼠,取出肝脏,一部分用4%福尔马林固定,HE染色,切片,送河北省秦皇岛市海港医院病理科,供组织病理学检查;另一部分,制成10%肝组织匀浆,测定其中TG、TC、MDA、SOD含量或活性。
2.3数据处理
采用SPSS 10.0软件对数据进行统计学描述和分析,结果以(表示,采用单因素方差分析进行多组间均数比较。
3结果
3.1非酒精性单纯性脂肪肝模型的建立
与正常对照组比较,高脂饲料喂养的模型小鼠血清和肝脏中TG、TC含量均显著升高(P<0.05或P<0.01),血清中ALT、AST活性和肝脏中MDA含量显著升高(P<0.01),SOD活力降低(P<0.05),结果见表1、2,肝组织病理切片观察可见肝细胞脂肪变性。表明非酒精性单纯性脂肪肝小鼠模型建立成功。
高脂饲料的配方是在基础饲料的基础上添加胆固醇、猪油、胆酸钠等,胆酸钠可以乳化脂肪,促进吸收。本实验通过高脂饲料喂养小鼠成功建立了非酒精性单纯性脂肪肝动物模型。
3.2小鼠血清和肝组织生化指标检测
实验结束时,阳性药物组小鼠的各项生化指标都有改善(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组相比,受试药物IV组表现出降低非酒精性单纯性脂肪肝小鼠血清中TG、TC含量和ALT、AST活性的作用,降低非酒精性单纯性脂肪肝小鼠肝脏中TG、TC、MDA含量,升高SOD活力的作用(P<0.05或P<0.01)。而且从各项生化指标的比较中,受试药物IV组的治疗效果与阳性药物组相当(P>0.05),对于降低血清中的TC含量,受试药物IV组还优于阳性药物组。结果见表1、2。
表1对非酒精性单纯性脂肪肝小鼠生化指标的影响(n=10,)
注:与模型对照组比较,*P<0.05,#P<0.01
表2对非酒精性单纯性脂肪肝小鼠生化指标的影响(n=10,)
注:与模型对照组比较,*P<0.05,#P<0.01
3.3对非酒精性单纯性脂肪肝小鼠肝组织病理学的影响
给药5周后,阳性药物组和受试药物IV组小鼠肝脏颜色接近正常肝脏的暗红色,而模型对照组小鼠的肝脏为乳白色。组织病理切片见附图1至附图8,实验结果显示,受试药物IV组的小鼠肝细胞脂肪病变程度减轻,肝细胞中几乎没有脂滴的沉积,肝细胞坏死程度降低。
4结论
本实验结果显示,受试药物IV组治疗5周,非酒精性单纯性脂肪肝小鼠血清和肝脏中TG、TC含量均明显降低,非酒精性单纯性脂肪肝小鼠的血清ALT、AST水平和肝脏MDA的量明显降低,SOD活性显著升高,肝细胞脂肪变性得到修复,小鼠肝脏组织形态接近正常状态。
研究表明,本发明药物(受试药物IV)对于非酒精性单纯性脂肪肝有非常优异的治疗效果。
实验二:本发明药物对小鼠慢性酒精性肝损伤模型的实验研究
本发明药物对于非酒精性单纯性脂肪肝有治疗作用,按照医药领域技术人员的常规逻辑推理,本发明药物对酒精性肝损伤也应该具有一定的治疗作用,基于此逻辑推理,发明人对此也进行了试探的实验研究。
1实验材料
1.1药物和试剂
1.1.1试剂:红星二锅头酒(清香型白酒,酒精度52%vol),500ml/瓶,北京红星股份有限公司。丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒,天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒,胆固醇(TC)试剂盒,由上海铭博生物科技有限公司制造。
1.1.2本发明药物:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得。
阳性药物:联苯双酯片,由华北制药河北华诺有限公司生产,批准文号:国药准字H13023912,规格:25mg,批号:20161115。用蒸馏水配制成浓度为0.50mg/mL的药液,4℃冷藏保存。
1.1.3阳性对照药:联苯双酯片,由华北制药河北华诺有限公司生产,批准文号:国药准字H13023912,规格:25mg。
1.2实验动物昆明种小鼠,SPF级,♂,体质量(22±3)g,购自河北医科大学实验动物中心,实验动物许可证号:SCXK(冀)2008-1-003。
1.3实验仪器全自动生化仪,由上海玉研科学仪器有限公司制造;低速大容量多管离心机,由上海沪粤明科学仪器有限公司制造;电子天平,由沈阳神宇龙腾天平有限公司制造;气流粉碎机,由昆山强威粉体设备有限公司制造;全自动干湿一体激光粒径检测仪,由丹东百特仪器有限公司制造;电子分析天平,由常州天之平仪器厂制造。
2.实验方法
2.1动物分组
雄性ICR小鼠,分为本发明药物、正常对照组、模型对照组、阳性对照组,每组10只,共4组。
2.2给药与造模
给药剂量均为50mg·kg-1,1次·d-1,灌胃容积均为2mL·10g-1体重。正常对照组和模型对照组给予水;本发明药物灌胃给予0.5g·mL-1的本发明药物。每次给药后2h,除正常对照组外,其余组按10mL·kg-1体重灌胃给予52°白酒,连续7周造成慢性酒精性肝损伤模型。
2.3指标测定末次灌胃给予酒精后禁食不禁水,12h后摘眼球取血,4000r·min-1离心20min,取血清备测ALT、AST、TC。
2.4统计学处理:实验数据以表示,组间差异采用t检验。
3.结果
实验结果见表3,结果显示,与正常对照组比较,模型对照组小鼠血清ALT、AST、TC明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型对照组比较,本发明药物不能降低血清ALT(P>0.05)、血清AST(P>0.05)和血清TC(P>0.05)。说明本发明药物对慢性酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST、TC没有明显的改善作用,对酒精性肝损伤小鼠的改善作用不明显。
表3对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响n=10
与正常组相比:△P<0.05;与模型组相比:*P<0.05
实验三:HPLC法同时测定本发明药物中京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的含量
前期研究表明,栀子中含有的京尼平苷、栀子酮苷,以及川楝子中含有的异槲皮苷、高北美圣草素是本发明药物治疗非酒精性单纯性脂肪肝的重要活性成分。本实验采用高效液相色谱法同时测定本发明药物中的京尼平苷、栀子酮苷,以及异槲皮苷和高北美圣草素的含量,实验研究如下。
1仪器与试药
1.1仪器
SHIMADZU高效液相色谱仪(SIL-20A自动进样器,SPD-M20A型光电二极管阵列检测器,CTO-10ASVP柱温箱,LC-20AT二元泵,DGU-20A5真空脱气机,日本岛津公司);万分之一分析天平(由厦门懿恒电子称重有限公司制造);SZ-93A自动双重纯水蒸馏器(由江苏省金坛市友联仪器研究所制造)。
1.2试药
对照品京尼平苷(批号111524-201506),由北京谱析科技有限公司生产;栀子酮苷(批号120312-201509)由北京谱析科技有限公司生产;异槲皮苷(批号110226-201508)由上海甄准生物科技有限公司生产;高北美圣草素(批号110322-201511)由上海甄准生物科技有限公司生产;乙腈为色谱纯(Fisher公司),水为重蒸水,磷酸为分析纯。
本发明药物,在本发明中成为“样品”,采用如下处方和制法来制备:
处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得。
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1混合对照品储备液的制备
精密称取对照品异槲皮苷3.0mg、高北美圣草素3.0mg、京尼平苷4.0mg、栀子酮苷4.0mg,置于25mL量瓶中,加乙腈定容至刻度,即得含有异槲皮苷0.12mg·mL-1、高北美圣草素0.12mg·mL-1、京尼平苷0.16mg·mL-1、栀子酮苷0.16mg·mL-1混合对照品储备液。
2.1.2供试品溶液的制备
取样品,研细,精密称取50mg,置25mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,0.22μm微孔滤膜滤过,即得。
2.1.3阴性样品溶液的制备
按处方比例分别称取除栀子、川楝子外其他药材适量,按本发明药物的制备工艺制得缺栀子的阴性样品及缺川楝子的阴性样品,照供试品溶液制备项下方法制备阴性样品溶液。
2.2色谱条件
色谱柱:Atlantis C18,规格:150mm×4.6mm,5μm;流动相:乙腈-0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,洗脱顺序为:从0至20min,乙腈从50%线性上升至70%,0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从50%线性下降至30%,从21至40min,乙腈从70%线性上升至80%,0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从30%线性下降至20%;流速:1.5mL·min-1;0至20min时,检测京尼平苷、栀子酮苷;检测波长为:236nm;21至40min时,检测异槲皮苷、高北美圣草素,检测波长为:268nm;柱温:32℃;进样量:10μL。
在上述色谱条件下,对照品、样品、阴性样品色谱图见附图9、附图10、附图11、附图12。京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的分离度均大于1.8,样品中其他成分对京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的测定无干扰。
2.3线性关系考察
依次精密吸取混合对照品溶液0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、8.0mL、16.0mL,分别置25mL量瓶中,加乙腈定容至刻度,配制成不同质量浓度的混合对照品溶液。按上述色谱条件进样测定,以对照品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,得4种成分的回归方程、相关系数及线性范围,见表4。
表4各成分回归方程与线性范围
2.4精密度试验
精密吸取混合对照品溶液10μL,按上述色谱条件连续进样6次,测定待测组分的峰面积,计算得京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素峰面积的RSD(n=6)分别为1.5%、0.9%、1.2%、1.1%。
2.5重复性试验
取同一批样品共6份,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,进样10μL,测定峰面积,计算样品中各待测成分含量及其RSD。结果样品中京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的平均含量(n=6)分别为3.21mg·g-1、2.25mg·g-1、0.55mg·g-1、1.35mg·g-1,RSD分别为1.2%、1.1%、0.9%、0.8%。
2.6稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液,在25℃条件下分别于0、1、2、4、6、8、12、24h进样测定各待测成分峰面积,计算RSD。结果京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素峰面积的RSD(n=6)分别为1.1%、0.6%、1.4%、1.6%。表明供试品溶液24h内稳定。
2.7回收率考察
取已知含量的样品6份,取内容物适量,研细,精密称定,置25mL量瓶中,分别精密加入低、中、高3种不同浓度的混合对照品溶液,按“2.1.2”项下方法制备供试溶液,按“2.2”项色谱条件进样测定,得到各待测成分平均回收率和RSD,结果见表5。
表5回收率试验
2.8样品测定
取5个批号的本发明药物,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,注入液相色谱仪,在“2.2”项条件下进样测定4种待测成分的峰面积,将峰面积值代入回归方程,计算样品待测组分含量,结果见表6。
表6不同批次本发明药物中4个成分含量测定结果(mg·g-1,n=5)
3结论
本实验所建立的HPLC法同时测定本发明药物中京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素4种成分,测定方法简便、可行,可用于本发明药物活性成分的含量检测。
实验四:采用高效液相色谱法测定不同制备方法下制备的受试药物中活性成分含量的比较实验
1不同制备方法下制备的受试药物
1.1受试药物I:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,即得受试药物I。
1.2受试药物II:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:将处方量的柯子、川楝子、栀子,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇,得浸膏,浓缩,干燥,即得受试药物II。
1.3受试药物III:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:将处方量的柯子、川楝子、栀子,加10倍量的水回流提取2次,每次提取2小时,合并水提取液,滤过,滤液浓缩,干燥,即得受试药物III。
1.4受试药物IV:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得受试药物IV。
1.5受试药物V:三子散,处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:以上三味,粉碎成粗粉,过筛,混匀,即得。由阜新蒙药有限责任公司生产,批准文号:国药准字Z21020301,规格:每袋装18g,批号:20151223。购于秦皇岛市天贺药店。
2测定
采用本发明实验三提供的HPLC法同时测定药物中京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素含量的方法进行测定。
3测定结果
测定结果见表7。
表7不同制备方法下制备的受试药物中活性成分含量(mg·g-1,n=2)
4.结论
由上表实验结果可见,采用本发明提供的制备方法制备得到的受试药物IV,其含有的京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的含量明显高于其他制备方法下制备所得的药物,这也可能是受试药物IV(本发明药物)在治疗非酒精性单纯性脂肪肝的疗效优于其他药物的原因。
实验五:气相色谱法测定本发明药物中4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯与2-乙基-2-己烯醛的含量
前期研究表明,川楝子中含有的4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、以及栀子中含有的2-乙基-2-己烯醛是本发明药物治疗非酒精性单纯性脂肪肝的重要活性成分。本实验采用气相色谱法测定本发明药物中的4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯和2-乙基-2-己烯醛的含量,实验研究如下。
1仪器与试药
Agilent 6890气相色谱仪,检测器为FID,载气为氮气,LM-ID氢气发生器,AG-I静音无油空气发生器。4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯对照品,购于上海子起生物科技有限公司,批号为101230-201509;2-乙基-2-己烯醛对照品,购于北京更新生物科技有限公司,批号为111023-201512;水杨酸甲酯对照品,购于深圳菲斯生物科技有限公司,批号为110622-201511。乙酸乙酯、丙酮均为分析纯,均由无锡市展望化工试剂有限公司提供。
本发明药物:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得。
2方法与结果
2.1色谱条件
SUPELCO的WAX-10石英毛细管色谱柱,规格:30m×0.32mm,0.5μm,进样口温度220℃,进样量1μL,分流比为7:3,柱温170℃,载气流速4.5mL·min-1,检测器温度270℃,尾吹气流量45.0mL·min-1,FID氢气流量40mL·min-1,空气流量350mL·min-1。
2.2内标溶液的制备
取水杨酸甲酯对照品25mg,置25mL量瓶中,加比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,制成每1mL含水杨酸甲酯1mg的溶液,摇匀,作为内标溶液。
2.3混合对照品溶液的制备
取4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯对照品20mg、2-乙基-2-己烯醛对照品25mg,置25mL量瓶中,加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,再从中精密吸取5mL,置25mL量瓶中,再加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液。
2.4供试品溶液制备
取待测样品1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入内标溶液20mL,称定重量,超声处理40min,超声功率300W,超声频率40kHz,放冷,再称定重量,用比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过;精密吸取续滤液5mL,置10mL量瓶中,精密加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,即得供试品溶液。
2.5阴性对照品溶液的制备
取缺2-乙基-2-己烯醛和4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯的阴性供试品1g,制成阴性对照品溶液,气相色谱检测,见附图13、附图14、附图15、附图16、附图17。
2.6线性关系考察
分别吸取4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛对照品溶液,精密加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液2mL,加比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液定容至10mL,摇匀,配制成不同浓度的对照品溶液。吸取上述溶液各1μL,注入气相色谱仪,以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程分别如下:
4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯:Y=6.2648X-0.0236(r=0.999)
2-乙基-2-己烯醛:Y=8.2684X-0.0168(r=0.998);
结果表明两种成分分别在0.023~0.469mg·mL-1和0.052~0.759mg·mL-1范围内线性关系良好。
2.7稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液,分别在0,2,4,6,10h各进样1次,每次进样1μL,按照2.1项下的色谱条件测定。结果4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛峰面积的RSD分别为0.5%和0.9%,表明供试品溶液在10h内基本稳定。
2.8精密度试验
取同一对照品溶液,连续进样6次,每次进样1μL,按照2.1项下的色谱条件测定。结果4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛峰面积的RSD分别为1.6%和1.8%(n=6),表明仪器的精密度良好。
2.9重现性试验
取同一批样品,按照2.4项下的制备方法制备供试品溶液共6份,依2.1项下的色谱条件测定,每次进样1μL。结果4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛含量的RSD分别为1.2%和1.7%,表明方法重现性良好。
2.10加样回收率试验
称取同一批号的样品共6份,置具塞锥形瓶中,分别精密加入4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛混合对照品溶液(其中:4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯9.125mg·mL-1,2-乙基-2-己烯醛16.250mg·mL-1)0.5mL,再加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液20mL,超声处理30min(功率300W,频率40kHz),放冷,再称定重量,用比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过;精密吸取续滤液5mL,置10mL量瓶中,加入内标溶液2mL,加比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,即得。吸取上述加样回收样品溶液各1μL,按2.1项下的色谱条件测定含量,计算回收率,结果见表8和表9。
表8 4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯回收试验结果
表9 2-乙基-2-己烯醛回收试验结果
2.11样品含量测定
按2.4项下的方法分别制得10批供试品溶液,按照2.1项下的色谱条件,测定,计算含量,结果见表10。
表10 10批样品含量(mg·g-1)
3结论
本发明药物每克含2-乙基-2-己烯醛不低于1.2mg,含4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯不低于1.8mg。
实验六:采用气相色谱法测定不同制备方法下制备的受试药物中活性成分含量的比较实验
1不同制备方法下制备的受试药物
1.1受试药物I:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,即得受试药物I。
1.2受试药物II:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:将处方量的柯子、川楝子、栀子,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇,得浸膏,浓缩,干燥,即得受试药物II。
1.3受试药物III:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:将处方量的柯子、川楝子、栀子,加10倍量的水回流提取2次,每次提取2小时,合并水提取液,滤过,滤液浓缩,干燥,即得受试药物III。
1.4受试药物IV:处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得受试药物IV。
1.5受试药物V:三子散,处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:以上三味,粉碎成粗粉,过筛,混匀,即得。由阜新蒙药有限责任公司生产,批准文号:国药准字Z21020301,规格:每袋装18g,批号:20151223。购于秦皇岛市天贺药店。
2测定
采用本发明实验五提供的气相色谱法同时测定药物中京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素含量的方法进行测定。
3测定结果
测定结果见表11。
表11不同制备方法下制备的受试药物中活性成分含量(mg·g-1,n=2)
4.结论
由上表实验结果可见,采用本发明提供的制备方法制备得到的受试药物IV,其含有的2-乙基-2-己烯醛、4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯的含量明显高于其他制备方法下制备所得的药物,这也可能是受试药物IV(本发明药物)在治疗非酒精性单纯性脂肪肝的疗效优于其他药物的原因。
附图说明:
图1为正常对照组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)
图2为模型对照组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)
图3为阳性对照组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)
图4为受试药物I组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)
图5为受试药物II组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)
图6为受试药物III组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)
图7为受试药物IV组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)
图8为受试药物V组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)
图9为对照品的高效液相色谱图,其中:1号峰为京尼平苷;2号峰为栀子酮苷;3号峰为异槲皮苷;4号峰为高北美圣草素。
图10为样品的高效液相色谱图,其中:1号峰为京尼平苷;2号峰为栀子酮苷;3号峰为异槲皮苷;4号峰为高北美圣草素。
图11为缺川楝子阴性样品的高效液相色谱图,其中:1号峰为京尼平苷;2号峰为栀子酮苷;
图12为缺栀子阴性样品的高效液相色谱图,其中:3号峰为异槲皮苷;4号峰为高北美圣草素。
图13为4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯的气相色谱图
图14为2-乙基-2-己烯醛的气相色谱图
图15为水杨酸甲酯的气相色谱图
图16为的阴性对照品的气相色谱图
图17为的供试品的气相色谱图
具体实施方式:
实施例1:
处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
检测方法:
采用高效液相色谱法同时测定药物中京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:色谱柱:Atlantis C18,规格:150mm×4.6mm,5μm;流动相:乙腈-0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,洗脱顺序为:从0至20min,乙腈从50%线性上升至70%,0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从50%线性下降至30%,从21至40min,乙腈从70%线性上升至80%,0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从30%线性下降至20%;流速:1.5mL·min-1;0至20min时,检测京尼平苷、栀子酮苷;检测波长为:236nm;21至40min时,检测异槲皮苷、高北美圣草素,检测波长为:268nm;柱温:32℃;进样量:10μL;
(2)混合对照品储备液的制备:精密称取对照品异槲皮苷3.0mg、高北美圣草素3.0mg、京尼平苷4.0mg、栀子酮苷4.0mg,置于25mL量瓶中,加乙腈定容至刻度,即得含有异槲皮苷0.12mg·mL-1、高北美圣草素0.12mg·mL-1、京尼平苷0.16mg·mL-1、栀子酮苷0.16mg·mL-1混合对照品储备液;
(3)供试品溶液的制备:取样品,研细,精密称取50mg,置25mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
(4)测定:精密吸取混合对照品储备液、供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,进行测定;
(5)测定结果:药物样品中京尼平苷含量为2.14mg·g-1、栀子酮苷含量为2.21mg·g-1、异槲皮苷含量为0.62mg·g-1、高北美圣草素含量为1.24mg·g-1。
采用气相色谱法同时测定4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:SUPELCO的WAX-10石英毛细管色谱柱,规格:30m×0.32mm,0.5μm,进样口温度220℃,进样量1μL,分流比为7:3,柱温170℃,载气流速4.5mL·min-1,检测器温度270℃,尾吹气流量45.0mL·min-1,FID氢气流量40mL·min-1,空气流量350mL·min-1;
(2)内标溶液的制备:取水杨酸甲酯对照品25mg,置25mL量瓶中,加比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,制成每1mL含水杨酸甲酯1mg的溶液,摇匀,作为内标溶液;
(3)混合对照品溶液的制备:取4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯对照品20mg、2-乙基-2-己烯醛对照品25mg,置25mL量瓶中,加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,再从中精密吸取5mL,置25mL量瓶中,再加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液;
(4)供试品溶液制备:取待测样品1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入内标溶液20mL,称定重量,超声处理40min,超声功率300W,超声频率40kHz,放冷,再称定重量,用比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过;精密吸取续滤液5mL,置10mL量瓶中,精密加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,即得供试品溶液;
(5)测定:精密吸取内标溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各1μL,注入气相色谱仪,进行测定;
(6)测定结果:药物样品中4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯含量为1.29mg·g-1、2-乙基-2-己烯醛含量为1.82mg·g-1。
实施例2:
处方:柯子200g,川楝子200g,栀子200g;
制备方法:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,加入适量的淀粉、糊精,混匀,制粒,装入硬胶囊,制成硬胶囊剂1200粒。
实施例3:本发明药物胶囊治疗非酒精性单纯性脂肪肝临床试验研究
应用本发明药物治疗非酒精性单纯性脂肪肝共14例,因技术法规的限制,本发明药物还不可以做大规模的临床试验研究,仅以14例的小样本做了初步的临床试验研究。14例患者均签署了《知情同意书》,自愿接受临床试验。
1资料与方法
1.1一般资料选择2017年3月~2017年5月本院收治的非酒精性单纯性脂肪肝患者14例。
纳入标准:(1)符合中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组编制的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》的诊断标准;(2)年龄35~45岁;(3)血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)升高,ALT升高超过正常上限2.5倍以上,持续5周以及5周以上。
排除标准:(1)有饮酒史或饮酒折合乙醇量男性>150g/w、女性>75g/w;(2)酒精性脂肪肝患者;(3)妊娠及哺乳期妇女;(4)合并病毒性、药物性肝炎、肝硬化、肝脏肿瘤者;(5)合并其他脑、肾、心等严重疾病或精神疾病者。
入选患者随机分为观察组7例和对照组7例,分别如下:
观察组,男4例,女3例,年龄36~44岁,平均38.2±2.6,病程1.5年~4.2年,平均3.2±0.9年;
对照组,男3例,女4例,年龄36~43岁,平均37.8±2.4,病程1.6年~4.0年,平均3.1±0.8年。
两组患者一般情况无显著性差异(P>0.05)。
1.2方法
1.2.1治疗方法
对所有患者进行健康教育、饮食及运动干预等常规治疗。
对照组:采用当飞利肝宁胶囊进行治疗,当飞利肝宁胶囊由四川美大康药业股份有限公司生产,批准文号:国药准字Z51020085,规格为:每粒装0.25g。口服,一次4粒,一日3次,疗程12周。
观察者:按照对照组的用药剂量,在采用当飞利肝宁胶囊的基础上,再加用本发明药物胶囊治疗,采用说明书实施例2的处方和制备方法来制备。口服,一次4粒,一日3次,疗程12周。
1.2.2观察指标观察两组患者治疗后临床症状、肝功能(ALT、AST)、血脂(TG、TC、HDL-C、LDL-C)改善情况;治疗前后行B超检查脂肪肝变化情况。
1.2.3疗效评价
痊愈:临床症状消失,血脂、肝功能、B超检查正常;
显效:临床症状明显改善,血脂正常或TG或TC下降≥20%,肝功能正常或ALT或AST下降≥40%,B超示回声衰减明显减轻;
有效:临床症状好转,血脂TG或TC下降≥15%,肝功能ALT或AST下降≥25%,B超示回声衰减略减轻;
无效:症状及各项指标无明显改善或加重。
1.3统计学分析
采用SPSS12.0软件,计数资料采用χ2检验;计量资料采用均数±标准差表示,进行t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1两组患者治疗前后血脂、肝功能比较
两组患者治疗前血脂、肝功能指标无显著差异(P>0.05),治疗后观察组的TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平均显著降低(P<0.05),HDL-C显著升高(P<0.05),对照组的TG、LDL-C、ALT、AST水平降低(P<0.05),HDL-C没有显著升高(P>0.05)。
两组间比较,观察组上述指标较对照组改善明显(P<0.05)。见表12、表13。
表12两组患者治疗前后血脂比较
注:与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05;
表13两组患者治疗前后血脂比较
注:与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05;
2.2两组患者疗效比较
治疗后,观察组有效率达100%,显著高于对照组的71.42%,两组疗效比较有显著性差异(P<0.05)。见表14。
表14两组临床疗效比较[n(%)]
注:与对照组比较,*P<0.05。
4结论
本研究显示,本发明药物胶囊能显著改善非酒精性单纯性脂肪肝患者临床症状,降低TG、TC、LDL-C水平,升高HDL-C水平,改善血脂代谢;同时,其能显著降低ALT、AST,保护肝功能,与对照组相比疗效显著。因此,本发明药物治疗非酒精性单纯性脂肪肝疗效确切。
Claims (7)
1.一种治疗非酒精性单纯性脂肪肝的药物,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,其特征在于,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内35~45℃烘干3~5h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1800~2000kPa,进料速度为230~250r·min-1,分级频率为30~40Hz,粉碎时间为20~30min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取6~10 h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加5~7倍量的70%~80%乙醇回流提取1~3次,每次提取1~3小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加6~10倍量60%~70%的丙酮,于65~75℃水浴回流提取1~3次,每次提取80~100min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:7~9,上样体积8~10BV,用pH 2~4的盐酸水溶液10~14BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用20%~40%的丙酮水溶液8~12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯8~12BV进行洗脱,流速为2~4BV·h-1,收集洗脱液,然后在70~80℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得。
2.根据权利要求1所述的药物,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,其特征在于,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8 h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得。
3.一种治疗非酒精性单纯性脂肪肝的药物的检测方法,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内35~45℃烘干3~5h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1800~2000kPa,进料速度为230~250r·min-1,分级频率为30~40Hz,粉碎时间为20~30min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取6~10 h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加5~7倍量的70%~80%乙醇回流提取1~3次,每次提取1~3小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加6~10倍量60%~70%的丙酮,于65~75℃水浴回流提取1~3次,每次提取80~100min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:7~9,上样体积8~10BV,用pH 2~4的盐酸水溶液10~14BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用20%~40%的丙酮水溶液8~12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯8~12BV进行洗脱,流速为2~4BV·h-1,收集洗脱液,然后在70~80℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
其特征在于,采用高效液相色谱法同时测定京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:色谱柱:Atlantis C18;流动相:乙腈-0.10 moL·L-1~0.20 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,洗脱顺序为:从0至20min,乙腈从50%线性上升至70%,0.10moL·L-1~0.20 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从50%线性下降至30%,从21至40min,乙腈从70%线性上升至80%,0.10 moL·L-1~0.20 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从30%线性下降至20%;流速:1.0~2.0mL·min-1;0至20min时,检测京尼平苷、栀子酮苷;检测波长为:230~240nm;21至40min时,检测异槲皮苷、高北美圣草素,检测波长为:265~275nm;柱温:30~35℃;进样量:5~20μL;
(2)混合对照品储备液的制备:精密称取对照品异槲皮苷2.0~4.0mg、高北美圣草素2.0~4.0mg、京尼平苷3.0~5.0mg、栀子酮苷3.0~5.0mg,置于25~50mL量瓶中,加乙腈定容至刻度,即得含有异槲皮苷0.10~0.20mg·mL-1、高北美圣草素0.10~0.20mg·mL-1、京尼平苷0.10~0.20mg·mL-1、栀子酮苷0.10~0.20mg·mL-1混合对照品储备液;
(3)供试品溶液的制备:取样品,研细,精密称取40~60mg,置25~50mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
(4)测定:精密吸取混合对照品储备液、供试品溶液各5~20μL,注入高效液相色谱仪,进行测定。
4.根据权利要求3所述的药物的检测方法,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8 h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
其特征在于,采用高效液相色谱法同时测定京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:色谱柱:Atlantis C18,规格:150mm×4.6mm,5μm;流动相:乙腈-0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,洗脱顺序为:从0至20min,乙腈从50%线性上升至70%,0.15 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从50%线性下降至30%,从21至40min,乙腈从70%线性上升至80%,0.15 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从30%线性下降至20%;流速:1.5mL·min-1;0至20min时,检测京尼平苷、栀子酮苷;检测波长为:236nm;21至40min时,检测异槲皮苷、高北美圣草素,检测波长为:268nm;柱温:32℃;进样量:10μL;
(2)混合对照品储备液的制备:精密称取对照品异槲皮苷3.0mg、高北美圣草素3.0mg、京尼平苷4.0mg、栀子酮苷4.0mg,置于25mL量瓶中,加乙腈定容至刻度,即得含有异槲皮苷0.12mg·mL-1、高北美圣草素0.12mg·mL-1、京尼平苷0.16mg·mL-1、栀子酮苷0.16mg·mL-1混合对照品储备液;
(3)供试品溶液的制备:取样品,研细,精密称取50mg,置25mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
(4)测定:精密吸取混合对照品储备液、供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,进行测定。
5.一种治疗非酒精性单纯性脂肪肝的药物的检测方法,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内35~45℃烘干3~5h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1800~2000kPa,进料速度为230~250r·min-1,分级频率为30~40Hz,粉碎时间为20~30min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取6~10 h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加5~7倍量的70%~80%乙醇回流提取1~3次,每次提取1~3小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加6~10倍量60%~70%的丙酮,于65~75℃水浴回流提取1~3次,每次提取80~100min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:7~9,上样体积8~10BV,用pH 2~4的盐酸水溶液10~14BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用20%~40%的丙酮水溶液8~12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯8~12BV进行洗脱,流速为2~4BV·h-1,收集洗脱液,然后在70~80℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
其特征在于,采用气相色谱法同时测定4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:SUPELCO的WAX-10石英毛细管色谱柱,进样口温度210~230℃,进样量1~5μL,分流比为6~8:2~4,柱温160~180℃,载气流速4.0~5.0mL·min-1,检测器温度260~280℃,尾吹气流量40.0~50.0mL·min-1,FID氢气流量35~45mL·min-1,空气流量330~370 mL·min-1;
(2)内标溶液的制备:取水杨酸甲酯对照品20~30mg,置25~50mL量瓶中,加比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,制成每1mL含水杨酸甲酯0.5~2.0mg的溶液,摇匀,作为内标溶液;
(3)混合对照品溶液的制备:取4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯对照品10~30mg、2-乙基-2-己烯醛对照品20~30mg,置25~50mL量瓶中,加入比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,再从中精密吸取5~10mL,置25~50mL量瓶中,再加入比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液;
(4)供试品溶液制备:取待测样品1~2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入内标溶液20~40mL,称定重量,超声处理35~45min,超声功率280~320W,超声频率35~45kHz,放冷,再称定重量,用比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过;精密吸取续滤液5~10mL,置10~25mL量瓶中,精密加入比例为80~90:10~20的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,即得供试品溶液;
(5)测定:精密吸取内标溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各1~2μL,注入气相色谱仪,进行测定。
6.根据权利要求5所述的药物的检测方法,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8 h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
其特征在于,采用气相色谱法同时测定4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:SUPELCO的WAX-10石英毛细管色谱柱,规格:30m×0.32mm,0.5μm,进样口温度220℃,进样量1μL,分流比为7:3,柱温170℃,载气流速4.5mL·min-1,检测器温度270℃,尾吹气流量45.0mL·min-1,FID氢气流量40mL·min-1,空气流量350 mL·min-1;
(2)内标溶液的制备:取水杨酸甲酯对照品25mg,置25mL量瓶中,加比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,制成每1mL含水杨酸甲酯1mg的溶液,摇匀,作为内标溶液;
(3)混合对照品溶液的制备:取4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯对照品20mg、2-乙基-2-己烯醛对照品25mg,置25mL量瓶中,加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,再从中精密吸取5mL,置25mL量瓶中,再加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液;
(4)供试品溶液制备:取待测样品1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入内标溶液20mL,称定重量,超声处理40min,超声功率300W,超声频率40kHz,放冷,再称定重量,用比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过;精密吸取续滤液5mL,置10mL量瓶中,精密加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,即得供试品溶液;
(5)测定:精密吸取内标溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各1μL,注入气相色谱仪,进行测定。
7.一种药物组合物在制备治疗非酒精性单纯性脂肪肝药物中的应用,其特征在于,该药物是由以下重量份的药味原料制成:柯子1重量份,川楝子1重量份,栀子1重量份,该药物采用如下方法制备:
(1)将处方量的柯子、川楝子、栀子置烘箱内40℃烘干4h后,取干燥的柯子、川楝子、栀子,采用气流粉碎机进行超微粉碎,气流粉碎机的气流压力为1900kPa,进料速度为240r·min-1,分级频率为35Hz,粉碎时间为25min,得混合超微粉;
(2)取步骤(1)所得的柯子、川楝子、栀子的混合超微粉,将其进行水蒸气蒸馏提取8 h,从中提取得到挥发油A,备用;水蒸气蒸馏提取后的水溶液过滤,滤液加热浓缩,得浸膏B,备用;保留水蒸气蒸馏提取后的药渣,备用;
(3)取步骤(2)所得的水蒸气蒸馏提取后的药渣,加6倍量的75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时,合并乙醇提取液,滤过,滤液回收乙醇并浓缩,得浸膏C,备用;保留乙醇提取后的药渣,备用;
(4)取步骤(3)所得乙醇提取后的药渣,加8倍量65%的丙酮,于70℃水浴回流提取2次,每次提取90min,合并提取液,回收丙酮,得到浸膏D;
(5)取步骤(2)所得浸膏B、步骤(3)所得浸膏C、步骤(4)所得浸膏D,混合,得混合浸膏,进行柱层析分离,选用H-20型大孔吸附树脂树脂,柱径高比为1:8,上样体积9BV,用pH 3的盐酸水溶液12BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用30%的丙酮水溶液10BV进行洗脱,弃去洗脱液,再用乙酸乙酯10BV进行洗脱,流速为3BV·h-1,收集洗脱液,然后在75℃下蒸馏,除去乙酸乙酯,浓缩,得到浸膏E;
(6)将步骤(2)所得挥发油A加入到步骤(5)所得浸膏E中,混匀,冷冻干燥,即得;
采用高效液相色谱法同时测定京尼平苷、栀子酮苷、异槲皮苷、高北美圣草素的含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:色谱柱:Atlantis C18,规格:150mm×4.6mm,5μm;流动相:乙腈-0.15moL·L-1磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,洗脱顺序为:从0至20min,乙腈从50%线性上升至70%,0.15 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从50%线性下降至30%,从21至40min,乙腈从70%线性上升至80%,0.15 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液从30%线性下降至20%;流速:1.5mL·min-1;0至20min时,检测京尼平苷、栀子酮苷;检测波长为:236nm;21至40min时,检测异槲皮苷、高北美圣草素,检测波长为:268nm;柱温:32℃;进样量:10μL;
(2)混合对照品储备液的制备:精密称取对照品异槲皮苷3.0mg、高北美圣草素3.0mg、京尼平苷4.0mg、栀子酮苷4.0mg,置于25mL量瓶中,加乙腈定容至刻度,即得含有异槲皮苷0.12mg·mL-1、高北美圣草素0.12mg·mL-1、京尼平苷0.16mg·mL-1、栀子酮苷0.16mg·mL-1混合对照品储备液;
(3)供试品溶液的制备:取样品,研细,精密称取50mg,置25mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,0.22μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液;
(4)测定:精密吸取混合对照品储备液、供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,进行测定;
采用气相色谱法同时测定4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯、2-乙基-2-己烯醛含量,测定方法如下:
(1)色谱条件:SUPELCO的WAX-10石英毛细管色谱柱,规格:30m×0.32mm,0.5μm,进样口温度220℃,进样量1μL,分流比为7:3,柱温170℃,载气流速4.5mL·min-1,检测器温度270℃,尾吹气流量45.0mL·min-1,FID氢气流量40mL·min-1,空气流量350 mL·min-1;
(2)内标溶液的制备:取水杨酸甲酯对照品25mg,置25mL量瓶中,加比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,制成每1mL含水杨酸甲酯1mg的溶液,摇匀,作为内标溶液;
(3)混合对照品溶液的制备:取4-(4-乙基环己基)-1-戊烷基环己烯对照品20mg、2-乙基-2-己烯醛对照品25mg,置25mL量瓶中,加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,再从中精密吸取5mL,置25mL量瓶中,再加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液;
(4)供试品溶液制备:取待测样品1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入内标溶液20mL,称定重量,超声处理40min,超声功率300W,超声频率40kHz,放冷,再称定重量,用比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液补足减失的重量,摇匀,滤过;精密吸取续滤液5mL,置10mL量瓶中,精密加入比例为85:15的乙酸乙酯-丙酮混合溶液至刻度,摇匀,即得供试品溶液;
(5)测定:精密吸取内标溶液、混合对照品溶液、供试品溶液各1μL,注入气相色谱仪,进行测定。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711217187.0A CN107714802B (zh) | 2017-11-28 | 2017-11-28 | 一种治疗非酒精性脂肪肝的药物及其制法与检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711217187.0A CN107714802B (zh) | 2017-11-28 | 2017-11-28 | 一种治疗非酒精性脂肪肝的药物及其制法与检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107714802A CN107714802A (zh) | 2018-02-23 |
CN107714802B true CN107714802B (zh) | 2018-07-03 |
Family
ID=61219979
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201711217187.0A Active CN107714802B (zh) | 2017-11-28 | 2017-11-28 | 一种治疗非酒精性脂肪肝的药物及其制法与检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107714802B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108576313A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-28 | 河南牧业经济学院 | 一种辅助预防非酒精性脂肪肝的保健茶及制法与检测方法 |
CN109806205B (zh) * | 2019-01-07 | 2022-07-01 | 惠州绵俪生物科技有限公司 | 一种西青果提取物及其抗菌用途 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102429975A (zh) * | 2011-11-30 | 2012-05-02 | 河南牧翔动物药业有限公司 | 一种三子丹口服液及其制备方法 |
CN104013710B (zh) * | 2013-03-01 | 2019-11-08 | 中国中医科学院中药研究所 | 一种栀柏组合物及其检测方法 |
CN103550342A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-02-05 | 内蒙古大学 | 一种蒙成药加工新方法 |
CN105770144B (zh) * | 2016-05-09 | 2017-03-01 | 黑龙江中桂制药有限公司 | 复方鱼腥草糖浆的检测方法 |
-
2017
- 2017-11-28 CN CN201711217187.0A patent/CN107714802B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107714802A (zh) | 2018-02-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103257188A (zh) | 一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法 | |
CN103933203A (zh) | 一种用于治疗再生障碍性贫血的复方生血胶囊及其制备方法 | |
CN101904893B (zh) | 当归补血胶囊的制备方法 | |
CN101721488A (zh) | 一种治疗肝病的药物组合物及其制备方法 | |
CN107714802B (zh) | 一种治疗非酒精性脂肪肝的药物及其制法与检测方法 | |
Bilal et al. | Effects of Nigella sativa oil on some blood parameters in type 2 diabetes mellitus patients | |
CN108143825A (zh) | 一种治疗银屑病的药物及其制备方法与检测方法 | |
Wang et al. | Study on the changes of chemical constituents in different compatibilities of ginseng-prepared rehmannia root and their effects on bone marrow inhibition after chemotherapy | |
CN107551089B (zh) | 一种治疗高脂血症的药物及其制备方法与检测方法 | |
CN1436549A (zh) | 一种中药复方三七滴丸及其制备方法 | |
CN102526656A (zh) | 一种预防或/和治疗红细胞增多症的药物或保健食品组合物 | |
CN103156997B (zh) | 一种治疗慢性肝病的中药有效部位组合物及其制备方法和应用 | |
CN105012413B (zh) | 一种具有降血脂作用的中药组合物及其制备方法与应用 | |
Fu et al. | Safety Evaluation of a New Traditional Chinese Medical Formula, Ciji‐Hua’ai‐Baosheng II Formula, in Adult Rodent Models | |
CN109381505A (zh) | 一种中药提取物及其组合物和用于抗疲劳的用途 | |
CN107029074A (zh) | 一种治疗脂肪肝的药物组合物及制备方法与用途 | |
RU2320359C2 (ru) | Декокт yian для прекращения наркотической зависимости | |
CN108159297B (zh) | 一种疏风解毒胶囊及其制备方法与制药用途 | |
CN102430001B (zh) | 防治糖尿病的复方蔷薇果黄酮制剂及其制备方法 | |
CN107233511B (zh) | 一种疏风解毒胶囊及其制备方法与检测方法及用途 | |
CN107389818B (zh) | 一种治疗帕金森的药物及其制备方法与检测方法及用途 | |
CN110151806A (zh) | 一种熟三七及其制备方法和补血用途 | |
Zhang et al. | Network Pharmacology‐Based Strategy Reveals the Effects of Hedysarum multijugum Maxim.‐Radix Salviae Compound on Oxidative Capacity and Cardiomyocyte Apoptosis in Rats with Diabetic Cardiomyopathy | |
CN108066494A (zh) | 一种夜尿频作用药液及其制备方法 | |
CN101264158B (zh) | 中药组方在制备治疗代谢综合症药物方面的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |