CN115708538B - 一种改性大豆分离蛋白的制备方法及改性大豆分离蛋白 - Google Patents

Abstract

本申请涉及微生物发酵的技术领域，具体公开了一种改性大豆分离蛋白的制备方法及改性大豆分离蛋白。该制备方法具体包括如下步骤：利用植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌在大豆分离蛋白培养基中复合发酵，制得改性大豆分离蛋白；所述大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度为0.04‑0.06g/mL。本申请还提供了利用上述制备方法制备的改性大豆分离蛋白以及该改性大豆分离蛋白的应用。本申请提供的制备方法能够改善大豆分离蛋白的功能特性，利用本申请提供的制备方法制备的改性大豆分离蛋白具有更好的溶解性、乳化性和起泡性。

Description

一种改性大豆分离蛋白的制备方法及改性大豆分离蛋白

技术领域

本申请涉及微生物发酵的技术领域，更具体地说，涉及一种改性大豆分离蛋白的制备方法及改性大豆分离蛋白。

背景技术

大豆分离蛋白（SPI）是大豆蛋白中的主要组分，是利用碱溶酸沉的原理从低温脱脂豆粕中提取出来的，其蛋白质含量一般高于90%。根据沉降系数的不同，大豆分离蛋白可分为2S、7S、11S、15S 四种组分，其中β-伴大豆球蛋白（7S组分）和大豆球蛋白（11S组分）为主要成分。β-伴大豆球蛋白（分子量约为180~210kDa）是由α、α'和β三种亚基以不同的组合通过疏水作用堆积形成的糖基化蛋白质，其中α和α'亚基由核心区域和外围区域参与构成，而β亚基只由核心区域构成。大豆球蛋白（分子量约为300~380kDa）是由五种AB亚基对组成的异构六聚体蛋白，由酸性亚基A（分子量约为35kDa）和碱性亚基B（分子量约为20kDa）构成，其中酸性亚基有六种，分别为A1、A2、A3、A4、A5、A6，碱性亚基B（分离后带羟基）有四种，分别为B1、B2、B3、B4。每种酸性亚基和碱性亚基之间通过二硫键相互交联形成较为稳定的结构。

大豆分离蛋白因具有良好的功能特性、高营养价值以及低廉的价格等优点而被作为食品添加剂广泛应用于食品加工生产中。大豆分离蛋白功能特性主要分为三大类：

（1）蛋白质水合特性，如溶解性、表观粘性、溶胀性等；

（2）蛋白质分子间的相互作用，主要包括蛋白质的沉淀作用、凝胶性、聚集作用等；

（3）蛋白质的界面学性质，如乳化性、吸油性、起泡性等。

在大豆分离蛋白的功能特性中，溶解性、乳化性和起泡性与利用大豆分离蛋白制得的食品的品质密切相关。

发明内容

为了进一步改善大豆分离蛋白的溶解性、乳化性和起泡性，本申请提供一种改性大豆分离蛋白的制备方法及改性大豆分离蛋白。

第一方面，本申请提供一种改性大豆分离蛋白的制备方法，采用如下的技术方案：

一种改性大豆分离蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：利用植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌在大豆分离蛋白培养基中复合发酵，制得改性大豆分离蛋白；所述大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度为0.04-0.06g/mL。

利用本申请提供的制备方法改性大豆分离蛋白，能够有效提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解性、乳化性和起泡性。

大豆分离蛋白的溶解性是评价大豆分离蛋白可应用性的重要指标之一。较好的溶解性可以促使蛋白质分子在体系中和界面间的分散，因而溶解性直接影响着蛋白质的其他功能特性，例如乳化性、凝胶性、起泡性等。乳化性是大豆分离蛋白主要功能特性之一。大豆分离蛋白同时具有亲水基团和亲油基团，既可以降低水和油的表面张力，又可以降低水和空气的表面张力，从而形成稳定的W/O或者O/W型乳液。起泡性是指蛋白溶液经过快速剪切作用形成泡沫的过程。大豆分离蛋白的起泡性能够使食品更加疏松且具有良好的口感，被广泛应用于糕点加工上。大豆分离蛋白聚集状态和结构的改变、溶液的浓度、体系pH、温度、离子强度等都会显著影响起泡性能。

经过试验分析，本申请从六种菌种中选择了三种菌种进行复合发酵改性处理大豆分离蛋白。与利用其中任意一种菌种发酵改性处理大豆分离蛋白相比，使用物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌复合发酵，能够有效提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、乳化性和起泡性。此外，在发酵菌种由单一菌种转变为复合菌种的基础上，本申请还对大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度进行了筛选。与传统的大豆分离培养基中大豆分离蛋白的浓度为0.2g/mL相比，本申请将大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度控制在0.4-0.6g/mL的范围内，能够进一步提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、乳化性和起泡性。

在一个具体的实施方案中，所述大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度可以是0.4g/mL、0.5g/mL、0.6g/mL。

在一些具体的实施方案中，所述大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度可以是0.4-0.5g/mL、0.5-0.6g/mL。

优选地，所述植物乳杆菌的接种量为（0.5-1.2）×10⁷CFU/mL；所述鼠李糖乳杆菌的接种量为（1-1.5）×10⁷CFU/mL；所述罗伊氏乳杆菌的接种量为（0.3-0.8）×10⁷CFU/mL。

在一个具体的实施方案中，所述植物乳杆菌的接种量可以是0.3×10⁷CFU/mL、0.5×10⁷CFU/mL、1×10⁷CFU/mL、1.2×10⁷CFU/mL和1.5×10⁷CFU/mL。

在一些具体的实施方案中，所述植物乳杆菌的接种量可以是（0.3-0.5）×10⁷CFU/mL、（0.3-1）×10⁷CFU/mL、（0.3-1.2）×10⁷CFU/mL、（0.3-1.5）×10⁷CFU/mL、（0.5-1）×10⁷CFU/mL、（0.5-1.5）×10⁷CFU/mL、（1-1.2）×10⁷CFU/mL、（1-1.5）×10⁷CFU/mL、（1.2-1.5）×10⁷CFU/mL。

在一个具体的实施方案中，所述鼠李糖乳杆菌的接种量可以是0.8×10⁷CFU/mL、1×10⁷CFU/mL、1.3×10⁷CFU/mL、1.5×10⁷CFU/mL和1.8×10⁷CFU/mL。

在一些具体的实施方案中，所述鼠李糖乳杆菌的接种量可以是（0.8-1）×10⁷CFU/mL、（0.8-1.3）×10⁷CFU/mL、（0.8-1.5）×10⁷CFU/mL、（0.8-1.8）×10⁷CFU/mL、（1-1.3）×10⁷CFU/mL、（1-1.8）×10⁷CFU/mL、（1.3-1.5）×10⁷CFU/mL、（1.3-1.8）×10⁷CFU/mL、（1.5-1.8）×10⁷CFU/mL。

在一个具体的实施方案中，所述罗伊氏乳杆菌的接种量可以是0.2×10⁷CFU/mL、0.3×10⁷CFU/mL、0.5×10⁷CFU/mL、0.8×10⁷CFU/mL和1×10⁷CFU/mL。

在一些具体的实施方案中，所述罗伊氏乳杆菌的接种量可以是（0.2-0.3）×10⁷CFU/mL、（0.2-0.5）×10⁷CFU/mL、（0.2-0.8）×10⁷CFU/mL、（0.2-1）×10⁷CFU/mL、（0.3-0.5）×10⁷CFU/mL、（0.3-1）×10⁷CFU/mL、（0.5-0.8）×10⁷CFU/mL、（0.5-1）×10⁷CFU/mL、（0.8-1）×10⁷CFU/mL。

经过试验分析，本申请对复合发酵中三种菌种的接种量进行了筛选。与将各菌种的接种量均控制在相关技术中的2×10⁷CFU/mL相比，本申请将复合菌种中植物乳杆菌的接种量控制在上述范围内，能够进一步有效提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解性、乳化性和起泡性。

优选地，所述大豆分离蛋白培养基中还包含糜蛋白酶。

优选地，所述糜蛋白酶的浓度为0.15-0.28ug/mL。

在一个具体的实施方案中，所述糜蛋白酶的浓度可以是0.12ug/mL、0.15ug/mL、0.24ug/mL、0.28ug/mL、0.30ug/mL。

在一些具体的实施方案中，所述糜蛋白酶的浓度可以是0.12-0.15ug/mL、0.12-0.24ug/mL、0.12-0.28ug/mL、0.12-0.30ug/mL、0.15-0.24ug/mL、0.15-0.30ug/mL、0.24-0.28ug/mL、0.24-0.30ug/mL、0.28-0.30ug/mL。

相关技术中，大豆分离蛋白培养基中还可以加入蛋白水解酶，蛋白水解酶能够进行蛋白水解。通常情况下，蛋白水解酶可以选自糜蛋白酶、胃蛋白酶和菠萝蛋白酶。本申请在筛选出复合菌种的基础上，进一步进行了蛋白水解酶类型的筛选。经过筛选，本申请选择在大豆分离蛋白培养基中加入糜蛋白酶。经过试验分析，利用加入糜蛋白酶后的大豆分离蛋白培养基能够进一步提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡性和乳化性。

此外，本申请进一步筛选大豆分离蛋白培养基中的糜蛋白酶的浓度。本申请将大豆分离蛋白培养基中糜蛋白酶的浓度控制在上述范围内，能够再进一步改善获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡性和乳化性。

优选地，所述大豆分离蛋白培养基中还包含莱菔素、胡萝卜苷或乌苏酸中的任意一种或多种。

本申请通过向大豆分离蛋白培养基中添加新物质，以提高制得的改性大豆分离蛋白的功能特性。经过筛选，利用添加了莱菔素、胡萝卜苷或乌苏酸中的任意一种或多种的大豆分离蛋白培养基结合三种菌种复合发酵，获得的改性大豆分离蛋白具有更加优异的溶解度、乳化性和起泡性。

第二方面，本申请提供一种改性大豆分离蛋白，采用如下的技术方案：

一种改性大豆分离蛋白，所述改性大豆分离蛋白是利用上述的制备方法制备的。

第三方面，本申请提供一种上述改性大豆分离蛋白在制备食品中作为食品添加剂的应用。

第四方面，本申请提供一种饮料，采用如下技术方案：

一种饮料，所述饮料包含上述改性大豆分离蛋白。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请利用鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌三种菌种复合发酵改性处理大豆分离蛋白，能够有效改善获得的改性大豆分离蛋白的功能特性。同时，还对大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度进行了筛选，能够进一步改善获得的改性大豆分离蛋白的功能特性，尤其是改性大豆分离蛋白的溶解度达到91.5%以上，起泡能力达到225%以上，起泡稳定性达到95.56%以上，乳化能力达到40.30m²/g以上。

2、本申请进一步优化了复合发酵过程中三种菌种的接种量，本申请将复合菌种中植物乳杆菌的接种量控制在（0.5-1.2）×10⁷CFU/mL的范围内，鼠李糖乳杆菌的接种量控制在（1-1.5）×10⁷CFU/mL的范围内，罗伊氏乳杆菌的接种量控制在（0.3-0.8）×10⁷CFU/mL的范围内，能够进一步有效提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解性、乳化性和起泡性。尤其是改性大豆分离蛋白的溶解度达到96%以上，起泡能力达到257%以上，起泡稳定性达到96.11%以上，乳化能力达到42.14m²/g以上。

3、本申请提供的制备方法中进一步加入了糜蛋白酶，并筛选了糜蛋白酶的浓度。能够再进一步提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、乳化性和起泡性。尤其是改性大豆分离蛋白的溶解度达到97.25%以上，起泡能力达到272%以上，起泡稳定性达到96.32%以上，乳化能力达到43.53m²/g以上，且此时乳化稳定性能够到了252min。

4、本申请进一步利用添加了莱菔素、胡萝卜苷或乌苏酸中的任意一种或多种的大豆分离蛋白培养基结合三种菌种复合发酵，获得的改性大豆分离蛋白具有更加优异的溶解度、乳化性和起泡性。

具体实施方式

本申请提供了一种改性大豆分离蛋白的制备方法。上述制备方法具体如下：利用植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌在大豆分离蛋白培养基中复合发酵，制得改性大豆分离蛋白；所述大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度为0.04-0.06g/mL。另外，大豆分离蛋白培养基中还加入了碳源。在本申请中，碳源为葡萄糖。具体地，大豆分离蛋白培养基中葡萄糖的浓度为0.015-0.025g/mL。本申请中，所用的大豆分离蛋白购自南通光合生物技术有限公司。

上述改性大豆分离蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）菌种活化：将菌种活化，并将活化的菌液离心、重悬，制得菌悬液；

（2）大豆分离蛋白培养基的制备：制备大豆分离蛋白的浓度为0.04-0.06g/mL、葡萄糖的浓度为0.015-0.025g/mL的大豆分离蛋白培养基。

（3）接种：将步骤（1）制备的菌悬液接种至步骤（2）制备的大豆分离蛋白培养基中，将接种后的溶液置于37℃的恒温培养箱中静置培养9-36h，获得发酵样品。

（4）将步骤（3）获得的发酵样品进行热处理，终止发酵，调节pH至中性并于-40℃的条件下冻存过夜，保持在-50 ℃条件下冻干，即为改性大豆分离蛋白样品。

进一步地，所述植物乳杆菌的接种量为（0.5-1.2）×10⁷CFU/mL；所述鼠李糖乳杆菌的接种量为（1-1.5）×10⁷CFU/mL；所述罗伊氏乳杆菌的接种量为（0.3-0.8）×10⁷CFU/mL。

进一步地，大豆分离蛋白培养基中还可以加入糜蛋白酶。糜蛋白酶的浓度可以是0.15-0.28ug/mL。本申请中，糜蛋白酶的类型可以是相关技术中可以任意获得的糜蛋白酶。本申请进一步利用添加了莱菔素、胡萝卜苷或乌苏酸中的任意一种或多种的大豆分离蛋白培养基结合三种菌种复合发酵，获得的改性大豆分离蛋白具有更加优异的溶解度、乳化性和起泡性。

本申请还提供了一种利用上述制备方法制得的改性大豆分离蛋白。利用该制备方法制备的改性大豆分离蛋白具有更好的溶解性、乳化性和起泡性。

另外，本申请还提供了上述改性大豆分离蛋白在制备食品中作为食品添加剂的应用。例如，一种饮料，该饮料中包含上述制备方法制备的改性大豆分离蛋白。

以下结合实施例1-34以及性能检测试验对本申请作进一步详细说明。

实施例

实施例1-6

实施例1-6分别提供了一种改性大豆分离蛋白的制备方法。其不同之处在于：上述制备方法中，发酵所用的菌种类型，具体如表1所示。

表1 实施例1-6中发酵所用的菌种类型和来源

上述改性大豆分离蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）菌种活化：将表1所示的菌种接种于MRS培养基中，置于37℃下静置培养24h，重复三次，进行菌种的活化；将第三次获得的菌液置于4000rpm、4℃的条件下离心15min，获得沉淀；将沉淀重悬于无菌生理盐水中，获得浓度为10⁸CFU/mL的菌悬液。

MRS培养基的配方如下：每1000mL培养基中，包含10g蛋白陈、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰，余量为蒸馏水。制法如下：将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH至于6.2，分装后121℃高压灭菌20min。

（2）大豆分离蛋白培养基的制备：将质量浓度为2.5%的大豆分离蛋白溶液40mL于85℃下进行10min巴氏杀菌操作，加入质量浓度为10.0%的无菌葡萄糖溶液10mL（补充菌株生长所需的碳源），以补充菌株生长所需的碳源，配置成大豆分离蛋白浓度为0.02g/mL、葡萄糖浓度为0.02g/mL的大豆分离蛋白培养基。

（3）接种：将步骤（1）制备的菌悬液接种至步骤（2）制备的大豆分离蛋白培养基中，接种后溶液中菌种的接种量为2×10⁷CFU/mL。将接种后的溶液置于37℃的恒温培养箱中静置培养24h，获得发酵样品。

（4）将步骤（3）获得的发酵样品置于沸水浴中热处理10min终止发酵，使用2M NaOH中和发酵样品至pH为7.0±0.2并于-40℃的条件下冻存过夜，保持在-50 ℃条件下冻干，即为改性大豆分离蛋白样品。

实施例7-11

实施例7-11分别提供了一种改性大豆分离蛋白的制备方法。上述实施例与实施例1的不同之处在于：发酵所用的菌种为复合菌种以及大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度。复合菌种的接种情况和大豆分离蛋白的浓度如表2所示。其余均与实施例1相同。

实施例12-24

实施例12-24分别提供了一种改性大豆分离蛋白的制备方法。上述实施例与实施例10的不同之处在于：复合菌种的接种量，具体如表2所示。其余均与实施例10相同。

实施例25-29

实施例25-29分别提供了一种改性大豆分离蛋白的制备方法。上述实施例与实施例14的不同之处在于：大豆分离蛋白培养基中还添加了糜蛋白酶，糜蛋白酶的浓度具体如表2所示。其余均与实施例14相同。

实施例30-32

实施例30提供了一种改性大豆分离蛋白的制备方法。上述实施例与实施例27的不同之处在于：用不同物质代替糜蛋白酶，具体如表2所示。其余均与实施例27相同。

其中，莱菔素购自上海西格生物科技有限公司，CAS编号：592-95-0。胡萝卜苷购自上海钦诚生物科技有限公司，CAS编号：474-58-8。乌苏酸购自上海延慕实业有限公司，CAS编号：6246-46-4。

实施例33-34

实施例33-34提供了一种改性大豆分离蛋白的制备方法。上述实施例与实施例27的不同之处在于：分别利用胃蛋白酶或菠萝蛋白酶代替糜蛋白酶，具体如表2所示。其余均与实施例27相同。

其中，糜蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，CAS编号：9004-07-3。胃蛋白酶购自河北创之源生物科技有限公司，CAS编号：9001-75-6。菠萝蛋白酶购自河北科隆多生物科技有限公司，CAS编号：9001-00-7。

表2 实施例7-34所用复合菌种中各菌种的接种量以及培养基中各物质的添加情况

性能检测试验

一、溶解度检测

对实施例1-34提供的改性大豆分离蛋白和市售大豆分离蛋白进行溶解度检测。检测结果如表3所示。

溶解度的检测方法如下：

将待测的改性大豆分离蛋白或市售大豆分离蛋白配置成20mg/mL的溶液，调pH至8.0，搅拌1h使样品溶解，静置2min后，将上层液倒入离心管中离心15min（12000×g），取上清液10mL，采用lowry法测定蛋白质含量。

Lowry法是根据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu²⁺螯合形成蛋白质铜复合物，此复合物中的酪氨酸和苯丙氨酸残基使酚试剂的磷钼酸盐磷钨酸盐还原，产生蓝色化合物。该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据蛋白样品的吸光度，计算蛋白质含量。Lowry法可检测的最低蛋白质含量达5mg，通常测定范围是20~250mg。

溶解度=上清液中蛋白的含量/样本中总蛋白的含量×100%。

其中，上清液中蛋白的含量通过Lowry法检测确定，样本中总蛋白的含量通过大豆分离蛋白溶液确定。

二、起泡性检测

对实施例1-34提供的改性大豆分离蛋白和市售大豆分离蛋白进行起泡性检测。起泡性检测包括起泡能力检测和起泡稳定性检测。检测结果如表3所示。

起泡性的检测方法如下：

将待测的改性大豆分离蛋白或市售大豆分离蛋白配置成50mg/mL的溶液，并取配置好的溶液100mL置于500mL量筒中（口径6cm，高为20cm）中，使用高速乳化均质机以17000r/min均质40s，连续三次共计2min，记录均质后的液面高度，计为V₀，静置30min后再次记录液面高度，计为V_30min。

起泡能力（Foaming capacity）的计算公式如下：

FC（%）=（V₀－100）/100×100%。

泡沫稳定性（Foaming stability）的计算公式如下：

FS（%）=（V_30min－100）/（V₀－100）×100%。

三、乳化性检测

对实施例1-34提供的改性大豆分离蛋白和市售大豆分离蛋白进行乳化性检测。乳化性检测包括乳化能力检测和乳化稳定性检测。检测结果如表3所示。

乳化性的检测方法如下：

将待测的改性大豆分离蛋白或市售大豆分离蛋白配置成20mg/mL的溶液，将溶液倒入高速组织捣碎机中，按油：水=1:3添加90mL溶液、30mL大豆油，在高速搅拌10000r/min的转速下搅拌1min后立即取出200μL，用0.1%的SDS稀释到10mL，用0.1% SDS作为空白，在500nm下测定此时（0min）的吸光值即为乳化值（EA）记做OD₅₀₀；10min时仍用同样的方法取出200μL，用0.1%的SDS稀释到10mL，用0.1%的SDS作为空白，在500nm下测定此时（10min）的吸光值记做OD_500’。

乳化能力（Emulsifying Ability）的计算公式如下：

EA（m²/g）=2T×A₀×N/（C×β×10000）。

其中，T=2.303；N：稀释倍数50；C：乳化液形成前蛋白质溶液中改性大豆分离蛋白或市售大豆分离蛋白的浓度（g/mL）；β：乳化液中油的体积分数（0.25）。

乳化稳定性（Emulsion Stability）的计算公式如下：

ES（min）=OD₅₀₀/（OD₅₀₀－OD_500’）×10。

表3 实施例1-34的改性大豆分离蛋白和市售大豆分离蛋白的检测结果

由表3可知，本申请利用鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌三种菌种复合发酵处理大豆分离蛋白，能够有效改善获得的改性大豆分离蛋白的功能特性。尤其是在改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性、乳化能力方面均有提高。

通过对比实施例1-6的检测结果和市售大豆分离蛋白的检测结果可知，分别利用单一菌种发酵处理大豆分离蛋白，能够在一定程度上改善大豆分离蛋白的功能特性。一方面，获得的改性大豆分离蛋白的溶解度略微降低，按照溶解度降序排列，发酵处理利用的菌种分别为鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌。另一方面，获得的改性大豆分离蛋白的起泡能力和起泡污泥稳定性有提高，按照起泡能力和起泡稳定性降序排列，发酵处理利用的菌种分别为鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌。此外，获得的改性大豆分离蛋白的乳化能力有所升高，按照乳化能力降序排列，发酵处理利用的菌种分别为鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌。获得的改性大豆分离蛋白的乳化稳定性有所变化，按照乳化稳定性降序排列，发酵处理利用的菌种分别为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌。

在上述结果的基础上，本申请从实施例1-6提供的六种菌种中选择了三种菌种进行复合发酵来改性处理大豆分离蛋白，选择的三种菌种分别为鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。

通过对比实施例7-11的检测结果可知，利用鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌复合发酵处理大豆分离蛋白，三种菌种的接种量均为2×10⁷CFU/mL时，当大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度为0.04-0.06g/mL时，利用本申请提供的方法获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性和乳化能力均优于当大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度为0.02g/mL时获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性和乳化能力。此时，获得的改性大豆分离蛋白的乳化稳定性则低于当大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度为0.02g/mL时获得的改性大豆分离蛋白的乳化稳定性。基于上述，本申请提供的制备方法中将大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度控制在0.04-0.06g/mL。

通过对比实施例12-16的检测结果可知，将制备方法中复合菌中植物乳杆菌的接种量控制在（0.5-1.2）×10⁷CFU/mL的范围内，能够进一步提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性和乳化能力，同时，与市售大豆分离蛋白相比，获得的改性大豆分离蛋白的乳化稳定性略有降低。

通过对比实施例14、实施例17-20的检测结果可知，将制备方法中复合菌中鼠李糖乳杆菌的接种量控制在（1-1.5）×10⁷CFU/mL的范围内，能够进一步提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性和乳化能力，同时，与市售大豆分离蛋白相比，获得的改性大豆分离蛋白的乳化稳定性略有降低。

通过对比实施例14、实施例21-24的检测结果可知，将制备方法中复合菌中罗伊氏乳杆菌的接种量控制在（0.3-0.8）×10⁷CFU/mL的范围内，能够进一步提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性和乳化能力，同时，与市售大豆分离蛋白相比，获得的改性大豆分离蛋白的乳化稳定性略有降低。

因此，本申请提供的制备方法将复合菌中植物乳杆菌的接种量控制在（0.5-1.2）×10⁷CFU/mL，将复合菌中鼠李糖乳杆菌的接种量控制在（1-1.5）×10⁷CFU/mL，将复合菌中罗伊氏乳杆菌的接种量控制在（0.3-0.8）×10⁷CFU/mL。

本申请提供的制备方法中，进一步在大豆分离蛋白培养基中加入了糜蛋白酶，通过对比实施例14和实施例27的检测结果可知，加入糜蛋白酶后，获得的改性大豆分离蛋白的能够进一步提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性和乳化能力，且与市售大豆分离蛋白相比，此时获得的改性大豆分离蛋白的起泡稳定性也略有提高。

通过对比实施例25-29的检测结果可知，本申请提供的制备方法中将大豆分离蛋白培养基中糜蛋白酶的添加量控制在0.15-0.28ug/mL的范围内，获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性、乳化能力以及乳化稳定性均获得有效提高。因此，本申请将大豆分离蛋白培养基中糜蛋白酶的添加量控制在0.15-0.28ug/mL的范围内。

通过对比实施例27和实施例30-32的检测结果可知，区别在于实施例27添加的是糜蛋白酶，实施例30添加的是莱菔素，实施例31添加的是胡萝卜苷，实施例32添加的是乌苏酸。当添加莱菔素、胡萝卜苷或乌苏酸时，能够进一步提高获得的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性、乳化能力以及乳化稳定性。

通过对比实施例27、实施例33-34的检测结果可知，上述实施例的不同之处在于在大豆分离蛋白培养基中加入的蛋白水解酶的类型不同。实施例27的检测结果优于实施例33和实施例34的检测结果，说明在本申请提供的制备方法的基础上，在大豆分离蛋白中加入糜蛋白酶，获得的改性大豆蛋白的溶解度、起泡能力、起泡稳定性和乳化能力均优于在大豆分离蛋白中加入胃蛋白酶和菠萝蛋白酶获得的改性大豆分离蛋白的相应性能。

四、改性大豆分离蛋白的改性过程检测

利用实施例14、27、30提供的制备方法，制备改性大豆分离蛋白。不同之处在于：在培养基中静置培养的时间和取样时机。

在制备过程中，在37℃恒温培养箱中静置培养。分别在培养至0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h取样，将取出的样品置于沸水浴中热处理10min终止发酵，使用2M NaOH中和发酵样品至pH为7.0±0.2并于-40℃的条件下冻存过夜，保持在-50 ℃条件下冻干，获得不同发酵时间下的改性大豆分离蛋白样品。

检测不同发酵时间下的改性大豆分离蛋白的溶解度、起泡性、乳化性。检测方法如上所述。检测结果如表4所示。

表4 实施例14、27、30的改性大豆分离蛋白的检测结果

由表4可知，与未改性的大豆分离蛋白相比，采用实施例14、27和30提供的制备方法，利用上述三种菌种复合发酵制备的改性大豆分离蛋白的溶解性显著提高，且在发酵进行过程中，发酵至9h时制备的改性大豆分离蛋白的溶解度最高。

通过实施例14和实施例27的检测结果可知，与未改性的大豆分离蛋白相比，采用上述三种菌种复合发酵制备的改性大豆分离蛋白的乳化能力显著提高，且在发酵进行过程中，发酵至6h时制备的改性大豆分离蛋白的乳化能力最高。而乳化稳定性则随着发酵时间的进行发生降低，这可能是由于发酵过程中产生了较多短肽，影响了界面膜的粘着力。

通过实施例30的检测结果可知，与未改性的大豆分离蛋白相比，采用上述三种菌种复合发酵制备的改性大豆分离蛋白的乳化能力和乳化稳定性均显著提高，说明大豆分离蛋白培养基中加入莱菔素能够显著提高改性大豆分离蛋白的乳化稳定性。

此外，通过实施例14、27和30的检测结果可知，与未改性的大豆分离蛋白相比，利用上述三种菌种复合发酵制备的改性大豆分离蛋白的起泡能力和起泡稳定性显著提高，且随着发酵过程的进行，改性大豆分离蛋白的起泡能力和起泡稳定性呈现先上升后下降的趋势。

五、改性大豆分离蛋白的热处理检测

对实施例14、27、30、31、32提供的改性大豆分离蛋白和市售大豆分离蛋白进行热处理检测。热处理检测包括超高温热处理和喷雾干燥。对超高温热处理和喷雾干燥后的改性大豆分离蛋白或市售大豆分离蛋白进行溶解度、起泡性和乳化性检测（检测方法同上）。检测结果如表5所示。

超高温热处理的检测方法具体如下：

将改性大豆分离蛋白或市售大豆分离蛋白分别配置成2%（w/v）和5%（w/v）两个浓度，用管板式组合式超高温杀菌机进行处理，处理条件为135℃，时间为5s，设置三次重复。

喷雾干燥的检测方法具体如下：

将改性大豆分离蛋白或市售大豆分离蛋白分别配置成12%（w/v），控制喷雾干燥的条件为进风温度为190℃，塔体温度为85℃，塔下负压-150Pa。

表5 热处理检测结果

由表5可知，本申请实施例14、27和30-32提供的改性大豆分离蛋白经过超高温热处理和喷雾干燥处理后，其溶解性、起泡能力、起泡稳定性、乳化能力和乳化稳定性与未经过超高温热处理和喷雾干燥处理的改性大豆分离蛋白的各项指标相比，各项指标的变化幅度在15%以下。而市售大豆分离蛋白经过超高温热处理和喷雾干燥处理后，其起泡稳定性、乳化能力和乳化稳定性与未经过超高温热处理和喷雾干燥处理的市售大豆分离蛋白的各项指标相比，各项指标的变化幅度在30%以上。尤其是2%（w/v）市售大豆分离蛋白经过超高温处理后乳化稳定性下降了77%。由上述可知，与市售本申请提供的改性大豆分离蛋白经过超高温热处理和喷雾干燥处理后，仍具有较高的溶解性、起泡能力、起泡稳定性、乳化能力和乳化稳定性。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (6)

1.一种改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

利用植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌在大豆分离蛋白培养基中复合发酵，制得改性大豆分离蛋白；

所述大豆分离蛋白培养基中大豆分离蛋白的浓度为0.04-0.06g/mL；

所述植物乳杆菌的接种量为(0.5-1.2)×10⁷CFU/mL；

所述鼠李糖乳杆菌的接种量为(1-1.5)×10⁷CFU/mL；

所述罗伊氏乳杆菌的接种量为(0.3-0.8)×10⁷CFU/mL；

所述大豆分离蛋白培养基中还包括碳源；

所述大豆分离蛋白培养基中还包括莱菔素、胡萝卜苷或乌苏酸中的任意一种或多种。

2.根据权利要求1所述的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于，所述大豆分离蛋

白培养基中还包含糜蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的改性大豆分离蛋白的制备方法，其特征在于，所述糜蛋白酶的

浓度为0.15-0.28ug/mL。

4.一种改性大豆分离蛋白，其特征在于，所述改性大豆分离蛋白利用权利要求1-3中任一项所述的制备方法制备。

5.一种权利要求4所述的改性大豆分离蛋白在制备食品中作为食品添加剂的应用。

6.一种饮料，其特征在于，所述饮料包含权利要求4所述的改性大豆分离蛋白。