CN114736835B - 副干酪乳杆菌菌株ss-01、用该菌株制备的胞外多糖、制备方法及应用 - Google Patents

副干酪乳杆菌菌株ss-01、用该菌株制备的胞外多糖、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种保藏编号为CGMCC No.23145的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株SS‑01，以及由其发酵提取的胞外多糖，制备方法包括：将副干酪乳杆菌SS‑01经活化、纯化、扩大培养处理所得种子液接种至MRS肉汤进行发酵培养处理，然后灭菌、分离得到发酵液上清；将发酵液上清进行浓缩富集，再依次经醇沉、去蛋白、醇沉、冻干处理得到粗胞外多糖。该菌株生产的胞外多糖具有良好的抗氧化功效和安全性，可以作为功效成分加入到化妆品配方中，发酵过程中步骤简便，操作简单，能耗较小，可以节约成本，所得胞外多糖的产量高。

Description

副干酪乳杆菌菌株SS-01、用该菌株制备的胞外多糖、制备方 法及应用
技术领域
本公开属于生物发酵技术领域，具体涉及副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)菌株SS-01、用该菌株制备的胞外多糖、制备方法及应用。
背景技术
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是乳酸菌中乳杆菌属的重要成员，通过调节肠道菌群失衡改变肠道微生态环境，增强人体免疫力，对人体发挥着益生菌的作用。副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)是由Collins首次从干酪乳杆菌亚种中划分出来的新种，研究发现副干酪乳杆菌的抗氧化性可能与菌体代谢产物密切相关。
研究发现乳酸菌代谢产物对皮肤具有有益效能，具体表现为：1、可有效清除DPPH自由基、羟自由基，具有良好的抗氧化能力；2、抑制酪氨酸酶活性，具有美白活性；3、通过人体保湿功效评价发现，副干酪乳杆菌具有良好的保湿能力；4、通过检测体内炎症因子的表达发现，副干酪乳杆菌具有良好的抗炎能力。
但是，对于副干酪乳杆菌还有待更深入的研究。一，目前只发现副干酪乳杆菌胞外多糖具有良好的功效，其他代谢物的活性目前还处于未知；二，目前的技术提取副干酪乳杆菌胞外多糖成本较高，不适用于工业生产；三，副干酪乳杆菌的活性代谢物产量有限，不可批量生产。
发明内容
在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
为解决上述技术问题，本公开提供的技术方案是：
第一方面，本公开提供副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株SS-01，其保藏编号为CGMCC No.23145。
本公开的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株SS-01从酸奶中分离得到。具体地，取5mL酸奶与45mL无菌生理盐水混合，体积比为1：9，吸取50μL稀释后的菌液于MRS固体平板上(蛋白胨10.0g/L，牛肉粉8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温801.0g/L，pH值5.7±0.2)，用涂布棒涂匀，37℃培养48h。挑选单个的具有典型乳酸菌菌落特征且形态差异较为明显的菌落，划线纯化2～3代，将上述分离纯化得到的乳酸菌接入MRS斜面培养基，4℃保藏。
第二方面，本公开提供一种副干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括：
发酵步骤：将上述副干酪乳杆菌SS-01经活化、纯化、扩大培养处理所得种子液接种至MRS肉汤进行发酵培养处理，然后灭菌、分离得到发酵液上清；
粗胞外多糖提取步骤：将所述发酵液上清进行浓缩富集，再依次经醇沉、去蛋白、醇沉、冻干处理得到粗胞外多糖。
上述胞外多糖的制备方法，作为一种优选实施方式，所述粗胞外多糖提取步骤之后还包括纯化步骤：将所述粗胞外多糖经透析处理后，再通过DEAE-52纤维树脂柱进一步纯化处理，即得所述胞外多糖；优选地所述DEAE-52纤维树脂柱层析处理中使用水进行洗脱。
上述胞外多糖的制备方法，作为一种优选实施方式，所述发酵步骤中，用于接种的所述种子液在600nm处OD值为0.7-1.6(比如0.8、1.0、1.2、1.4等)，接菌量(即所述种子液的体积和所述MRS肉汤的体积之比)为5-30％(比如10％、15％、20％、25％等)。
上述胞外多糖的制备方法，作为一种优选实施方式，所述发酵步骤中，发酵温度为37-45℃(比如38℃、40℃、42℃、44℃等)，摇床转速150r/min-180r/min(比如155r/min、160r/min、165r/min、170r/min、175r/min等)，发酵时间为6-27h(比如8h、10h、12h、15h、18h、20h、24h、27h等)。
上述胞外多糖的制备方法，作为一种优选实施方式，所述粗胞外多糖提取步骤中，所述发酵液上清浓缩至原体积的10-15％(比如12％、14％等)，首次醇沉处理时，乙醇和浓缩后的发酵液上清体积比4:1-10:1(比如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1等)，-4℃醇沉约12-24h(比如15h、18h、20h、22h)。
上述胞外多糖的制备方法，作为一种优选实施方式，所述粗胞外多糖提取步骤中，所述去蛋白处理包括：将首次醇沉所得产物用水复溶至样品原体积，加入适量木瓜蛋白酶混匀，室温酶解2-10h(比如3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h)后再煮沸失活。优选地，所述木瓜蛋白酶添加量与复溶后体系的体积之比为2-10g/100mL。
第三方面，本公开还提供一种由上述方法制备的副干酪乳杆菌胞外多糖。
第四方面，本公开还提供一种含有干酪乳杆菌胞外多糖的化妆品。
相比现有技术，本公开的有益效果包括但不限于：
1、本公开提供一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株SS-01，其保藏编号为CGMCC No.23145，该菌株生产的胞外多糖，具有良好的抗氧化功效和安全性，可以作为功效成分加入到化妆品配方中，制备包括但不限于：面膜、精华液、乳液等化妆品；
2、本公开采用发酵的方式，以MRS培养基为底物经过灭菌处理，接入副干酪乳杆菌菌株SS-01进行发酵，在恒温恒湿箱中进行发酵，其发酵过程中步骤简便，操作简单，能耗较小，可以节约成本；
3、本公开提供的副干酪乳杆菌菌株SS-01及相应的发酵方法所得胞外多糖的产量高。
本公开的副干酪乳杆菌新菌株保藏日期为2021年08月16日，保藏编号为CGMCCNo.23145，分类命名为：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株SS-01，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
附图说明
图1为实施例2菌种筛选实验五种乳酸菌发酵液上清的总糖含量图；
图2为实施例3制得的副干酪乳杆菌粗胞外多糖LP-EPS的GPC图谱；
图3为实施例4中透析实验操作示意图；
图4为实施例4副干酪乳杆菌粗胞外多糖LP-EPS的DEAE-52阴离子柱层析洗脱曲线；
图5为葡聚糖标准品的GPC图谱；
图6为实施例4纯化后制得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1的GPC图谱；
图7为实施例4纯化后制得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-2的GPC图谱；
图8为实施例4纯化后制得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1和EPS-LP-2紫外线全波长扫描图；
图9为实施例4纯化后制得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1的FT-IR图谱；
图10为扫描电子显微镜观察实施例3所得粗胞外多糖LP-EPS和实施例4所得EPS-LP-1的表面微观图，其中，(A)LP-EPS在250×放大条件下的表面微观图，(B)LP-EPS在500×放大条件下的表面微观图，(C)EPS-LP-1在250×放大条件下的表面微观图，(D)EPS-LP-1在500×放大条件下的表面微观图，(E)EPS-LP-1在750×放大条件下的表面微观图，(F)EPS-LP-1在1000×放大条件下的表面微观图；
图11为实施例4所得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1对DPPH自由基和羟自由基的清除作用示意图；
图12为实施例4所得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1对成纤维细胞的毒性作用示意图；
图13为实施例4所得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1对表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)的毒性作用示意图；
图14为实施例4所得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1保护作用下对丙二醛(MDA)含量的影响示意图；
图15为实施例4所得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1对HaCaT细胞外IL-18含量的影响示意图；
图16为实施例4所得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1对HaCaT细胞外IL-6含量的影响示意图；
图17为实施例4所得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1浓度对红细胞溶血率的影响示意图；
图18为实施例4所得的副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1和SDS的红细胞溶血率对比示意图；
图19为实施例3所得粗胞外多糖LP-EPS的皮肤含水量(MMV)变化率测试曲线图；
图20为实施例3所得粗胞外多糖LP-EPS的经皮水分散失(TEWL)变化率测试曲线图；
图21为实施例3所得粗胞外多糖LP-EPS的皮肤含水量(MMV)变化率和经皮水分散失(TEWL)变化率曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。再不背立本发明精神和实质的情况下，本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，属于本发明的范围。
在下文中将结合示范性实施例对本公开的技术方案进行描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的副干酪乳杆菌菌株SS-01的保藏日期为2021年08月16日，保藏编号为CGMCC No.23145，菌株鉴定序列号为GenBank:MW433888.1。
下述实施例中所用的MRS肉汤配方如下：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2，37℃。
实施例1副干酪乳杆菌SS-01的分离、鉴定和保藏
1、菌种的分离
副干酪乳杆菌SS-01从酸奶中分离得到。具体地，将酸奶制成菌液(取5mL酸奶与45mL无菌生理盐水混合，浓度9:1)，吸取50μL稀释后的菌液于MRS固体平板上(蛋白胨10.0g/L，牛肉粉8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2)，用涂布棒涂匀，37℃培养48h。挑选单个的具有典型乳酸菌菌落特征且形态差异较为明显的菌落，划线纯化2～3代，将上述分离纯化得到的乳酸菌接入MRS斜面培养基，4℃保藏。
2、菌种的鉴定
1)形态学鉴定。该菌株在MRS培养基平板上37℃培养24h，菌落形态呈现为圆形，灰白色，表面光滑湿润，边缘整齐，不透明。革兰氏染色阳性。
2)分子系统发育分析。按照细菌基因组提取试剂盒(品牌为OMEGA，型号为D3390-02)的操作步骤，提取SS-01的基因组DNA。以上述提取的基因组DNA作为扩增模板，通过16sRNA对副干酪乳杆菌进行测序，其中引物序列为27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和TACGGYTACCTTGTTACGACTT：TCCTCCGCTTATTGATATGC为引物进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共35个循环。对得到的PCR产物进行测序，rDNA-16S序列参见序列表，测序结果表明SS-01的rDNA-ITS序列与NCBI数据库中已公开的序列进行在线同源性比对，结果显示SS-01与副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)核酸序列同源性最高，相似性为99％，Genebank编号为MW433888.1。
3、菌种的保藏
SS-01已于2021年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.23145。SS-01的全称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株SS-01中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)No.23145。
实施例2菌种筛选实验
提前配制好MRS肉汤，pH值6.2-6.4，均匀分装至五个锥形瓶中放入灭菌锅中进行高温灭菌处理。灭菌完毕后取出，放入超净台中冷却备用。实验室的五种乳酸菌，依次命名为1、2、3、4、5号菌，五个提前准备好的装有MRS肉汤的锥形瓶中分别接种1、2、3、4、5号菌并编号命名(表1为菌种详细信息)，扩大培养至在600nm处菌液OD值1.1。然后，按接菌量5％接种扩大培养所得菌液至MRS肉汤，在发酵温度37℃，摇床转速180r/min的发酵条件下，发酵48h后取出。取出后进行灭菌，再离心去除菌体收集上清液。检测不同菌种发酵上清液的总糖含量，以总糖含量为指标进行菌株筛选。
表1菌种详细信息
采用苯酚-硫酸法测上清液样品的总糖含量，方法如下：
1)制作葡萄糖标准曲线：准确称取105℃烘干至恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中配成0.1mg/ml的标准溶液，用蒸馏水分别配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml 1ml标准液分别加入5％苯酚溶液1ml并迅速加入浓硫酸5ml静置10min摇匀，30℃放置30min后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线，得到的回归方程：y＝7.2769x+0.2513，相关系数R2＝1，其具有良好的相关。
2)样品含量测定：吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作测定OD490，并代入标准曲线计算样品的总糖含量。
实验结果参见图1，可见，1号菌和4号菌的产糖能力明显优于2、3、5号菌。其中，1号菌种即副干酪乳杆菌SS-01。
实施例3副干酪乳杆菌SS-01粗胞外多糖的制备
提前配制好MRS肉汤，pH值约6.0，倒入锥形瓶中放入灭菌锅中进行高温灭菌处理。灭菌完毕后取出，放入超净台中冷却备用。将副干酪乳杆菌SS-01接种到MRS肉汤中，经活化、纯化、扩大培养处理得到种子液(600nm处OD值1.1)。然后接种至MRS肉汤中发酵培养，接菌量10％，在发酵温度37℃、摇床转速180r/min的发酵条件下发酵24h。发酵完成后取出进行灭菌，再离心去除菌体收集上清液。
取上清液200ml先旋蒸浓缩至约25ml，以减少后续无水乙醇的消耗。再按发酵液和乙醇体积比4:1(发酵液20％，乙醇80％)的比例混合，在-4℃条件下醇沉样品过夜，约12h。醇沉后用水复溶至样品原体积，加入体积比2％的木瓜蛋白酶，混匀，室温酶解4h后，煮沸10min使酶失活，再次醇沉，收集醇沉的沉淀物，冷冻干燥后即为多糖粗提物，后文称为粗胞外多糖或LP-EPS。
然后采用高效凝胶渗透色谱法(GPC)测定LP-EPS的分子质量：1)样品配制：将待测溶解，配制成3mg/ml，过0.22μm水系膜过滤后装进样品瓶，放置4℃冰箱备用。2)流动相的配制：重氮化钠0.02％与0.2M的硝酸钠配2L，流动相配制完毕后过膜，再超声脱气备用。3)实验条件为：色谱柱：Ultrahydrogel 250 Column(7.0×300mm)；Ultrahydrogel 120 Column(7.0×300mm)；Ultrahydrogel Guard Column 125(6μm,6mm×40mm)；检测器温度与柱温：(Det：50℃、Col：60℃)；流速：0.8mL/min。
实验结果如下：因为LP-EPS纯度不够，导致激光光散射信号与示差检测器信号并不重合。选取两个激光光散射信号较强的峰，如图2所示，peak 1和peak 2可以对LP-EPS的分子量分布范围进行初步估计。由于peak 1和peak 2激光光散射信号与示差检测器信号并不重合，利用软件Empower和WAYTT计算出的分子量结果(如表2所示)并不准确。但可以大致判断，LP-EPS的分子量在105分子级范围内。
表2 LP-EPS分子量分布表
实施例4副干酪乳杆菌菌株SS-01胞外多糖的纯化
1.纯化步骤
1)透析截留
新购买或保存在0.02％叠氮化钠溶液中的透析袋，取出使用时，先放在去离子水或超纯水中静置20min左右，再用流动水冲洗透析袋内部。清洗后装满水，两头用透析夹夹上，检查是否漏水。若不漏水，可以开始装样透析。透析操作如图3所示，将大烧杯放置于磁力搅拌器中搅拌以加快透析速率。透析处理可以去除小分子无机盐等杂质。
2)DEAE-52阴离子柱层析
将100g DEAE树脂用蒸馏水浸泡，使其充分溶胀，分别用稀酸稀碱预处理后，用蒸溜水冲洗至中性，采用高浓度的NaCl溶液将OH型树脂转化为Cr型后装柱。装好柱后用洗脱液平衡24h。将粗多糖溶于0.1mol/ml NaCl溶液中，离心、除去不溶物。取上清液加到平衡好的DEAE-52柱内(2.6cm×40cm)，进样后，线性洗脱先采用0.3mol/ml NaCl溶液，根据洗脱峰的位置然后分别选用0.1、0.2、0.4mol/ml NaCl溶液进行梯度洗脱，自动部分收集器分部收集，硫酸-苯酚法跟踪检测，吸光度为纵坐标，洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线，一直洗至无糖检出为止。洗脱液浓缩后，流动的蒸馏水透析去除残留的盐类，真空冷冻干燥为纯化副干酪乳杆菌胞外多糖。
实验结果如图4所示，共有两个洗脱峰，分别出现在第15管和第50管附近。第一个峰出现在用水洗脱区间出现，初步推测该组分是一种中性多糖，命名为EPS-LP-1。第二个峰出现在用0.1M氯化钠洗脱阶段，命名为EPS-LP-2，EPS-LP-2初步推断为酸性多糖组分。EPS-LP-1是用水洗脱得到，更便于进一步分离，纯化和收集。相反，EPS-LP-2含有氯化钠杂质，透析截留去除氯化钠杂质会增加后续的损耗，因此，发明人选择EPS-LP-1作为进一步研究的主要对象，将其收集，透析和冷冻干燥以进行进一步分析。纯化的EPS-LP-1的产量为1.223g/L，纯化得率为61.5％。
2.纯化副干酪乳杆菌胞外多糖的结构表征
2.1高效凝胶渗透色谱(GPC)法测定相对分子质量
样品配制：将待测溶解，配制成3mg/ml，经0.22μm水系膜过滤后装进样品瓶，放置4℃冰箱备用。流动相的配制：重氮化钠0.02％与0.2M的硝酸钠配2L流动相，配制完毕后过膜，再超声脱气备用。色谱柱：Ultrahydrogel 250 Column(7.0×300mm)，Ultrahydrogel120 Column(7.0×300mm)，Ultrahydrogel Guard Column 125(6μm,6mm×40mm)；检测器温度与柱温：(Det：50℃、Col：60℃)；流速：0.8mL/min。
使用葡聚糖标准品(Mw 1.26×104g/mol)作为标记和校准，葡聚糖标品的GPC图谱如图5，激光光散射信号与示差检测器信号均呈现对称峰，且两个信号峰高度重合，计算后得到的重均分子量Mw为1.134×104g/mol(±1.245％)，与葡聚糖标品的分子量(Mw 1.26×104g/mol)高度吻合，表明系统功能正常且无人为操作误差。EPS-LP-1和EPS-LP-2的GPC图谱分别如图6和图7所示，GPC图谱均为对称且较尖锐的峰，且激光光散射信号与示差检测器信号均高度重合，说明EPS-LP-1和EPS-LP-2纯度均较高。检测到的EPS-LP-1和EPS-LP-2的Mw分别为4.968×104(±4.436％)和5.782×104(±5.715％)(如表3)，这与以前研究报道的乳酸菌胞外多糖的分子量通常在104–106Da之间一致。本实施例所获的胞外多糖，具有较低分子量，具有更好的水溶性和相对扩展的链构象，从而导致更好的生物活性，应用在化妆品领域也更易被皮肤吸收。
表3葡聚糖标品、EPS-LP-1和EPS-LP-2分子量汇总
2.2紫外(UV)和红外(FT-IR)光谱分析
紫外光谱分析：将EPS-LP-1和EPS-LP-2样品分别配成浓度为1.0mg/mL的溶液，离心取上清，在190-400nm范围内使用紫外分光光度计进行扫描。观察紫外图谱在260nm是否存在核酸的特征吸收峰和280nm处是否存在蛋白质的特征吸收峰。
红外(FT-IR)光谱：将纯化多糖粉末加入纯水中，20℃、80W下超声30分钟取上清液，18000rpm、4℃下离心6min，蒸馏水反复洗涤沉淀三次，将沉淀烘干。使用美国Vertex 70型傅里叶红外光谱仪分析，波长在4000-400cm-1范围内，分辨率为1cm-1。
如图8所示，LP-EPS经过分离和纯化得到的EPS-LP-1和EPS-LP-2在260nm和280nm处均无紫外吸收，不存在核酸和蛋白质的特征吸收峰。说明酶法去蛋白完全，在胞外多糖醇沉、去蛋白等粗提取过程中未引入新的蛋白质或核酸杂质；后期使用DEAE-52纤维树脂进行柱层析分离过程中也未引入核酸或蛋白质杂质。
EPS-LP-1的红外光谱图如图9所示，3396cm-1的峰值是由于多糖的羟基(O-H)拉伸振动；而(C-H)拉伸振动出现在2938cm-1，与报道的乳酸隐球菌L2所产的胞外多糖(2931cm-1)一致；在1650cm-1处的吸收归因于C＝O拉伸振动；吸收峰1532cm-1表示脂肪族CH 2基的C-H弯曲；在1395cm-1附近的峰表示C＝O延伸的羧基和来自羧基的C-O键；此外，在1234cm-1和1042cm-1附近的吸收峰，根据kefiri乳酸杆菌胞外多糖的红外图谱解析，1226.7cm-1和1058.9cm-1被认为是存在碳水化合物必不可少的两个识别区域。
2.3扫描电子显微镜(SEM)
利用高分辨场发射扫描电镜Hitachi S-5500进行胞外多糖形貌的表征，取适量纯化冻干粉加入纯水，20℃、80W超声30分钟，取上清液滴加铜网上晾干即可。
实验结果如图10所示。250倍和500倍扫描电子显微镜观察下，LP-EPS的表面超微形貌结构呈现出薄片状的结构，显示出粗糙和不平坦的表面，且皱褶而紧密，说明LP-EPS机械性能较稳定但质地偏脆。而纯化后的EPS-LP-1，250倍和500倍扫描电子显微镜观察下，微形貌结构呈现疏松的表面，具有光滑表面的不规则层状形态，片状结构变厚且轮廓偏棒状，且无规则。说明EPS-LP-1质地较松软细腻，与其质地轻盈的粉末外观十分吻合。这可能的原因是LP-EPS不是单一组分，而EPS-LP-1是纯化后的单一组分，所以两者会体现出一定的物理性差异。可初步判断，EPS-LP-1因具有疏松的表面超微形貌，比表面超微形貌结构呈紧密薄片状的LP-EPS，具有更为优良的保水持水能力和流变学特性，但EPS-PL-1的瞬间溶水率能力比LP-EPS差，日常空气中放置，EPS-LP-1更不易吸潮。
3.副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1的活性测定
3.1自由基清除能力测试
1)DPPH自由基清除实验
在所有试管中(T、T0、C、C0)补充溶剂，水溶性样品用水，油溶性样品用95％乙醇，补足3mL，混匀。在样品管(T)和DPPH管(C)中加入DPPH乙醇溶液1mL，样品本底(T0)和溶剂本底(C0)用95％乙醇代替，轻轻摇匀，室温下静置5分钟。将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值。
表4样品加液要求
T-样品管 T0-样品本底 C-DPPH管 C0-溶剂本底
样品溶液(mL) 1 1 - -
水或95％乙醇溶剂(mL) 2 2 3 3
DPPH乙醇溶液(mL) 1 - 1 -
95％乙醇(mL) - 1 - 1
平行次数 3/样 1/样 3/试验 1/试验
按照下式计算DPPH自由基清除率：
式中：T-样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；T0-样品本底吸光值；C-DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；C0-溶剂本底吸光值。
2)羟自由基OH清除实验
取0.5mL 0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶于试管中，依次加入1mL 0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)和0.5mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.5mL 0.75mmol/L硫酸亚铁溶液(FeSO4)，混匀后，加入0.5mL 0.01％双氧水(H2O2)，于37℃水浴60min后，在536nm测其吸光值所得数据为损伤管吸光度A损伤，未损伤管以0.5mL蒸馏水代替损伤管中的0.5mL0.01％双氧水操作方法同损伤管可测得未损伤管的吸光度值A未损伤样品管以样品代替损伤管中的蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得样品管中的吸光度A样品，按照下式计算样品对OH的清除率：清除率I(％)＝100％*(A样品-A损伤)/(A未损伤-A损伤)。
3)实验结果如下：
副干酪乳杆菌纯化胞外多糖(EPS-LP-1)及粗胞外多糖(LP-EPS)的清除DPPH自由基、羟自由基的实验结果如图11。图11中的A为DPPH自由基清除实验，从图中我们看出，10mg/ml的粗多糖及纯化多糖都具有较高的清除率，但因粗多糖杂质较多，可能与纯化多糖相比，清除活性相差较大。图11中的B为羟自由基清除实验，结果与DPPH自由基清除实验相同，纯化多糖的羟自由基清除活性强于粗多糖，因此在之后的功效实验验证选用纯化多糖EPS-LP-1。
3.2真皮成纤维细胞及表皮角质形成细胞毒性实验
1)真皮成纤维细胞及表皮角质形成细胞的复苏和培养
从液氮中取出冻存的成纤维细胞与角质形成细胞，立刻置于37℃水浴中，待细胞血清混合液融化，将混合液吹打均匀后，吸取液体于T25培养瓶中，加入FM培养基，使培养基中的液体为5mL。置于37℃，5％的二氧化碳的孵育培养箱中进行培养复苏。将复苏后的成纤维细胞进行传代，PBS清洗细胞2遍，1瓶细胞加入1mL胰酶，待细胞消化完全，加入2mL DMEM培养基终止消化，将细胞混合液转移至15mL离心管中，1500rpm离心5分钟，取细胞沉淀与FM培养基吹打制成细胞悬浮液，转移至新的培养瓶中，补足培养基。置于37℃，5％的二氧化碳的孵育培养箱中进行培养。
2)真皮成纤维细胞及表皮角质形成细胞毒性实验
将两种细胞分别以8×103/孔的密度接种到96孔板(100μL/孔)中。培养12小时，将样品分别添加到96孔板中浓度为10-0.08mg/ml(倍比稀释)。37℃条件下温育24小时后，加10μlCCK8培养箱中温育，2小时后在450nm下测量吸光度。
3)实验结果如下：
副干酪乳杆菌胞外多糖(EPS-LP-1)对成纤维细胞的毒性作用如图12，浓度低于5mg/ml的EPS-LP-1作用于成纤维细胞，成纤维细胞的细胞活率均大于80％。通常认为当样品作用细胞后，细胞活率在80％及以上，均可认为样品对细胞呈现较小的细胞毒性。5mg/ml的EPS-LP-1作用于成纤维细胞，成纤维细胞的细胞活率为75.72％，与空白组(control)相比细胞活率下降14.28％(P<0.0007)。8mg/ml的EPS-LP-1作用于成纤维细胞，细胞活率为69.58％与空白组(control)相比细胞活率下降30.42％(p<0.0001)。5mg/ml的EPS和8mg/ml的EPS-LP-1作用下细胞活率低于80％，说明对细胞具有一定的毒性。10mg/ml的EPS作用于成纤维细胞，成纤维细胞的细胞活率均53.69％，说明10mg/ml的EPS-LP-1对细胞毒性较大。EPS-LP-1对人皮肤成纤维细胞(HSF)的毒性作用IC50＝10.16％。最终选用细胞活率为95％的EPS-LP-1浓度(1.25mg/mL)作为进一步实验的浓度。
EPS-LP-1对HaCaT细胞的毒性作用如图13所示，EPS-LP-1对HaCaT细胞的毒性作用大致呈剂量依赖关系，即EPS-LP-1浓度越大，对HaCaT细胞的毒性作用越大。10mg/mL的细胞活率为71.6％(p＝0.0043,p<0.05)。EPS-LP-1对HaCaT细胞的毒性作用的IC80为5mg/mL，最终选择IC80浓度及其相近的浓度作为后续实验的浓度，即最终选用2.5、5、10mg/mL三个浓度作为后续实验浓度。
3.3副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1对细胞内丙二醛(MDA)含量的影响
1)细胞裂解液的制备：收集对数期成纤维细胞，加入DMEM培养基，制成细胞悬浮液，将细胞浓度调整至7.5×105个/mL，每孔加入2mL，轻轻摇晃，使细胞均匀铺于6孔板中，置于培养箱培养过夜。倒掉培养基，每孔加入2mL样品，空白组(control)和模型组(Treated)加2mL无血清DMEM培养基培，阳性对照加2mL 86ug/mL的Vc。培养箱孵育24h，弃培养液，PBS轻洗细胞2遍，加1mL PBS，UVA照射2h(12J/cm2)，弃PBS。每孔加入细胞裂解液100μL，移液枪吹打，并置于冰浴上继续裂解1-2min，使细胞裂解充分，吸取裂解液，分装于无菌离心管中，-80℃保存。
2)MDA含量的测定：按照试剂盒(S0131S,碧云天生物科技有限公司)说明书操作。MDA含量的计算：根据实验数据，得到MDA标准曲线为y＝2486.5x-115.82，R2＝0.99966。对照标准曲线进行计算，得到MDA的含量。
3)实验结果如下：
丙二醛(MDA)是脂质过氧化的最典型的终产物，其含量越高表明膜质过氧化作用越强。如图14所示，空白组的MDA含量为193.5μM/mg蛋白。模型组(Treated)的MDA含量为259.5μM/mg蛋白，与空白组(Control)相比，模型组的MDA含量含量增加，说明氧化损伤模型建模成功。1.25mg/mL EPS-LP-1的保护作用下，与模型组相比，MDA含量显著下降(p<0.001)。1.25mg/mL EPS-LP-1的保护作用下MDA含量为100.18μM/mg蛋白，86μg/mL的Vc保护作用下MDA含量为118.407μM/mg蛋白。说明1.25％EPS-LP-1对成纤维细胞的氧化应激保护作用于仅略低于86μg/mL的Vc，即EPS-LP-1对成纤维细胞具有良好的氧化应激保护作用。
3.5副干酪乳杆菌胞外多糖对HaCaT细胞外IL-18、IL-6含量的影响
将细胞悬浮液调整浓度为5×105cells/mL，接种至6孔板，每孔加入2mL细胞悬浮液，置37℃，5％CO2培养箱培养过夜。加不同浓度的样品和100μg/mL的LPS(脂多糖)作用于6孔板中的HaCat细胞24h，集细胞上清液，采用人白介素(IL-18)及人白介素(IL-6)酶联免疫试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)进行检测。实验结果如下。
IL-18是一种前炎症因子。副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1对HaCaT细胞外所分泌的IL-18含量影响如图15所示。模型组(Treated)是用LPS诱导炎症损伤的HaCaT细胞，模型组与空白组(Control)相比炎症因子IL-18的分泌量明显升高(p<0.05)，说明炎症模型建立成功。与模型组相比，4mM的乙酰水杨酸(阿司匹林，asprin)处理后的阳性对照组明显降低了炎症因子IL-18的分泌。2.5、5、10mg/mL的EPS-LP-1均一定程度可以降低炎症因子IL-6的分泌。其中，5mg/mL的EPS-LP-1可显著降低炎症因子IL-18的分泌(p<0.05)，但降低炎症因子IL-18的分泌的能力低于4mM的乙酰水杨酸(阿司匹林，asprin)。说明5mg/mL的EPS-LP-1具有一定的抗炎能力，但抗炎能力低于4mM的乙酰水杨酸。
IL-6是白介素家族炎症因子的一种，急性炎症反应中会快速生成。副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1对HaCaT细胞外所分泌的IL-6含量影响如图16所示。模型组(Treated)是用LPS诱导炎症损伤的HaCaT细胞，模型组与空白组(Control)相比炎症因子IL-6的分泌量明显升高(p＝0.0081,p<0.05)，说明炎症模型建立成功。与模型组相比，4mM的乙酰水杨酸(阿司匹林，asprin)处理后的阳性对照组明显降低了炎症因子IL-6的分泌。2.5、5、10mg/mL的EPS-LP-1均一定程度可以降低炎症因子IL-6的分泌。其中，10mg/mL的EPS-LP-1可显著降低炎症因子IL-6的分泌(p<0.05)，优于4mM的乙酰水杨酸(阿司匹林，asprin)；5mg/mL的EPS-LP-1抗炎能力与4mM的乙酰水杨酸相当。
4.副干酪乳杆菌胞外多糖EPS-LP-1的安全性功效评价
4.1红细胞溶血实验(RBC)
红细胞溶血实验(Red blood cell test，RBC)，是兔眼刺激实验(Draize test)的替代方法之一。红细胞被认为是研究生物膜效应最好的生物来源，操作性强且同质性好。RBC实验的基本原理是通过检测红细胞中血红蛋白的漏出量及蛋白质的变性程度来评价化学品对眼组织的刺激性。国际上也广泛地将RBC实验用于化妆品产品及原料等化学品的眼刺激性研究。
本实验的具体步骤如下：
1.RBC的前处理
(1)血液的获取和运输
屠宰场取新鲜兔血盛装于聚乙烯塑料容器中，按1：9加入抗凝剂柠檬酸缓冲液混匀。立即将混匀血样保温于保温箱中，温度为21-22℃。30分钟内运于实验室，若血样没有受到污染，时间可延长至1小时。
(2)RBC的分离
1)分装稀释：收集新鲜血液(已用柠檬酸抗凝剂处理)用PBS溶液稀释(血液：PBS＝4：10体积比)；
2)离心去杂：在室温下，用1500×g离心上述稀释液10min，离心后的上清液和淡黄色的白细胞层小心地吸掉，然后添加PBS重复上述洗涤离心步骤2-3次(第2次离心时打开酶标仪预热15min)。
3)RBC悬液配制：最后一次离心后，将沉淀的细胞用PBS稀释至浓度约为2％红细胞悬液(约2mL沉淀+98mL PBS)，轻轻摇晃均匀。
4)RBC浓度校准：取0.5mL上述细胞悬液于10mL EP管中，加入蒸馏水稀释至5mL，混匀反应1分钟，用酶标仪在541nm处测量(PBS为空白对照，用红细胞悬液调吸光度)，理想的吸光值应为0.5(±5％)。将处理好的RBC悬液密封于4℃储存。
2.溶血曲线的测定
(1)将实施例1最佳制备条件制得的刺梨发酵液加水稀释而成体积浓度为20％、40％、60％、80％、100％的样品溶液，然后将各浓度梯度样品溶液与RBC悬液按3：1的比例添加(750μL 样品+250μL RBC)，混匀。
(2)将受试物RBC混合液在室温下摇床孵育60min。
(3)将各EP管置于离心机中，10000rpm/min速度离心1分钟，终止孵育。
(4)取上清液测量其在540nm处的吸光度值。每个浓度做三个平行，结果取平均值。
(5)同时测定对照组：
阴性对照(零溶血)：750μL PBS+250μL RBC，设阴性对照的溶血率为0％；
阳性对照：750μl 0.1％SDS水+250μL RBC；
完全溶血对照：750μL水+250μL RBC，设完全溶血对照的溶血率为100％。
3.数据处理
将各组在560nm波长下测得的吸光度OD值与浓度梯度曲线，取线性区作回归线，并将560nm下阴性对照与阳性对照OD值的差值带入回归线方程，得到H50(以在测试体系中的浓度表示)。
计算公式如下：
/>
实验结果如下：
如图17所示，EPS-LP-1的溶血率均呈剂量依赖性增加。但是，EPS-LP-1的浓度为0-10mg/mL区间内，溶血率均低于0.01％的SDS(如图18所示)。而根据《化妆品安全技术规范2015》，SDS并不在化妆品的禁用或限用名单中。SDS在化妆品中的安全添加量一般在2-10％，在淋洗类产品中的安全添加量甚至大于10％。而常用最低添加量2％是0.1％的20倍。由此可以推断，0-10mg/mL浓度范围内的EPS-LP-1没有眼刺激作用，可以作为安全的化妆品原料使用。
4.2安全性检测——皮肤封闭斑贴实验
参照《化妆品安全技术规范(2015年版)》进行皮肤封闭型斑贴试验。按表5的标准观察皮肤反应。并记录观察结果。
表5皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
实验结果如下：皮肤封闭型斑贴试验广泛在化妆品领域用于检测化妆品成品或半成品对人体皮肤的不良反应。按表5的标准观察皮肤反应，记录并观察皮肤封闭型斑贴试验结果。结果如表6所示，共30名志愿者完成了EPS-LP-1的斑贴实验，结果未出现阳性反应，说明样品安全。不会引起人体刺激和不良反应。
表6皮肤封闭型斑贴试验结果
5.人体保湿实验
实验中，在左右手臂内侧标记试验区域，尺寸为3cm×3cm，同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔1cm。使用样品之前，测量每个测试区域的空白值，然后每个区域涂抹量为(2.0±0.l)(mg样品·cm2)-1。皮肤含水量(MMV)、经皮水分散失(TEWL)在涂抹后0min、5min、20min和60min时分别进行测定，同一时段各测试点各测3个重复，计算平均值。同一个志愿者的测试必须由同一个测量人员完成，以减少误差。
皮肤含水量(MMV)使用Corneometer探头进行测定，测定结果以水合率表示。水合率公式如下：水合率＝没测试区域时段测量值平均值/每测试区域空白值平均值。
经皮水分散失(TEWL)使用Tewamter探头进行测定，测定结果以水散变化率表示。水散变化率公式如下：水散变化率＝每测试区域每时段测量值平均值/每测试区域空白值平均值。
为了评估LP-EPS对皮肤的保湿效果，进行了短期皮肤即时保湿测试，记录皮肤水分含量变化和经皮水分流失变化。LP-EPS样品为用去离子水溶解的浓度为2wt.％的溶液，空白对照为去离子水。
皮肤水分含量变化，如图19所示，0min时两组的初始数值即皮肤基底数据一样，随着时间的变化，LP-EPS组和空白组均呈现先增后降的趋势，且LP-EPS组的平均水含量(MMV)均高于空白组。如图19和图21所示，皮肤水分含量在0-5min迅速上升，并在5-20min区段内开始下降；20-60min区段内显示出更稳定的趋势。LP-EPS作用60min后，皮肤水分含量为27.54％，与0min(24.39％)相比，皮肤水分含量增加了3.15％；而空白组作用60min后，皮肤水分含量为25.69％，与0分钟(24.39％)相比仅增加1.3％；说明随着时间变化，皮肤水分含量由于吸收了去离子水先上升后下降然后趋于稳定，最终LP-EPS作用60min后皮肤水分含量增加了3.15％，比空白组增幅大1.85％，具有良好的补水保湿效果。
经皮水分流失变化，如图20所示，0min时两组的初始数值既皮肤基底数据一样，随着时间的变化，LP-EPS组和空白组均呈现先增后降的趋势，且LP-EPS组的平均经皮水分流失率均低于空白组。如图20和图21所示，LP-EPS作用下，皮肤经皮水分流失率在0-5min迅速上升，这可能是表皮去离子水挥发导致；在5-60min区段内逐步下降。LP-EPS作用60min后，皮肤经皮水分流失率为5.33％，与0min(6.02％)相比，皮肤经皮水分流失率减少了0.69％。而空白组作用60min后，皮肤经皮水分流失率皮肤为6.01％，与0min(6.02％)相比，皮肤经皮水分流失基本回到了初始值。说明2％的LP-EPS溶液作用60min后，皮肤经皮水分流失率减少了0.69％，而空白组皮肤经皮水分流失基本没有变化。
综上，2％LP-EPS能通过增加皮肤水分含量和减少皮肤经皮水分流失两个途径，共同达到保湿效果。
最后，还需要说明的是，在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 副干酪乳杆菌菌株 SS-01、用该菌株制备的胞外多糖、制备方法及应用
<130> PD220246CN0095
<150> 2022104337502
<151> 2022-04-24
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1522
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 1
gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gagttctcgt tgatgatcgg 60
tgcttgcacc gagattcaac atggaacgag tggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 120
ctgcccttaa gtgggggata acatttggaa acagatgcta ataccgcata gatccaagaa 180
ccgcatggtt cttggctgaa agatggcgta agctatcgct tttggatgga cccgcggcgt 240
attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcgatga tacgtagccg aactgagagg 300
ttgatcggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg 360
aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggctttc 420
gggtcgtaaa actctgttgt tggagaagaa tggtcggcag agtaactgtt gtcggcgtga 480
cggtatccaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 540
ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga 600
tgtgaaagcc ctcggcttaa ccgaggaagc gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga 660
agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag 720
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caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga atgctaggtg ttggagggtt 840
tccgcccttc agtgccgcag ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt acgaccgcaa 900
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cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcttt tgatcacctg agagatcagg 1020
tttccccttc gggggcaaaa tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatgac tagttgccag catttagttg 1140
ggcactctag taagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1200
catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgag 1260
accgcgaggt caagctaatc tcttaaagcc attctcagtt cggactgtag gctgcaactc 1320
gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc 1380
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt gtaacacccg aagccggtgg 1440
cgtaaccctt ttagggagcg agccgtctaa ggtgggacaa atgattaggg tgaagtcgta 1500
acaaggtagc cgtaggagaa cc 1522

Claims (11)

1.一种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）菌株SS-01，其保藏编号为CGMCCNo.23145。
2.一种副干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括：
发酵步骤：将如权利要求1所述的副干酪乳杆菌SS-01经活化、扩大培养处理所得种子液接种至MRS肉汤进行发酵培养处理，然后灭菌、分离得到发酵液上清；
粗胞外多糖提取步骤：将所述发酵液上清进行浓缩富集，再依次经醇沉、去蛋白、醇沉、冻干处理得到粗胞外多糖。
3. 如权利要求2所述的副干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，所述种子液在600nm处 OD值为0.7-1.6，所述种子液的体积和所述MRS肉汤的体积之比为5-30%。
4. 如权利要求2或3任一项所述的副干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，发酵温度为37-45℃，摇床转速150 r/min-180r/min，发酵时间为6-27h。
5.如权利要求4所述的副干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述粗胞外多糖提取步骤中，所述发酵液上清浓缩至原体积的10-15%，首次醇沉处理时，乙醇和浓缩后的发酵液上清体积比4:1-10:1，-4℃醇沉12-24h。
6.如权利要求2、3、5中任一项所述的副干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述粗胞外多糖提取步骤中，所述去蛋白处理包括：将首次醇沉所得产物用水复溶至样品原体积，加入适量木瓜蛋白酶混匀，室温酶解2-10h后再煮沸失活。
7.如权利要求6所述的副干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述粗胞外多糖提取步骤中，所述木瓜蛋白酶添加量与复溶后体系的体积之比为2-10g/100mL。
8.如权利要求2、3、5、7中任一项所述的副干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述粗胞外多糖提取步骤之后还包括：
纯化步骤：将所述粗胞外多糖经透析处理后，再通过DEAE-52纤维树脂柱层析处理，即得纯化胞外多糖。
9.如权利要求8所述的副干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述DEAE-52纤维树脂柱层析处理中使用水进行洗脱。
10.一种由如权利要求2-9中任一项所述的方法制备的副干酪乳杆菌胞外多糖。
11.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品以权利要求10所述的副干酪乳杆菌胞外多糖为活性成分之一。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115161364B (zh) * 2022-09-06 2022-12-09 东北农业大学 提高副干酪乳杆菌jy062胞外多糖产量的制法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063565A (zh) * 2020-09-23 2020-12-11 山东环亿生物科技有限公司 一种灭活乳酸菌菌剂及其制备方法和应用
CN113773999A (zh) * 2021-07-22 2021-12-10 华熙生物科技股份有限公司 副干酪乳杆菌发酵滤液、制备方法及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105820968B (zh) * 2015-01-04 2019-09-06 上海理工大学 一株副干酪乳杆菌及其应用
CN104894021B (zh) * 2015-06-03 2018-02-09 宜兰食品工业股份有限公司 一种副干酪乳杆菌及其应用
CN105368738A (zh) * 2015-10-23 2016-03-02 中国农业大学 一种副干酪乳杆菌及其应用
TWI727293B (zh) * 2018-04-25 2021-05-11 日商曾根農場股份有限公司 第iv型過敏用組成物
CN112143680B (zh) * 2020-09-28 2021-08-17 浙江大学 具有抗氧化功效副干酪乳杆菌zjuids05及其应用
CN113881591B (zh) * 2021-09-27 2023-01-24 四川轻化工大学 一种产多糖的副干酪乳酸杆菌slp16及其应用以及利用该菌株制备得到的饲料添加剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112063565A (zh) * 2020-09-23 2020-12-11 山东环亿生物科技有限公司 一种灭活乳酸菌菌剂及其制备方法和应用
CN113773999A (zh) * 2021-07-22 2021-12-10 华熙生物科技股份有限公司 副干酪乳杆菌发酵滤液、制备方法及其应用

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