CN114468304B - 一种植物乳杆菌dmdl9010微胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents

一种植物乳杆菌dmdl9010微胶囊及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品加工领域，本发明公开了一种植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊及其制备方法和应用。所述制备方法，包括如下步骤：将壳聚糖溶于乳酸溶液中，将pH调节至3～5，加入植物乳杆菌DMDL 9010活化菌泥，充分搅拌，随后加入京尼平溶液，混合均匀，再加入与含司盘80的植物油，混合均匀，搅拌制备油包水乳液，进行交联反应，得到微胶囊悬液，乙酸乙酯洗涤，干燥即得植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊冻干粉。本发明所得植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊具有包埋率高、粒径小、胃肠道耐受性强及制备方法简单等优势，具有较强的应用价值。

Description

一种植物乳杆菌DMDL9010微胶囊及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品加工领域，具体涉及一种植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊及其制备方法和应用。
背景技术
植物乳杆菌属于芽孢杆菌纲乳杆菌属益生菌，是一种厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，通常存在于发酵蔬菜、果汁、发酵乳制品和肉类中，具有丰富的保健作用，如增强机体免疫力、维持肠道菌群平衡、降低血清胆固醇含量、缓解乳糖不耐症和抑制肿瘤细胞的形成等。
据粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)的数据显示，益生菌能发挥益生效果的最低细菌数为106-107CFU/mL。益生菌必须通过胃肠道消化系统并以大量活菌定植于肠道中才能发挥最大的益生特性。然而，不利的储存条件以及人体胃酸、胆汁等消化液的作用均会导致益生菌失活。因此利用包埋技术保护益生菌，使其耐受胃酸及胆盐以充分发挥其益生功能已成为近年来的研究热点。
目前，常用的益生菌包埋方法主要包括喷雾干燥法、乳化法、挤出法、胶凝法和复配多层包埋法。喷雾干燥法将液体进料雾化成10-150微米的液滴，喷入150-250℃的干热空气中，使液滴中水分迅速挥发，形成粉末，从而达到包埋效果，但其所需的高温条件不可避免地会影响益生菌的活性。挤出法是将聚合物溶液与微生物细胞混合，通过注射器针头注射到高压条件下的交联剂溶液中，使两者胶凝化，达到包埋目的，但该方法无法生产小于500微米的微胶囊。胶凝法是在特定成分、温度、溶液pH条件下，通过凝聚层在核心成分周围的沉积形成微球来达到包埋目的。相比于其他方法，该方法生产成本较高，效率更低。复配多层包埋法是基于单种包材包埋益生菌方法的基础上，添加两种或以上的包材进行配合，复配包材之间互相穿插结合，形成更稳固的微胶囊结构。该方法效率高，但生产步骤多，原料复杂。
乳化法由两相组成，即包含益生菌聚合物悬浮液的分散相与植物油(或矿物油)的连续相，通过表面活性剂或乳化剂将两相混合物均质化，发生界面聚合，最终形成乳液。生物交联剂可使益生菌与包埋材料共融，在油相中形成聚合物微珠，随后离心或过滤得到产物，此类微珠粒径属于纳米级别。目前主流包埋材料有海藻酸盐、明胶、羧甲基纤维素、壳聚糖以及固化剂(如氯化钙)，但仍然存在微胶囊粒径大、包埋及存活效果不佳的问题。
中国专利CN201510557120.6公开了一种以脱脂乳、碳酸钙及菌液为水相，通过与油相混合后加入冰醋酸形成微胶囊，其包埋率为76％，平均粒径为100μm。中国专利CN201810897303.6公开了一种基于双乳液结构的益生菌液态制剂及其制备方法，W1/O乳液加入水相经中速剪切混合，得到W1/O/W2型双乳液结构的益生菌乳液制剂，其最佳实施例在pH 1.5的环境下存活率为33.36％。中国专利申请CN201810701045.X公开了一种双乳化法-喷雾干燥生产复合益生菌双层微胶囊的技术方法，在加入植物油等油溶性成分形成内层油性壁材的基础上，再由大豆分离蛋白与麦芽糊精经分子间相互作用形成致密完整的外层囊壁，最终形成W/O/W双层活菌微胶囊，微胶囊粒径在6.5-12.5μm之间。
发明内容
针对现有乳化法制备微胶囊的技术或过程存在制备方法复杂、微胶囊粒径大、包埋及存活效果不佳的不足，本发明的目的是提供一种植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的制备方法及其应用。本发明通过植物乳杆菌细胞壁上的肽聚糖与京尼平、壳聚糖交联，形成包裹植物乳杆菌的纳米级别的微胶囊，同时京尼平自身的聚合反应及壳聚糖分子间形成的大量氢键和糖环结构，使得微胶囊的交联效果和力学强度更好。相比于传统的交联剂，京尼平和壳聚糖制备的微胶囊交联紧密，粒径小，包埋效果好，且该方法操作简便，原料来源简单，具有较强的生产应用价值。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)将活化的植物乳杆菌DMDL 9010作为种子菌液，种子菌液按接入扩大发酵培养基中培养，得到植物乳杆菌DMDL9010发酵液，取其沉淀菌泥，以无菌PBS缓冲液洗涤，得到活化菌泥；
(2)将壳聚糖溶于乳酸溶液中，加入步骤(1)所得的活化菌泥，充分搅拌，得到壳聚糖活菌液；
(3)将司盘溶于植物油中得到植物油混合液；
(4)将步骤(2)所得壳聚糖活菌液加入京尼平溶液中，再加入步骤(3)所得的植物油混合液，混合均匀，形成油包水乳液，进行交联反应，得到微胶囊悬液；
(5)将步骤(4)所得的微胶囊悬液分离，取沉淀用乙酸乙酯洗涤，冷冻干燥，得到微胶囊冻干粉。
优选地，所述步骤(1)中培养基配方为(以重量份数计)：酪蛋白消化物0.8～1.0份，酵母膏0.3～0.5份，葡萄糖1.5～2.0份，柠檬酸三铵0.1～0.2份，硫酸镁0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，乙酸钠0.4～0.5份，吐温80 0.1～0.3份，硫酸锰0.015～0.025份，其余为水。种子培养基初始pH为5.8～6.2；所述扩大发酵培养的条件为：培养基初始pH为6.0，发酵温度25℃-35℃，发酵时间20-30h，接种量5-10％。
优选地，所述的乳酸溶液pH为3～5。
优选地，所述的司盘为司盘80。
优选地，步骤(4)所述的京尼平水溶液的质量浓度为0.1％～2％。
优选地，步骤(4)所述的京尼平水溶液的质量浓度为0.5％～1％。
进一步优选地，步骤(4)所述的京尼平水溶液的质量浓度为1％。
优选地，步骤(2)所述的壳聚糖活菌液中壳聚糖的浓度为15-25g/L，活化菌泥的浓度为1-3g/L。
进一步优选地，步骤(2)所述的壳聚糖活菌液中壳聚糖的浓度为20g/L，活化菌泥的浓度为2g/L。
优选地，步骤(2)所述的乳酸溶液中乳酸的体积分数为0.1-2％。
优选地，步骤(4)所述的壳聚糖活菌液、京尼平水溶液、植物油混合液的体积比为(4-6):1:(20-30)。
进一步优选地，步骤(4)所述的壳聚糖活菌液、京尼平水溶液和植物油混合液的体积比为5:1:26.25。
优选地，步骤(4)所述的交联反应的反应时间为8-12h；步骤(3)所述的司盘80与植物油的体积比为1-1.5:20-30；所述的植物油为大豆油。
进一步，步骤(1)所述扩大发酵培养的条件为：发酵温度32℃，发酵时间28h，接种量9％。
进一步，步骤(4)所述的交联反应的时间为10h；步骤(4)所述的交联反应的搅拌速率为300rpm
进一步，本发明还提出植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊在乳制品发酵中的应用。
进一步，植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊在食品中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明所得到的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊(优选地)包埋率为90.8％，粒径小，颗粒均匀，分散性好，具有较强耐胃酸及胆盐能力，微胶囊在经过2h模拟胃消化和2h模拟肠道消化后，其包埋的植物乳杆菌DMDL 9010的存活率依然能达到90.9％，相比于直接暴露于模拟胃肠道消化的植物乳杆菌DMDL 9010，本发明包埋的植物乳杆菌DMDL 9010存活率提高了43％。
(2)采用FTIR、SEM、光学显微镜及热重分析(图7)发现植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊(优选地)形状规则均匀，接近球型，边缘轮廓清晰，交联效果良好，且随着交联剂京尼平含量的增加，其交联效果也增加，微胶囊开始出现明显质量损失的温度点约为90℃，具有较好的热稳定性。
(3)本发明所得到的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊(优选地)具有较强的储藏稳定性(图8)，在25℃条件下储藏30天，微胶囊内活菌数仅减少了12.4％。
(4)本发明提供的制备方法，通过植物乳杆菌细胞壁上的肽聚糖与京尼平和壳聚糖交联，形成包裹植物乳杆菌的纳米级别的微胶囊。京尼平上的酯基基团与壳聚糖上的氨基反应生成酰胺，使其产生交联作用。在发生交联反应的同时，京尼平自身也发生聚合反应，生成一定长度的聚合物，使反应产生类似大分子交联剂所产生的结果。同时壳聚糖自身分子间形成的大量氢键和糖环结构也使得交联产物的力学强度更好。基于上述原理，本发明所得到的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊交联紧密，粒径在纳米级别。纳米级别的微胶囊能够提高益生菌的包埋率并有助于其在胃肠道中的释放，此外，较小的粒径也有助于维持益生菌的储藏稳定性并降低其对产品质感(如口感)的影响。因此，本发明制备的微胶囊包埋效果好，粒径小，且操作简便，原料来源简单，具有较强的生产应用价值。
附图说明
图1为实施例1-3所制得的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的包埋率结果。
图2为植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的粒径分布图(A：实施例3制得的微胶囊；B：实施例2制得的微胶囊；C：实施例1制得的微胶囊)。
图3为实施例3所制得的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊体外模拟胃肠道消化活菌存活率。
图4为实施例1-3制得的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的光学显微镜结果。
图5为实施例1-3(实施例1-3分别对应上中下谱图)制得的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的红外光谱扫描(FTIR)结果。
图6为实施例1-3制得的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊扫描电镜(SEM)图。
图7为植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的热重分析结果(A：实施例3制得的微胶囊；B：实施例2制得的微胶囊；C：实施例1制得的微胶囊)。
图8为植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的储藏期稳定性结果(A：实施例3制得的微胶囊；B：实施例2制得的微胶囊；C：实施例1制得的微胶囊)。
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
菌体：植物乳杆菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010，保藏编号为CGMCC NO.5172，于2011年8月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株已在中国专利CN102978134A中公开。
实施例1：一种植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的制备方法
(1)菌种活化：将于甘油管中保存的DMDL 9010菌液接种于液体培养基中(接种量2％，v/v)，于恒温37℃生化培养箱中温育16h。将活化的植物乳杆菌DMDL 9010作为种子菌液，该种子菌液的菌含量约为108CFU/mL；
(2)扩大培养：将上述种子菌液按体积比2:100接入初始pH为6.0的扩大发酵培养基中，摇床上培养，发酵温度32℃，接种量9％，发酵28h，得到植物乳杆菌DMDL 9010发酵液；
(3)预处理：将植物乳杆菌DMDL 9010发酵液离心，弃上清，取沉淀菌泥以无菌PBS缓冲液洗涤3次，再次离心，弃上清，得到活化菌泥。
(4)将2g壳聚糖溶于100mL 1％v/v乳酸溶液中，随后使用0.1mol/L KOH溶液将pH调节至4，将重量为0.2g的活化菌泥加入壳聚糖溶液，充分搅拌，得到壳聚糖活菌液。
(5)将1.25mL司盘80溶于25mL大豆油中得到含有司盘80的大豆油混合液。
(6)取5mL壳聚糖活菌液，加入1mL 0.5％(wt.％)的京尼平溶液，再加入步骤(5)的含有司盘80的大豆油混合液，使用磁力搅拌器将体系混合均匀制备油包水乳液，待体系混合均匀后，将转速调为300rpm，反应10h使交联充分进行，得微胶囊悬液。
(7)对步骤(6)所得悬液进行离心分离，乙酸乙酯洗涤，冷冻干燥。
植物乳杆菌DMDL 9010培养基配方为(以重量份数计)：酪蛋白消化物0.9份，酵母膏0.4份，葡萄糖1.8份，柠檬酸三铵0.15份，硫酸镁0.05份，牛肉膏0.75份，磷酸氢二钾0.15份，乙酸钠0.45份，吐温80 0.2份，硫酸锰0.02份，其余为水。
实施例2：一种植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的制备方法
(1)菌种活化：将于甘油管中保存的DMDL 9010菌液接种于液体培养基中(接种量2％，v/v)，于恒温37℃生化培养箱中温育16h。将活化的植物乳杆菌DMDL 9010作为种子菌液，该种子菌液的菌含量约为108CFU/mL；
(2)扩大培养：将上述种子菌液按体积比2:100接入初始pH为6.0的扩大发酵培养基中，摇床上培养，发酵温度32℃，接种量9％，发酵28h，得到植物乳杆菌DMDL 9010发酵液；
(3)预处理：将植物乳杆菌DMDL 9010发酵液离心，弃上清，取沉淀菌泥以无菌PBS缓冲液洗涤3次，再次离心，弃上清，得到活化菌泥。
(4)将2g壳聚糖溶于100mL 1％v/v乳酸溶液中，随后使用0.1mol/L KOH溶液将pH调节至4，将重量为0.2g的活化菌泥加入壳聚糖溶液，充分搅拌，得到壳聚糖活菌液。
(5)将1.25mL司盘80溶于25mL大豆油中得到含有司盘80的大豆油混合液。
(6)取5mL壳聚糖活菌液，加入1mL 0.75％(wt.％)的京尼平溶液，再加入步骤(5)的含有司盘80的大豆油混合液，使用磁力搅拌器将体系混合均匀制备油包水乳液，待体系混合均匀后，将转速调为300rpm，反应10h使交联充分进行，得微胶囊悬液。
(7)对步骤(6)所得悬液进行离心分离，乙酸乙酯洗涤，冷冻干燥。
植物乳杆菌DMDL 9010培养基配方为(以重量份数计)：酪蛋白消化物0.9份，酵母膏0.4份，葡萄糖1.8份，柠檬酸三铵0.15份，硫酸镁0.05份，牛肉膏0.75份，磷酸氢二钾0.15份，乙酸钠0.45份，吐温80 0.2份，硫酸锰0.02份，其余为水。
实施例3：一种植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的制备方法
(1)菌种活化：将于甘油管中保存的DMDL 9010菌液接种于液体培养基中(接种量2％，v/v)，于恒温37℃生化培养箱中温育16h。将活化的植物乳杆菌DMDL 9010作为种子菌液，该种子菌液的菌含量约为108CFU/mL；
(2)扩大培养：将上述种子菌液按体积比2:100接入初始pH为6.0的扩大发酵培养基中，摇床上培养，发酵温度32℃，接种量9％，发酵28h，得到植物乳杆菌DMDL 9010发酵液；
(3)预处理：将植物乳杆菌DMDL 9010发酵液离心，弃上清，取沉淀菌泥以无菌PBS缓冲液洗涤3次，再次离心，弃上清，得到活化菌泥。
(4)将2g壳聚糖溶于100mL 1％v/v乳酸溶液中，随后使用0.1mol/L KOH溶液将pH调节至4，将重量为0.2g的活化菌泥加入壳聚糖溶液，充分搅拌，得到壳聚糖活菌液。
(5)将1.25mL司盘80溶于25mL大豆油中得到含有司盘80的大豆油混合液。
(6)取5mL壳聚糖活菌液，加入1mL 1.0％(wt.％)的京尼平溶液，再加入步骤(5)的含有司盘80的大豆油混合液，使用磁力搅拌器将体系混合均匀制备油包水乳液，待体系混合均匀后，将转速调为300rpm，反应10h使交联充分进行，得微胶囊悬液。
(7)对步骤(6)所得悬液进行离心分离，乙酸乙酯洗涤，冷冻干燥。
植物乳杆菌DMDL 9010培养基配方为(以重量份数计)：酪蛋白消化物0.9份，酵母膏0.4份，葡萄糖1.8份，柠檬酸三铵0.15份，硫酸镁0.05份，牛肉膏0.75份，磷酸氢二钾0.15份，乙酸钠0.45份，吐温80 0.2份，硫酸锰0.02份，其余为水。
微胶囊包埋率测定
取新制的三组湿微胶囊，离心分离出油相，得微胶囊沉淀；以乙酸乙酯对微胶囊沉淀洗涤3次，以无菌PBS缓冲液洗涤1次，分别加入等量无菌PBS缓冲液，震荡均匀；然后在37℃，180rpm条件下溶胀解离反应1h，使植物乳杆菌充分释放，进行梯度稀释，取101、102、103稀释度以固体MRS肉汤培养基进行平板倾注，于37℃条件下培养24h，进行活菌计数。微胶囊包埋率通过下列公式进行计算：
存活率(％)＝(logCFU(N1)/logCFU(N0))×100％
注：式中N0为制备微胶囊时加入的总活菌数，N1为微胶囊溶胀解离1h后的总活菌数。
由图1可知，实施例3得到的微胶囊对植物乳杆菌DMDL 9010的包埋率最高，达到约90.8％；而且微胶囊对植物乳杆菌的包埋率随京尼平添加量减少而降低，说明更多的京尼平能促进壳聚糖与益生菌胞外多糖的交联，使微胶囊能够包埋入更多的益生菌。
微胶囊体外模拟胃肠道消化实验
(1)人工胃液的配制
称取0.88g NaCl，以少量蒸馏水溶解，用1mol/L HCl溶液和1mol/L NaOH溶液调节pH值到3.0，以5g/L的浓度加入胃蛋白酶，最终以蒸馏水定容至30mL，混合均匀，再用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。
(2)人工肠液的配制
称取0.27g KH2PO3，以少量蒸馏水溶解，用1mol/L HCl溶液和1mol/L NaOH溶液调节pH值到6.8，以0.1g/L的浓度加入胰蛋白酶，以0.3％的浓度加入胆盐，以蒸馏水定容至30mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，备用
(3)模拟胃肠道消化
取新制备的实施例3的1.00wt％微胶囊，离心分离油相，以乙酸乙酯洗涤3次，用无菌PBS缓冲液洗涤3次，离心后留下微胶囊沉淀。按10％(v/v)的接种量加入模拟胃液中，混合均匀，在37℃、180rpm模拟消化条件下培养120min后以NaOH溶液调pH至8.0，后加入等体积模拟肠液，震荡均匀。在37℃、180rpm模拟消化条件下培养120min后取样，进行平板菌落计数；微胶囊中菌株存活率由下列公式计算：
存活率(％)＝(logCFU(Nt)/logCFU(N0))×100％
注：式中N0为0h取样的活菌数，Nt为菌株暴露在模拟胃液中120min和模拟肠液中120min后取样的活菌数。
由图3可知，实施例3的微胶囊在经过2h模拟胃消化和2h模拟肠道消化后，其包埋的植物乳杆菌DMDL 9010的存活率依然能达到90.9％，只有约9％的DMDL 9010失活。相比于直接暴露于模拟胃肠道消化的植物乳杆菌DMDL 9010，微胶囊所包埋的DMDL 9010存活率提高了43％左右，说明微胶囊能输送更多具有活性的植物乳杆菌到达人体肠道。
微胶囊光学显微镜表征
取适量新制备好的湿胶囊样品，以乙酸乙酯洗涤，再用PBS缓冲液溶液分散均匀备用；用胶头滴管吸取少量微胶囊悬液滴于载玻片上，小心盖上盖玻片，排除多余气泡。将样品固定于显微镜载物台上，首先以低倍镜观察，记录微胶囊形态；选择视野中央有较多微胶囊的位置，在该处盖玻片滴一滴松柏油，将物镜切换为高倍油镜(放大倍数为1600倍)，调整光线与微调螺旋，直至看见清晰的微胶囊形态并进行记录。实施例1、2、3制备的微胶囊的光学显微镜观察结果如图4所示。通过1600倍光学显微镜放大，可见实施例3制备的微胶囊结构完整，边缘轮廓清晰。
微胶囊红外光谱扫描(FTIR)表征
将三种湿微胶囊样品以乙酸乙酯洗涤3次，与KBr按照1:100(w/w)比例混合研磨，在50℃条件下烘干压片，扫描范围为400-4000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为4cm-1。
实施例1、2、3制备的微胶囊FTIR光谱如图5所示。波长3359cm-1处的强吸收峰归属羟基拉伸振动；吸收峰约为2942cm-1处，归因于碳氢键(C-H基团)的不对称伸缩振动。吸收峰约为1376cm-1处可归因于壳聚糖主醇基团的拉伸。在1000cm-1和1100cm-1之间的吸收带归因于C-O和C-N的拉伸和C-C-N的弯曲振动。天然的壳聚糖约在1630cm-1和1526cm-1处表现出吸收，这是典型的伯胺的N-H弯曲振动。在交联体系中，可以在1544cm-1处发现酰胺II带，具有N-H变形特征，这是由于京尼平酯与羟基、壳聚糖氨基反应生成仲酰胺所致。在1653-1665cm-1的范围对应多糖的羰基键振动(C-O)；1531-1543cm-1之间，可归因于氨基糖酰胺的N-H键，表明存在多糖结合蛋白，推测检测到的是部分细菌表面糖蛋白。
微胶囊是由京尼平与壳聚糖通过羟氨基化和羧基、氨基缩合反应进行交联，由图5可见随着京尼平用量的增加，各基团对应的透光率均向下偏移，说明京尼平含量增加促进了与壳聚糖氨基的交联。
微胶囊电镜扫描(SEM)表征
将三种湿微胶囊样品以乙酸乙酯洗涤3次，并真空干燥，制得微胶囊干样品，将其固定到金属板上，以离子溅射法喷金处理3min，然后用SEM电镜在5kv电压下进行扫描观察，并拍照记录。由图6可知，微胶囊是类球型纳米颗粒，表面较为平滑，致密无可见孔隙(这可能影响后续植物乳杆菌的释放)；大小为500-1000nm，与粒径测试结果相近(图2)。由图可见，微胶囊颗粒以交联成较大颗粒的形式存在，与光学显微镜表征的结果相吻合。
对比三种微胶囊样品，实施例3制备的微胶囊形状更规则均匀，接近球型，边缘轮廓清晰，可见其交联效果比较良好；实施例2制备的微胶囊样品同样较为规则，有部分微胶囊没有形成规则球型；实施例1制备的微胶囊样品的SEM图可见其交联效果较差，形状相较前两者更不规则，可能对植物乳杆菌包埋效果造成负面影响。
实施例4：一种植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊在乳制品发酵中的应用
(1)乳品的制备
以150mL蓝口瓶作为容器，将脱脂奶粉以1:8的比例与100mL蒸馏水混合，再加入质量分数为6％的白砂糖混合均匀；旋紧盖子，在85℃水浴加热条件下进行巴氏灭菌30min，冷却至室温备用。
(2)发酵菌的准备
在嗜热链球菌和德式乳杆菌的基础上分别添加含菌量相等的植物乳杆菌DMDL9010(植物乳杆菌DMDL 9010组)、植物乳杆菌DSM 6595(植物乳杆菌DSM 6595组)和植物乳杆菌DMDL9010微胶囊(植物乳杆菌DMDL9010微胶囊组)；并设置一个空白组：只添加嗜热链球菌和德式乳杆菌。四组菌粉分别用1mL无菌蒸馏水震荡分散均匀。
菌体：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)DMST-H2，保藏编号为GDMCC60642，于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该菌株已在中国专利申请CN201910788676.4中公开。
菌体：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)DMLD-H1，保藏编号为GDMCCNO.60645，于2019年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该菌株已在中国专利申请CN201910800818.4中公开。
菌体：植物乳杆菌DSM 6595为市售菌种，目前其已广泛应用于商业发酵产品。
(3)乳品发酵
将分散好的菌液分别加入牛乳中，微胶囊直接加入牛乳，混合均匀；在43℃水浴加热条件下进行发酵；待发酵乳样品pH值达到4.7左右，或发酵时间达到10h后，可视为发酵终点。发酵完成的乳品放入4℃冰箱冷藏，进行后酸化。
(4)乳制品发酵过程理化指标测定
pH值：分别在0、2、4、6、8、10h时取适量四组试验样品，以pH计进行pH值测量，重复2次平行实验。
酸度：分别在0、2、4、6、8、10h时取四组试验样品，每组每次取约1g，每个样品以4mL蒸馏水稀释均匀，加入1滴0.5％酚酞试剂混匀；用0.01mol/L NaOH标准溶液进行滴定，待溶液呈现浅红色并30s内不褪色时，视为滴定终点。记录消耗NaOH溶液体积，做2次平行。样品酸度通过下列公式计算：
持水力：分别在2、4、6、8、10h时取适量四组试验样品，分装于1mL EP管中，称取并记录质量m1，后以8000rpm，2min条件离心，吸走上层清液，再次称取并记录质量m2，重复2次平行实验。样品持水力通过下列公式计算：
持水率(％)＝m2/m1×100％
注：m1为离心前发酵乳质量，m2为离心吸走上清液后沉淀质量。
由表1可知，四种配方的乳品pH值变化规律相近，发酵2h内pH降低的速率最快，且在嗜热链球菌与德氏乳杆菌的基础上添加植物乳杆菌DMDL 9010、植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊和对照菌株植物乳杆菌DSM 6595的乳制品pH值均比单独添加嗜热链球菌和德氏乳杆菌(空白组)菌株的乳制品低。植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊组pH值相比植物乳杆菌DMDL9010组稍高，推测是由于微胶囊包埋了植物乳杆菌使其无法完全释放，利用乳制品进行代谢，在发酵结束后仍有部分植物乳杆菌未从微胶囊中释放。因此，在人体饮用发酵乳后，未释放的植物乳杆菌受到微胶囊的保护经过人体胃消化，到达小肠，可提升植物乳杆菌DMDL9010的存活率，并促进其在小肠的定植。
表1添加不同益生菌菌株乳制品发酵过程的pH值
如表2所示，四种乳制品发、酵酸度在2h时显著上升，与pH的显著下降相符合。在发酵过程中，可见6、8、10h时空白组的酸度相比其他三组是最低的，而植物乳杆菌DMDL 9010组和植物乳杆菌DSM 6595组最终酸度高于植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊组，同样说明微胶囊中的植物乳杆菌DMDL 9010未完全释放。
表2添加不同益生菌菌株乳制品发酵过程的酸度
注：酸度以°T记
根据表3可知，发酵至2h时，四组发酵乳持水力均达到了35％以上，其中空白组和植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊发酵组的持水力最强，说明其凝乳效果最佳。后续各发酵组的持水力均呈现下降趋势，推测是由于取样时机械外力破坏了凝乳结构，导致乳清析出，使持水力降低。到达发酵终点10h时，持水力最强的是植物乳杆菌DSM 6595发酵组，其次是植物乳杆菌DMDL 9010发酵组，持水力最低的是只添加了空白组的发酵组，说明添加植物乳杆菌复配嗜热链球菌和德氏乳杆菌联合发酵能有效提高发酵乳的凝乳效果，使产品结构更加稳定。
表3添加不同益生菌菌株乳制品发酵过程的持水力
注：持水力以％记
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将活化的植物乳杆菌DMDL 9010作为种子菌液，种子菌液接入扩大发酵培养基中培养，得到植物乳杆菌DMDL9010发酵液，取其沉淀菌泥，以无菌PBS缓冲液洗涤，得到活化菌泥；
(2)将壳聚糖溶于乳酸溶液中，加入步骤(1)所得的活化菌泥，充分搅拌，得到壳聚糖活菌液；
(3)将司盘溶于植物油中得到植物油混合液；
(4)将步骤(2)所得壳聚糖活菌液加入京尼平溶液中，再加入步骤(3)所得的植物油混合液，混合均匀，形成油包水乳液，进行交联反应，得到微胶囊悬液；
(5)将步骤(4)所得的微胶囊悬液分离，取沉淀用乙酸乙酯洗涤，冷冻干燥，得到微胶囊冻干粉；
步骤(4)所述的京尼平水溶液的质量浓度为0.1％～2％；步骤(4)所述的壳聚糖活菌液、京尼平水溶液和植物油混合液的体积比为(4-6):1:(20-30)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的壳聚糖活菌液中壳聚糖的浓度为15-25g/L，活化菌泥的浓度为1-3g/L；步骤(4)所述的京尼平水溶液的质量浓度为0.5％～1％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的交联反应的时间为8-12h；
步骤(3)所述的司盘与植物油的体积比为1-1.5:20-30。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的植物油为大豆油；所述扩大发酵培养的条件为：培养基初始pH为6.0，发酵温度25℃-35℃，发酵时间20-30h，接种量5-10％；所述的乳酸溶液pH为3～5；所述的司盘为司盘80。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的乳酸溶液中乳酸的体积分数为0.1-2％；步骤(2)所述的壳聚糖活菌液中壳聚糖的浓度为20g/L，活化菌泥的浓度为2g/L；步骤(4)所述的京尼平水溶液的质量浓度为1％；步骤(4)所述的壳聚糖活菌液、京尼平水溶液和植物油混合液的体积比为5:1:26.25；步骤(4)所述的交联反应的时间为10h；步骤(4)所述的交联反应的搅拌速率为300rpm。
6.权利要求1-5任意一项所述的方法制得的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊。
7.权利要求6所述的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊在发酵乳中的应用。
8.权利要求6所述的植物乳杆菌DMDL 9010微胶囊在食品中的应用。
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