CN111996184B - 一种乳酸菌的固定化方法及在制备果蔬饮料中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乳酸菌的固定化方法及在制备果蔬饮料中的应用，属于农产品加工技术领域，即以海藻酸钠‑碳点壳聚糖‑海藻酸钠‑碳点壳聚糖为固定化细胞载体，经过对乳酸菌双层固定，不仅提高了乳酸菌的存活率，同时由于碳点的引入强化细胞载体流变和力学性能，增强了乳酸菌固定化颗粒机械强度，提高了乳酸菌固定化颗粒包埋率，固定化乳酸菌发酵性能稳定，发酵效果好，乳酸菌固定化颗粒稳定性高，使用寿命长，成本低；在果蔬发酵中，通过添加氨基酸提供氮源，添加还原糖增加碳源，进行乳酸菌发酵，缩短了时间，发酵产品风味明显改善。

Description

一种乳酸菌的固定化方法及在制备果蔬饮料中的应用
技术领域
本发明属于农产品加工技术领域，具体是涉及一种乳酸菌的固定化方法及在制备果蔬饮料中的应用。
背景技术
乳酸菌是一类能利用可溶性碳水化合物产生大量乳酸的细菌，可降解脂类和蛋白质并产生多种人体必需氨基酸和维生素，是对宿主具有潜在益生作用的益生菌；用乳酸菌发酵果蔬，在丰富营养价值的同时还可以产生特殊的风味物质，如醇、醛、酸、酯和硫化物等。乳酸菌具有提高抗氧化性、调节新陈代谢、延缓衰老、增强抗肿瘤能力等功能。乳酸菌参与发酵可改善人体消化情况，促进维生素和矿物质的吸收和利用。用乳酸菌发酵工艺研发果蔬制品既能够获得优良的风味品质，又可以赋予产品营养保健功能，在发酵过程中由于乳酸菌参与分解代谢，使得果蔬中酚类物质、维生素等成分含量增加，抗氧化能力增强。果蔬发酵工艺主要有游离细胞发酵法和固定化细胞发酵法。固定化细胞发酵法主要优点有：（1）细胞无需进行酶的分离与纯化，保证了酶的活力不受到损失；（2）细胞具有辅酶再生系统，因而无需添加额外的辅助因子，且较单一酶的催化，还具备多酶级联催化的潜力；（3）细胞内环境可很好地保持酶的原始活性，对复杂的外部环境有较好的抵御能力。
壳聚糖对各种菌株都有良好的抗菌效果，壳聚糖在酸性情况下带正电荷，其抗菌原理 主要是小分子量的壳聚糖能穿透细胞壁进入细胞，导致细菌的代谢紊乱，从而起到杀菌作 用。壳聚糖包覆的海藻酸钠微球作为固定化乳酸菌凝胶珠载体，可以保证微生物目标物在固体体系中的释放，从而使细胞开始并引导发酵。研究表明，壳聚糖包覆的海藻酸钠微球作为固定化细胞载体能够提高热稳定性细胞及残留酶活。碳点是一种新型碳纳米材料，由于具有良好的水溶解性、生物相容性和低细胞毒性及表面功能化等优异性能，成为研究热点。目前常用固定化细胞载体对细胞酶活存在着一定的毒性，容易导致细胞活性丧失或机械强度差等问题。 因此，开发新型高效、无毒、廉价的固定化材料仍是目前固定化细胞技术发展的主要方向。
发明内容
本发明目的是提供一种固定化乳酸菌的制备方法，该方法制备的固定化乳酸菌生物相容性好、安全无毒、负载量大、稳定性高、使用寿命长，以及将固定化乳酸菌应用在制备果蔬饮料中。
本发明方法以碳点-聚乙烯醇-壳聚糖-海藻酸钠为固定化细胞载体，经过双层对乳酸菌的固定，不仅提高了乳酸菌的存活率，同时由于碳点的引入强化细胞载体流变和力学性能，增强了乳酸菌固定化颗粒机械强度，提高了乳酸菌固定化颗粒包埋率，固定化乳酸菌发酵性能稳定，发酵效果好，乳酸菌固定化颗粒稳定性高，使用寿命长，成本低；在果蔬发酵中，通过添加氨基酸提供氮源，添加葡萄糖增加碳源，进行乳酸菌发酵，缩短了时间，发酵产品风味明显改善。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
1、乳酸菌菌悬液制备
将保存的乳酸菌菌株分别用MRS液体培养基活化活化2~3次，然后接种于MRS液体培养基中，于37℃下培养，取对数生长期培养液离心，收集菌体，菌体用无菌生理盐水制成乳酸菌菌悬液，活菌数≥1.0×107 CFU/mL；
所述乳酸菌为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、保加利亚乳杆菌（Lac.delbrueckii subsp）中的一种或几种；
2、海藻酸钠乳酸菌胶珠制备
按体积比1:8~12的比例，将乳酸菌菌悬液和重量体积浓度2~5%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后静置片刻，然后用注射器吸取混合液，在距离液面25~35cm的高度以1.5~2mL/min速度逐滴滴入到0.15mol/L的CaCl2溶液中，以150r/min转速搅拌，固化30~40min，过滤，胶珠用无菌去离子水洗去表面的CaCl2溶液，于4℃冰箱中贮存备用；
3、海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化
取碳点壳聚糖溶液，用1mol/L NaOH调节pH为6，添加与碳点壳聚糖溶液等体积的蒸馏水稀释，按重量比1: 8~12的比例将步骤（2）的海藻酸钠乳酸菌胶珠加入碳点壳聚糖稀释液中，在摇床中混合10~15min，胶珠用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤，完成第一层碳点壳聚糖涂层；按重量比1: 8~12的比例，将第一层碳点壳聚糖涂层的乳酸菌胶珠与重量浓度0.10~0.20%的无菌海藻酸钠溶液在摇床中混合10~15min，过滤，用无菌去离子水洗涤胶珠，按重量比1: 8~12的比例将洗涤后的胶珠加入到碳点壳聚糖稀释液中，在摇床中混合10~15min，用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤，得到海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球；
所述碳点壳聚糖溶液的制备方法如下：
（1）碳点合成：按重量体积比g:mL=1~3: 50~100的比例，将DL-丙氨酸加到去离子水中，超声20~30min后转移至聚四氟乙烯反应釜中，于200℃下加热8~12h，自然冷却后，用孔径为0.22μm滤膜过滤，得到水溶性碳点；
（2）碳点壳聚糖复合物制备：将步骤（1）水溶性碳点、聚乙烯醇、壳聚糖、重量浓度1%乙酸溶液混合，搅拌混合1~2h，即得碳点壳聚糖溶液，其中水溶性碳点、聚乙烯醇、壳聚糖的重量比为0.5:300:30~50，壳聚糖与1%乙酸溶液的重量体积比1:100~150；
4、将果蔬去皮，切成果肉丁榨汁，用100目筛分果肉纤维和果汁，得果蔬原汁，用饱和碳酸钠溶液调pH值至7.0，进行巴氏消毒，待果蔬汁冷却到室温后，与步骤3制备的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球按重量比1000~2000:1的比例混合得混合物，同时加入还原糖、氨基酸，其中还原糖在混合物中的重量浓度为5~10%，氨基酸在混合物中的重量浓度为3~5%，混匀后，37℃发酵24~72h，过滤去除海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球，发酵液即为乳酸菌果蔬饮料，或添加辅料进行调配，将得到的乳酸菌果蔬饮料贮藏于4℃冰箱中；
所述氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或几种；
所述还原糖为葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖中的一种或几种。
相对于现有技术，本发明具有以下显著优点：
1、本发明制备的固定化乳酸菌，利用碳点-聚乙烯醇-壳聚糖-海藻酸钠双层对乳酸菌的固定，提高了乳酸菌的存活率，同时碳点的引入强化细胞载体流变和力学性能，增强了乳酸菌固定化颗粒机械强度，提高了乳酸菌固定化颗粒包埋率；
2、通过固定化乳酸菌在果蔬汁发酵液中不同时间的乳酸菌的存活率的测定，经过六周后，乳酸菌还有80%的存活率，而未固定的乳酸菌在3周后就全部死亡，这也为乳酸菌果蔬汁中益生菌的利用提供了理论支持；
3、本发明制备的固定化乳酸菌发酵性能稳定，发酵效果好，乳酸菌固定化颗粒稳定性高，使用寿命长，在应用中通过添加氨基酸提供氮源、还原糖增加碳源，有利于发酵，发酵时间缩短，发酵产品澄清，风味得到改善。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明中采用的乳酸菌为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、保加利亚乳杆菌（Lac.delbrueckii subsp），由昆明理工大学生命科学与技术学院微生物研究组提供；
实施例1：脐橙汁乳酸菌饮料的制备
（1）乳酸菌菌悬液制备：将嗜酸乳杆菌冻干粉（-80℃冷藏）接种于MRS液体培养基中，连续活化3代，然后按 3% 的接种量接种于1L MRS 液体培养基中，37℃扩大培养至生长对数期取出，将所得菌液离心（4℃、5000 r/min，10 min），倒掉上层培养基，用无菌生理盐水将沉淀洗3次后得到菌泥，再将其转入无菌生理盐水中震荡均匀得乳酸菌菌悬液，乳酸菌菌悬液活菌数≥1.0×107 CFU/mL；
（2）碳点合成：100g的DL-丙氨酸加到5000 mL去离子水中，超声20min后转移至聚四氟乙烯反应釜，于200℃下加热8 h，自然冷却后，先用孔径为0.22μm滤膜过滤，得到水溶性碳点；
（3）碳点壳聚糖溶液制备：用重量浓度1%的乙酸溶解壳聚糖，然后加入步骤（2）制备的水溶性碳点、聚乙烯醇，搅拌混合1h，得到碳点壳聚糖溶液，其中水溶性碳点、聚乙烯醇、壳聚糖的重量比为0.5:300:30，壳聚糖与1%乙酸溶液的重量体积比1:100；
（4）海藻酸钠乳酸菌胶珠制备：将10mL乳酸菌菌悬液和重量体积浓度3%的无菌海藻酸钠溶液100mL混合，用无菌玻璃棒搅拌均匀，静置片刻，然后用10mL一次性医用注射器吸取混合液，在距离液面30cm左右的高度以1.5-2mL/min速度逐滴滴入到0.15mol/L的CaCl2溶液1000mL中，以150r/min转速搅拌，固化30min，过滤得海藻酸钠乳酸菌胶珠，用无菌去离子水洗去胶珠表面的CaCl2溶液，于4℃冰箱中贮存备用；
（5）乳酸菌的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化：取1000mL碳点壳聚糖溶液，用1mol/L NaOH调节pH为6，用蒸馏水稀释至 2000mL，将步骤（4）海藻酸钠乳酸菌胶珠20g加入碳点壳聚糖稀释液200g中，在摇床中混合15min，涂层完成，用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤，得到海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化乳酸菌微球；将得到的海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化乳酸菌微球20g与重量浓度0.15%的无菌海藻酸钠溶液200g在摇床中混合15min，过滤，用无菌去离子水洗涤微球，按重量比1:10的比例将洗涤后的微球加入到碳点壳聚糖稀释液中，在摇床中混合10min，用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤微球，得到海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球；
（6）脐橙汁乳酸菌饮料制备：将脐橙洗净去皮，脐橙切成果肉丁榨汁，用100目筛分果肉纤维和果汁，得澄清脐橙汁，用饱和碳酸钠溶液调pH值至7.0，进行巴氏消毒，待冷却到室温后，与步骤（5）的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化嗜酸乳杆菌微球按质量比1000:1的比例混合，同时加入5%葡萄糖、4%甘氨酸，混匀，37℃发酵48h，过滤去除海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化乳酸菌微球，发酵液进行常规调配，得到脐橙汁乳酸菌饮料，将得到的脐橙汁乳酸菌饮料贮藏于4℃冰箱中。
（7）脐橙汁乳酸菌饮料感官评价
感官评价对样品的总体接受度、气味、口味和表观进行评分，感官评价小组由10名食品专业人员组成，利用标度法对每项指标进行打分，样品的最终评分取感官评价小组的平均分，评分标准见表1；
（8）脐橙汁乳酸菌饮料性能测定
总酸：参照 GB/T 12456-2008 采用酸碱滴定法；总酚：GBT 8313-2008中的福林酚试剂比色法；pH 值：参考 GB10468-1989 采用电位差法；活菌数：参考 GB 478935-2010采用稀释平板计数法进行测定；超氧化物歧化酶类似物（SOD-like）值测定：发酵果汁经 8000r/min低温4℃离心10 min，取上清液作为测试样，使用邻苯三酚自氧化法测定SOD-like活性，结果见表2。
实施例2： 苹果汁乳酸菌饮料制备
（1）乳酸菌菌悬液制备：同实施例1，不同在于乳酸菌为植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌；
（2）碳点合成：按重量体积比g:mL=2: 70的比例，将DL-丙氨酸加到去离子水中，超声30min后转移至聚四氟乙烯反应釜中，于200℃下加热10h，自然冷却后，用孔径为0.22μm滤膜过滤，得到水溶性碳点；
（3）碳点壳聚糖复合物制备：用重量浓度1%的乙酸溶解壳聚糖，然后加入步骤（2）制备的水溶性碳点、聚乙烯醇，搅拌混合2h，得到碳点壳聚糖溶液，其中水溶性碳点、聚乙烯醇、壳聚糖的重量比为0.5:300:40，壳聚糖与1%乙酸溶液的重量体积比1:120；
（4）按体积比1:11的比例，将植物乳杆菌菌悬液、保加利亚乳杆菌菌悬液分别与重量体积浓度4%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后静置片刻，然后用注射器吸取混合液，在距离液面28cm左右高度以1.5~2mL/min速度逐滴滴入到0.15mol/L的CaCl2溶液中，以150r/min转速搅拌，固化40min，过滤，胶珠用无菌去离子水洗去表面的CaCl2溶液，制得海藻酸钠植物乳杆菌胶珠和海藻酸钠保加利亚乳杆菌胶珠，于4℃冰箱中贮存备用；
（5）乳酸菌的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化：同实施例1，制得海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化保加利亚乳杆菌微球、海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化植物乳杆菌微球；
（6）苹果汁乳酸菌饮料制备：将苹果洗净，切成果肉丁榨汁，可加0.1% VC防止褐变，用100目筛分果肉纤维和果汁，得苹果汁，用饱和碳酸钠溶液调pH值至7.0，进行巴氏消毒，待冷却到室温后，按质量比1500:1的比例与步骤（5）制备的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化保加利亚乳杆菌微球及植物乳杆菌微球（2种微球质量比1:1）混合，同时加入3%蔗糖、3%乳糖、3%丝氨酸，混匀，37℃发酵24h，过滤去除海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化乳酸菌微球，发酵液进行常规调配，得到苹果汁乳酸菌饮料，将得到的苹果汁乳酸菌饮料贮藏于4℃冰箱中。
（7）苹果汁乳酸菌饮料感官评价：同实施例1。
（8）苹果汁乳酸菌饮料性能测定：同实施例1。
实施例3：胡萝卜汁乳酸菌饮料制备
（1）乳酸菌菌悬液制备：同实施例1，乳酸菌为干酪乳杆菌；
（2）碳点合成：按重量体积比g:mL=3:100的比例，将DL-丙氨酸加到去离子水中，超声25min后转移至聚四氟乙烯反应釜中，于200℃下加热12h，自然冷却后，用孔径为0.22μm滤膜过滤，得到水溶性碳点；
（3）碳点壳聚糖复合物制备：用重量浓度1%的乙酸溶解壳聚糖，然后加入步骤（2）制备的水溶性碳点、聚乙烯醇，搅拌混合1.5h，得到碳点壳聚糖溶液，其中水溶性碳点、聚乙烯醇、壳聚糖的重量比为0.5:300:50，壳聚糖与1%乙酸溶液的重量体积比1:150；
（4）海藻酸钠乳酸菌胶珠制备：按体积比1:9的比例，将步骤（1）乳酸菌菌悬液和重量体积浓度2.5%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后静置片刻，然后用注射器吸取混合液，在距离液面35cm的高度以1.5~2mL/min速度逐滴滴入到0.15mol/L的CaCl2溶液中，以150r/min转速搅拌，固化35min，过滤，胶珠用无菌去离子水洗去表面的CaCl2溶液，于4℃冰箱中贮存备用；
（5）取碳点壳聚糖溶液，用1mol/L NaOH调节pH为6，添加与碳点壳聚糖溶液等体积的蒸馏水稀释，按重量比1: 8的比例将步骤（4）的海藻酸钠乳酸菌胶珠加入碳点壳聚糖稀释液中，在摇床中混合12min，涂层完成，用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤，得到海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化乳酸菌微球；按重量比1:11的比例将得到的海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化乳酸菌微球与0.18%无菌海藻酸钠溶液，在摇床中混合15min，过滤，用无菌去离子水洗去胶珠，按重量比1:9加入碳点壳聚糖稀释液中，在摇床中混合15min，用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤，得到海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球；
（6）胡萝卜汁乳酸菌饮料制备：将胡萝卜洗净，切成果肉丁，加入10倍的蒸馏水，榨汁，用100目筛分果肉纤维和果汁，得胡萝卜汁，用饱和碳酸钠溶液调pH值至7.0，进行巴氏消毒，待冷却到室温后，与步骤（5）制备的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖干酪乳杆菌微球按质量比2000:1混合，同时加入3%葡萄糖、3%半乳糖、2%苏氨酸，3%酪氨酸混匀，37℃发酵72 h，过滤去除海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化乳酸菌微球，发酵液进行调配，得到胡萝卜乳酸菌饮料，将得到的苹果汁乳酸菌饮料贮藏于4℃冰箱中。
（7）胡萝卜汁乳酸菌饮料感官评价：同实施例1；
（8）胡萝卜汁乳酸菌饮料性能测定：同实施例1。
实施例4：石榴汁乳酸菌饮料制备
（1）乳酸菌菌悬液制备：同实施例1，乳酸菌为植物乳杆菌；
（2）碳点合成：同实施例2；
（3）碳点壳聚糖复合物制备：同实施例2；
（4）海藻酸钠乳酸菌胶珠制备：同实施例1；
（5）乳酸菌的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化：同实施例1；制得海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化植物乳杆菌微球；
（6）石榴汁乳酸菌饮料制备：将石榴剥皮，将石榴籽榨汁，用100目筛分果肉纤维、籽和果汁，得石榴汁，用饱和碳酸钠溶液调pH值至7.0，进行巴氏消毒，待冷却到室温后，按质量比1500:1的比例与步骤（5）制备的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化植物乳杆菌微球混合，同时加入6%果糖、4%阿拉伯糖、1%甘氨酸、3%天冬酰胺，混匀，37℃发酵24h，过滤去除海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化乳酸菌微球，发酵液进行调配，得到石榴汁乳酸菌饮料，将得到的石榴汁乳酸菌饮料贮藏于4℃冰箱中；
（7）石榴汁乳酸菌饮料感官评价：同实施例1；
（8）石榴汁乳酸菌饮料性能测定：同实施例1。
实施例5：杨梅汁乳酸菌饮料制备
（1）乳酸菌菌悬液制备：同实施例1，乳酸菌为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌；
（2）碳点合成：同实施例1；
（3）碳点壳聚糖复合物制备：同实施例1；
（4）海藻酸钠乳酸菌胶珠制备：同实施例1；
（5）乳酸菌的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化：同实施例1；制得海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化植物乳杆菌微球、海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化嗜酸乳杆菌微球；
（6）杨梅汁乳酸菌饮料制备：将杨梅洗净，榨汁，用100目筛分果肉纤维和果汁，得杨梅汁，用饱和碳酸钠溶液调pH值至7.0，进行巴氏消毒，待冷却到室温后，按质量比1200:1的比例与步骤（5）制备的海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化嗜酸乳杆菌微球及植物乳杆菌微球（2种微球质量比1:1）混合，同时加入3%蔗糖、5%阿拉伯糖、3%丝氨酸、2%谷氨酰胺，混匀，37℃发酵72h，过滤去除海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖固定化乳酸菌微球，发酵液进行调配，得到杨梅汁乳酸菌饮料，将得到的杨梅汁乳酸菌饮料贮藏于4℃冰箱中；
（7）杨梅汁乳酸菌饮料感官评价：同实施例1；
（8）杨梅汁乳酸菌饮料性能测定：同实施例1。
表1 发酵后乳酸菌果蔬汁感官分析
本发明制备的固定化乳酸菌用于乳酸果汁发酵对不同水果有不同影响，总体对本身风味浓郁且酸味较明显的果蔬汁有正面影响，如苹果、石榴、脐橙、杨梅，而对本身风味强度和酸味较弱的果蔬汁影响较小，如胡萝卜。
表2发酵后乳酸菌果蔬汁性能指标
表中（）部分为发酵前原汁的性能指标
性能测试结果表明，用本发明制备的固定化乳酸菌发酵果汁，总酸、总酚都有所提高，pH下降，活菌数达到109 CFU/mL以上；超氧化物歧化酶类似物（SOD-like）活性表征物质清除活性氧的能力，是评价果蔬汁抗氧化活性的典型指标之一，本发明制备的乳酸菌果汁的SOD-like都呈增加趋势，尤其脐橙汁、石榴汁及杨梅汁，这些结果表明本发明制备的乳酸菌果汁的品质得到较大提高。

Claims (5)

1.一种固定化乳酸菌在制备果蔬饮料中的应用，所述固定化乳酸菌制备方法如下：
（1）乳酸菌菌悬液制备
将保存的乳酸菌菌株分别用MRS液体培养基活化2~3次，然后接种于MRS液体培养基中，于37℃下培养，取对数生长期培养液离心，收集菌体，菌体用无菌生理盐水制成乳酸菌菌悬液，活菌数≥1.0×107 CFU/mL；
（2）海藻酸钠乳酸菌胶珠制备
按体积比1:8~12的比例，将乳酸菌菌悬液和重量体积浓度2~5%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后静置片刻，然后用注射器吸取混合液，在距离液面25~35cm的高度以1.5~2mL/min速度逐滴滴入到0.15mol/L的CaCl2溶液中，以150r/min转速搅拌，固化30~40min，过滤，胶珠用无菌去离子水洗去表面的CaCl2溶液，于4℃冰箱中贮存备用；
（3）海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化
取碳点壳聚糖溶液，用1mol/L NaOH调节pH为6，添加与碳点壳聚糖溶液等体积的蒸馏水稀释，按重量比1: 8~12的比例将步骤（2）的海藻酸钠乳酸菌胶珠加入碳点壳聚糖稀释液中，在摇床中混合10~15min，胶珠用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤，完成第一层碳点壳聚糖涂层；按重量比1: 8~12的比例，将第一层碳点壳聚糖涂层的乳酸菌胶珠与重量浓度0.10~0.20%的无菌海藻酸钠溶液在摇床中混合10~15min，过滤，用无菌去离子水洗涤胶珠，按重量比1: 8~12的比例将洗涤后的胶珠加入到碳点壳聚糖稀释液中，在摇床中混合10~15min，用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤，得到海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球;
所述碳点壳聚糖溶液的制备方法如下：
（1）碳点合成：按重量体积比g:mL=1~3: 50~100的比例，将DL-丙氨酸加到去离子水中，超声20~30min后转移至聚四氟乙烯反应釜中，于200℃下加热8~12h，自然冷却后，用孔径为0.22μm滤膜过滤，得到水溶性碳点；
（2）碳点壳聚糖复合物制备：将步骤（1）水溶性碳点、聚乙烯醇、壳聚糖、重量浓度1%乙酸溶液混合，搅拌混合1~2h，即得碳点壳聚糖溶液，其中水溶性碳点、聚乙烯醇、壳聚糖的重量比为0.5:300:30~50，壳聚糖与1%乙酸溶液的重量体积比1:100~150。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：乳酸菌为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、保加利亚乳杆菌（Lac.delbrueckii subsp）中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将果蔬去皮，切成果肉丁榨汁，用100目筛分果肉纤维和果汁，得果蔬原汁，用饱和碳酸钠溶液调pH值至7.0，进行巴氏消毒，待果蔬汁冷却到室温后，与海藻酸钠-碳点壳聚糖-海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球按重量比1000~2000:1的比例混合得到混合物，同时加入还原糖、氨基酸，其中还原糖在混合物中的重量浓度为5~10%，氨基酸在混合物中的重量浓度为3~5%，混匀后，37℃发酵24~72h，过滤去除海藻酸钠-碳点壳聚糖双层固定化乳酸菌微球，发酵液即为乳酸菌果蔬饮料，或添加辅料进行调配，将得到的乳酸菌果蔬饮料贮藏于4℃冰箱中。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：还原糖为葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖中的一种或几种。
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