CN111357901B - 益生菌发酵果蔬饮料产品 - Google Patents
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Abstract
本发明属于饮用品技术领域，具体涉及一种益生菌发酵果蔬饮料。是以新鲜果蔬为原料，经过干酪乳杆菌NCU215发酵而成的风味卓越，营养协调，不添加任何香精、色素或防腐剂的益生菌发酵果蔬饮料。具有以下优点：(1)经过益生菌NCU215发酵，能增加果蔬中风味物质种类含量，使得产品具有独特的发酵风味，酸味柔和，香气怡人(烯萜类化合物大量降解，生腥味明显减弱，醇、酮、烃类化合物含量明显增加、酯类、醇类、醛类物质含量也均有增加)；(2)采用非浓缩加工工艺，充分保留了果蔬原有的香味成分和营养物质；(3)产品不添加任何香精、色素、防腐剂，更健康安全。
Description
技术领域：
本发明属于饮用品技术领域，具体涉及益生菌发酵果蔬饮料产品。
背景技术：
随着人们对健康生活追求的日趋加强，由新鲜果蔬经过一定工艺所制成的橙汁、黄瓜汁、番茄汁、西瓜汁、哈密瓜汁等果蔬饮料在市场上广受欢迎。如CN 108936167A公开了《一种多种益生菌发酵果蔬汁饮料的制备方法》，步骤包括挑选果蔬原料；果蔬原料清洁加工；制备原料汁；原料汁定容与调配；灌装；灭菌；接种；后熟；储存。该发明依次经过原料挑选、原料清洁、原料汁制备、调配、灌装、灭菌、冷却、接种发酵、后熟和储藏等步骤，得到多种益生菌发酵果蔬汁饮料，能最大限度保留多种营养成分，口感酸甜适中，在保留原料营养成分的同时具有益生菌发酵产物等营养物质，为人体提供丰富营养，起到很好的保健作用，具有清凉止渴、抑菌抗癌强健身体、抗氧化等功效。CN 105995710A公开了一种《植物益生菌发酵果蔬浆方法》，通过果蔬前处理、破碎、软化、果蔬制浆、调配、一次杀菌冷却、发酵、离心、脱气、均质、二次杀菌冷却、无菌灌装步骤完成。该发明通过不同的乳酸菌对酸性较弱的果蔬浆进行发酵，产生大量的乳酸等有机酸，从而使其pH降低，同时产生较好的发酵风味，降低了杀菌的条件，节约成本同时保留了果蔬本身的营养、增加发酵产物营养成分；同时通过卧螺离心机浆发酵后的果蔬原浆进行离心分离酵泥，有效提高发酵果蔬浆在饮料行业利用的稳定性。解决了低酸以及酸性果蔬原浆在保质期较短、产品风味不佳、加工成本高以及加工中营养损失严重的问题。
但现有技术普遍存在发酵时间长、生腥味明显以及添加香精、色素、防腐剂等问题。本发明旨在提供一种选自新鲜果蔬原料，经过清洗打浆配料发酵而成的果蔬饮料，该法制备的益生菌发酵果蔬饮料能够有效消除新鲜果蔬如胡萝卜、苦瓜等榨汁或打浆后普遍存在的野蒿味等不良风味，提供较柔和的酸味，此外对人体肠道健康具有一定功能。与市场上鲜榨果蔬汁饮料相比，本产品实现了货架期长；与同类产品化果蔬汁饮料相比，本产品不添加任何香精、色素、防腐剂，更符合消费者对健康饮品的要求。
发明内容：
本发明的目的是提供一种以新鲜果蔬为原料，经过益生菌发酵而成的风味卓越，营养协调，不添加任何香精、色素或防腐剂的益生菌发酵果蔬饮料。
所述益生菌发酵果蔬饮料由以下原料经益生菌发酵所得：果蔬浆料15～35份、纯净水45～84.95份、葡萄糖或代用糖0.05～20份；
进一步地，还包括异维生素C钠或维生素C 0.01～0.5份；
所述的代用糖是白砂糖、三氯蔗糖、阿斯巴甜、甜菊糖、安赛蜜、甜蜜素或低聚异麦芽糖；
所述益生菌发酵果蔬饮料的制备方法如下：
(1)选择无腐烂、新鲜果蔬为原料，清洗后去除其不可食用部分，打浆或榨汁后获得果蔬浆料，按以上原料组分及比例搅拌均匀成果蔬汁，灭菌；
进一步地，新鲜果蔬经过预煮后再进行打浆或榨汁；
进一步地，灭菌温度为85℃～132℃，灭菌时间为2秒～30分钟；
(2)灭菌后将果蔬汁冷却至20℃～45℃后，将益生菌按照103～109cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的果蔬汁中，25℃～45℃发酵10～36小时，pH值3.0～5.0为发酵终点；
进一步地，所述益生菌为一株干酪乳杆菌NCU215，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)NCU215，已于2019年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18702；
干酪乳杆菌NCU215筛选自我国传统发酵泡菜，是一株具有优良果蔬发酵性能且耐消化道环境压力的益生菌株，该菌株具有以下生理特性:
①在pH 2.0的PBS中处理2h存活率为78.98％；
②在0.5％的胆盐环境中处理4h后的存活率为84.89％；
③在pH 3.0的模拟胃液中消化3h，随即转移至pH 8.0的模拟肠液中消化8h后，活力无显著下降；
④该菌株具有较好的表面性质及黏附肠上皮细胞的能力：24h的自凝集率为64.32％，表面疏水率为23.15％，对人结肠癌细胞Caco-2的黏附率为7.47％；
⑤该菌株具有较好的抗氧化活性：DPPH自由基清除率为11.91％，羟基自由基清除率为10.85％，总抗氧化能力相当于95.90μmol Trolox，总还原能力相当于0.28mM FeSO4；
⑥该菌株的24h发酵上清液对常见食源性致病菌具有优异的抑菌活性，尤其对单增李斯特菌及金黄色葡萄球菌的抑制活性最好，其抑菌圈直径分别为23.18mm和24.42mm；此外，该菌株的溶血活性检测显示不具溶血性；抗生素敏感性检测显示：该菌株对四环素、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢噻吩、红霉素和青霉素敏感，对卡那霉素、环丙沙星、链霉素、庆大霉素耐受；
⑦菌落形态：橙黄色、圆形，扁平、表面光滑、边缘整齐、产酸强、1-3mm；革兰氏染色阳性、菌体呈短杆状(见图1)；
结合生理生化特性及16SrRNA序列鉴定为干酪乳杆菌，系统发育树见图2；
进一步地，所述的pH值发酵终点，可以根据不同口味的要求确定和调整；
(3)将发酵后的果蔬汁进行标准化即为益生菌发酵果蔬饮料；
更进一步地，所述的标准化为按照行业、企业或者实际需求对产品的酸度、甜度进行标准化，通过标准化弥补每批发酵产品在酸度、糖度或糖酸比上的少许差异；
进一步地，所述益生菌发酵果蔬饮料成品可放入0℃～4℃的冰箱中冷藏，产品在0℃～4℃保质期为21天；也可以进行温度85℃～132℃，时间2秒～10分钟的超高温瞬时杀菌，无菌罐装，产品在常温下保质期为18个月；也可以罐装封口后进行温度75℃～132℃，时间20～40分钟杀菌，产品在常温下保质期为18个月。
本发明所述果蔬原料为浆果类(包括草莓、蓝莓、桑葚、黑莓、覆盆子、蔓越莓等)；瓜类(包括西瓜、哈密瓜、香瓜、甜瓜等)；核果类(包括桃、黄桃、樱桃、李、杨梅、酸枣、橄榄、龙眼、荔枝等)；仁果类(包括苹果、梨、柿子、枇杷等)；柑橘类(包括橘子、柳丁、金桔、柠檬、葡萄柚、文旦、柚子等)；根菜类(包括萝卜、胡萝卜、甘蓝、甜菜、生姜、葛根、山药、红薯、竹笋等)；叶菜类(包括菠菜、茼蒿、芹菜等)；果菜类(包括菱角、秋葵、番茄、辣椒、南瓜、苦瓜等)等果蔬中的任何一种或多种。
有益效果：
1、本发明所采用的菌株NCU215具有优良的发酵性能，在果蔬原料中产酸速度快，发酵时间相比其他干酪乳杆菌明显缩短；以胡萝卜汁为发酵原料接种NCU215，pH下降速度快，产酸能力强，菌株NCU215发酵8h后胡萝卜汁pH值就降到3.86，24h后则降到了3.12，酸度达到4.28‰；
2、与市场现有果蔬饮料相比本发明提供的益生菌发酵果蔬饮料具备以下特点：(1)经过益生菌NCU215发酵，能增加果蔬中风味物质种类含量，使得产品具有独特的发酵风味，酸味柔和，香气怡人(烯萜类化合物大量降解，生腥味明显减弱，醇、酮、烃类化合物含量明显增加、酯类、醇类、醛类物质含量也均有增加)；(2)采用非浓缩加工工艺，充分保留了果蔬原有的香味成分和营养物质；(3)该法制备的益生菌发酵果蔬饮料能够有效消除新鲜果蔬如胡萝卜、苦瓜等榨汁或打浆后普遍存在的野蒿味等不良风味，提供较柔和的酸味，此外对人体肠道健康具有一定功能；(4)产品不添加任何香精、色素、防腐剂，更健康安全。
附图说明：
图1NCU215菌体形态；
图2系统发育树。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
1、本发明所采用的菌株NCU215具有优良的发酵性能，在果蔬原料中产酸速度快，发酵时间相比其他干酪乳杆菌明显缩短。以胡萝卜汁为发酵原料，以干酪乳杆菌NCU215、ATCC393分别为发酵菌种进行发酵(选择新鲜、无腐烂的胡萝卜为原料，清洗去皮后打浆，按照胡萝卜浆30份，纯净水60份，葡萄糖10份的组分及比例搅拌均匀成胡萝卜汁，灭菌，灭菌温度为90℃，时间8分钟。灭菌后将料液冷却至37℃后，将干酪乳杆菌NCU215、ATCC393的冻干菌粉按照106cfu/mL的比例分别接种到灭菌冷却后的胡萝卜汁中，37℃下发酵。)，测定发酵生产性能，结果显示：菌株NCU215比ATCC393的pH下降速度快，产酸能力强，菌株NCU215发酵8h后胡萝卜汁pH值就降到3.86，24h后则降到了3.12，酸度达到4.28‰，而对比菌株ATCC393发酵8h后胡萝卜汁pH值为4.35，24h后为3.69，酸度仅为3.05‰。
2、本发明所采用的菌株NCU215能增加果蔬中风味物质种类含量，使得产品具有独特的发酵风味，酸味柔和，香气怡人。分别以胡萝卜汁、蜜桔汁、芒果汁为发酵原料，干酪乳杆菌NCU215、ATCC393为发酵菌株，测定发酵前后风味物质的变化，结果如下：
(1)选择新鲜、无腐烂的胡萝卜为原料，清洗去皮后打浆，按照胡萝卜浆30份，纯净水60份，葡萄糖10份的组分及比例搅拌均匀成胡萝卜汁，灭菌，灭菌温度为90℃，时间8分钟。灭菌后将料液冷却至37℃后，将干酪乳杆菌NCU215、ATCC393的冻干菌粉分别按照106cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的胡萝卜汁中，37℃下发酵，pH3.9为发酵终点。
胡萝卜汁经过干酪乳杆菌NCU215发酵后，烯萜类化合物大量降解，生腥味明显减弱，新增大量风味物质。而经对比菌株ATCC393发酵后，胡萝卜的风味并未明显改善。
表1胡萝卜汁发酵前后主要风味物质分析
注：“-”表示样品中未检测出。
(2)选择新鲜、无腐烂的蜜桔为原料，洗净去皮去籽后打浆，按照蜜桔浆25份，纯净水64.8份，异维生素C钠0.2份，白砂糖10份的组分及比例搅拌均匀成蜜桔汁，灭菌，灭菌温度为105℃，时间3分钟。灭菌后将料液冷却至40℃后，将干酪乳杆菌NCU215、ATCC393的冻干菌粉分别按照105cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的蜜桔汁中，37℃发酵，pH值为4.0时为发酵终点。
蜜桔汁经过干酪乳杆菌NCU215发酵后，其挥发性香气成分在风味构成成分、数量和比例上差异显著，发酵后醇、酮、烃类化合物含量明显增加，烯类种类和含量明显减少。其中烯类在发酵前所占比例较大，是柑橘果汁最主要的特征香气成分，发酵后烯类含量减少，在一定程度上降低了橘子的特征香气，但是新增加的风味物质如：罗勒烯，其具有花似的香气；β-环柠檬醛，其具有强烈的柠檬样的香气；松油烯-4-醇，其具有紫丁香香气；2-十一烷酮，其具有蜡香、果香、酮香的香气；而这些香气成分进一步的丰富发酵蜜桔饮料的风味。而经对比菌株干酪乳杆菌ATCC393发酵后，蜜桔饮料中的挥发性风味物质变化不明显。
表2蜜桔饮料发酵前后主要风味物质分析
注：“-”表示样品中未检测出。
(3)萜烯类是芒果风味成分中种类和含量最多的一类物质，这些物质的存在使芒果稍具尖锐的刺激性气味。选择新鲜、无腐烂的芒果为原料，洗净去皮去籽后打浆，按照芒果浆23份、三氯蔗糖0.08份、纯净水76.92份的组分及比例搅拌均匀成芒果汁，灭菌，灭菌温度为102℃，时间7分钟。灭菌后将料液冷却至37℃后，将干酪乳杆菌NCU215、ATCC393的冻干菌粉分别按照106cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的芒果汁中，37℃发酵，pH值为3.8时为发酵终点。
芒果汁经干酪乳杆菌NCU215发酵后，萜烯类物质含量降低，酯类、醇类、醛类物质含量三者均有增加，丁酸乙酯具有清灵强烈的甜果香，有菠萝、香蕉、苹果气息，发酵后新生成的甲酸庚酯有尧尾和玫瑰底香果香，似梅子的甜香味。发酵后的芒果制品香味更加平和，乙酸辛酯具有令人愉悦的果香味。橙花醇有令人愉快的玫瑰和橙花的香气，香气较平和，微带柠檬味的果香。这些芳香族物质极大地丰富了发酵后芒果浆的风味，改善了芒果的刺激性气味。而经对比菌株干酪乳杆菌ATCC393发酵后，芒果饮料中的挥发性风味物质变化不明显。
表3芒果汁发酵前后主要风味物质分析
注：“-”表示样品中未检测出。
3、经NCU215发酵后胡萝卜饮料和蜜桔饮料中甜味和鲜味氨基酸显著增多，苦味氨基酸含量显著降低。而经对比菌株干酪乳杆菌ATCC393、CICC 6117、ATCC334发酵后的胡萝卜饮料和蜜桔饮料中呈味氨基酸的变化不显著(发酵方法同前述“2”中的胡萝卜饮料和蜜桔饮料)，结果见表4、5。
表4胡萝卜饮料发酵前后氨基酸的变化
表5蜜桔汁发酵前后氨基酸的变化
4、NCU215发酵后的胡萝卜饮料稳定性增强，颜色更加鲜亮。
胡萝卜汁在发酵前，呈现分层现象，经NCU215发酵后，分层现象消失，常温放置2个月后，才逐渐出现分层。而经对比菌株干酪乳杆菌ATCC393、CICC 6117、ATCC334发酵后的胡萝卜饮料一直呈现分层现象。
5、菌株NCU215的16SrRNA序列如下(序列表SEQ ID NO.1)：
CGGCAGTGCGGGTGCTATACATGCAAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGCCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGTTTTCCCCTTTCGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGATGTCGTCAGCCTCGTGTCGTGAGATGGTGGGGTAGGTCCCGCACGAGCGCACCTATGAACTAGTGCAGCATTAGTTGGTCACTCTAGTAGACTGCAGTGACGACCGGAGGCAACGTTGGAATGAACGGTTCAATTCATCAG
6、测定方法
(1)风味物质的检测方法如下：
采用静态顶空-气相色谱-质谱法，利用Agilent三重串联四极杆气质联用仪进行风味物质的检测，其中气相色谱和质谱条件为：
色谱柱：HP-5石英毛细管柱(30m×0.25mm，1μm)；
升温程序：初温50℃，保持3min，然后以2℃/min升温到120℃，最后以20℃/min升温到250℃，保持5min；载气(He)，流速1.0mL/min，压力7.6522psi；进样量1μL；不分流。电子电离离子源；电子能量70eV；质量扫描范围m/z35～450，20scans/s；离子源温度230℃。
风味物质表格中“-”均表示样品中未检测出。
(2)氨基酸检测方法是根据GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》，利用氨基酸分析仪测定样品的氨基酸种类及含量。
以下将通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例1：一种益生菌发酵苹果饮料
一种益生菌发酵苹果饮料，原料配比为：30份苹果浆、16份葡萄糖、0.02份异维生素C钠、53.8份纯净水。
选择新鲜、无腐烂的苹果为原料，取果肉打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成苹果汁，灭菌，灭菌温度为105℃，时间2分钟。灭菌后将料液冷却至35℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照104cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的苹果汁中，37℃发酵18小时，pH值为4.2时为发酵终点。将发酵后的苹果饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵苹果饮料成品。将标准化后的发酵苹果饮料进行132℃、3秒超高温瞬时杀菌，无菌灌装，产品在常温下保质期为18个月。
实施例2：一种益生菌发酵西柚饮料
一种益生菌发酵西柚饮料原料配比为：西柚浆22份、甜菊糖0.06份、纯净水77.94份。
选择新鲜、无腐烂的西柚为原料，洗净去皮去籽后打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成西柚汁，灭菌，灭菌温度为100℃，时间3分钟。灭菌后将料液冷却至40℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照105cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的西柚汁中，37℃发酵24小时，pH值为4.0时为发酵终点。将发酵后的西柚饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵西柚饮料成品。将标准化后的发酵西柚饮料放入0～4℃冰箱中冷藏，产品在0～4℃保质期为21天。
实施例3：一种益生菌发酵猕猴桃饮料
一种益生菌发酵猕猴桃饮料原料配比为：猕猴桃浆24份、安赛蜜0.07份、纯净水75.93份。
选择新鲜、无腐烂的猕猴桃为原料，清洗去皮后打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成猕猴桃汁，灭菌，灭菌温度为90℃，时间8分钟。灭菌后将料液冷却至37℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照106cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的猕猴桃汁中，37℃发酵25小时，pH值为3.9时为发酵终点。将发酵后的猕猴桃饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵猕猴桃饮料成品。将标准化后的发酵猕猴桃饮料进行132℃、3秒超高温瞬时灭菌，无菌灌装，产品在常温下保质期为18个月。
实施例4：一种益生菌发酵荔枝饮料
一种益生菌发酵荔枝饮料原料配比为：荔枝浆21份、三氯蔗糖0.07份、纯净水78.93份。
选择新鲜、无腐烂的荔枝为原料，洗净后取果肉打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成荔枝汁，灭菌，灭菌温度为120℃，时间30秒。灭菌后将料液冷却至42℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照105cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的荔枝汁中，38℃发酵20小时，pH值为3.8时为发酵终点。将发酵后的荔枝饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵荔枝饮料成品。将标准化后的发酵荔枝饮料罐装封口后进行115℃、30分钟灭菌，产品在常温下保质期为18个月。
实施例5：一种益生菌发酵桑葚饮料
一种益生菌发酵桑葚饮料原料配比为：桑葚浆18份、低聚异麦芽糖19份、纯净水63份。
选择新鲜、无腐烂的桑葚为原料，洗净后打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成桑葚汁，灭菌，灭菌温度为85℃，时间10分钟。灭菌后将料液冷却至35℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照109cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的桑葚汁中，35℃发酵28小时，pH值为3.5时为发酵终点。将发酵后的桑葚饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵桑葚饮料成品。将标准化后的发酵桑葚饮料放入0～4℃冰箱中冷藏，产品在0～4℃保质期为21天。
实施例6：一种益生菌发酵西瓜饮料
一种益生菌发酵西瓜饮料原料配比为：西瓜浆35份、葡萄糖12份、纯净水53份。
选择新鲜、无腐烂的西瓜为原料，洗净后取果肉打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成西瓜汁，灭菌，灭菌温度为105℃，时间2分钟。灭菌后将料液冷却至37℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照105cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的西瓜饮料中，38℃发酵20小时，pH值为4.2时为发酵终点。将发酵后的西瓜饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵西瓜饮料成品。将标准化后的发酵西瓜饮料进行132℃、3秒超高温瞬时灭菌，无菌灌装，产品在常温下保质期为18个月。
实施例7：一种益生菌发酵生姜饮料
一种益生菌发酵生姜饮料原料配比为：生姜浆15份、安赛蜜0.07份、纯净水84.93份。
选择新鲜、无腐烂的生姜为原料，洗净去皮后打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成生姜汁，灭菌，灭菌温度为85℃，时间10分钟。灭菌后将料液冷却至38℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照107cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的生姜汁中，32℃发酵24小时，pH值为4.3时为发酵终点。将发酵后的生姜饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵生姜饮料成品。将标准化后的发酵生姜饮料进行132℃、3秒超高温瞬时灭菌，无菌灌装，产品在常温下保质期为18个月。
实施例8：一种益生菌发酵芒果饮料
一种益生菌发酵芒果饮料原料配比为：芒果浆22份、甜菊糖0.08份、纯净水77.92份。
选择新鲜、无腐烂的芒果为原料，洗净取果肉打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成芒果汁，灭菌，灭菌温度为105℃，时间5分钟。灭菌后将料液冷却至30℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照106cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的芒果汁中，37℃发酵20小时，pH值为3.7时为发酵终点。将发酵后的芒果饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵芒果饮料成品。将标准化后的发酵芒果饮料放入0～4℃冰箱中冷藏，产品在0～4℃保质期为21天。
实施例9：一种益生菌发酵葡萄饮料
一种益生菌发酵葡萄饮料原料配比为：葡萄浆18份、三氯蔗糖0.07份、纯净水81.93份。
选择新鲜、无腐烂的葡萄为原料，洗净后打浆滤去皮渣，按照以上组分及比例搅拌均匀成葡萄汁，灭菌，灭菌温度为101℃，时间3分钟。灭菌后将料液冷却至40℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照105cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的葡萄汁中，37℃发酵34小时，pH值为3.9时为发酵终点。将发酵后的葡萄饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵葡萄饮料成品。将标准化后的发酵葡萄饮料罐装封口后进行115℃，30分钟灭菌，产品在常温下保质期为18个月。
实施例10：一种益生菌发酵南瓜饮料
一种益生菌发酵南瓜饮料原料配比为：南瓜浆25份、葡萄糖16份、纯净水59份。
选择新鲜、无腐烂的南瓜为原料，洗净去籽打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成南瓜汁，灭菌，灭菌温度为105℃，时间5分钟。灭菌后将料液冷却至32℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照104cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的南瓜汁中，35℃发酵24小时，pH值为3.9时为发酵终点。将发酵后的南瓜饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵南瓜饮料成品。将标准化后的发酵南瓜饮料放入0～4℃冰箱中冷藏，产品在0～4℃保质期为21天。
实施例11：一种益生菌发酵黄桃饮料
一种益生菌发酵黄桃饮料原料配比为：黄桃浆30份、甜菊糖0.06份、纯净水69.94份。
选择新鲜、无腐烂的黄桃为原料，洗净后取果肉打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成黄桃汁，灭菌，灭菌温度为105℃，时间3分钟。灭菌后将料液冷却至37℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照106cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的黄桃汁中，37℃发酵20小时，pH值为4.1时为发酵终点。将发酵后的黄桃饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵黄桃饮料成品。将标准化后的发酵黄桃饮料进行132℃、3秒超高温瞬时灭菌，无菌灌装，产品在常温下保质期为18个月。
实施例12：一种益生菌发酵枇杷饮料
一种益生菌发酵枇杷饮料原料配比为：枇杷浆22份、三氯蔗糖0.07份、纯净水77.93份。
选择新鲜、无腐烂的枇杷为原料，洗净去皮去籽后打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成枇杷汁，灭菌，灭菌温度为100℃，时间4分钟。灭菌后将料液冷却至38℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照104cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的枇杷汁中，37℃发酵18小时，pH值为3.8时为发酵终点。将发酵后的枇杷饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵枇杷饮料成品。将标准化后的发酵枇杷饮料放入0～4℃冰箱中冷藏，产品在0～4℃保质期为21天。
实施例13：一种益生菌发酵香蕉饮料
一种益生菌发酵香蕉饮料原料配比为：香蕉浆28份、葡萄糖14份、0.02份异维生素C钠、纯净水57.8份。
选择新鲜、无腐烂的香蕉为原料，去皮后打浆，按照以上组分及比例搅拌均匀成香蕉汁，灭菌，灭菌温度为105℃，时间5分钟。灭菌后将料液冷却至32℃后，将干酪乳杆菌NCU215的冻干菌粉按照104cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的香蕉汁中，34℃发酵20小时，pH值为4.2时为发酵终点。将发酵后的香蕉饮料进行甜、酸标准化即为益生菌发酵香蕉饮料成品。将标准化后的发酵香蕉饮料放入0～4℃冰箱中冷藏，产品在0～4℃保质期为21天。
实施例14 保质期评价标准
本发明的保质期通过以下指标进行确定：
未灭菌发酵果蔬饮料0～4℃储存过程中感官及微生物数量变化
灭菌发酵饮料常温储存过程中感官及微生物数量变化
实施例15 NCU215生理生化特性测定
①耐酸性测试——在pH 2.0的PBS中处理2h存活率为78.98％；
将挑选好的NCU215用MRS液体培养基活化两次，然后按2％(v/v)的接种量37℃培养24h，10000g离心5min以收集菌体。将菌体用pH 2.0的无菌PBS重悬并调节活菌浓度至108CFU/mL，于37℃下孵育2h，采用稀释涂布法测定孵育前后的活菌数以测定其存活率。存活率按下式计算
其中N1为孵育后存活菌数，N0为初始菌数。
②耐胆盐测试——在0.5％的胆盐环境中处理4h后的存活率为84.89％；
将培养24h后的NCU215在4℃、10000g下离心5min以收集菌体，获得的菌体用含0.5％胆盐的无菌PBS重悬并调节活菌浓度至108CFU/mL，在37℃孵育4h，用稀释涂布平板法测定活菌数以评估NCU215的耐胆盐能力。根据下式计算NCU215存活率
其中N1为存活菌数，N0为初始菌数。
③模拟胃肠液耐受性
将培养24h后得NCU215在4℃、10000g下离心5min以收集菌体，并用无菌PBS清洗两次；随即将其重悬至pH 3.0的模拟胃液中37℃孵育3h，并于第0，1，2，3h测定活菌数；然后将1mL培养物加入9mL模拟肠液中37℃孵育8h，并于第0，2，4，8h时测定培养物的活菌数。根据下式计算NCU215存活率
其中N1为存活菌数，N0为初始菌数。
结果显示，在pH 3.0的模拟胃液中消化3h，随即转移至pH 8.0的模拟肠液中消化8h后，活力无显著下降，在模拟胃液中处理3h存活率为101.52±1.67％，在模拟肠液中处理8h存活率为100.27±2.05％。
④-1自凝集能力测试
将过夜培养的乳酸菌在10000g下离心5min收集菌体，并用无菌PBS缓冲液洗涤两次。随后，将获得的菌体细胞用无菌PBS重悬并调整A600＝0.6±0.05(A0)，涡旋振荡10s后在37℃孵育24h。在第0、2、4、6、12和24h时取上层菌悬液，于600nm下测定吸光度(At)，每次测定三个平行，重复三次。按照下式计算细菌的自凝集能力。
其中，A0表示菌体初始吸光值，At代表t时刻上层菌悬液的吸光值。
结果显示，该菌株24h的自凝集率为64.32％。
④-2表面疏水性测试
利用微生物黏着碳氢化合物法(Bacteria Adhesion To Hydrocarbons,BATH)进行乳酸菌表面疏水性的测定。首先将过夜培养的乳酸菌在10000g下离心5min收集菌体细胞，并用无菌PBS缓冲液洗涤两次；随后，将获得的菌体细胞用0.1mol/LKNO3重悬并调整A600＝0.6±0.05(A0)。然后取1mL二甲苯加入至3mL调整好浓度的菌体细胞悬液中，混合后在室温下预孵育10min，涡旋振荡2min，然后在室温下孵育30min分层，小心吸取水相，以无菌PBS为空白测定OD600值(A)。按下式计算细菌的疏水性
其中A0表示菌体初始吸光值；A为二甲苯处理后下层水相吸光值。结果显示该菌株表面疏水率为23.15％。
④-3黏附性测试
将培养好的Caco-2细胞用胰酶-EDTA消化液消化，再用DMEM完全培养液调整细胞浓度为1.0×105个/mL，装于6孔组织培养板中，每孔2mL，于CO2培养箱(5％CO2、95％空气)中37℃孵育至细胞长至分化的单层，每两天换液一次。弃去组织培养板中各孔的DMEM培养液，以无菌PBS缓冲液清洗培养板2遍，加入1mL用DMEM不完全培养液重悬的乳酸菌菌悬液(108CFU/mL；OD＝1)(Caco-2细胞：细菌数量≧1：100)，于37℃孵育2h。孵育完成后弃去组织培养板中各孔的混合液，用无菌PBS缓冲液洗涤5次，以除去未黏附的菌体细胞。加入0.5mL0.25％的胰酶在37℃孵育5min以消化细胞，然后将细胞消化液进行梯度稀释，涂布于MRS固体平板上计算黏附的细菌数。黏附能力用下式计算
黏附率(％)＝Nt/N0×100
其中，Nt表示黏附于Caco-2细胞上的细菌数，N0表示加入的NCU215总细菌数。结果显示该菌株对人结肠癌细胞Caco-2的黏附率为7.47％。
⑤抗氧化活性测试(NCU215样品液菌体浓度是109CFU/mL)
DPPH自由基清除能力
将1.0mL NCU215样品液加入到1mL的乙醇DPPH自由基溶液(0.1mM)中，混匀后在室温下黑暗环境中温育30min。8000g离心10min后，以PBS和DPPH溶液作为对照，乙醇溶液和NCU215样品作为空白，在517nm下测量所得溶液的吸光度。清除能力用下式表示：
其中As为样品在517nm下的吸光度，Ab为空白在517nm下的吸光度，Ac为对照在517nm下的吸光度。
羟基自由基清除能力
将1mL 2.5mM的邻菲罗啉，1mL PBS(pH 7.4)，1mL 2.5mM FeSO4和1mL的NCU215样品简单混合。通过加入1mL 20mM H2O2并在37℃下孵育90min开始反应。在536nm下测量混合物的吸光度，并按下式计算羟基自由基清除活性。
其中Asample是在样品和H2O2都存在下的吸光度，Acontro1是无样品和H2O2存在下的吸光度，Ablank是在无样品和有H2O2存在下对照的吸光度。
ABTS自由基清除能力
根据ABTS自由基检测试剂盒(碧云天)说明书配制ABTS工作母液，室温避光放置16h，然用PBS调整吸光值为A734＝0.7±0.01(ABTS工作液)。96孔板的每个检测孔中加入200μL ABTS工作液。空白对照孔中加入10μL PBS；标准曲线检测孔内分别加入10μL的0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM的Trolox标准溶液；样品检测孔内加入10μL NCU215样品，轻轻混匀。室温避光孵育6min后测定A734。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。
总还原能力
根据FRAP总抗氧化能力检测试剂盒(碧云天)说明书配制FRAP工作液。新鲜配置0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM的。96孔板的每个检测孔中加入180μL FRAP工作液；空白对照孔中加入5μL PBS溶液；标准曲线检测孔内加入5μL新鲜配置的0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM FeSO4标准溶液；样品检测孔内加入5μLNCU215样品，轻轻混匀。37℃孵育5min后测定A593。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。
结果显示，该菌株具有较好的抗氧化活性：DPPH自由基清除率为11.91％，羟基自由基清除率为10.85％，总抗氧化能力相当于95.90μmol Trolox，总还原能力相当于0.28mMFeSO4。
⑥-1抑菌活性测试
NCU215在MRS培养基中37℃下培养24h，并于4℃下10000g离心10min。发酵上清液用0.22μm滤膜过滤除菌后得到无细胞上清液(CFS)并保存在-80℃下备用。利用打孔法测定NCU215 CFS对致病菌的抑菌活性，即取200μL NCU215 CFS加入涂有大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的LB平板孔中，37℃下孵育12h测定抑菌圈直径。
⑥-2溶血活性测试
挑取测试菌株单菌落划线至哥伦比亚血琼脂平板上并在37℃下培养48h后确定溶血活性。发酵乳杆菌CECT5716为阳性对照，金黄色葡萄球菌为阴性对照，实验重复三次。
⑥-3抗生素敏感性测试
采用K-B(药敏纸片琼脂扩散法)进行药敏试验来评价菌株的抗生素耐药性。将过夜培养的乳杆菌发酵液调节菌浓至108CFU/mL，吸取100μL涂布于MRS平板上。分别将链霉素(10mg/mL)，氨苄青霉素(10mg/mL)，红霉素(15mg/mL)，四环素(30mg/mL)，庆大霉素(10mg/mL)，卡那霉素(30mg/mL)，青霉素(10mg/mL)，头孢噻吩(15mg/mL)，环丙沙星(5mg/mL)和阿莫西林(30mg/mL)的药敏纸片轻轻放置于涂有乳杆菌菌液的MRS平板上，37℃培养24h，游标卡尺测定抑菌圈直径，确定测试乳杆菌对上述抗生素的敏感性。
结果显示，该菌株的24h发酵上清液对常见食源性致病菌具有优异的抑菌活性，尤其对单增李斯特菌及金黄色葡萄球菌的抑制活性最好，其抑菌圈直径分别为23.18mm和24.42mm；此外，该菌株的溶血活性检测显示不具溶血性；抗生素敏感性检测显示：该菌株对四环素、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢噻吩、红霉素和青霉素敏感，对卡那霉素、环丙沙星、链霉素、庆大霉素耐受。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
序列表
<110> 南昌大学
<120> 益生菌发酵果蔬饮料产品
<130> 1
<141> 2020-02-28
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1194
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)
<400> 1
cggcagtgcg ggtgctatac atgcaagtcg aacgagttct cgttgatgat cggtgcttgc 60
accgagattc aacatggaac gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccct 120
taagtggggg ataacatttg gaaacagatg ctaataccgc atagatccaa gaaccgcatg 180
gttcttggct gaaagatggc gtaagctatc gcttttggat ggacccgcgg cgtattagct 240
agttggtgag gtaatggctc accaaggcga tgatacgtag ccgaactgag aggttgatcg 300
gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360
cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggct ttcgggtcgt 420
aaaactctgt tgttggagaa gaatggtcgg cagagtaact gttgccggcg tgacggtatc 480
caaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540
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agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720
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agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgaatgctag gtgttggagg gtttccgccc 840
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aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtgggtt taattcgaag 960
caacgcgaag aacccttacc aggtcttgac atcttttgat cacctgagag atcagttttc 1020
ccctttcggg gcaaaatgac aggtggtgca tgatgtcgtc agcctcgtgt cgtgagatgg 1080
tggggtaggt cccgcacgag cgcacctatg aactagtgca gcattagttg gtcactctag 1140
tagactgcag tgacgaccgg aggcaacgtt ggaatgaacg gttcaattca tcag 1194
Claims (10)
1.一种干酪乳杆菌益生菌，其特征在于，所述干酪乳杆菌具体为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）NCU215，保藏编号为CGMCC No.18702。
2.一种益生菌发酵果蔬饮料的制备方法，其特征在于，具体如下：
（1）选择无腐烂、新鲜果蔬为原料，清洗后去除其不可食用部分，打浆或榨汁后按如下原料组分及比例搅拌均匀成果蔬汁，灭菌：果蔬浆料15~35份、纯净水45~84.95份、葡萄糖或代用糖0.05~20份；
（2）灭菌后将果蔬汁冷却至20℃~45℃后，将益生菌按照103~109cfu/mL的比例接种到灭菌冷却后的果蔬汁中，25℃~45℃发酵，pH值3.0~5.0为发酵终点；
所述益生菌为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）NCU215，保藏编号为CGMCCNo.18702。
3.如权利要求2所述的一种益生菌发酵果蔬饮料的制备方法，其特征在于，灭菌温度为85℃~132℃，灭菌时间为2秒~30分钟。
4.如权利要求2所述的一种益生菌发酵果蔬饮料的制备方法，其特征在于，将发酵后的果蔬汁进行酸度或甜度标准化即为益生菌发酵果蔬饮料。
5.如权利要求2所述的一种益生菌发酵果蔬饮料的制备方法，其特征在于，所述益生菌发酵果蔬饮料成品可放入0℃~4℃的冰箱中冷藏；或者85℃~132℃，2秒~10分钟杀菌后无菌罐装；或者罐装封口后进行75℃~132℃，20~40分钟杀菌。
6.如权利要求2所述的一种益生菌发酵果蔬饮料的制备方法，其特征在于，发酵时间为10~36小时。
7.如权利要求2所述的一种益生菌发酵果蔬饮料的制备方法，其特征在于，原料还包括异维生素C钠或维生素C 0.01~0.5份。
8.如权利要求2所述的一种益生菌发酵果蔬饮料的制备方法，其特征在于，所述的代用糖是三氯蔗糖、阿斯巴甜、甜菊糖、安赛蜜、甜蜜素或低聚异麦芽糖。
9.如权利要求2所述的一种益生菌发酵果蔬饮料的制备方法，其特征在于，所述果蔬为浆果类、瓜类、仁果类、根菜类、叶菜类、果菜类中的任何一种或多种。
10.由权利要求2-9任意一项方法制备的益生菌发酵果蔬饮料。
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