JP2021136984A

JP2021136984A - プロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料製品

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Publication number: JP2021136984A
Application number: JP2020059642A
Authority: JP
Inventors: 明勇謝; Mingyong Xie; 涛熊; Tao Xiong; 倩倩関; Qianqian Guan
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2021-09-16
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111357901A; CN111357901B; JP6775861B1

Abstract

【課題】新鮮な果物野菜を原料として、プロバイオティクスで発酵させて得られ、風味に優れ、栄養がバランスよく、いかなるエッセンス、色素や防腐剤も添加されていない果物野菜飲料を提供する。【解決手段】プロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料製品であって、１５〜３５部の果物野菜パルプ、４５〜８４．９５部の純水、０．０５〜２０部のグルコース又は代用糖といった原料をプロバイオティクスで発酵させて得られ、前記プロバイオティクスは、保存番号がＣＧＭＣＣＮｏ．１８７０２のラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）ＮＣＵ２１５であることを特徴とするプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料製品。【選択図】図１

Description

本発明は飲用品の技術分野に属し、具体的にはプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料製品に関する。

人々がより健康的な生活を求めているため、新鮮な果物野菜で所定のプロセスを経て製造されたオレンジジュース、キュウリジュース、トマトジュース、スイカジュース、ハミウリジュースなどの果物野菜飲料は、市場においてとても人気がある。たとえばＣＮ１０８９３６１６７Ａには、「複数種のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜ジュース飲料の製造方法」が開示されている。この製造方法のステップは、果物野菜原料の選択、果物野菜原料のクリーン加工、原料ジュースの製造、原料ジュースの定容・調製、充填、滅菌、接種、後熟、及び貯蔵を含む。該発明は、順に原料選択、原料クリーン、原料ジュースの製造、調製、充填、滅菌、冷却、接種発酵、後熟及び貯蔵などのステップによって、複数種のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜ジュース飲料を得ることで、複数種の栄養成分を最大限に保持することができ、食感の酸味と甘さが適度であり、原料栄養成分を保持するとともに、プロバイオティクスで発酵させた生成物などの栄養素を有し、人体に豊かな栄養を提供し、良好な健康作用を果たし、さっぱりとしてどの渇きをいやし、制菌し抗がんできるので身体を強くし、抗酸化するなどの効能を持っている。ＣＮ１０５９９５７１０Ａには、「植物プロバイオティクスによる果物野菜パルプの発酵方法」が開示されている。この発酵方法は、果物野菜に対する前処理、破砕、軟化、果物野菜パルプの製造、調製、１回目の殺菌冷却、発酵、遠心分離、脱気、均質化、２回目の殺菌冷却、無菌充填のステップによって完了するものである。該発明は、酸性が弱い果物野菜パルプを異なる乳酸菌で発酵させ、大量の乳酸などの有機酸を生成し、それによりｐＨを低下させるとともに、良好な発酵風味を生じ、殺菌の条件を低下させ、コストを節約し、また、果物野菜そのものの栄養を保持し、発酵生成物の栄養成分を増加させ、さらに、デカンター遠心分離機により発酵後の果物野菜パルプからパルプ沈殿を遠心分離させ、飲料業界における発酵させた果物野菜パルプの利用安定性を効果的に高める。低酸性及び酸性の果物野菜パルプは、賞味期限が短く、製品風味が悪く、加工コストが高く及び加工で栄養の損失がひどいという問題を解決する。

しかし、従来技術では、一般的に、発酵時間が長く、生臭さが強く、エッセンス、色素、防腐剤などが添加されるという問題が存在する。本発明は、新鮮な果物野菜を原料として、洗浄・圧搾・配合・発酵させて得られた果物野菜飲料を提供することを目的とし、該方法で製造される、プロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料は、たとえばニンジン、苦瓜などの新鮮な果物野菜を搾ったまたは圧搾した後に一般的に存在するヨモギ味などの不良風味を効果的に解消し、柔らかい酸味を提供することができるとともに、人体の腸管健康に対して所定の機能を持っている。本製品は市場の搾り立ての果物野菜ジュース飲料に比べて、シェルフライフが長く、同じ種類の製品化された果物野菜ジュース飲料に比べて、いかなるエッセンス、色素や防腐剤も添加されず、健康ドリンクに対する消費者の要求を満たす。

本発明は、新鮮な果物野菜を原料として、プロバイオティクスで発酵させて得られ、風味に優れ、栄養がバランスよく、いかなるエッセンス、色素や防腐剤も添加されていないプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料を提供することを目的とする。

前記プロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料は、１５〜３５部の果物野菜パルプ、４５〜８４．９５部の純水、０．０５〜２０部のグルコース又は代用糖といった原料をプロバイオティクスで発酵させて得られ、
更に、０．０１〜０．５部のエリソルビン酸ナトリウム又はビタミンＣをさらに含み、
前記代用糖は白砂糖、スクラロース、アスパルテーム、ステビオサイド、アセスルファムカリウム、チクロ又はイソマルトオリゴ糖である。

前記プロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料の製造方法は以下のとおりである。
（１）腐っていない新鮮な果物野菜を原料として選択し、洗浄後に食べられない部分を除去し、圧搾し又は搾って果物野菜パルプを得て、上記の原料成分を上記の割合で均一に撹拌して果物野菜ジュースを得て、滅菌する。
更に、新鮮な果物野菜をあらかじめ煮た後に圧搾しまたは搾りる。
更に、滅菌温度は８５℃〜１３２℃であり、滅菌時間は２秒〜３０分間である。
（２）滅菌後に果物野菜ジュースを２０℃〜４５℃に冷却させ、プロバイオティクスを１０^３〜１０^９ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後の果物野菜ジュースに接種し、ｐＨ値３．０〜５．０を発酵終点として２５℃〜４５℃で１０〜３６時間発酵させる。
更に、前記プロバイオティクスはラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５であり、前記ラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）ＮＣＵ２１５は、２０１９年１０月２１日にアドレスが北京市朝陽区北辰西路１号院３号の中国科学院微生物研究所の中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに保存され、保存番号がＣＧＭＣＣＮｏ．１８７０２である。

ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５は、中国の従来の発酵漬物からスクリーニングされ、果物野菜に対して優良な発酵性能を有し且つ消化管の環境に耐えられるプロバイオティクス株であり、該菌株は、１）〜７）の生理学的特性を持っている。
１）ｐＨが２．０のＰＢＳにおいて２ｈ処理した後の生存率が７８．９８％であり、
２）０．５％の胆汁酸環境において４ｈ処理した後の生存率が８４．８９％であり、
３）ｐＨが３．０の模擬胃液において３ｈ消化した直後、ｐＨが８．０の模擬腸液に移して８ｈ消化して、活性が著しく低下せず、
４）該菌株は、良好な表面性質及び腸上皮細胞に付着する能力を有し、２４ｈの自己凝集率が６４．３２％であり、表面疎水率が２３．１５％であり、ヒト大腸がん細胞Ｃａｃｏ−２に対する付着率が７．４７％であり、
５）該菌株は、良好な抗酸化活性を有し、ＤＰＰＨラジカルの消去率が１１．９１％であり、ヒドロキシルラジカルの消去率が１０．８５％であり、総抗酸化能が９５．９０μｍｏｌのＴｒｏｌｏｘに相当し、総還元能力が０．２８ｍＭのＦｅＳＯ_４に相当し、
６）該菌株で２４ｈ発酵させた上清は、通常の食品媒介病原菌に対して優れた制菌活性を有し、特にリステリアモノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌に対する抑制活性が最も良好であり、それらの阻止円の直径がそれぞれ２３．１８ｍｍ及び２４．４２ｍｍであり、また、該菌株の溶血活性測定によれば、溶血性を有さないことを示し、抗生物質感受性測定によれば、該菌株はテトラサイクリン、アンピシリン、アモキシシリン、セファロスポリンチオフェン、エリスロマイシン及びペニシリンに敏感であり、カナマイシン、シプロフロキサシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンに耐性を持っていることを示し、
７）コロニーの形態は、オレンジ色であり、扁平な円形であり、表面が滑らかで、縁がきちんとしており、酸生産能力が強く、１−３ｍｍで、グラム陽性であり、菌体が短杆状であり（図１に示される）、
生理学的及び生化学的特性と１６ＳｒＲＮＡシーケンスと組み合わせてラクトバチルスカゼイとして同定され、システム系統樹は図２に示され、
更に、前記ｐＨ値の発酵終点は、異なる好みによって決定して調整することができる。
（３）発酵後の果物野菜ジュースに対して標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料を得る。
更に、前記標準化とは、業界、企業又は実際のニーズに応じて製品の酸度、甘味度に対して標準化を行うものであり、標準化により、各バッチの発酵製品の酸度、糖度又は糖酸比のわずかな違いを補償し、
更に、前記プロバイオティクスで発酵させた仕上がり果物野菜飲料を０℃〜４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵してもよく、この場合、０℃〜４℃で製品の賞味期限が２１日であり、温度８５℃〜１３２℃で、２秒〜１０分間超高温瞬時殺菌し、無菌で缶詰するようにしてもよく、この場合、常温下で製品の賞味期限が１８ヶ月であり、缶詰めしてシールした後に温度７５℃〜１３２℃で、２０〜４０分間殺菌してもよく、常温下で製品の賞味期限が１８ヶ月である。

本発明の前記果物野菜の原料は、ベリー類（イチゴ、ブルーベリー、桑の実、ブラックベリー、フクボンシ、クランベリーなどを含む）、瓜類（スイカ、ハミウリ、マクワウリ、メロンなどを含む）、核果類（もも、黄桃、サクランボ、スモモ、ヤマモモ、サネブトナツメ、オリーブ、リュウガン、レイシなどを含む）、仁果類（リンゴ、梨、カキ、ビワなどを含む）、柑橘類（みかん、オレンジ、キンカン、レモン、グレープフルーツ、ブンタン、柚子などを含む）、根菜類（大根、ニンジン、キャベツ、ビート、ショウガ、カッコン、サンヤク、サツマイモ、タケノコなどを含む）、葉菜類（ホウレン草、春菊、セロリなどを含む）、果菜類（ひしの実、オクラ、トマト、トウガラシ、カボチャ、苦瓜などを含む）などの果物野菜のうちの任意の１種又は複数種である。

有益な効果は以下のとおりである。
１、本発明の用いる菌株ＮＣＵ２１５は優れた発酵性能を有し、果物野菜原料において酸生産速度が速く、発酵時間がその他のラクトバチルスカゼイに比べて著しく縮まり、ニンジンジュースを発酵原料としてＮＣＵ２１５を接種し、ｐＨ低下速度が速く、酸生産能力が強く、菌株ＮＣＵ２１５で８ｈ発酵させた後にニンジンジュースのｐＨ値が３．８６に下がり、２４ｈ後に３．１２に下がり、酸度が４．２８‰に達する。
２、本発明に係るプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料は、市場の従来の果物野菜飲料に比べて以下の特徴を有する。（１）プロバイオティクスＮＣＵ２１５で発酵させることにより、果物野菜における風味物質の種類と含有量を増加させることができ、製品は独特な発酵風味を持ち、酸味が柔らかく、香りが心地よく（大量のオレフィンテルペン類化合物が分解し、生臭みが著しく弱まり、アルコール類、ケトン類、炭化水素類化合物の含有量が著しく増加し、エステル類、アルコール類、アルデヒド類物質の含有量もいずれも増加する）、（２）非濃縮加工プロセスを用いて、果物野菜そのものの香り成分と栄養素を十分に保持し、（３）該方法で製造される、プロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料は、たとえばニンジン、苦瓜などの新鮮な果物野菜を搾ったまたは圧搾した後に一般的に存在するヨモギ味などの不良風味を効果的に解消し、柔らかい酸味を提供することができるとともに、人体の腸管健康に対して所定の機能を持っており、（４）製品にはいかなるエッセンス、色素、防腐剤も添加されず、健康的かつ安全になる。

ＮＣＵ２１５菌体の形態である。系統樹である。

本特許の目的、技術案及び利点をより明瞭かつはっきりとするために、以下、具体的な実施例を参照しながら、本特許について更に詳細に説明する。なお、ここで説明される具体的な実施例は本特許を説明するためのものにすぎず、本発明を限定するものではない。

１、本発明の用いる菌株ＮＣＵ２１５は、優れた発酵性能を有し、果物野菜原料において酸生産速度が速く、発酵時間がその他のラクトバチルスカゼイに比べて著しく縮む。ニンジンジュースを発酵原料として、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５、ＡＴＣＣ３９３をそれぞれ発酵菌種として発酵させ（腐っていない新鮮なニンジンを原料として選択し、洗浄して皮を除去して圧搾し、３０部のニンジンパルプ、６０部の純水、１０部のグルコースの成分及び割合で均一に撹拌してニンジンジュースを得て、温度９０℃で、８分間滅菌する。滅菌後に原料液を３７℃に冷却させた後、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５、ＡＴＣＣ３９３の凍結乾燥菌粉末を１０^６ｃｆｕ／ｍＬの割合でそれぞれ滅菌冷却後のニンジンジュースに接種し、３７℃で発酵させる）、発酵生産性能を測定し、結果によれば、菌株ＮＣＵ２１５はＡＴＣＣ３９３に比べてｐＨ低下速度が速く、酸生産能力が強く、菌株ＮＣＵ２１５で８ｈ発酵させた後に、ニンジンジュースはｐＨ値が３．８６に下がり、２４ｈ後に３．１２に下がり、酸度が４．２８‰に達する一方、比較菌株ＡＴＣＣ３９３で８ｈ発酵させた後、ｐＨ値が４．３５になり、２４ｈ後に３．６９になり、酸度が３．０５‰だけである。

２、本発明の用いる菌株ＮＣＵ２１５は果物野菜における風味物質の種類と含有量を増加させ、製品は独特な発酵風味を持ち、酸味が柔らかく、香りが心地よい。それぞれニンジンジュース、ミカンジュース、マンゴジュースを発酵原料として、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５、ＡＴＣＣ３９３を発酵菌株として、発酵前後の風味物質の変化を測定し、結果は以下のとおりである。
（１）腐っていない新鮮なニンジンを原料として選択し、洗浄して皮を除去した後に圧搾し、３０部のニンジンパルプ、６０部の純水、１０部のグルコースの成分及び割合で均一に撹拌してニンジンジュースを得て、温度９０℃で、８分間滅菌する。滅菌後に原料液を３７℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５、ＡＴＣＣ３９３の凍結乾燥菌粉末をそれぞれ１０^６ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のニンジンジュースに接種し、ｐＨ３．９を発酵終点として３７℃で発酵させる。

ニンジンジュースはラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５で発酵された後、大量のオレフィンテルペン類化合物が分解し、生臭みが著しく弱まり、大量の風味物質が増加する。一方、比較菌株ＡＴＣＣ３９３で発酵された後は、ニンジンの風味は著しく改善されていない。

（２）腐っていない新鮮なミカンを原料として選択し、洗浄して皮と種を除去して圧搾し、２５部のミカンパルプ、６４．８部の純水、０．２部のエリソルビン酸ナトリウム、１０部の白砂糖の成分及び割合で均一に撹拌してミカンジュースを得て、温度１０５℃で、３分間滅菌する。滅菌後に原料液を４０℃に冷却させて、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５、ＡＴＣＣ３９３の凍結乾燥菌粉末をそれぞれ１０^５ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のミカンジュースに接種し、ｐＨ値が４．０になる時点を発酵終点として３７℃で発酵させる。

ミカンジュースは、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５で発酵された後、その揮発性の香り成分の風味構成成分、量及び割合に有意差が生じ、発酵後にアルコール類、ケトン類、炭化水素類化合物の含有量が著しく増加し、アルケン類の種類と含有量が著しく減少する。アルケン類は発酵前に占める割合が大きく、柑橘ジュースの最も主な特徴的香り成分であり、発酵後に含有量が減少し、ある程度までみかんの特徴的香りを減少させるが、増加する風味物質、たとえばオシメンは、花のような香りを有し、β−シクロシトラールは、強いレモンのような香りを有し、テルピネン−４−オールは、ライラックの香りを有し、２−ウンデカノンは、ロウソクの香り、フルーティーな香り、ケトン類の香りを有し、これらの香り成分は更に発酵ミカン飲料の風味を豊かにする。比較菌株ラクトバチルスカゼイＡＴＣＣ３９３で発酵された後、ミカン飲料の揮発性風味物質の変化は著しくない。

（３）テルペン類は、マンゴの風味成分のうちの種類と含有量が最も多い物質であり、これらの物質の存在により、マンゴがやや鋭く刺激的な臭いを持っている。腐っていない新鮮なマンゴを原料として選択し、洗浄して皮と種を除去して圧搾し、２３部のマンゴパルプ、０．０８部のスクラロース、７６．９２部の純水の成分及び割合で均一に撹拌してマンゴジュースを得て、温度１０２℃で、７分間滅菌する。滅菌後に原料液を３７℃に冷却させた後、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５、ＡＴＣＣ３９３の凍結乾燥菌粉末をそれぞれ１０^６ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のマンゴジュースに接種し、ｐＨ値が３．８になる時点を発酵終点として３７℃で発酵させる。

マンゴジュースはラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５で発酵された後、テルペン類物質の含有量が低下し、エステル類、アルコール類、アルデヒド類物質の含有量がいずれも増加し、酪酸エチルは強くて甘く、すっきりとしたフルーティーな香りを持ち、パイナップル、バナナ、リンゴのような匂いを持ち、発酵後に新しく生成したぎ酸ヘプチルはアヤメとローズのフルーティーな香りを持ち、梅の甘い香りに似っている。発酵後のマンゴ製品の香りがより柔らかく、オクチルアセテートは心地よいフルーティーな香りを有する。ネロールは心地よいローズとダイダイ花の香りを持ち、香りが柔らかく、レモン味のフルーティーな香りをわずかに持っている。これらの芳香族物質は発酵後のマンゴパルプの風味を大幅に豊かにし、マンゴの刺激的な匂いを改善する。比較菌株ラクトバチルスカゼイＡＴＣＣ３９３で発酵された後、マンゴ飲料中の揮発性風味物質の変化は著しくない。

３、ＮＣＵ２１５で発酵された後に、ニンジン飲料とミカン飲料の甘味とうま味アミノ酸が著しく増加し、苦味アミノ酸の含有量が著しく低下する。比較菌株ラクトバチルスカゼイＡＴＣＣ３９３、ＣＩＣＣ６１１７、ＡＴＣＣ３３４で発酵された後のニンジン飲料とミカン飲料において呈味アミノ酸の変化は著しくなく（発酵方法は前述した「２」におけるニンジン飲料とミカン飲料と同じ）、結果は表４、５に示される。

４、ＮＣＵ２１５で発酵させた後のニンジン飲料は安定性が強まり、色が明るくなる。
ニンジンジュースは発酵前、層化現象を呈し、ＮＣＵ２１５で発酵された後、層化現象が消え、常温で２ヶ月放置した後に、徐々に層化が発生する。比較菌株ラクトバチルスカゼイＡＴＣＣ３９３、ＣＩＣＣ６１１７、ＡＴＣＣ３３４で発酵された後のニンジン飲料は常に層化現象を呈する。

５、菌株ＮＣＵ２１５の１６ＳｒＲＮＡシーケンスは以下のとおりである（シーケンス表ＳＥＱＩＤＮＯ．１）。
ＣＧＧＣＡＧＴＧＣＧＧＧＴＧＣＴＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＧＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＴＴＣＡＡＣＡＴＧＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＣＴＴＡＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＡＡＧＣＴＡＴＣＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＣＧＴＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＴＧＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＡＴＡＣＧＴＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＧＧＣＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＡＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＣＡＴＣＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＣＧＣＡＡＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡＴＣＡＧＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＣＧＡＧＣＧＣＡＣＣＴＡＴＧＡＡＣＴＡＧＴＧＣＡＧＣＡＴＴＡＧＴＴＧＧＴＣＡＣＴＣＴＡＧＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＧＡＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＣＧＴＴＧＧＡＡＴＧＡＡＣＧＧＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧ

６、測定方法
（１）風味物質の検出方法は以下のとおりである。
スタティックヘッドスペース−ガスクロマトグラフィ−マススペクトル法を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔトリプル四重極ガスクロマトグラフィ質量分計で風味物質を検出する。ガスクロマトグラフィ及びマススペクトルの条件は以下のとおりである。
クロマトグラフカラム：ｈＰ−５石英キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ、１μｍ）、
昇温プログラム：開始温度を５０℃にし、３ｍｉｎ保持し、次に２℃／ｍｉｎで１２０℃に昇温させ、最後に２０℃／ｍｉｎで２５０℃に昇温して、５ｍｉｎ保持する。キャリアガス（Ｈｅ）は、流速が１．０ｍＬ／ｍｉｎであり、圧力が７．６５２２ｐｓｉであり、試料注入量が１μＬであり、分流しない。

電子電離イオン源：電子エネルギーが７０ｅＶであり、質量走査範囲がｍ／ｚ３５〜４５０であり、速度が２０ｓｃａｎｓ／ｓであり、イオン源温度が２３０℃である。

風味物質フォームにおいて、「−」は、いずれもサンプルにおいて検出されていないことを示す。

（２）アミノ酸検出方法は、ＧＢ／Ｔ５００９．１２４−２００３「食品中のアミノ酸の測定」に基づいて、アミノ酸アナライザでサンプルのアミノ酸の種類及び含有量を測定する。

以下、具体的な実施例によって本発明について更に解釈して説明する。

実施例１：プロバイオティクスで発酵させたリンゴ飲料
プロバイオティクスで発酵させたリンゴ飲料の原料配合比率は、リンゴパルプ３０部、グルコース１６部、エリソルビン酸ナトリウム０．０２部、純水５３．８部であった。

腐っていない新鮮なリンゴを原料として選択し、果肉を圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してリンゴジュースを得て、温度１０５℃で、２分間滅菌した。滅菌後に原料液を３５℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^４ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のリンゴジュースに接種し、ｐＨ値が４．２になる時点を発酵終点として３７℃で１８時間発酵させた。発酵後のリンゴ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵仕上がりリンゴ飲料を得た。標準化済みの発酵リンゴ飲料を１３２℃で、３秒超高温瞬時殺菌し、無菌で充填し、常温下で製品の賞味期限は１８ヶ月であった。

実施例２：プロバイオティクスで発酵させたグレープフルーツ飲料
プロバイオティクスで発酵させたグレープフルーツ飲料の原料配合比率は、グレープフルーツパルプ２２部、ステビオサイド０．０６部、純水７７．９４部であった。

腐っていない新鮮なグレープフルーツを原料として選択し、洗浄して皮と種を除去して圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してグレープフルーツジュースを得て、温度１００℃で、３分間滅菌した。滅菌後に原料液を４０℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^５ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のグレープフルーツジュースに接種し、ｐＨ値が４．０になる時点を発酵終点として３７℃で２４時間発酵させた。発酵後のグレープフルーツ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がりグレープフルーツ飲料を得た。標準化済みの発酵グレープフルーツ飲料を０〜４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵し、０〜４℃で製品の賞味期限は２１日であった。

実施例３：プロバイオティクスで発酵させたキウイフルーツ飲料
プロバイオティクスで発酵させたキウイフルーツ飲料の原料配合比率は、キウイフルーツパルプ２４部、アセスルファムカリウム０．０７部、純水７５．９３部であった。

腐っていない新鮮なキウイフルーツを原料として選択し、洗浄して皮を除去して圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してキウイフルーツジュースを得て、温度９０℃で、８分間滅菌した。滅菌後に原料液を３７℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^６ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のキウイフルーツジュースに接種し、ｐＨ値が３．９になる時点を発酵終点として３７℃で２５時間発酵させた。発酵後のキウイフルーツ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がりキウイフルーツ飲料を得た。標準化済みの発酵キウイフルーツ飲料を１３２℃で、３秒超高温瞬時滅菌し、無菌で充填し、常温下で製品の賞味期限は１８ヶ月であった。

実施例４：プロバイオティクスで発酵させたレイシ飲料
プロバイオティクスで発酵させたレイシ飲料の原料配合比率は、レイシパルプ２１部、スクラロース０．０７部、純水７８．９３部であった。

腐っていない新鮮なレイシを原料として選択し、洗浄して果肉を圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してレイシジュースを得て、温度１２０℃で、時間３０秒滅菌した。滅菌後に原料液を４２℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^５ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のレイシジュースに接種し、ｐＨ値が３．８になる時点を発酵終点として３８℃で２０時間発酵させた。発酵後のレイシ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がりレイシ飲料を得た。標準化済みの発酵レイシ飲料を缶詰めしてシールした後に１１５℃で、３０分間滅菌し、常温下で製品の賞味期限は１８ヶ月であった。

実施例５：プロバイオティクスで発酵させた桑の実飲料
プロバイオティクスで発酵させた桑の実飲料の原料配合比率は、桑の実パルプ１８部、イソマルトオリゴ糖１９部、純水６３部であった。

腐っていない新鮮な桑の実を原料として選択し、洗浄して圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌して桑の実ジュースを得て、温度８５℃で、１０分間滅菌した。滅菌後に原料液を３５℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^９ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後の桑の実ジュースに接種し、ｐＨ値が３．５になる時点を発酵終点として３５℃で２８時間発酵させた。発酵後の桑の実飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がり桑の実飲料を得た。標準化済みの発酵桑の実飲料を０〜４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵し、０〜４℃で製品の賞味期限は２１日であった。

実施例６：プロバイオティクスで発酵させたスイカ飲料
プロバイオティクスで発酵させたスイカ飲料の原料配合比率は、スイカパルプ３５部、グルコース１２部、純水５３部であった。

腐っていない新鮮なスイカを原料として選択し、洗浄して果肉を圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してスイカジュースを得て、温度１０５℃で、２分間滅菌した。滅菌後に原料液を３７℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^５ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のスイカジュースに接種し、ｐＨ値が４．２になる時点を発酵終点として３８℃で２０時間発酵させた。発酵後のスイカ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がりスイカ飲料を得た。標準化済みの発酵スイカ飲料を１３２℃で、３秒超高温瞬時滅菌し、無菌で充填し、常温下で製品の賞味期限は１８ヶ月であった。

実施例７：プロバイオティクスで発酵させたショウガ飲料
プロバイオティクスで発酵させたショウガ飲料の原料配合比率は、ショウガパルプ１５部、アセスルファムカリウム０．０７部、純水８４．９３部であった。

腐っていない新鮮なショウガを原料として選択し、洗浄して皮を除去して圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してショウガジュースを得て、滅菌温度８５℃で、１０分間滅菌した。滅菌後に原料液を３８℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^７ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のショウガジュースに接種し、ｐＨ値が４．３になる時点を発酵終点として３２℃で２４時間発酵させた。発酵後のショウガ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がりショウガ飲料を得た。標準化済みの発酵ショウガ飲料を１３２℃で、３秒超高温瞬時滅菌し、無菌で充填し、常温下で製品の賞味期限は１８ヶ月であった。

実施例８：プロバイオティクスで発酵させたマンゴ飲料
プロバイオティクスで発酵させたマンゴ飲料の原料配合比率は、マンゴパルプ２２部、ステビオサイド０．０８部、純水７７．９２部であった。

腐っていない新鮮なマンゴを原料として選択し、洗浄して果肉を圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してマンゴジュースを得て、温度１０５℃で、５分間滅菌した。滅菌後に原料液を３０℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^６ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のマンゴジュースに接種し、ｐＨ値が３．７になる時点を発酵終点として３７℃で２０時間発酵させた。発酵後のマンゴ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がりマンゴ飲料を得た。標準化済みの発酵マンゴ飲料を０〜４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵し、０〜４℃で製品の賞味期限は２１日であった。

実施例９：プロバイオティクスで発酵させた葡萄飲料
プロバイオティクスで発酵させた葡萄飲料の原料配合比率は、葡萄パルプ１８部、スクラロース０．０７部、純水８１．９３部であった。

腐っていない新鮮な葡萄を原料として選択し、洗浄して圧搾して皮と搾りかすを濾過し、上記の成分及び割合で均一に撹拌して葡萄ジュースを得て、温度１０１℃で、３分間滅菌した。滅菌後に原料液を４０℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^５ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後の葡萄ジュースに接種し、ｐＨ値が３．９になる時点を発酵終点として３７℃で３４時間発酵させた。発酵後の葡萄飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がり葡萄飲料を得た。標準化済みの発酵葡萄飲料を缶詰めしてシールした後に１１５℃で、３０分間滅菌し、常温下で製品の賞味期限は１８ヶ月であった。

実施例１０：プロバイオティクスで発酵させたカボチャ飲料
プロバイオティクスで発酵させたカボチャ飲料の原料配合比率は、カボチャパルプ２５部、グルコース１６部、純水５９部であった。

腐っていない新鮮なカボチャを原料として選択し、洗浄して種を除去して圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してカボチャジュースを得て、温度１０５℃で、５分間滅菌した。滅菌後に原料液を３２℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^４ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のカボチャジュースに接種し、ｐＨ値が３．９になる時点を発酵終点として３５℃で２４時間発酵させた。発酵後のカボチャ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がりカボチャ飲料を得た。標準化済みの発酵カボチャ飲料を０〜４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵し、０〜４℃で製品の賞味期限は２１日であった。

実施例１１：プロバイオティクスで発酵させた黄桃飲料
プロバイオティクスで発酵させた黄桃飲料の原料配合比率は、黄桃パルプ３０部、ステビオサイド０．０６部、純水６９．９４部であった。

腐っていない新鮮な黄桃を原料として選択し、洗浄して果肉を圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌して黄桃ジュースを得て、温度１０５℃で、３分間滅菌した。滅菌後に原料液を３７℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^６ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後の黄桃ジュースに接種し、ｐＨ値が４．１になる時点を発酵終点として３７℃で２０時間発酵させた。発酵後の黄桃飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がり黄桃飲料を得た。標準化済みの発酵黄桃飲料を１３２℃で、３秒超高温瞬時滅菌し、無菌で充填し、常温下で製品の賞味期限は１８ヶ月であった。

実施例１２：プロバイオティクスで発酵させたビワ飲料
プロバイオティクスで発酵させたビワ飲料の原料配合比率は、ビワパルプ２２部、スクラロース０．０７部、純水７７．９３部であった。

腐っていない新鮮なビワを原料として選択し、洗浄して皮と種を除去して圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してビワジュースを得て、温度１００℃で、４分間滅菌した。滅菌後に原料液を３８℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^４ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のビワジュースに接種し、ｐＨ値が３．８になる時点を発酵終点として３７℃で１８時間発酵させた。発酵後のビワ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がりビワ飲料を得た。標準化済みの発酵ビワ飲料を０〜４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵し、０〜４℃で製品の賞味期限は２１日であった。

実施例１３：プロバイオティクスで発酵させたバナナ飲料
プロバイオティクスで発酵させたバナナ飲料の原料配合比率は、バナナパルプ２８部、グルコース１４部、０．０２部エリソルビン酸ナトリウム、純水５７．８部であった。

腐っていない新鮮なバナナを原料として選択し、皮を除去して圧搾し、上記の成分及び割合で均一に撹拌してバナナジュースを得て、温度１０５℃で、５分間滅菌した。滅菌後に原料液を３２℃に冷却させ、ラクトバチルスカゼイＮＣＵ２１５の凍結乾燥菌粉末を１０^４ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後のバナナジュースに接種し、ｐＨ値が４．２になる時点を発酵終点として３４℃で２０時間発酵させた。発酵後のバナナ飲料に対して酸度、甘味度の標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた仕上がりバナナ飲料を得た。標準化済みの発酵バナナ飲料を０〜４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵し、０〜４℃で製品の賞味期限は２１日であった。

実施例１４賞味期限の評価標準
本発明の賞味期限は、以下の指標により決定される。
滅菌されていない発酵させた果物野菜飲料の０〜４℃貯蔵プロセスでの官能的変化及び微生物数の変化

実施例１５ＮＣＵ２１５の生理学的及び生化学的特性の測定
１）耐酸性試験−ｐＨが２．０のＰＢＳにおいて２ｈ処理した後の生存率が７８．９８％であり、
選択されたＮＣＵ２１５をＭＲＳ液体培地で２回活性化し、次に２％（ｖ／ｖ）の接種量に従って３７℃で２４ｈインキュベートし、ＮＣＵ２１５１００００ｇを５ｍｉｎ遠心分離させて菌体を収集した。菌体をｐＨが２．０の無菌ＰＢＳで再懸濁化して生菌濃度を１０^８ＣＦＵ／ｍＬに調整し、３７℃下で２ｈ培養し、勾配希釈コーティング法でインキュベート前後の生菌数を測定してその生存率を測定した。生存率は下記の式で計算された。

式中、Ｎ_１はインキュベート後の生存細菌数であり、Ｎ_０は初期菌数であった。

２）耐胆汁酸能試験−０．５％の胆汁酸環境で４ｈ処理した後の生存率が８４．８９％であり、
２４ｈ培養した後の１００００ｇのＮＣＵ２１５を、４℃で５ｍｉｎ遠心分離させて菌体を収集し、取得された菌体を０．５％胆汁酸を含む無菌ＰＢＳで再懸濁化して生菌濃度を１０^８ＣＦＵ／ｍＬに調整し、３７℃で４ｈインキュベートし、希釈プレート法で生菌数を測定してＮＣＵ２１５の耐胆汁酸能を評定した。下記の式に基づいてＮＣＵ２１５生存率を計算した。

式中、Ｎ_１は生存細菌数であり、Ｎ_０は初期菌数であった。

３）模擬胃腸液の耐性
２４ｈ培養した後の１００００ｇのＮＣＵ２１５を得て４℃で、５ｍｉｎ遠心分離させて菌体を収集し、無菌ＰＢＳで２回洗浄した直後、ｐＨが３．０の模擬胃液に再懸濁化して３７℃で３ｈインキュベートし、０ｈ目、１ｈ目、２ｈ目、３ｈ目に生菌数を測定し、次に１ｍＬの培養物を９ｍＬの模擬腸液に加えて３７℃で８ｈインキュベートし、０ｈ目、２ｈ目、４ｈ目、８ｈ目に培養物の生菌数を測定した。下記の式に基づいてＮＣＵ２１５の生存率を計算した。

結果によれば、ｐＨが３．０の模擬胃液において３ｈ消化した直後に、ｐＨが８．０の模擬腸液に移して８ｈ消化して、活性が著しく低下せず、模擬胃液において３ｈ処理した後の生存率が１０１．５２±１．６７％であり、模擬腸液において８ｈ処理した後の生存率が１００．２７±２．０５％であることを示した。

４）−１自己凝集能試験
一夜培養した１００００ｇの乳酸菌を５ｍｉｎ遠心分離させて菌体を収集し、無菌ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。次に、取得された菌体細胞を無菌ＰＢＳで再懸濁化してＡ_６００＝０．６±０．０５（Ａ_０）になるように調整し、１０ｓボルテックスして３７℃で２４ｈインキュベートした。０ｈ目、２ｈ目、４ｈ目、６ｈ目、１２ｈ目及び２４ｈｈ目に上層の細菌懸濁液を取って、６００ｎｍで吸光度（Ａ_ｔ）を測定し、毎回３つの平行サンプルを測定し、繰り返して３回行った。下記の式で細菌の自己凝集能を計算した。

式中、Ａ_０は菌体の初期吸光値を示し、Ａ_ｔはｔ時点に上層細菌懸濁液の吸光値を代表した。

結果によれば、該菌株２４ｈの自己凝集率が６４．３２％であることを示した。

４）−２表面疎水性試験
炭化水素への微生物付着法（ＢａｃｔｅｒｉａＡｄｈｅｓｉｏｎＴｏｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ、ＢＡＴＨ）で乳酸菌の表面疎水性を測定した。まず一夜培養した１００００ｇの乳酸菌を５ｍｉｎ遠心分離させて菌体細胞を収集し、無菌ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、次に、取得された菌体細胞を０．１ｍｏｌ／ＬのＫＮＯ_３で再懸濁化してＡ_６００＝０．６±０．０５（Ａ_０）になるように調整した。次に１ｍＬのキシレンを濃度が調整された３ｍＬの菌体細胞懸濁液に加え、混合後に室温で１０ｍｉｎ予備インキュベートし、２ｍｉｎボルテックスし、次に室温下で３０ｍｉｎインキュベートして層化し、ゆっくりと水相をピペッティングし、無菌ＰＢＳをブランクとしてＯＤ_６００値（Ａ）を測定した。下記の式で細菌の疎水性を計算した。

式中、Ａ_０は菌体の初期吸光値を示し、Ａはキシレンで処理された後の下層水相の吸光値であった。結果によれば、該菌株の表面疎水率が２３．１５％であることを示した。

４）−３付着性試験
培養したＣａｃｏ−２細胞をトリプシンＥＤＴＡ消化液で消化して、ＤＭＥＭ完全培養液で細胞濃度を１．０×１０^５個／ｍＬに調整し、各ウェルに２ｍＬずつ６ウェル組織培養プレートに入れ、細胞が分化した単一層に成長するまでＣＯ_２培養器（５％のＣＯ_２、９５％の空気）において３７℃でインキュベートし、２日ごとに液体を交換した。組織培養プレートにおける各ウェルのＤＭＥＭ培養液を除き、無菌ＰＢＳ緩衝液で培養プレートを２回洗浄し、ＤＭＥＭ不完全培養液で再懸濁化された１ｍＬの乳酸菌細菌懸濁液（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ、ＯＤ＝１）（細菌数≧１：１００のＣａｃｏ−２細胞）を加え、３７℃で２ｈインキュベートした。インキュベート完了後に、組織培養プレートにおける各ウェルの混合液を除き、無菌ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、未付着の菌体細胞を除去した。０．５ｍＬの０．２５％のトリプシンを加えて３７℃で５ｍｉｎインキュベートして細胞を消化し、次に細胞消化液に対して勾配希釈を行い、ＭＲＳ固体平板にコーティングして付着した細菌数を計算した。付着能力を下記の式で計算した。

式中、Ｎ_ｔはＣａｃｏ−２細胞に付着した細菌数を示し、Ｎ_０は加えたＮＣＵ２１５総細菌数を示した。結果によれば、該菌株のヒト大腸がん細胞Ｃａｃｏ−２に対する付着率が７．４７％であることを示した。

５）抗酸化活性試験（ＮＣＵ２１５サンプル液の菌体濃度が１０^９ＣＦＵ／ｍＬであった）
ＤＰＰＨラジカル消去能
１．０ｍＬのＮＣＵ２１５サンプル液を１ｍＬのエタノールＤＰＰＨラジカル溶液（０．１ｍＭ）に加え、混合後に室温下で暗黒環境において３０ｍｉｎ培養した。サンプル液８０００ｇを１０ｍｉｎ遠心分離させた後、ＰＢＳ及びＤＰＰＨ溶液を対照とし、エタノール溶液及びＮＣＵ２１５サンプルをブランクとし、得られた溶液の吸光度を５１７ｎｍで測定した。消去能は下記の式で示された。

式中、Ａ_ｓは５１７ｎｍでのサンプルの吸光度であり、Ａ_ｂは５１７ｎｍでのブランクの吸光度であり、Ａ_ｃは５１７ｎｍでの対照の吸光度であった。

ヒドロキシルラジカル消去能
２．５ｍＭの１ｍＬの１，１０−フェナントロリン一水和物、１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）、２．５ｍＭの１ｍＬのＦｅＳＯ_４及び１ｍＬのＮＣＵ２１５サンプルを簡単に混合した。２０ｍＭの１ｍＬのｈ_２Ｏ_２を加えて３７℃下で９０ｍｉｎインキュベートして反応を開始させた。５３６ｎｍで混合物の吸光度を測定し、下記の式でヒドロキシルラジカル消去活性を計算した。

式中、Ａ_{ｓａｍｐｌｅ}は、サンプル及びＨ_２Ｏ_２がいずれも存在する場合の吸光度であり、Ａ_{ｃｏｎｔｒｏ１}は、サンプルがなく、Ｈ_２Ｏ_２が存在する場合の吸光度であり、Ａ_{ｂｌａｎｋ}は、サンプルがなく、Ｈ_２Ｏ_２が存在する場合の対照の吸光度であった。

ＡＢＴＳラジカル消去能
ＡＢＴＳラジカル測定キット（ビヨタイム）のマニュアルに基づいてＡＢＴＳ使用ストック溶液を調製し、室温で１６ｈ遮光放置し、ＰＢＳで吸光値をＡ_７３４＝０．７±０．０１（ＡＢＴＳ作動液）に調整した。９６ウェルプレートの各試験ウェルに２００μＬのＡＢＴＳ作動液を加えた。ブランク対照ウェルに１０μＬのＰＢＳを加え、標準曲線試験ウェル内にそれぞれ１０μＬの０．１５、０．３、０．６、０．９、１．２及び１．５ｍＭのＴｒｏｌｏｘ標準溶液を加え、サンプル試験ウェル内に１０μＬのＮＣＵ２１５サンプルを加え、軽く混合した。室温で６ｍｉｎ遮光インキュベートした後にＡ_７３４を測定した。標準曲線に基づいてサンプルの総抗酸化能を計算した。

総還元能力
ＦＲＡＰ総抗酸化能測定キット（ビヨタイム）のマニュアルに基づいてＦＲＡＰ使用溶液を調製した。０．１５、０．３、０．６、０．９、１．２及び１．５ｍＭのものを新鮮に調製した。９６ウェルプレートの各試験ウェルに１８０μＬのＦＲＡＰ作動液を加え、ブランク対照ウェルに５μＬのＰＢＳ溶液を加え、標準曲線試験ウェル内に新鮮に調製した０．１５、０．３、０．６、０．９、１．２及び１．５ｍＭのＦｅＳＯ_４標準溶液を５μＬ加え、サンプル試験ウェル内に５μＬのＮＣＵ２１５サンプルを加え、軽く混合した。３７℃で５ｍｉｎインキュベートした後、Ａ５９３を測定した。標準曲線に基づいてサンプルの総抗酸化能を計算した。

結果によれば、該菌株は、以下の良好な抗酸化活性を有することを示した。ＤＰＰＨラジカルの消去率が１１．９１％であり、ヒドロキシルラジカルの消去率が１０．８５％であり、総抗酸化能が９５．９０μｍｏｌのＴｒｏｌｏｘに相当し、総還元能力が０．２８ｍＭのＦｅＳＯ_４に相当した。

６）−１制菌活性試験
ＮＣＵ２１５をＭＲＳ培地において３７℃下で２４ｈ培養し、ＮＣＵ２１５１００００ｇを４℃下で１０ｍｉｎ遠心分離させた。発酵させた上清を０．２２μｍ濾過膜で濾過滅菌した後に、無細胞上清（ＣＦＳ）を得て−８０℃下で保存した。穴あき法でＮＣＵ２１５ＣＦＳの病原菌に対する制菌活性を測定し、すなわち、２００μＬのＮＣＵ２１５ＣＦＳを大腸菌、サルモネラ菌、リステリアモノサイトゲネス、緑膿菌、エンテロバクターサカザキ、セレウス菌及び黄色ブドウ球菌がコーティングされたＬＢプレートウェルに加え、３７℃下で１２ｈインキュベートして阻止円の直径を測定した。

６）−２溶血活性試験
試験菌株単一コロニーをピックアップしてコロンビア血液寒天プレートに画線して３７℃下で４８ｈ培養した後、溶血活性を決定した。発酵乳酸杆菌ＣＥＣＴ５７１６を陽性対照とし、黄色ブドウ球菌を陰性対照として、実験を３回繰り返した。

６）−３抗生物質感受性試験
Ｋ−Ｂ（薬剤感受性試験紙の寒天拡散法）で薬剤感受性試験を行って菌株の抗生物質の薬剤耐性を評価した。一夜培養した乳酸杆菌発酵液で細菌濃度を１０^８ＣＦＵ／ｍＬに調整し、乳酸杆菌発酵液１００μＬをピペッティングしてＭＲＳプレートにコーティングした。それぞれストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）、アンピシリン（１０ｍｇ／ｍＬ）、エリスロマイシン（１５ｍｇ／ｍＬ）、テトラサイクリン（３０ｍｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）、カナマイシン（３０ｍｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１０ｍｇ／ｍＬ）、セファロスポリンチオフェン（１５ｍｇ／ｍＬ）、シプロフロキサシン（５ｍｇ／ｍＬ）及びアモキシシリン（３０ｍｇ／ｍＬ）の薬剤感受性試験紙を乳酸杆菌の菌液がコーティングされたＭＲＳプレートに軽く置いて、３７℃で２４ｈ培養し、阻止円の直径をノギスで測定し、試験乳酸杆菌の上記抗生物質に対する感受性を決定した。

結果によれば、該菌株で２４ｈ発酵させた上清は、通常の食品媒介病原菌に対して優れた制菌活性を有し、特に、リステリアモノサイトゲネス及び黄色ブドウ球菌に対する抑制活性が最も高く、それらの阻止円直径がそれぞれ２３．１８ｍｍ及び２４．４２ｍｍであることを示し、また、該菌株の溶血活性測定によれば、溶血性を有さないことを示し、抗生物質感受性測定によれば、該菌株がテトラサイクリン、アンピシリン、アモキシシリン、セファロスポリンチオフェン、エリスロマイシン及びペニシリンに敏感であり、カナマイシン、シプロフロキサシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンに耐受を持っていることを示した。

以上の実施例は本発明のいくつかの実施形態にすぎず、具体的かつ詳細に説明されているが、特許範囲に対する制限として理解してはいけない。なお、当業者にとっては、本特許の発想から逸脱することなく、上記各実施形態に対していくつかの変形、組合せや改良を行うことができ、これらはすべて本特許の特許範囲に属する。従って、本特許の特許範囲は特許請求の範囲を基準とする。

Claims

ラクトバチルスカゼイプロバイオティクスであって、具体的には、保存番号がＣＧＭＣＣＮｏ．１８７０２のラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）ＮＣＵ２１５であることを特徴とするラクトバチルスカゼイプロバイオティクス。
プロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料製品であって、１５〜３５部の果物野菜パルプ、４５〜８４．９５部の純水、０．０５〜２０部のグルコース又は代用糖といった原料をプロバイオティクスで発酵させて得られ、
前記プロバイオティクスは、保存番号がＣＧＭＣＣＮｏ．１８７０２のラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）ＮＣＵ２１５であることを特徴とするプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料製品。
原料は更に０．０１〜０．５部のエリソルビン酸ナトリウム又はビタミンＣを含むことを特徴とする請求項２に記載のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料。
前記代用糖は白砂糖、スクラロース、アスパルテーム、ステビオサイド、アセスルファムカリウム、チクロ又はイソマルトオリゴ糖であることを特徴とする請求項２に記載のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料。
腐っていない新鮮な果物野菜を原料として選択し、洗浄後に食べられない部分を除去し、圧搾し又は搾って請求項１の原料成分を上記の割合で均一に撹拌して果物野菜ジュースを得て、滅菌するステップ（１）と、
滅菌後に果物野菜ジュースを２０℃〜４５℃に冷却させ、プロバイオティクスを１０^３〜１０^９ｃｆｕ／ｍＬの割合で滅菌冷却後の果物野菜ジュースに接種し、ｐＨ値３．０〜５．０を発酵終点として２５℃〜４５℃で発酵させるステップ（２）とを含む製造方法により得られることを特徴とする請求項２に記載のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料。
滅菌温度は８５℃〜１３２℃、滅菌時間は２秒〜３０分間であることを特徴とする請求項５に記載のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料。
発酵後の果物野菜ジュースに対して酸度又は甘味度標準化を行って、プロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料を得ることを特徴とする請求項５に記載のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料。
前記プロバイオティクスで発酵させた仕上がり果物野菜飲料を０℃〜４℃の冷蔵庫に入れて冷蔵し、又は８５℃〜１３２℃で、２秒〜１０分間超高温瞬時殺菌して無菌で缶詰めし、又は缶詰めしてシールした後に７５℃〜１３２℃で、２０〜４０分間殺菌することを特徴とする請求項５に記載のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料。
前記発酵の時間が１０〜３６時間であることを特徴とする請求項５に記載のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料。
ベリー類、瓜類、仁果類、根菜類、葉菜類、果菜類のうちの任意の１種又は複数種を果物野菜の原料とすることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロバイオティクスで発酵させた果物野菜飲料。