CN1152939A - 促进中枢神经系统髓鞘再形成的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了当给予患有脱髓鞘性疾病哺乳动物IgM单克隆抗体时，可促进中枢神经系统髓鞘再形成作用。这些抗体显示多器官的自体反应活性，并可识别神经原细胞表面和胞浆的抗原决定簇。

Description

促进中枢神经系统髓鞘 再形成的单克隆抗体
发明背景
多发性硬化症(MS)是一类慢性、炎症性和通常是进行性的中枢神经系统(CNS)疾病，其病理特征在于初期的脱髓鞘作用，而且通常无轴索损伤的发生。多发性硬化症的病因学和病原学尚不清楚。多发性硬化症的一些免疫学性质，以及它与某些主要组织相容性复合物(MHC)等位基因的一定联系，促使人们推测它是一种免疫介导的疾病(哈夫，D.A and魏纳，H.L.今日免疫，10：104-107(1989)；康普斯顿，D.A.S.，“Genetic Susceptibityto multiple Sclerosis，”In：McAlpine氏多发性硬化症(马修，B编)，pp301-319，伦敦：ChurchiLlvingston(1991)；奥森，T.Curr.Opin.Neurosurg.5：195-202(1992))。
实验性自身免疫(过敏性)脑脊髓炎(EAE)模型支持了该病的自身免疫性疾病的假说，因为将某些髓鞘质的组份注射至遗传学易感动物中会导致T细胞介导的中枢神经系统脱髓鞘作用(卡巴，E.A.et al.，实验药学杂志，85：117-129(1947)；鲁伯林，F.D.，Spinger Semin.Immunopathol.，8：197-208(1985))。然而，在多发性硬化症患者的中枢神经系统或与多发性硬化症相关的其它自身免疫性疾病中尚未能确切发现由特异性抗原或病原性髓鞘反应性的T细胞。基于流行病学的数据(马汀，C.，“The epidmioiolgy of multiple Sclerosis.In：McAlpine氏多发性硬化症，(马修，B编)，pp 3-40，伦敦：ChurchilLiuingstong)，另一种假说认为环境因素，可能是某类未知的病毒，参与了中枢神经系统的免疫反应，并导致髓鞘质直接或间接(“bystander”)的破坏，生成潜在的诱发自身免疫性反应的组份(兰伯特，P.W.美国病理学杂志91：176-208(1978)。一些证据支持这一假说，对于人(莱斯.G.P.A.，Curr.Opin.Neurol.Neurosurg.，5：188-194(1992))和动物(道坎图，M.C.and莱比诺维茨，S.G.，Ann.Neurol.，11：109-127(1982))，发生某些自然的病毒感染时会导致脱髓鞘作用。通常使用的一个病毒实验模型是由Theiler’s鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)引起(道坎图，M.C.，and利普顿，H.L.，美国病理学杂志，88：497-500(1977))。
日前治疗多发性硬化症及其它脱髓鞘性疾病的局限性(古金，O.E.etal.，Clev.Clin.J.Med.，59：63-74(1992))，已经引起了人们使用新的治疗方法去改善这些疾病的兴趣(马汀，R.，et al.，免疫学综述年评，10：153-187(1992)；斯腾曼，L.，Adv.免疫学进展，49：357-379(1992)；魏纳，H.L.，et al.，Science 259：1321-1324(1993))。然而，由于这类疾病的发病机理所显示的复杂性，即潜在地包括环境及自身免疫两方面的因素，因此仍需要一种有效的方法去治疗这类脱髓鞘性疾病。
发明概述
本发明涉及促进或刺激哺乳动物中枢神经系统轴索的髓鞘再形成。本发明特别涉及使用单克隆抗体的方法刺激中枢神经系统轴索髓鞘再形成，该抗体可由经正常哺乳动物(例如未感染任何脱髓鞘性疾病的动物)脊髓匀浆(SCH)所免疫的哺乳动物中获得。该单克隆在此称作SCH 94.03，按照Budapest条约，分泌该单抗的杂交瘤已于1994年4月28日存入美国种型培养收集库(ATCC)，登记号为CRL11627。本文表明，使用SCH 94.03单抗处理患有脱髓鞘性疾病的哺乳动物，与使用对照单抗的小鼠相比，结果显示中枢神经系统髓鞘再形成作用增加。
本发明亦涉及使用SCH 94.03单抗处理哺乳动物脱髓鞘性疾病的方法，如人类多发性硬化症；或者治疗人类或家畜中枢神经系统病毒性疾病的方法，如感染后脑脊髓炎；以及预防性地抑制这些疾病状态下的脱髓鞘作用的发生和发展。本发明进一步涉及引起和刺激O神经胶质细胞，如少突神经胶质细胞，在体外增殖的方法，以及使用这些神经胶质细胞治疗脱髓鞘性疾病。
图示简介
图1描述了抗体介导的大鼠大脑混合培养物中，细胞增殖的剂量-反应性质。
图2描述了抗体介导的大鼠大脑混合培养物中，细胞的时间曲线。
图3A-D显示了SCH 94.03单抗促进中枢神经系统髓鞘再形成的光学和电子显微照片。(A)SCH 94.03单抗处理的慢性感染的SJL/J小鼠脊髓切片的光学显微照片，显示中枢神经系统的髓鞘再形成作用。(B)对照IgM处理的慢性感染的SJL/J小鼠脊髓切片的光学显微照片，显示广泛的脱髓鞘作用和几乎无髓鞘再形成作用。箭号指示炎症细胞，包含消化的髓鞘碎片的巨噬细胞。星号指示代表性裸露的轴索。(C)具有正常髓鞘的脊髓切片光学显微照片。(D)SCH 94.03单抗处理动物的脊髓切片的电子显微照片，显示出与轴索直径相比不正常薄髓壳的多个轴索。右上角星号指示具有正常髓壳厚度的轴索。箭头指示星形胶质细胞化的过程，显示与轴索的髓鞘再形成有关。A-C的标尺框代表13μm，而D为2μm。
图4描述临床疾病的变化与形态学上髓鞘再形成间的相关性。
图5描述了SCH 94.03单抗处理与中枢神经系统髓鞘再形成的剂量一反应关系。不同剂量SCH 94.03单抗处理动物中枢神经系统的髓鞘再形成面积(·)和髓鞘再形成面积与损伤面积的百分比(O)。
图6显示TMEV蛋白的蛋白印迹杂交(Western blot)。在SDS-PAGE上电泳分离从感染的L2成纤维细胞得到的细胞裂解物，转移至硝酸纤维素膜上，并分别与SCH 94.03单抗(条带1)、SCH 94.03单抗(条带2)、慢性感染TMEV的易感小鼠血清(条带3)和兔抗TMEV的IgG多抗(条带4)杂交。左侧以千道尔顿(KDa)标明了蛋白的分子量。右侧标明了TMEV外壳的主要蛋白。
图7A-7D显示了培养的神经胶质细胞和冰冻的中枢神经系统组织物切片以SCH 94.03单抗的免疫染色。标尺框代表15μm。
图8A-8C显示ELISA法测定SCH 94.03单抗(图8A)和对照IgMs抗体(图8B和8C)与各种蛋白抗原结合的结果。
图9显示ELISA法测定SCH 94.03单抗F(ab2)′片段与各种蛋白抗原结合的结果。
图10A-10C显示ELISA法测定SCH 94.03单抗(图10A)的对照IgMs抗体(图10B和10C)与化学修饰半抗原结合的结果。
图11显示SCH 94.03单抗和对照IgM、CH12以及胚系Ig基因片段中免疫球蛋白轻链和重链可变区序列的排列(SEQ ID NOS：1-11)。
发明详述
本发明涉及促进或刺激哺乳动物中枢神经系统轴索的髓鞘再形成。
本发明特别涉及使用单抗刺激中枢神经系统轴索髓鞘再形成的方法，该抗体可由经正常哺乳动物(如未感染任何脱髓鞘疾病的动物)脊髓匀浆免疫的哺乳动物中获得。该单抗称为SCH 94.03(或SCH 94.32)，为IgM单抗，本发明使用若干生化和分子分析描述了该单抗的抗原活性特征，其中包括免疫组织化学、细胞免疫化学、Western-blotting、固态酶联免疫吸附分析(ELISA)和Ig可变区的序列分析。按照Budapest条约，分泌SCH 94.03单抗的杂交瘤已于1994年4月28日存入美国种型培养收集库(ATCC)，登记号为CRL 11627。经本专利发明人的同意，对获取该贮存物的所有限制不可改变地取消。
本发明涉及使用SCH 94.03单抗治疗哺乳动物脱髓鞘性疾病的方法，如人类多发性硬化症；或治疗人类或家畜中枢神经系统病毒性疾病的方法，如感染后脑脊髓炎。本发明亦包括使用该单抗去抑制脱髓鞘性疾病发生和发展的预防性治疗方法。
促进中枢神经系统髓鞘再形成SCH单抗的选择
如实施例1所详述，构建了一组单克隆抗体，它们来自注射了SCH的、未感染的SJL/L小鼠的脾细胞。经过融合和克隆后，使用ELISA法确定，在95孔活的Ig-分泌性的杂交瘤中，有两孔含有显著结合SCH的单抗。从这两孔中获得的被称为79和94系列的杂交瘤，经过限制性稀释后被亚克隆化，并用ELISA法再筛选与SCH的结合。对于79系列，在49个克隆中有14个为ELISA法SCH结合阳性，而对于94株，在32个克隆中有17个为SCH结合阳性。79株的两个杂交瘤(SCH 79.08和SCH 79.27)，用ELISA法发现它们都还与髓鞘质碱性蛋白(MBP)结合，而94株的三个杂交瘤(SCH 94.03、SCH 94.11的SCH 94.32)，均不与MBP结合，这些杂交瘤均被用于抗体的腹水生产和体内的转移试验。
单抗促进神经胶质细胞的增殖
如实施例2所述，在体外测定了以上单克隆抗体促进神经胶质细胞增殖的能力。表1表明，与生长在单独培养基或含其它同种型相匹配的对比单抗的对照组比较，生长在含有94.03或79.27单抗组中的大鼠视神经细胞可掺入更多的3H-胸苷。数据为具有类似结果的五次实验中的一个。
接着测定了抗体介导细胞增殖的剂量一反应性质。图1所示，94.03单抗的最大刺激浓度在100ng/ml。对照的骨髓瘤IgMs MOPC 104E和TEPC(结果未显示)同样可以刺激大鼠大脑混合培养细胞的增殖，但它们的最大作用浓度高达94.03单抗的10倍。
图2显示了抗体介导细胞增殖的时间曲线。在培养开始后的第8天，将100ng/ml抗体加入培养液(时间记为0)。以24小时间隔收集细胞，并以每个时间间隔最后培养24小时加入3H-胸苷以测定细胞增殖。94.03单抗的最大刺激的时间为抗体加入后72小时。94.32具有相似的结果。对照的其它同种型抗体经120小时的培养，均未显示明显的细胞增殖作用。这些数据表明，94.32和94.03单抗均可引起大鼠大脑混合培养物中神经胶质细胞的增殖，且增殖的最大值发生在抗体浓度为100ng/ml和抗体加入后培养72小时期间。
单抗SCH 94.03和SCH 94.32促进中枢神经系统髓鞘再形成
如实施例3所述，用单抗处理TMEV慢性感染的SJL/J小鼠，单抗的总剂量为：静脉注射0.5mg或腹腔注射5.0mg并分别以每周两次，约4-5周给完。每只小鼠取十份脊髓横切片，用定量形态分析的方法测定中枢神经系统的髓鞘再形成。中枢神经系统髓鞘再形成的标准为与轴索直径相比不正常薄的髓鞘。数据取自六次实验，表示为均值±SEM，n代表小鼠的只数。使用修改后的rank sum检验，将髓鞘再形成的累积值与IgM和仅含缓冲液的对照组进行统计比较。经单侧ANOVA分析，各处理组间的脱髓鞘化损伤数目和面积没有显著性差异。至于对照的IgMs抗体，我们使用了骨髓瘤MOPC 104E抗体和ABPC 22抗体(均购自Sigma)，以及TB5-1，一种抗分枝杆菌的单抗。
经SCH 94.03或SCH 94.32单抗处理的TMEV慢性感染的SJL/J小鼠，与其它同种型相匹配对照抗体或仅含缓冲液处理的对照组相比，中枢神经系统髓鞘再形成作用显著增强(表2)。
经静脉注射或腹腔注射(单抗)后，可见髓鞘再形成作用。经SCH94.03或SCH 94.32单抗处理的动物与对照组动物相比，具有多出约2-3倍的髓鞘再形成化的损伤，和大出3-4倍的中枢神经系统髓鞘再形成总面积。当使用这两个治疗效果参数作为累积统计比较时，SCH 94.03和SCH 94.32单抗引起的中枢神经系统髓鞘再形成作用显示高的显著性(P＜0.005；表2)。在诸如TMEV感染的慢性进行性疾病中，中枢神经系统的修复程度是中枢神经系统的损伤程度的正函数。各处理组间在中枢神经系统损伤的数目和面积上均无差异，表明相似的疾病程度(表2)。当用显示髓鞘再形成(区域)占损伤面积的百分率表示中枢神经系统髓鞘再形成时，在SCH 94.03或SCH 94.32处理小鼠中，大约有1/3的累积脱髓鞘损伤面积显示出中枢神经系统的髓鞘再形成作用(表2)。
中枢神经系统髓鞘再形成的形态学
经光学和电子显微术，中枢神经系统的髓鞘再形成作用易于作形态学上的确定(图3A-3D)。图3A显示了SCH 94.03单抗处理后动物的髓鞘再形成损伤区。损伤部位中的大部分轴索显示出形态学上修复的迹象，即与轴索直径相比非正常薄的髓鞘(拉顿，S.K.“鼠中枢神经系统髓鞘再形成”In：具有髓鞘的轴索的病理学(Adachi M，Hirano A，Aronson SM eds)，pp 49-79，Tokyo：Igaku-Shoin Ltd.(1985)；拉顿，S.K.，神经科学进展，47：215-254(1988))。与此对照，图3B显示了脱髓鞘损伤，很少有髓鞘再形成，而图3C为正常的髓鞘质，具有较厚的具有髓鞘的轴索。在髓鞘再形成化的损伤区(图3A)，有100μm2中有15.3±1.0个(均值±SEM)髓鞘化的轴索，与此相比，在脱髓鞘损伤区(图3B)，100μm2中只有1.1±0.2个髓鞘化的轴索。图3C显示了具有正常髓鞘质脊髓切片的光学显微照片，中枢神经系统髓鞘再形成作用非常明显(图3D)。尽管每个轴索髓鞘再形成的程度(即髓鞘质的厚度)不同，视野中几乎每个轴索都有新的髓鞘质形成的迹象，表明修复过程的不同阶段。髓鞘再形成化轴索的髓鞘质厚度与轴突直径相比为0.08±0.01(均值±SEM，n＝25个轴索)、与此相比，对于正常髓鞘质化的轴索为0.21±0.01(n＝34个轴索)。
临床疾病与髓鞘再形成形态学间的相关性
实施例3评价了形态学上髓鞘再形成与有关疾病改善临床征兆间的相关性。如实施例3所述，对每个经注射处理的小鼠均进行了临床评估。临床评价值的变化与损伤区域中髓鞘再形成所占百分率间具有相关性(图4)。形态学上的髓鞘再形成可表示为中枢神经系统髓鞘再形成占损伤面积的百分率。在临床评价分数的变化值中，0代表了动物在处理过程中(4-5个星期)病情稳定，而正的变化值表示临床病情的恶化，负值则代表了病情的改善。上述数据来自所有处理组中的动物个体。正的变化值表明疾病的恶化。使用所有处理组的数据，临床评价分数与髓鞘再形成占损伤面积百分率间显示了一定的、但是显著的负相关性(R＝-0.40；P＜0.04)。尽管只有少数动物在临床上有真正的改善(Δ临床评价分数＜0)，那些病情加重(Δ临床评价分数＞0)的动物具有形态学髓鞘再形成减少的趋势，而那些保持临床稳定病情(Δ临床评价分数＝0)的动物显示出最明显的髓鞘再形成作用。如表2所示，当使用髓鞘再形成的其它定量测定时(髓鞘再形成数目和面积)，可获得同样的负相关性。这些数据表明，有形态学方法定量的髓鞘再形成作用与减缓临床病情进展有关。
SCH 94.03单抗剂量与中枢神经系统髓鞘再形成的量效关系
对于最初的治疗试验，单抗的总剂量在经验上选择静脉注射25mg/kg的腹腔注射250mg/kg。为评估剂量-反应性质和确定促进髓鞘再形成所需单抗的最小剂量，使用了不同剂量的SCH 94.03单抗处理慢性感染的小鼠。使用较大剂量的SCH 94.03单抗，可使髓鞘再形成化损伤数目(数据未显示)和髓鞘再形成总面积(图5)均有显著地增加。髓鞘再形成作用如表2所述可以定量确定。数据为每个单抗剂量下4-5只动物的均值，并按图5上所示的最终累积剂量。SEM平均为均值的35％。通过单侧的ANOVA分析，在脱髓鞘化损伤或脱髓鞘化面积上各处理组间无统计学上的差异，表明所有动物具有相似的疾病程度。脱髓鞘化损伤数目和损伤面积分别为：1000μg组33.2±7.5和1.25±0.43，100μg组31.8±8和1.11±0.31，10μg组23.8±3.4和0.54±0.14，和单纯缓冲液对照组29.0±6.5和0.74±0.20(图上用剂量0表示)。用100μg对照IgM(MOPC 104E)处理的动物具有与用单纯缓冲液处理的动物相类似的髓鞘再形成评估值。当把中枢神经系统病情的程度考虑在内的话，SCH 94.03剂量与中枢神经系统髓鞘再形成间的正相关性更加明确。当把中枢神经系统修复表示为损伤面积中髓鞘再形成所占百分率时，经1000、100或10μg SCH 94.03单抗处理的小鼠，其髓鞘再形成作为分别为对照组的6、5和4倍(图5)。给小鼠腹腔注射少至10μg的SCH 94.03单抗(0.5mg/kg)即显示出显著的中枢神经再形成作用。这些数据表明SCH 94.03单抗与中枢神经系统髓鞘再形成作用间存在着剂量-反应的正相关，只需很少剂量的单抗即可促进髓鞘质的修复。
SCH上94.03和SCH 94.32的抗原特异性
尽管SCH 94.03和SCH 94.32单抗源自未感染小鼠的脾细胞，并经过取自未感染小鼠的SCH加以筛选，必须直接评估这两种单抗是否能够在体外与TMEV外壳蛋白反应或抑制该病毒的感染性。通过Western-blotting分析(图6)，SCH 94.03和SCH 94.32不与任何一种TMEV蛋白反应，而这些蛋白可被慢性感染小鼠的血清或注射纯化的TMEV的兔多抗所识别(Rodriguez，M.，et al.，神经病学年评，13：426-433(1983))。把对照模拟感染的L2细胞，其细胞裂解液的Western blot表明可与慢性感染动物血清反应在32kd有一个条带，而与兔抗TMEVIgG多抗反应时43kd一个条带，但与SCH 94.03或94.32单抗无反应性。
另外，在体外，使用最高达到5μg/ml的SCH 94.03或SCH 94.32单抗不能显著地抑制TMEV的感染性，而在该测试条件下使用1∶34,000倍稀释的慢性感染动物血清，可以中和50％的TMEV。这些结果表明SCH 94.03和SCH 94.32单抗的临床效果并非直接抑制病毒。
为了开始表征SCH 94.03和SCH 94.32单抗所识别的抗原，来自神经胶质的不同细胞系(大鼠C6、小鼠G26-20、人U373MG和U87MG)、神经细胞(人成神经细胞瘤)、成纤维细胞(小鼠L和3T3)、上皮细胞(人SCC-9肉瘤)和淋巴细胞(小鼠CTLL2)被用于染色。这两种单抗均使所有被测细胞系的内部抗原染色，这表明在体外这些单抗识别的某类抗原不局限于特定的细胞类型中。基于SCH 94.03和SCH 94.32的治疗效果是由于对中枢神经系统特定作用的假设，进一步研究了SCH94.03和SCH 94.32对培养的大鼠神经胶原细胞系5.5BS细胞的免疫染色。这一不死的神经胶原细胞系具有辅助细胞(ac)和星形细胞的表型特征，可表达MBP和2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶(CNP)，以及表达的、但可测到的神经胶质纤维酸蛋白(GFAP)的表达，有脂质或可被A2B5和O4单抗识别的蛋白(Bozyczko，D.et al.，Ann.NY AcadSci.，605：350-353(1990))。SCH 94.03和SCH 94.32均可识别5.5 B8细胞表面和胞浆中的抗原决定簇。细胞表面染色主要在小个细胞上，它们位于细胞层的顶部，为形态学上已分化的细胞(图7A)。活细胞的流式细胞测定证实了这一细胞表面的染色结果。当细胞膜经脱水或非离子表面活性剂短暂处理的而透性化以暴露内部抗原，染色的方式发生了很大的改变(图7B)。胞浆染色为丝状，具有稠密的核周围网络，并延伸至细胞的突起中。这一类型与中央丝状的骨架蛋白Vimentin的染色类型非常相似。这些结果表明，SCH 94.03和SCH 94.32识别的抗原不局限神经系统来源的细胞，但它们确实对神经胶原细胞表面和胞浆中的抗原决定簇都可识别。
对于冰冻的小鼠、大鼠和人组织的免疫组化染色证实SCH 94.03和SCH 94.32不是中枢神经系统特异的单抗，而具有多器官的反应活性。对所有受检的主要器官进行两种抗体的免疫染色，其中包括脑、脊髓、视神经、心脏、肝脏、肾脏、胃、小肠和骨胳肌。然而某一器官内并非所有的细胞均被染色，表明其原位细胞学的特异性。在中枢神经系统内，SCH 94.03和SCH 94.32主要着染血管、室管膜细胞、具有神经胶质细胞形态特征的星状细胞，这些细胞富含于新生小脑、脑室周围和脑干白质区(图7C)，以及新生和成熟的视神经。在人尸解脑组织中，特别是在灰白质交接处(图7D)。可发现同样的SCH94.03和SCH94.32阳性神经胶质原细胞SCH 94.03单抗可得到同样的免疫染色的结果。可被SCH94.03和SCH 94.32免疫着染的所有样品和组织结构，在使用对照IgM(MOPC 104E)免疫染色显示阴性。
被称为“天然”或“生理性”自身抗体整个家族的确定和表征，影响了自身免疫和自体反应的传统观念。经过广泛的研究，尽管发现过其它同种型，天然的自身抗体是典型的IgMs，并可以与广泛范围的抗原反应，包括细胞骨架蛋白、表面蛋白、核酸、磷酯、细菌抗原如脂多糖，以及各种化学性半抗原(见Avramesa and Ternynck的综述，Mol.Immunol.，30：1133-1142(1993))。天然的自身抗原具有广泛的个体型交叉反应性或“联系性”，包括相似个体型的表达，一些病原性自身抗体的表达，以及对其它抗体所表达的共同个体型的反应性，分子分析表明，天然自身抗体一般由无突变的胚系免疫球蛋白(Ig)基因编码，只有很少的假如存在的体细胞突变，并因此是Ig全部组份的大部份，特别在那些尚未广泛接触外源性抗原的新生动物中。
天然自身抗体的功能仍不清楚。基于自身抗体的生化和分子特性，已提出了若干种假说，其中包括：(1)清除衰老或损伤的组份(2)提供在接触病原体后到抗原特异性免疫反应这一滞后期间内的第一道免疫防线(3)掩蔽潜在病原体自身免疫反应中的自身抗原(4)免疫调节，包括通过个体型网络构建新生动物的免疫组份(5)参与骨髓中B细胞的正性选择，类似于设想的胸腺中T细胞的选择过程。
因此，检验了SCH 94.03和SCH 94.32抗体为天然自身抗体的假设。为确定SCH 94.03和SCH 94.32抗体反应性的特性，使用了一些生化和分子分析，包括免疫组织化学和免疫细胞化学、Western blotting、固相酶联免疫吸附分析(EL1SA)和Ig可变区序列分析。如下所述，在所有的生化测定方面，很难区分SCH 94.03和SCH 94.32。另外，SCH 94.03和SCH 94.32具有相同的Ig可变区序列，证明他们是相同的单抗。
SCH 94.03刺激中枢神经系统髓鞘再形成的潜在机制可能是刺激了参与髓鞘形成作用细胞的增殖和/或分化，主要是少突神经胶原细胞或者它们的未成熟前体细胞。因此，SCH 94.03单抗是否能够着染不同细胞的表面进行了测定。使用永生化的细胞，确定SCH 94.03可以着染两种神经胶质细胞系，5.5B8(图7A)和20.2E11，但不能着染其它几种神经胶质细胞系的表面(10.IA3、20.2A40、C6、G26-20)、成神经细胞瘤系(B104)、两种成纤维细胞系(L2，Cos-1)或两种成肌细胞瘤(G8，L6)。从动物组织中分离的细胞和在培养基中生长的细胞获得同样的结果。SCH 94.03可以着染少突神经细胞表面，但不可看染星形细胞、小神经胶质细胞、许旺细胞(Schwann)成肌细胞或成纤维细胞。
同样用Western blotting测定了SCH 94.03单抗与神经胶质细胞、淋巴细胞系和脑、肝和小肠组织裂解液来源蛋白质的反应性。SCH 94.03与所有被检细胞和组织的多条蛋白带反应，并主要与50、95、120和＞200KDa的蛋白带反应。这些蛋白带的确切成份尚未确定。
用固态ELISA测定了SCH 94.03与一些纯化蛋白自身抗原的反应性(图8A-8C)。SCH 94.03显示对RBC抗原血影蛋白具有强的反应性，同样显示对血红蛋白、肌动蛋白、微管蛋白、波形蛋白和甲状腺球蛋白一定的反应性，尽管相对血影蛋白的反应程度较低。在本测定条件下，末观察到SCH 94.03与肌浆蛋白、转铁蛋白、白蛋白、溶菌酶或髓鞘质碱性蛋白的反应性。同样测定了其它六种对照的单抗或骨髓瘤的IgM，即XXMEN-OE5(图8B)、A2B5、MOPC104E、TEPC183、01以及CH12(图8C)均未观察到与所测任一抗原的反应性。
为证实SCH 94.03的单克隆性，使用固相ELISA测定了18种SCH94.03亚克隆(各有9种分别来自SCH 94.03和SCH 94.32母克隆细胞)的多反应性。在与一系列的蛋白抗原作用时，所有18种亚克隆显示了与其母克隆SCH 94.03一致的反应模式。为进一步证实SCH 94.03的多反应性是通过它的Fab区域的，我们制备了其F(ab)2′片段，并用ELISA法分析了它们与蛋白抗原的反应性(图9)。SCH 94.03的F(ab)2′片段显示了与IgM整个分子相似的多反应性。
通过与牛血清蛋白(BSA)构建一组化学半抗原，并用于固态ELISA法测定SCH 94.03的反应性(图10A-10C)。SCH 94.03显示对fluorescein(FL)和4-羟基-3-硝基苯基乙酸(NP)的强反应性，对苯噁唑酮(PhOx)的适中反应性，以及对三硝基苯(TNP)和对苯偶氮基砷酸(ArS)的弱反应性。而未测到对于对苯偶氮基三甲基铵(TMS)、对苯偶氮基磷酰胆碱(PC)或载体蛋白BSA的反应性。除了CH12可与TMA反应，以及如以前所报道的A2B5与NP反应外，对照的IgMs(图10B和10C)与任一测定的半抗原均末显示显著的结合作用。
进一步研究了SCH 94.03的Ig轻链(序列号NOS：1和2)和重链(H)(序列号NOS：6和7)是否由胚系(germline)Ig基因编码(图11)。SCH 94.03轻链可变区(VL)和结合区(JL)的核苷酸序列(序列号NOS：1和2)与以前发表胚系Vk10(序列号NO：4)和Jkl基因(序列号NO：5)的序列有99.4％相同，仅在VL和JL区3′有两个沉默变化。SCH 94.03 VH区(序列号NOS：6和7)的核苷酸序列与先前发表的胚系VH23(序列号NO：10)完全相同，而JH区域的序列与发表的胚JH2(序列号NO：11)在J区的5′端有1个核苷酸不同，在多样化(D)区有15个连续的核苷酸序列与胚系DFL16.1的基因序列不同。在V-D联连处和D-J联接处分别有8个和1个核苷酸与其它任何已知的胚系V或D区基因不符，它们可能是在V-D-J重组时，由末端脱氧核苷酸转移酶(deoxynucleotide transferase)插入的非编码核苷酸。由于SCH 94.03的重链与胚系基因的改变仅发生在V-D或D-J联接区，因此可以说明该变化是由于非编码核苷酸插入或是不精确联接的结果，而非体细胞突变的结果。另外，SCH 94.03的轻链和重链可变区均显示与B细胞淋巴瘤CH12产生的IgM(序列号NOS：8和9)广泛的序列相似性。
SCH 94.03是一种天然的自身抗体
这些抗原反应活性的初步结果提示，SCH 94.03是一种天然的自身抗体。尽管这一结论并不能轻易地作为SCH 94.03如何刺激中枢神经系统髓鞘再形成作用的一种机理，它至少表明了天然的自身抗原一种重要的生理功能。在正常生理过程中，或者对于组织损伤和对于所导致的以前隔离的抗原释放的反应中，生成的自身抗体可主动地参与了促进损伤组织的修复。按照以前对天然自身抗体功能的推测，这一主动的参与反应可能有利于移去损伤组织、掩蔽自身抗原因而阻止强烈的病原自身免疫反应、调节那些可以导致组织破坏的免疫反应，因而允许正常内源性组织修复的形成，或者直接刺激参与修复的细胞。
因此本发明所描述的研究结果阐明了一种自身抗体的产生、对其自身抗原结合能力的筛选，以及对于中枢神经系统髓鞘再形成的促进作用。通过对中枢神经系统髓鞘再形成作用细致、定量的形态学评估，受TMEV慢性感染的小鼠在经过杂交瘤分泌的SCH 94.03和SCH 94.32单抗静脉注射或腹腔注射处理后，中枢神经系统的修复明显地高于对对照动物。此外，最初的数据表明，自身抗体SCH 94.03同样可以有效地促进遭受实验性自身免疫性脑脊髓炎EAE哺乳动物的髓鞘再形成作用。因此，有理有预测自身抗体，如SCH 94.03单抗，将有阻止中枢神经系统疾病中免疫介导的脱髓鞘化过程中起到重要的作用。
关于抗体促进髓鞘再形成作用有两种潜在的机制。第一种机制认为抗体可能抑制了疾病过程中的一些病原成份，如病毒的活性，而这些物质所引起的免疫反应直接导致了脱髓鞘作用或是阻止了髓鞘再形成作用。如果疾病的后果是建立在组织破坏和修复平衡的基础上的，病原性成份的抑制可以使得生理性修复反应占主导地位。实验性和临床的证据支持这一假说。多发性硬化症和若干中枢神经系统脱髓鞘化实验模型中可见自发性的中枢神经系统髓鞘再形成，本发明所用模型的对照组小鼠中同样也可见自发性的髓鞘再形成。这表明髓鞘再形成是对髓鞘质损伤的生理反应。另外，给受TMEV慢性感染的小鼠不同的免疫抑制剂可以促进髓鞘再形成，但不减轻脱髓鞘作用，这表明存在有一种抑制再形成的免疫性成份(Rodriguez，M.and Lindsley，M.D.，Neurology，42：348-357(1992))。初步的免疫功能研究表明，SCH 94.03处理后的动物与对照动物相比，它们脾脏内B细胞和T细胞(CD4+和CD8+)数目是相近的，具有相似的体外脾细胞对丝裂原和抗原的增殖性反应，以及数值上可比的对T细胞依赖和不依赖抗原的抗体反应。
以上机制的第二种假说是某些抗体可以主动刺激中枢神经系统的髓鞘再形成作用，象体外所证明的那样，可能是通过体内对少突神经胶质细胞增殖和/或分化的刺激(戴兹，M.et al.，脑研究，154：231-239(1978)；莱恩，C.S.et al.，Lab.Invest.，38：397-403(1979)；莱勒，G.M.et al.，脑研究，172：557-560(1979)；班索，R.et al.，神经科学研究杂志，21：260-267(1988)；本杰明，J.A.and戴，C.A.，纽约科学院年评，605：90-100(1990)；戴，C.A.，分子神经科学，7：1-22(1993))。SCH 94.03单抗可直接刺激神经胶质细胞的前体细胞，而这些细胞出现在人或实验性中枢神经系统损伤区的边缘，在那里显示出主动的髓鞘再形成作用。另外，SCH 94.03可能间接的起作用，即通过活化星状细胞或其它辅助细胞，而这些细胞可以释放在少突神经胶质细胞谱系中细胞生存或增殖起重要作用的因子。在髓鞘质破坏而释放组织成份的原位，所形成的抗体-抗原复合物同样可能参与抗体介导的中枢神经髓鞘再形成作用。尽管SCH 94.03并非中枢神经系统物特异性，但它对于神经胶质细胞表面和胞浆抗原均可识别，从而支持了上述的主动机制的假说。与免疫调节假说相反，因为调节假说不需要抗体直接进入中枢神经系统，而抗体主动刺激中枢神经系统髓鞘再形成的前提是抗体直接进入中枢神经系统，这一点与血脑屏障的选择透过性相背，特别是对于那些大分子的抗体如五聚体IgM。然而，在如TMEV感染或多发性硬化症的慢性炎症条件下，外周血白细胞可游走至中枢神经系统，表明血脑屏障透过性的改变。因此，大分子蛋白，如血清Ig，在被动扩散作用下通过“开放”的内皮细胞或者在未知的主动运输机制下，也可能进入中枢神经系统。
脱髓鞘化疾病的治疗
对于上述的实验结果，业已有对多发性硬化症、脑脊髓炎和其它中枢神经系统脱髓鞘性疾病治疗的实际应用。在多发性硬化症中可发现极少数的自发性中枢神经系统型髓鞘再形成(暗状空斑)的病例，而在脊髓根进入区附近的脱髓鞘性空斑中，偶而可见外周神经系统(PNS)型的髓鞘再形成作用。在多发性硬化症的慢性空斑中心偶有少突神经胶质细胞，但在空斑的外周可见这类细胞的增殖，在那里他们与不完全的髓鞘再形成有关。髓质再形成过程可能与临床观察到的多发性硬化症的自发性缓解和改善相关。这些临床观察表明，在多发性硬化症中确实可能有新的髓鞘质形成。由于已能使用单抗刺激TMEV诱发脱髓鞘性小鼠的髓鞘再形成作用，使其有希望用于多发性硬化症治疗。
临床上非常重要的一个疑问是，对于形态学上薄的髓鞘结构的再生作用是否有助于功能上的恢复。计算机模拟表明，新的髓鞘质形成，甚至是不正常的、薄的髓鞘，增加了神经冲动的传导。由于正常髓鞘化神经纤维的轴索膜已高度分化，在郎飞氏结处需要存在高密度的钠通道，以保证传播跳跃性的神经传导。通过石房蛤毒结合作用的实验证据表明，新形成的郎飞氏结确实在逐步形成所需的高密度钠通道。一切数据表明，髓鞘的再形成作用、甚至出现不正常薄的髓鞘质增加了以前脱髓鞘化轴索的传导。因此，任何促进形态学上髓鞘再形成现象的方法，均具有产生功能上恢复的潜质。
这里列出的数据首次表明，体内给动物单克隆抗体，具有刺激中枢神经系统轴髓鞘再形成的能力。特别是，给TMEV慢性感染小鼠小至10μg的SCH 94.03单抗，与对照单抗处理小鼠相比，中枢神经系统髓鞘化的面积增加4至5倍。
因此，作为所述实验的结果，本发明的方法可以用于以治疗患有脱髓鞘化的疾病的包括人和家畜在内的哺乳动物，刺激中枢神经系统轴索的髓鞘再形成。其中，可以使用静脉注射或腹腔注射给予有效剂量的单抗。抗体的有效剂量可根据被治疗动物的大小、疾病的程度、单抗给药的途径和疗程而有所不同。例如，每个单抗的给予剂量范围可从约0.5mg/kg至400mf/kg，优选的范围为约0.5mg/kg至250mg/kg。重要的一点是剂量低至10μg(0.5mg/kg)对于促进小鼠中枢神经系统轴索的髓鞘再形成作用亦有效。单抗的剂量同样也取决于给药途径。例如，小鼠静脉注射所给的剂量为0.5mg/kg时，腹腔注射的剂量应为5.0mg/kg。疗程则包括单抗的频率(如每天、每周或双周)和治疗的持续时间(如四周至四个月)。因此，一个大剂量的单抗可能是每天给单抗，持续四到五周，与此相反，一个小剂量的单抗可以给药四个月。
所给单抗剂量的有效性可通过临床标准数字加以评估。例如，如实施例3所述，包括哺乳动物的外观、动物的活动能力、以及动物麻醉的程度。单抗诱导人髓鞘再形成所需的有效剂量同样也可以从双盲对照试验中加以评估。可以用单抗或对照物治疗具有已确定的神经病学缺陷的脱髓鞘性疾病患者。使用定量生物力学的肌肉测定方法去测定等长肌肉力量的改善，并作为初期治疗的终点。
有效剂量的单抗可以结合或被稀释至合适的、药剂学上可以接受的载体中，如生理性缓冲液或生理盐水。此外，单抗可被基因工程改变，例如通过将人抗体的核苷酸序列替换鼠单抗的不变区而使其具有“人化”，从而降低致免疫性。
除了使用体内的方法促进髓鞘再形成作用，本发明还包括使用离体(ex vivo)的方法去刺激中枢神经系统轴索的髓鞘再形成作用。例如，可在体外使用单抗刺激神经胶质细胞的增殖和/或分化，如实施例2所述的少突神经细胞。接着使用已知的技术将这些外源性的神经胶须细胞导入哺乳动物的中枢神经系统。由于增加了存在的内源性神经胶质细胞的数目(神经胶质细胞，如少突神经胶质细胞，在髓鞘质的产生上起着关键的作用)，进而促进了中枢神经系统轴索的髓鞘再形成化。
本发明同样包括体外产生神经胶质细胞的方法或者对混合培养物(如大鼠视神经细胞或大鼠大脑细胞培养物)中神经胶质细胞增殖的刺激作用。例如，在足够促进细胞生长的条件下，将从大鼠视神经或大鼠大脑获得的、含有神经胶质细胞的细胞混合培养。接着在混合细胞培养物中加入足以促进中枢神经轴索髓鞘再形成的有效剂量单抗，例如SCH94.03在细胞足够生长和增殖的条件下加以维持。单抗可以刺激混合培养物中神经胶质细胞的增殖。因此，与无单抗条件下神经胶质细胞的增殖相比，在有单抗存在的培养物中神经胶质细胞的增殖增加了。
在下面的实施例中，将对本发明作进一步的和更具体的阐述，但并非对发明内容加以任何限制。
实施例1：单克隆抗体的产生、筛选和纯化
动物
取两只SJL/J小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)，注射两次用完全福氏佐剂制备的脊髓匀浆(SCH)后，取其脾脏作为细胞融合和生产杂交瘤所用B细胞的来源。使用聚乙二醇使上述脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合，对不同的细胞融合物用次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)培养液加以选择，以及用有限稀释法加以克隆化(凯茨曼，J.A.et al.，美国国家科学院院报，78：162-166(1981))。
酶联免疫吸附分析(ELISA)
取有活性的产生Ig杂交瘤克隆的上清液，使用酶联免疫吸附分析(ELISA)的方法，筛选对SCH的结合。以下的抗原被用于单抗的筛选：SCH(10μg)，重新匀浆于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中(pH 8.5)；MBP(1μg)溶于磷酸缓冲液(PBS)中；GC(1μg)溶于纯乙醇中，PLP(1μg)溶于水中。PLP由Dr.W.MAcklin(UCLA)提供，他发表了一种有关PLP固态免疫分析的方法。对于SCH、MBP或GC的ELISA分析，用制备的抗原(100μl/孔)包被免疫II型平板，在4℃下温孵过夜。第二天每孔用PBS冲洗，并在室温下用PBS+1％血清阻断(板的非特异性吸附)1小时。平板再次用PBS冲洗后，加入用PBS/0.1％BSA稀释的原抗体连续稀释液，并在室温下温孵2小时。平板用PBS/0.05％吐温冲洗，并加入合适的联接碱性磷酸酶的二抗(1∶1000于含0.1％BSA的PBS中)。平板在37℃温孵2小时，用0.05％吐温的PBS冲洗，再加入底物(Sigma公司，碱磷酶底物表中104，在5ml二乙醇胺缓冲液中)反应30分钟。然后加入50μl 1N的NaOH终止反应。平板用Dynatech ELISA平板仪测定。
腹水生产
将治疗实验所选用的杂交瘤注射至用降直烷(pristane)处理过的BALB/C小鼠，以获得腹水产生。同样将杂交瘤至于含有10％胎牛血清RPMI-1640培养液中以产生IgM抗体。IgM单抗可通过硫酸钠沉淀法或Sepharyl S-400 HR柱上(Sigma)用凝胶过滤法加以纯化，以用于开始的转化试验，或者通过山羊抗小鼠IgM(μ-Chain specific；Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)偶联的6x活性胶床，以用于后期的转化试验。
实施例2：体外测定单克隆抗体
促进神经胶质细胞增殖单抗的选择
在体外测定了单抗促进神经胶质细胞增殖的能力。将大鼠大脑或视神经中分离的神经胶质细胞接种于Falon Microtest II型平板，每孔细胞浓度为2×104个，0.1ml DME培养液。全血清(SCH、IFA、MBP、GC、MBPIGC、PBS or PLP)，纯化Ig或单抗，连续稀释，并均为0.1ml体积加入细胞内，每个样品作3个平行孔。三天以后加入3H-胸苷(1μCi/ml)，17小时的使用的自动细胞收集器(Mash IIHarvester)收获细胞。为记录增殖细胞的类型(即星状细胞、祖代神经胶质细胞、巨噬细胞)，加入3H-胸苷后做选择培养，将细胞与合适的特定细胞类型抗体温孵，接着使用ABC免疫过氧化酶技术，在与Hanker-Yates试剂反应后，载玻片浸入Ilford K2核乳剂中，在4℃曝光4天以显影。
94.03和94.32单抗诱导大鼠大脑混合视神经培养物增殖
用乙醚处死1至2日龄龀的大鼠。经过仔细的剥离，将视神经从眼球的视神经叉中取出。将视神经转至2ml DMEM培养液的离心管中。加入同体积的胰蛋白酶并在37℃水浴中温孵45分钟。然后加入2ml的胎牛血清以终止反应。视神经穿过无菌的针头和注射器(21号管径)，接着在1400rpm下离心10分钟。细胞计数调整至细胞浓度为5×105个/100μl，含0.5％FCS的DMEM培养液，并种入24孔平皿中。12至16小时后，按实验步骤，加入适合的抗体或生长介质。
取1至2日龄大鼠的大脑，放入含10mM HEPES缓冲的Hank′s平衡盐溶液中(HBSS/H)，大约每个大脑1-2ml溶液。取掉大脑中的脑干、小脑和中脑，而将前脑用弯注射器打碎。通过将组织在一个10ml的移液管中反复抽吸而将组织进一步打碎，然后转移至50ml锥形瓶中。组织悬液于37℃在旋转振摇器上振摇(75rpm)30分钟。加入终浓度为0.125％的胰蛋白酶，并将悬液继续振摇60分钟。加入胎牛血清(10％)终止胰蛋白酶的消化反应。将细胞悬液依次通过120和54μm的Nytex(尼龙网)，离心，重悬于补充了10％胎牛血清的无血清培养液中，并再次通过54μm的尼龙网。无血清培养液为DMEM中加入3.7g/L碳酸氢钠、6.0g/L葡萄糖、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、5μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、5ng/ml selenite、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。给细胞计数，以5×104个细胞/cm2种于无包被细胞培养瓶中或平板内，并在37℃、5％CO2下培养。72小时后更换培养液，以后每48小时更换一次。从开始培养8天后，将培养液吸走，并用含有各种作为补充物(如抗体)的SFM替换。对于大多数实验，细胞在继续生长48小时后再收集。而加入3H-胸苷(5μCi/ml)的细胞共培养18～24个小时。
蛋白印迹法(Western blot)步骤
将抗原于十二烷基磺酸钠(SDS)上样缓冲液中100℃加热变性和增溶。样品在200伏电压下，于浓缩胶和分离胶分别为4.75％和12.0％的丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳后，凝胶和硝酸纤维膜在转移液(20mMTris，192mM甘氨酸、20％甲醇、pH8.1-8.3)中平衡30分钟。使用Bio-Rad微型转移器，将凝胶于100V/小时或30V过夜电转移。硝酸纤维素膜被切成条带，并用含0.03％ Tween 20的3×TBS(100mMNaCl，50mM Teis，pH7.6)洗涤，封闭(含3％脱脂奶粉和0.03％Tween 20)硝酸纤维素条带2-4小时，洗涤3次，并与一抗或抗血清(用封闭液稀释)温孵4小时或过夜。一抗温孵后，纤维条洗3次，与生物素或碱磷酸标的二抗(用封闭液稀释)温孵2小时，洗3次，如果使用生物素体系则再与碱磷酶标的链卵白素(用封闭液稀释)温孵2小时。纤维条洗4次(最后用不合Tween 20的TBS)，并与底物溶液(含0.165mg/ml BC/P和0.33mg/ml NBT的100mM NaCl，100mMTris，5mM MgCl2，pH9.5)温孵，直至充分显色(约10-15分钟)。加入含5mM EDTA的PBS终止反应。
细胞或混合脑细胞培养液用1％SDS还原上样缓冲液(2.3％SDS，10％2-ME，0.125M Tris，20％ glycerol)裂解，并在85℃加热15分钟。通过将细胞裂解液通过21-27号针头而剪切核酸。裂解的蛋白质在12％的丙烯酰胺还原胶中分离，转移至硝酸纤维膜上，并如前述用不同抗体做印迹杂交。
实施例3：使用单抗促进中枢神经系统髓鞘再形成作用
病毒
Theiler’s鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)DA株由Dr.J.Lehrich和BArnason提供，并在BHK细胞中传过八代。病毒在多重感染性为每细胞中有0.1个空斑形成单位(PFU)条件下继续传代4次。将培养细胞经过冻融和超声处理，使得细胞中病毒释放。细胞裂解液通过离心而澄清，分装后贮存于-70℃。以后所有实验均使用第12代病毒。这一病毒分离物可引起(脑和脊髓)白质的病变而不破坏前角细胞。
体外TMEV中和试验
按以前所报道的方法测定病毒空斑(Patick，A.K.，et al.，J.Neuropath.Exp Neurol.，50：523-537(1991))。对于中和试验，在接种于已铺满的L2细胞前，将一份TMEV病毒(200 PFU/ml)与不同浓度的单抗在室温下温孵1小时。作为阳性对照，我们使用已慢性感染TMEV的易感小鼠血清在上述的分析条件下，经1∶34,000稀释的血清产生50％的中和作用，并在假设血清Ig总浓度为15mg/ml和TMEV特异性抗体组份占5％的条件下，相当于20ng/ml的TMEV特异抗体。
脱髓鞘化过程
在雌性SJL/L小鼠上进行脱髓鞘化作用，年龄4-6周，购自Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME。在小鼠大脑内接种10μl体积的、含有2×105个空斑形成单位的DA株TMEV病毒。将已慢性感染TMEV的小鼠(注射4-6个月)随机分组用于实验。
治疗过程和临床疾病评估
每周给慢性感染的小鼠腹膜内或静脉注射两次单抗，注射4至5周。在每次治疗注射后，按照以下三个指标对小鼠作临床评估：外观、活动性和麻痹程度每个指标的评分范围从0(无病)到3(重病)。对于外观，1代表动物皮毛轻微变化，2代表中度改变(有皮屑的外观)，而3代表重度改变(失禁和染色状皮毛)。对于活动性，1代表降低的自主活动(轻微的共济失调)，2代表中度的行动缓慢(轻微的自主运动)，3代表中度的行动迟缓(无自主运动)。对于麻痹，0.5代表一个肢体的强直，1代表一个肢体的麻痹，1.5代表两个或更多的肢体强直，2代表两个肢体的麻痹，2.5代表无正确反应，3代表三个或四个肢体的麻痹。每只小鼠的总分为每个指标分数的累计值(最高值为9)由于临床指数为序数，而非基数刻度，临床指标的改变可被用于评估临床疾病。然而，临床评估的数据只有在髓鞘再形成形态学评估结束后才能得到验证。
光学和电子显微照片的制备和脱髓鞘作用的评估
制备光学和电子显微切片，并对髓鞘再形成作用进行形态学评估简单的过程为，使用戊巴比妥钠(0.2mg，ip)麻醉小鼠，心脏穿刺放血，并用心内注射Trump’s固定液(100mM磷酸缓冲液，pH7.2，含4％甲醛和1.5％戊二醛)处死动物。从脊髓腔中将完整的脊髓取出，并切成1mm横切面厚片。每三个厚片用1％四氧化锇后固定，并包被于Araldite(Polysciences，Warrington，PA)。每个厚片作1微米的切片并用p-phenylenediamine染色。对于每个切片，使用Zeiss作用数字分析系统(ZIDAS)定量化，并用连接在Zeiss光学显微镜(Carl Zeiss Inc.，Thornwood，NY)上的相机拍摄。将与轴索直径相比非正常薄的髓鞘作为中枢神经系统髓鞘再形成的标准。每只小鼠取10个脊髓切片加以测定，这相当于每只小鼠检测8-9mm2的白质。为防止主观偏向，玻片在不知道各处理组的情况下加以编号和定量。
髓鞘厚度和轴索直径测定以及髓鞘化轴索的定量
经塑料包被的脊髓切片中，正常和髓鞘再形成化的轴索的电子显微照片经Hamamatsu摄相机显示、数字化和使用IBAS 2000显示分析系统(Kontron，Munich，Germany)。测定了有及无髓鞘的轴索横切面，以及用等圆计算法确定轴索的直径和髓鞘的厚度。对于髓鞘化轴索的定量，则在Axiophot显微镜下(Carl Zeiss，Inc)，使用上述的分析方法，对于塑料包被脊髓切片中损伤部位的髓鞘化轴索加以计数。对于SCH94.03单抗、IgM或单纯缓冲液对照处理的动物，分别分析了17个髓鞘再形成区和15个脱髓鞘损伤区。这相当于0.6mm2的髓鞘再形成面积和0.8mm2的脱髓鞘面积。损伤区选择的标准为，脱髓鞘损伤区为存在严重的脱髓鞘作用，且极少修复；而选择的髓鞘再形成损伤区基于在损伤区内存在几乎完全的髓鞘再形成化。
免疫染色
大鼠5.5B8神经细胞在放有多聚D/L赖氨酸包被的载玻片的培养中生长，并用补充1.5g/LD-葡萄糖、30nM SeO2，15nM三碘甲状腺氨酸、10ng/ml生物素、100μM ZnCl2，50μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清的Dulbecco’s改进Eagle’s培养液(DMEM)培养。所有的染色步骤均在室温下进行。对于细胞表面染色，载玻片用PBS简单冲洗，稀薄用含1％甲醛的PBS轻微固定10分钟，以防止细胞在下面的染色步骤中脱落。对于胞浆染色，将载玻片用PBS冲洗两次，在空气中干燥1小时，或置于含0.1％Triton X-100的PBS中10分钟。细胞用2％的BSA封闭30分钟，冲洗，与对照IgM或者单抗SCH 94.03(10μg/ml in 1％BSA)温孵1小时，并用PBS充分冲洗在4％多聚甲醛中固定15分钟，载玻片用荧光素标记的山羊抗小鼠IgM(Jackson Immunoresearch)温孵1小时，用PBS冲洗，并在含10％MOWIOLR(Hoechst)的100mM Tris，25％甘油，pH8.5，和25μg/ml 1，4-diazobicyclo-[2，2，2]-octane(DABCO)中加盖玻片，以防退色，然后在暗处放置过夜。对于冰冻切片，新鲜的新生大鼠、成熟小鼠或尸解人的大脑皮质组织快速冷冻于用液氮冷却的异戊烷中，并随后置于液氮中。将冰冻切片(10μm)转移至明胶化的显微载玻片上，空气中干燥4-8小时，并于-70℃保存。在免疫染色前，玻片在室温下放置过夜。免疫过氧化物酶染色的步骤与前述的方法类似，使用ABC免疫过氧化物酶试剂(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，用溶于50mmTris，pH7.6，含0.034％H2O2的1.5mg/ml的Hanker-Yates试剂(p-phenyl diamine-procatechol)显色，再用Mayer’s苏木素复染，然后用Permout(Fischer Scientific，Pittsburgh，PA)封片。
数据分析
使用改进的累积rank sum检验(O’Brien，P.C.，Biometrics，40：1079-1087(1984))，以比较各处理组间的髓鞘再形成作用。这一统计检验考虑了若干数字化的、相互间无关的治疗效果参数，它被经常用于临床试验效果的评估。使用标准的非配对Student’s t检验，比较了髓鞘再形成化各单独参数的平行分析得出了等同的结果。在比较疾病的严重程度及其与髓鞘再形成相关的显著性时，使用了单侧方差分析(ANOVA)。统计分析是在SigmaStat(Jandel Scientific，San Ralfael，CA)或EXCEL(Microsoft Corporation，Redmond，WA)软件上进行的。当p值＜0.05时，计算被认为有显著性差异。
等同性
只要使用不超过常规的实验方法，本领域的技术人员将认为或能够确定与本发明所述的特定具体内容有许多等价物。这些等价物包括在下面的权利要求中。
核甘酸或氨基酸序列表(1)一般信息：(i)申请人：Mayo医疗教育研究基金(ii)发明题目：促进中枢系统髓鞘再形成的单克隆抗体(iii)序列个数：11个(iv)有关地址：
(A)地址：Hamilton，Brook，Smithy＆Reynolds，P.C.
(B)街道：Two Militia Drive
(C)城市：Lexington
(D)州：Massachusetts
(E)国家：USA
(F)邮编：02173(v)计算机可读形式：
(A)传媒类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)现在申请日期：
 (A)申请号：
 (B)提交日：
 (C)分类：(vii)预先申请日期：
  (A)申请号：U.S.08/236,520
  (B)提交日：April 29，1994(viii)代理人/机构信息
  (A)姓名：Granahan，Paterica
 (B)登记号：27,227
 (C)文献/摘要号：MMV92-01 PCT(ix)电传信息：
 (A)电话：617-861-6240
 (B)电传：617-861-9540(2)序列编号1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：393个碱基对
(B)类型：核酸
(C)DNA链：双链
(D)二维结构：线性(ix)性质：
(A)名称/符号：CDS
(B)位置：1..393(xi)序列描述：序列编号1：ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA       48Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln1               5                  10                  15GGT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC TCC CTG TCT       96Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
         20                  25                  30GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC       144Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
     35                  40                  45ATT AGC AAT TAT TTA AAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GAT GGA ACT GTT       192Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
 50                  55                  60AAA CTC CTG ATC TAC TAC ACA TCA AGA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA       240Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser65                  70                  75                  80AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AGC       288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
             85                  90                  95AAC CTG GAG CAA GAA GAT ATT GCC ACT TAC TTT TGC CAA CAG GGT AAT       336Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
        100                 105                 110ACG CTT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG       384Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
    115                 120                 125GCT GAT GCT                                                       393Ala Asp Ala
130(2)序列编号2的信息：(i)序列特征：
(A)长度：131个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)二维结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列编号2：Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln1               5                  10                  15Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
         20                  25                  30Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
     35                  40                  45Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
 50                  55                  60Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser65                  70                  75                  80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
             85                  90                  95Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
        100                 105                 110Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
    115                 120                 125Ala Asp Ala
130(2)序列编号3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：324个碱基对
(B)类型：核酸
(C)DNA链：双链
(D)二维结构：线性(xi)序列描述：序列编号3：GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA CAGAGTCACC      60ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA     120GATGGAACTG TTAAACTCCT GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA     180AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA     240GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAATACGC TTCCTCCGAC GTTCGGTGGA     300GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGG                                            324(2)序列编号4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：285个碱基对
(B)类型：核酸
(C)DNA链：双链
(D)二维结构：线性(xi)序列描述：序列编号4：GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA CAGAGTCACC        60ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA       120GATGGAACTG TTAAACTCCT GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA       180AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA       240GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAATACGC TTCCT                       285(2)序列编号5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：39个碱基对
(B)类型：核酸
(C)DNA链：双链
(D)二维结构：线性(xi)序列描述：序列编号5：TGGACGTTCG GTGGAGGCAC CAAGCTGGAA ATCAAACGT                             39(2)序列编号6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：429个碱基对
(B)类型：核酸
(C)DNA链：双链
(D)二维结构：线性(ix)性质：
(A)名称/符号：CDS
(B)位置：1..429(xi)序列描述：序列编号6：ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTT TTG GTA GCA GCA GCT ACA GGT        48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly1               5                  10                  15GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTG CAG CAG CCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG        96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys
         20                  25                  30CCT GGG GCT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC       144Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
     35                  40                  45ACC AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT       192Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
 50                  55                  60GAG TGG ATT GGA AAT ATT AAT CCT AGC AAT GGT GGT ACT AAC TAC AAT       240Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn65                  70                  75                  80GAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC       288Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
             85                  90                  95ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC       336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
        100                 105                 110TAT TAT TAT GCA AGA CGG GCC CCT TAC TAC GGT AGT AGG AAC TTT GAC       384Tyr Tyr Tyr Ala Arg Arg Ala Pro Tyr Tyr Gly Ser Arg Asn Phe Asp
    115                 120                 125TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GAG AGT CAG           429Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln
130                 135                 140(2)序列编号7的信息：(i)序列特征：
(A)长度：143个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)二维结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列编号7：Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly1               5                  10                  15Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys
         20                  25                  30Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
     35                  40                  45Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
 50                  55                  60Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn65                  70                  75                  80Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
             85                  90                  95Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
        100                 105                 110Tyr Tyr Tyr Ala Arg Arg Ala Pro Tyr Tyr Gly Ser Arg Asn Phe Asp
    115                 120                 125Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln
130                 135                 140(2)序列编号8的信息：(i)序列特征：
(A)长度：366个碱基对
(B)类型：核酸
(C)DNA链：双链
(D)二维结构：线性(ix)性质：
(A)名称/符号：CDS
(B)位置：1..366(xi)序列描述：序列编号8：CAG GTC CAA CTG CAG CAG CCT GGG ACT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT       48Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1               5                  10                  15TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC       96Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
         20                  25                  30TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATT      144Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
     35                  40                  45GGA AAT ATT AAT CCT AGC AAT GGT GGT ACT AAC TAC AAT GAG AAG TTC      192Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
 50                  55                  60AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC       240Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAT TAT       288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Tyr
             85                  90                  95GCA AGA GAT TAC TAC GGT AGT AGC TGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC TGG       336Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
        100                 105                 110GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA                               366Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)序列编号9的信息：(i)序列特征：
(A)长度：122个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)二维结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列编号9：Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1               5                  10                  15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
         20                  25                  30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
     35                  40                  45Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
 50                  55                  60Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Tyr
             85                  90                  95Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Trp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
        100                 105                 110Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)序列编号10的信息：(i)序列特征：
(A)长度：351个碱基对
(B)类型：核酸
(C)DNA链：双链
(D)二维结构：线性(xi)序列描述：序列编号10：ATGGGATGGA GCTGTATCAT CCTCTTTTTG GTAGCAGCAG CTACAGGTGT CCACTCCCAG      60GTCCAACTGC AGCAGCCTGG GACTGAACTG GTGAAGCCTG GGGCTTCAGT GAAGCTGTCC     120TGCAAGGCTT CTGGCTACAC CTTCACCAGC TACTGGATGC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT     180GGACAAGGCC TTGAGTGGAT TGGAAATATT AATCCTAGCA ATGGTGGTAC TAACTACAAT     240GAGAAGTTCA AGAGCAAGGC CACACTGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATG     300CAGCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ATTATGCAAG A              351(2)序列编号11的信息：(i)序列特征：
(A)长度：45个碱基对
(B)类型：核酸
(C)DNA链：双链
(D)二维结构：线性(xi)序列描述：序列编号11：TACTTTGACT ACTGGGGCCA AGGCACCACT CTCACAGTCT CCTCA                     45
表1
    与脊髓匀浆结合的单克隆抗体对培养的视神经细胞
    [3H]胸苷掺入的促进作用
加入培养介质 μg/ml CPM Mean+SE 与其它类型抗体对照比刺激指数 P 与PBS比刺激指数 P
 mAb 94.32     3    3,642±364     2.68     ＜0.01     2.17     ＜0.01
 mAb 79.27     3    2,326±182     1.71     ＜0.01     1.38     ＜0.05
 其它类型抗体对照     3    1,359±82     1.00     --     0.81     --
 磷酸缓冲液     --    1,680±203     1.23     --     1.00     --
 mAb 94.32     10    4,663±114     2.78     ＜0.002     1.90     ＜0.01
 mAb 79.27     10    2,711±176     1.62     NS     1.11     NS
其它类型抗全对照     10    1,678±213     1.00     --     0.68     --
 PBS     --    2,451±946     1.46     --     1.00     --
 mAb 94.32     30    3,855±639     4.01     ＜0.03     2.44     ＜0.002
 mAb 79.27     30    4,037±371     4.20     ＜0.04     2.56     ＜0.003
 其它类型抗全对照     30    962±191     1.00     --     0.61     --
 pBS     --    1,578±231     1.64     --     1.00     --
表2
    SCH 94.03和SCH 94.32单抗对中枢神经系统髓鞘再形成的促进作用
    处理   n     髓鞘再形成损伤数目   髓鞘再形成面积  (mm2)   P值   脱髄鞘损伤数目   损伤面积(mm2) 髓鞘再形成面积n/损伤面积(％)
    SCH94.03   12     12.8±2.6   0.35±0.09   ＜0.0025   25.8±2.6   1.09±0.19   28.9±3.8
    SCH94.32   12     12.3±2.3   0.42±0.11   ＜0.0001   24.9P±2.8   1.46±0.21   26.7±4.2
    IgM control   13     6.7±1.2   0.11±0.02    --   29.9±2.0   1.70±0.28   7.7±1.8
    Buffer only   11     5.1±1.1   0.06±0.01    --   27.7±2.7   1.11±0.29   6.5±1.2

Claims (31)

1.一种刺激哺乳动物中枢神经系统轴索髓鞘再形成的方法，包括给哺乳动物施用一种有效剂量的单克隆抗体，该抗体由ATCC保藏号为CRL11627的杂交瘤产生。
2.权利要求1的方法，其中施用单抗的方法为静脉注射。
3.权利要求1的方法，其中施用单抗的方法为腹腔注射。
4.权利要求1的方法，其中所施用单抗的剂量为0.5mg/kg左右至400mg/kg左右。
5.一种刺激哺乳动物中枢神经系统轴索内神经胶质细胞增殖的方法，包括给哺乳动物施用有效剂量的单克隆抗体，该抗体由ATCC保藏号为CRL11627的杂交瘤产生。
6.权利要求5的方法，其中施用单抗的方法为静脉注射。
7.权利要求5的方法，其中施用单抗的方法为腹腔注射。
8.权利要求5的方法，其中所施用单抗的剂量为0.5mg/kg左右至400mg/kg左右。
9.一种治疗哺乳动物中枢神经系统脱髓鞘化疾病的方法，包括给哺乳动物施用有效剂量的单克隆抗体，以促进所述动物中枢神经系统轴索的髓鞘再形成作用，该抗体由ATCC保藏号为CRL11627的杂交瘤产生。
10.权利要求9的方法，其中所述的哺乳动物为患有多发性硬化症的病人，或是患有病毒性脱髓鞘化疾病、或中枢神经系统神经疾病后的病人或家畜。
11.权利要求9的方法，其中施用单抗的方法为静脉注射。
12.权利要求9的方法，其中施用单抗的方法为腹腔注射。
13.权利要求9的方法，其中所施用单抗的剂量为0.5mg/kg左右至400mg/kg左右。
14.权利要求9的方法，其中所述的哺乳动物为感染Theiler’s鼠脑脊髓炎病毒DA株的小鼠。
15.包括ATCC保藏号为CRL11627杂交瘤在内的一种杂交瘤，其产生的单抗具有刺激中枢神经系统轴索髓鞘再形成的作用。
16.一种体外产生神经胶质细胞的方法，包括：
a)在足以使细胞增殖的条件下培养神经胶质细胞，从而产生神经胶质细胞培养物；
b)在神经胶质细胞培养物中加入有效量的、ATCC保藏号CRL11627杂交瘤产生的单抗，从而产生一种单抗处理过的神经胶质细胞培养物；
c)在足以使单抗处理过细胞增殖的条件下，保持步骤b)的细胞培养物；并且
d)从培养物中回收细胞，从而获得神经胶质细胞。
17.经权利16方法所获的神经胶质细胞。
18.一种体外刺激神经胶质细胞在混合细胞培养物中增殖的方法，包括：
a)在足以使细胞增殖的条件下，培养含有神经胶质细胞的混合细胞培养物；
b)在混合培养物中加入有效量的、ATCC保藏号CRL11627杂交瘤产生的单抗，从而产生一种单抗处理过的混合细胞培养物；
c)在足以使单抗处理过细胞增殖的条件下，保持步骤b)的细胞培养物，从而导致混合细胞培养物中的神经胶质细胞增殖；而且
d)从混合细胞培养物中回收神经胶质细胞。
19.权利要求18的方法，其中混合细胞培养物取自大鼠视神经。
20.权利要求18的方法，其中混合细胞培养物取自大鼠的大脑。
21.经权利18方法所获的神经胶质细胞。
22.一种刺激哺乳动物中枢神经系统轴索髓鞘再形成的方法，包括：
a)在足以使细胞增殖的条件下培养神经胶质细胞，从而产生神经胶质细胞培养物；
b)在神经胶质细胞培养物中加入有效量的、ATCC保藏号CRL11627杂交瘤产生的单抗，从而产生一种单抗处理过的神经胶质细胞培养物；
c)在足以使单抗处理过细胞增殖的条件下，保持步骤b)的细胞培养物；
d)从培养物中回收单抗处理过的细胞，从而获得神经胶质细胞；并且
e)将步骤d)所获的神经胶质细胞导入哺乳动物的中枢神经系统，从而中枢神经系统轴索的髓鞘再形成。
23.按照权利要求15杂交瘤所产生的一种单抗。
24.用于治疗的权利要求23所述的单抗。
25.权利要求23所述的单抗在用于刺激中枢神经系统轴索的髓鞘再形成的药物生产的应用。
26.权利要求23所述的单抗在用于刺激中枢神经系统轴索中神经胶质细胞的增殖的药物生产的应用。
27.权利要求23所述的单抗在用于治疗刺激中枢神经系统脱髓鞘化疾病，例如多发性硬化症，病毒性脱髓鞘化疾病，或中枢神经系统神经疾病后症状的药物生产的应用。
28.权利要求27的应用，其中药物用于治疗感染Theiler’s鼠脑脊髓炎病毒DA株的小鼠。
29.权利要求25，26，27之任一的应用，施用单抗的方法为静脉注射或者腹腔注射。
30.权利要求25至28之任一的应用，其中所施用单抗的剂量为0.5mg/kg左右至400mg/kg左右。
31.一种制备神经胶质细胞的方法，用于刺激哺乳动物中枢神经系统轴索的髓鞘再形成作用，包括：
a)在足以使细胞增殖的条件下培养神经胶质细胞，从而产生神经胶质细胞培养物；
b)在神经胶质细胞培养物中加入有效量的、ATCC保藏号CRL11627杂交瘤产生的单抗，从而产生一种单抗处理过的神经胶质细胞培养物；
c)在足以使单抗处理过细胞增殖的条件下，保持步骤b)的细胞培养物，从而获得神经胶质细胞。
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