ES2238073T3 - Anticuerpos monoclonales que promueven la remielinizacion del sistema nervioso central. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN ANTICUERPOS IGM MONOCLONALES QUE PROMUEVEN LA REMIELINIZACION DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL CUANDO SE ADMINISTRAN A MAMIFEROS AFECTADOS POR ENFERMEDADES DESMIELINIZANTES. ESTOS ANTICUERPOS PRESENTAN AUTORREACTIVIDAD MULTIORGANICA Y RECONOCEN DETERMINANTES DE SUPERFICIE Y CITOPLASMATICOS DE LAS CELULAS DE LA GLIA.

Description

Anticuerpos monoclonales que promueven la remielinización del sistema nervioso central.

Antecedentes

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC), frecuentemente progresiva, caracterizada patológicamente por desmielinización primaria, habitualmente sin daño axonal inicial. La etiología y patogénesis de la EM son desconocidas. Varios rasgos inmunológicos de la EM, y su moderada asociación a ciertos alelos del complejo mayor de histocompatibilidad, han alentado la especulación de que la EM es una enfermedad mediada por el sistema inmune (Hafler, D.A. y Weiner, H.L., Immunol. Today 10: 104-107 (1989); Compston, D.A.S.; "Genetic susceptibility to multiple sclerosis" en: "McAlpine's Multiple Sclerosis" (Matthews, B. ed.), pág. 301-319, Londres: Churchil Livingstone (1991); Olsson, T., Curr. Opin. Neurol. Neurosurg., 5: 195-202 (1992)).

La hipótesis autoinmune está apoyada por el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (alérgica) (EAE), en el que la inyección de ciertos componentes de mielina en animales genéticamente sensibles conduce a la desmienilización mediada por células T del SNC (Kabat, E.A. et al., J. Exp. Med. 85: 117-129 (1947); Lublin, F.D., Spinger Semin. Immunopathol., 8: 197-208 (1985)). Sin embargo, no se han identificado definitivamente autoantígenos específicos y células T reactivas con mielina patogénicas en el SNC de pacientes con EM, ni la EM está asociada a otras enfermedades autoinmunes. Una hipótesis alternativa, basada en datos epidemiológicos (Martyn, C., "The epidemiology of multiple sclerosis" en: "McAlpine's Multiple Sclerosis" (Matthews, B. ed.), pág. 3-40, Londres: Churchil Livingstone (1991), es que un factor ambiental, quizás un virus no identificado, precipita una respuesta inflamatoria en el SNC, que conduce directa o indirectamente ("espectador") a la destrucción de mielina, potencialmente con un componente autoinmune inducido (Lampert, P.W., Am. J. Path. 91: 176-208 (1978)). Esta hipótesis está apoyada por la evidencia de que varias infecciones virales de origen natural, tanto en seres humanos (Rice, G.P.A., Curr. Opin. Neurol. Neurosurg., 5: 188-194 (1992)) como animales (Dal Canto, M.C. y Rabinowitz, S.G., Ann. Neurol. 11: 109-127 (1982)), pueden causar desmielinización. Un modelo viral experimental utilizado habitualmente se induce mediante el virus de encefalomielitis de murina de Theiler (TMEV) (Dal Canto, M.C. y Lipton, H.L., Am. J. Path., 88: 497-500 (1977)).

La eficacia limitada de las terapias actuales para EM y otras enfermedades desmielinizantes (Goodkin, D.E. et al., Clev. Clin. J. Med., 59: 63-74 (1992)) ha estimulado el interés en nuevas terapias para mejorar estas enfermedades (Martin, R., et al., Ann. Rev. Immunol., 10: 153-187 (1992); Steinman, L., Adv. Immunol. 49: 357-379 (1992); Weiner, H.L., et al., Science 259: 1321-1324 (1993)). El documento WO 92/04442 sugiere el uso de anticuerpos monoclonales contra la proteína antiproliferativa neuronal (NAP) y el fragmento de fibronectina antiproliferativo críptico (CAFF) en el tratamiento de enfermedades desmielinizantes tales como la EM. Sin embargo, debido a la etiopatogénesis aparentemente compleja de estas enfermedades, que implica potencialmente tanto factores ambientales como autoinmunes, sigue existiendo la necesidad de un tratamiento eficaz de estos trastornos desmielinizantes.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal de IgM que tiene una cadena ligera de SEC Nº ID 2 y una cadena pesada de SEC Nº ID 7, o una versión humanizada del mismo, que está genéticamente alterado mediante la sustitución de secuencias nucleotídicas de anticuerpo humano en regiones no variables del anticuerpo, tiñendo dicho anticuerpo monoclonal la superficie de oligodendrocitos y estimulando la remielinización de axones del sistema nervioso central.

Es obtenible un anticuerpo monoclonal preferido de la invención a partir del hibridoma que tiene el número de acceso ATCC CRL 11627.

La presente invención incluye también composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo monoclonal de la invención y el uso del anticuerpo monoclonal en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad desmielinizante. El anticuerpo monoclonal de la invención puede utilizarse para la promoción o estimulación de la remielinización de axones del sistema nervioso central en un mamífero.

Se obtuvo un anticuerpo monoclonal según la invención a partir de un mamífero inmunizado con homogenizado de médula espinal (SCH) de un mamífero normal (concretamente no infectado por ninguna enfermedad desmielinizante). Este (mAb) monoclonal se designa en la presente memoria como SCH94.03, y el hibridoma que produce este anticuerpo monoclonal se ha depositado el 28 de abril de 1994, según los términos del Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection (ATCC) y se le ha dado el número de acceso ATCC CRL 11627. Como se demuestra en la presente memoria, el tratamiento de un mamífero aquejado por una enfermedad desmielinizante utilizando el mAb SCH94.03 daba como resultado un aumento de la remielinización del SNC en comparación con ratones tratados con mAb control.

El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede utilizarse para tratar enfermedades desmielinizantes en mamíferos, tales como esclerosis múltiple en seres humanos, y enfermedades virales del sistema nervioso central de seres humanos y animales domésticos, tales como encefalomielitis postinfecciosa, o inhibir profilácticamente la iniciación o progresión de la desmielinización en estos estados patológicos. El anticuerpo monoclonal puede utilizarse también en procedimientos in vitro de producción y estimulación de la proliferación de células gliales para tratar enfermedades desmielinizantes.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una gráfica que describe las características de dosis-respuesta de la proliferación mediada por anticuerpo de células en cultivo de cerebro de ratón mixto.

La Figura 2 es una gráfica que describe el perfil temporal de la proliferación mediada por anticuerpo de células en cultivo de cerebro de ratón mixto.

La Figura 3A-3D muestra fotografías con microscopio de luz y de electrones de la remielinización del SNC promovida por el mAb SCH94.03. (A) Fotografía con microscopio de luz de una sección de médula espinal de un ratón SJL/J infectado crónicamente tratado con SCH94.03, que muestra remielinización del SNC. (B) Fotografía con microscopio de luz de una sección de médula espinal de un ratón SJL/J infectado crónicamente tratado con una IgM control, que muestra una extensa desmielinización y la ausencia relativa de remielinización. Las células inflamatorias, incluyendo macrófagos con residuos de mielina ingeridos, se indican por flechas. El asterisco indica un axón desnudo representativo. (C) Fotografía con microscopio de luz de una sección de médula espinal con mielina normal. (D) Fotografía con microscopio electrónico de una sección de médula espinal de un animal tratado con SCH94.03, que muestra múltiples axones con vainas de mielina anormalmente finas respecto al diámetro del axón. La estrella en la esquina superior derecha indica un axón con grosor de vaina de mielina normal. Las puntas de flecha apuntan a procesos astrocíticos, que están íntimamente asociados a axones remielinizados. Las barras de escala representan 13 \mum en A-C y 2 \mum en D.

La Figura 4 es una gráfica que describe la correlación entre el cambio en la enfermedad clínica y la remielinización morfológica.

La Figura 5 es una gráfica que describe la relación de dosis-respuesta entre el tratamiento con el mAb SCH94.03 y la remielinización del SNC. Área de remielinización del SNC (\bullet) y porcentaje del área de lesión con remielinización (\circ) en animales tratados con diversas dosis de mAb SCH94.03.

La Figura 6 muestra una transferencia Western de proteínas de TMEV. Los lisados de células de fibroblasto L2 infectadas se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se transfirieron con SCH94.03 (carril 1), SCH94.32 (carril 2), suero de ratones sensibles infectados crónicamente con TMEV (carril 3), e IgG policlonal de conejo anti-TMEV (carril 4). Los pesos moleculares se indican a la izquierda en kilodaltones (kDa). La posición e identificación de las proteínas mayoritarias de cápsida de TMEV se indican a la derecha.

La Figura 7A-7D muestra la inmunotinción de células gliales cultivadas y secciones de tejido del SNC congeladas con el mAb SCH94.03. Las barras de escala representan 15 \mum.

La Figura 8A-8C muestra los resultados de la unión de SCH94.03 (Figura 8A) e IgM control (Figura 8B y 8C) a antígenos proteicos determinada por ELISA.

La Figura 9 muestra los resultados de la unión de F(ab2)' de SCH94.03 a antígenos proteicos determinada por ELISA.

La Figura 10A-10C muestra los resultados de la unión de SCH94.03 (Figura 10A) e IgM control (Figura 10B y 10C) a haptenos químicos determinada por ELISA.

La Figura 11 muestra el alineamiento de las secuencias de región variable de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de SCH94.03 y segmentos génicos de IgM control, CH12 e Ig de línea germinal (SEC Nº ID: 1-11).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso del anticuerpo monoclonal en la fabricación de un medicamento para uso en la promoción o estimulación de la remielinización de axones del sistema nervioso central en un mamífero. Específicamente, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo monoclonal en la fabricación de un medicamento para uso en la estimulación de la remielinización de axones del sistema nervioso central (SNC) utilizando el anticuerpo monoclonal. La reactividad de antígeno del anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de IgM designado en la presente memoria como SCH94.03 (también designado en la presente memoria como SCH94.32) se ha caracterizado como se describe a continuación, utilizando diversos ensayos bioquímicos y moleculares, incluyendo inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, transferencia Western, ensayos de inmunosorción con enzimas ligadas en fase sólida (ELISA) y secuenciación de la región variable de Ig. El hibridoma productor del anticuerpo monoclonal SCH94.03 se ha depositado el 28 de abril de 1994, bajo los términos del Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection (ATCC), y se la ha dado el número de acceso ATCC CRL 11627. Todas las restricciones sobre la disponibilidad del material de depósito se retirarán irrevocablemente tras la concesión de la patente.

La presente invención se refiere también al uso del anticuerpo monoclonal en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de enfermedades desmielinizantes en mamíferos, tales como esclerosis múltiple en seres humanos, y enfermedades virales del sistema nervioso central de seres humanos y animales domésticos, tales como encefalomielitis postinfecciosa, y para tratamiento profiláctico utilizando el mAb para inhibir la iniciación o progresión de enfermedades desmielinizantes.

Selección de mAb de SCH para promover la remielinización del SNC

Se construyó un panel de anticuerpos monoclonales (mAb) derivados de esplenocitos de ratones SJL/J no infectados inyectados con SCH como se describe con detalle en el ejemplo 1. Después de la fusión y clonación iniciales, 2 de los 95 pocillos con hibridomas secretores de Ig viables contenían mAb con unión significativa a SCH, como se demuestra por ELISA. Las células de hibridoma de estos dos pocillos, denominadas las series 79 y 94, se subclonaron mediante dilución limitante y se examinó de nuevo la unión a SCH por ELISA. Para los hibridomas de serie 79, 14 de los 49 clones fueron positivos por ELISA de SCH, mientras que para la serie 94, 17 de 32 fueron positivas para unión a SCH. Basándose en los datos de ELISA, se eligieron dos hibridomas de serie 79 (SCH79.08 y SCH79.27), ambos reaccionaban también con la proteína básica de mielina (MBP) por ELISA, y tres hibridomas de serie 94 (SCH94.03, SCH94.11 y SCH94.32), ninguno de los cuales reaccionaba con la MBP, para producción de ascitis y experimentos de transferencia in vivo.

Los mAb promueven la proliferación de células gliales

Como se describe en el ejemplo 2, se ensayó en los mAb su capacidad de promover la proliferación de células gliales in vitro. Como se muestra en la Tabla 1, las células de nervio óptico de rata crecidas en presencia de mAb 94.02 o 79.27 incorporaron más [^{3}H]-timidina que controles crecidos en medio solo o con un mAb control de isotipo coincidente. Se muestran los datos de uno de los cinco experimentos, que mostraron un resultado similar.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

Se examinaron después las características de dosis-respuesta de la proliferación mediada por anticuerpo. Como se muestra en la Figura 1, se observó una estimulación máxima con 94,03 a 100 ng/ml. Las IgM de mieloma control MOPC 104E y TEPC 183 (datos no mostrados) estimularon también la proliferación de los cultivos de cerebro de ratón mixtos. Sin embargo, se observó el efecto máximo a una concentración 10 veces mayor que la observada con los mAb.

Se examinó también el perfil temporal de la proliferación mediada por anticuerpo como se muestra en la Figura 2. El día 8, después del inicio del cultivo, se añadieron 100 ng/ml de anticuerpo a los cultivos (tiempo 0). Se recogieron las células a intervalos de 24 horas; la [^{3}H]-timidina estaba presente durante las 24 horas finales de cultivo para medir la proliferación total durante el intervalo. Se observó la máxima estimulación con 94.03 a las 72 horas después de la adición del anticuerpo. Se obtuvieron resultados similares con 94.32. Ninguno de los anticuerpos control isotípicos mostraron ninguna proliferación significativa a lo largo de las 120 horas de cultivo. Estos datos demuestran que ambos mAb 94.32 y 94.03 inducen la proliferación de células gliales de cultivo de cerebro de rata mixto. Esta proliferación es máxima a una concentración de anticuerpo de 100 ng/ml y un periodo de cultivo de 72 horas después de la adición de anticuerpo.

Remielinización del SNC promovida por los mAb SCH94.03 y SCH94.32

Como se describe en el ejemplo 3, se trataron ratones SJL/J infectados crónicamente con TMEV con una dosis de mAb total de 0,5 mg i.v. o 5,0 mg i.p. dividida en dosis dos veces a la semana durante 4-5 semanas. Se midió la remielinización del SNC mediante una evaluación morfológica cuantitativa de diez secciones transversales de médula espinal de cada ratón. El criterio para remielinización del SNC fue vainas de mielina anormalmente finas respecto al diámetro axonal. Los datos están compuestos por seis experimentos y se presentan como la media \pm ETM, en la que n indica el número de ratones. Las comparaciones estadísticas para los datos de remielinización se realizaron con los valores acumulados de ambas IgM y controles de sólo tampón utilizando un ensayo de suma de rangos modificado. El número de lesiones desmielinizadas y el área de desmielinización no fueron significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento evaluados mediante ANOVA de una variable. Para las IgM control, se utilizaron los mielomas MOPC 104E y ABPC 22 (ambos de Sigma) y TB5-1, un mAb anti-micobacteriano.

Ratones SJL/J infectados crónicamente con TMEV y tratados con mAb SCH94.03 o SCH94.32 mostraron una remielinización del SNC significativamente mayor que animales tratados con mAb control de isotipo coincidente o sólo tampón (Tabla 2).

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(Tabla pasa a página siguiente)

2

Se observó remielinización con inyecciones i.v. o i.p. Los animales tratados con SCH94.03 o SCH94.32 tenían aproximadamente 2-3 veces más lesiones remielinizadas y un área total de remielinización del SCN 3-4 veces mayor que los animales control. Cuando se realizó una comparación estadística acumulativa utilizando estos dos parámetros de eficacia terapéutica, la remielinización del SNC inducida por los mAb SCH94.03 y SCH94.32 fue altamente significativa (p< 0,005; tabla 2). En una enfermedad progresiva crónica como la infección por TMEV, la extensión de la reparación del SNC es una función directa de la extensión del daño del SNC. Ni el número ni el área de las lesiones del SNC fueron diferentes entre los grupos de tratamiento, indicando una gravedad similar de la enfermedad (Tabla 2). Cuando la remielinización del SNC se expresaba como el porcentaje de área de lesión que muestra remielinización, aproximadamente un tercio del área de la lesión desmielinizada acumulada mostraba remielinización del SCN en ratones tratados con mAb SCH94.03 o SCH94.32 (Tabla 2).

Morfología de la remielinización del SNC

Se identificó fácilmente morfológicamente la remielinización del SNC tanto mediante microscopía de luz como electrónica (Figura 3A-3D). La Figura 3A muestra una lesión remielinizada de un animal tratado con SCH94.03. La mayoría de los axones en la lesión muestran evidencias morfológicas de reparación, con vainas de mielina anormalmente finas con respecto al diámetro axonal (Ludwin, S.K., "Remyelination in the central nervous system of the mouse", en: "THE PATHOLOGY OF THE MYELINATED AXON" (Adachi M., Hirano A., Aronson S.M. Ed.), pág. 49-79, Tokio; Igaku-Shoin Ltd. (1985); Ludwin, S.K., Adv. Neurol. 47: 215-254 (1988)). En comparación, la Figura 3B muestra una lesión desmielinizada, con remielinización mínima, mientras que la Figura 3C es un área de mielina normal, con axones mielinizados gruesos. En las lesiones remielinizadas (Figura 3A), había 15,3 \pm 1,0 (media \pm ETM) axones mielinizados por 100 \mum^{2}, comparado con sólo 1,1 \pm 0,2 axones mielinizados por 100 \mum^{2} en lesiones desmielinizadas (Figura 3B). La Figura 3C muestra una fotografía por microscopio de luz de una sección de médula espinal con mielina normal. Mediante microscopía electrónica, la remielinización del SNC fue especialmente evidente (Figura 3D). Casi cada axón en el campo tiene evidencias de nueva formación de mielina, aunque el grado de remielinización (concretamente grosor de mielina) es variable entre los axones individuales, sugiriendo diferentes etapas del proceso de reparación. La relación de grosor de mielina a diámetro axonal fue de 0,08 \pm 0,01 (media \pm ETM; n= 25 axones) para axones remielinizados, en comparación con 0,21 \pm 0,01 (n= 34 axones) para axones mielinizados normales.

Correlación entre la enfermedad clínica y la remielinización morfológica

Se evaluó la correlación de la remielinización morfológica con señales clínicas de mejora de la enfermedad como se describe en el ejemplo 3. A cada inyección de tratamiento, se evaluaron clínicamente los ratones como se describe en el ejemplo 3. El cambio de la calificación clínica se correlacionó con el porcentaje de área de lesión que muestra remielinización (Figura 4). La remielinización morfológica se representa como el porcentaje de área de lesión que muestra remielinización del SNC. Un cambio en la calificación clínica de 0 representa enfermedad estable durante el periodo de tratamiento (4-5 semanas), mientras que un cambio positivo indica empeoramiento de la enfermedad clínica, y un cambio negativo indica mejora. Los datos representan animales individuales de todos los grupos de tratamiento. Un cambio positivo en la calificación clínica indica empeoramiento de la enfermedad. Utilizando datos de todos los grupos de tratamiento, el cambio en la calificación clínica mostró una correlación negativa moderada pero significativa (R= -0,40, p< 0,04) con el porcentaje de área de lesión que muestra remielinización. Aunque realmente pocos animales mejoraron clínicamente (\Delta calificación clínica < 0), los animales con un aumento de la gravedad de la enfermedad (\Delta calificación clínica > 0) tendían a tener menos remielinización morfológica, mientras que los animales que permanecieron clínicamente estables (\Delta calificación clínica = 0) mostraron la mayoría remielinización. Se obtuvo una correlación negativa similar cuando se utilizaron otras medidas cuantitativas de la remielinización (el número de lesiones remielinizadas y el área de remielinización) como se muestra en la Tabla 2. Estos datos demuestran que la remielinización cuantificada mediante morfología está asociada al retardo de la progresión de la enfermedad clínica.

Título de la dosis de mAb SCH94.03 y remielinización del SNC

Para los experimentos de tratamiento iniciales, se eligió empíricamente una dosis de mAb total de 25 mg/kg para inyecciones i.v. y de 250 mg/kg para inyección i.p. Para evaluar las características de dosis-respuesta y para determinar la cantidad mínima de mAb necesaria para promover la remielinización, se trataron ratones infectados crónicamente con diversas dosis i.p. de SCH94.03. Tanto el número de lesiones remielinizadas (datos no mostrados) como el área total de remielinización (Figura 5) aumentaron significativamente con dosis mayores de SCH94.03. Se cuantificó la remielinización como se describe para la Tabla 2. Los datos son los valores medios de 4-5 animales por dosis de mAb, con la dosis acumulada final indicada en la gráfica. El ETM promedió un 35% de la media. No hubo diferencia estadística evaluada por ANOVA de una variable en el número de lesiones desmielinizadas o el área de desmielinización entre los grupos de tratamiento, indicando una extensión similar de la enfermedad en todos los animales. El número de lesiones desmielinizadas y el área de las lesiones fueron de 33,2 \pm 7,5 y 1,25 \pm 0,43 para el grupo de 1000 \mug, de 31,8 \pm 8 y 1,11 \pm 0,31 para el grupo de 100 \mug, de 23,8 \pm 3,4 y 0,54 \pm 0,14 para el grupo de 10 \mug y de 29,0 \pm 6,5 y 0,74 \pm 0,20 para el grupo de sólo tampón (representado como el punto de dosis 0 en la gráfica).

Los animales tratados con 100 \mug de IgM control (MOPC 104E) tuvieron calificaciones de remielinización similares a animales control tratados con sólo tampón. La correlación positiva entre la dosis de mAb SCH94.03 y la remielinización del SNC fue especialmente notable cuando se tuvo en cuenta la gravedad de la enfermedad del SNC. Cuando la reparación del SNC se expresaba como el porcentaje de área de lesión que muestra remielinización, los ratones tratados con una dosis total de 1000, 100 ó 10 \mug de SCH94.03 tenían 6, 5 y 4 veces más remielinización que los animales control, respectivamente (Figura 5). Los ratones administrados con sólo 10 \mug de SCH94.03 i.p. (0,5 mg/kg) mostraron evidencias de remielinización potenciada del SNC. Estos datos indicaron que el mAb SCH94.03 y la remielinización del SNC tenían una relación de dosis-respuesta positiva, y que eran necesarias cantidades muy pequeñas de mAb para promover la reparación de mielina.

Especificidad antigénica de SCH94.03 y SCH94.32

Aunque los mAb SCH94.03 y SCH94.32 se generaron a partir de esplenocitos de ratones no infectados, y se examinaron frente a SCH de ratones no infectados, se evaluó directamente si algún mAb podía reaccionar con proteínas de cápsida de TMEV o inhibir la infectividad viral in vitro. Mediante transferencia Western (Figura 6), SCH94.03 y SCH94.32 no reaccionaron con ninguna proteína de TMEV reconocida por ningún suero de ratones infectados crónicamente o IgG policlonal de conejos inyectados con TMEV purificado (Rodríguez, M., et al., Ann. Neurol., 13: 426-433 (1983)). La transferencia Western de lisados de células L2 control infectadas ficticiamente mostró bandas sencillas con el suero de animales infectados crónicamente y la IgG policlonal anti-TMEV de conejo a 32 y 43 kDa, respectivamente, pero sin reactividad con SCH94.03 ni SCH94.32.

Además, no se observó inhibición significativa de la infectividad de TMEV in vitro con hasta 5 \mug/ml de SCH94.03 o SCH94.32 en condiciones de ensayo en que se observó un 50% de neutralización con una dilución 1:34.000 de suero de animales infectados crónicamente. Estos resultados indicaban que el efecto terapéutico de SCH94.03 y SCH94.32 no era debido a la inhibición directa del virus.

Para caracterizar inicialmente los antígenos reconocidos por los mAb SCH94.03 y SCH94.32, se tiñeron diversas líneas celulares derivadas de origen glial (C6 de rata, G26-20 de ratón, U373MG y U87MG humanas), neuronal (neuroblastoma humano), fibroblástico (L y 3T3 de ratón), epitelial (carcinoma humano SCC-9) y linfocítico (CTLL2 de ratón). Ambos mAb tiñeron antígenos internos de todas las líneas celulares ensayadas, lo que indicó que ciertos antígenos reconocidos por estos mAb no estaban limitados a tipos celulares únicos in vitro. Basándose en la hipótesis de que el efecto terapéutico de SCH94.03 y SCH94.32 era debido a una interacción específica del SNC, se investigó adicionalmente la inmunotinción de células cultivadas con SCH94.03 y SCH94.32 utilizando la línea celular glial de rata 5.5B8. Esta línea celular glial inmortalizada tiene características fenotípicas tanto de ac como de astrocitos, con expresión de MBP y 3'-fosfodiesterasa de nucleótidos 2',3'-cíclicos (CNP), y una baja pero detectable expresión de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y de lípidos o proteínas reconocidos por los mAb A2B5 y O4 (Bozyczko, D. et al., Ann. NY Acad. Sci., 605: 350-353 (1990)). SCH94.03 y SCH94.32 reconocieron ambos un determinante de superficie y citoplasmático en células 5.5B8. La tinción de superficie fue más prominente en células pequeñas que se encuentran sobre una capa de células planas morfológicamente diferenciadas (Figura 7A). La tinción de superficie se confirmó mediante citometría de flujo en células vivas. Cuando la membrana celular se permeabilizó mediante deshidratación o breve tratamiento con un detergente no iónico para exponer antígenos internos, el patrón de tinción se alteró considerablemente (Figura 7B). La tinción citoplasmática era filamentosa, con una densa red perinuclear que se extendía por los procesos celulares. Este patrón se asemejaba mucho al patrón de tinción de la proteína citoesquelética filamentosa intermedia vimentina. Estos datos indicaron que SCH94.03 y SCH94.32 reconocían antígenos que no estaban limitados a células del sistema nervioso, sino que reconocían tanto determinantes de superficie como citoplasmáticos en células gliales.

La tinción inmunohistoquímica de tejido congelado de ratón, rata y ser humano confirmó que SCH94.03 y
SCH94.32 no eran mAb específicos del SNC, sino que en cambio mostraban reactividad multiórganos. Ambos mAb inmunotiñeron todos los órganos importantes examinados, incluyendo cerebro, médula espinal, nervio óptico, corazón, hígado, riñón, estómago e intestino delgado y músculo esquelético. Sin embargo, no todas las células de un órgano se tiñeron, sugiriendo una especificidad citológica in situ. En el SNC, SCH94.03 y SCH94.32 tiñeron principalmente vasos sanguíneos, células ependimales y células de forma estrellada con los rasgos morfológicos de células gliales, que estaban enriquecidas con materia blanca cerebelar, periventricular y de tallo cerebral neonatal (Figura 7C), y tanto nervio óptico neonatal como adulto. Se encontraron células gliales similares positivas de SHC94.03 y SCH94.32 en tejido de cerebro humano de autopsia, especialmente en la unión de materia gris-blanca (Figura 7D). Se obtuvieron idénticos resultados de inmunotinción con el mAb SCH94.32. La inmunotinción con una IgM control (MOPC 104E) fue negativa para todas las muestras y estructuras de tejido que se inmunotiñeron con SCH94.03 y SCH94.32.

La identificación y caracterización de una familia entera de autoanticuerpos, designados como autoanticuerpos "naturales" o "fisiológicos", ha influido en las consideraciones tradicionales de autoinmunidad y autorreactividad. Los autoanticuerpos naturales que se han estudiado extensamente son típicamente IgM, aunque se han identificado otros isotipos que son reactivos frente a un amplio intervalo de antígenos, incluyendo proteínas citoesqueléticas, proteínas de superficie, ácidos nucleicos, fosfolípidos, antígenos bacterianos tales como lipopolisacáridos y diversos haptenos químicos (revisado por Avrameas y Ternynck, Mol. Immunol., 30: 1133-1142 (1993)). Los autoanticuerpos naturales comparten una extensa reactividad cruzada idiotípica o "conectividad", que incluye la expresión de idiotipos similares, algunos de los cuales están expresados por autoanticuerpos patogénicos, así como reactividad frente a idiotipos comunes expresados en otros anticuerpos. El análisis molecular ha mostrado que los autoanticuerpos naturales están codificados típicamente por genes de inmunoglobulina (Ig) de línea germinal no mutados, con pocas mutaciones somáticas o ninguna, y representan por lo tanto una fracción sustancial del repertorio de Ig, especialmente en animales neonatos que no han tenido una extensa exposición a antígenos exógenos.

La función de los autoanticuerpos naturales continúa siendo enigmática. Se han propuesto diversas hipótesis basadas en sus características bioquímicas y moleculares. Éstas incluyen: (1) eliminación del tejido senescente o dañado, (2) suministro de una primera línea de defensa inmunológica en el periodo de desfase entre la exposición a patógeno y la respuesta inmune específica de Ag, (3) enmascaramiento de autoantígenos de una respuesta autoinmune potencialmente patogénica, (4) inmunomodulación, incluyendo conformación del repertorio inmune neonatal mediante una red idiotípica, y (5) participación en la selección positiva de células B en la médula ósea, similar al proceso propuesto para las células T en el timo.

Se ensayó la hipótesis de que los anticuerpos SCH94.03 y SCH94.32 fueran autoanticuerpos naturales. Para caracterizar las reactividades antigénicas de SCH94.03 y SCH94.32 se utilizaron varios ensayos bioquímicos y moleculares, incluyendo inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, transferencia Western, ensayos de inmunosorción con enzimas ligadas en fase sólida (ELISA) y secuenciación de región variable de Ig. Como se describe a continuación, para todos los ensayos bioquímicos SCH94.03 y SCH94.32 fueron indistinguibles. Además, SCH94.03 y SCH94.32 tenían idénticas secuencias de región variable de Ig, lo que confirmó que eran el mismo mAb.

Un mecanismo potencial mediante el que el SCH94.03 podría estimular la remielinización en el sistema nervioso central sería estimular la proliferación y/o diferenciación de células implicadas en la mielogénesis, principalmente oligodendrocitos o sus precursores inmaduros. Por tanto, se ensayó si SCH94.03 teñía la superficie de diversas células. Utilizando células inmortalizadas, se determinó que SCH94.03 tenía dos líneas celulares gliales, 5.5B8 (Figura 7A) y 20.2E11, pero no teñía la superficie de varias otras líneas celulares gliales (10.IA3, 20.2A40, C6, G26-20), una línea celular de neuroblastoma (B104), dos líneas de fibroblasto (L2, Cos-1) o dos mioblastomas (G8, L6). Se obtuvieron resultados similares con células aisladas de tejidos animales y crecidas en cultivo. SCH94.03 teñía la superficie de oligodendrocitos, pero no de astrocitos, microglía, células de Schwann, mioblastos ni fibroblastos.

Se evaluó también la reactividad de SCH94.03 con proteínas de líneas celulares gliales y linfoides y lisados de tejido de cerebro, hígado e intestino mediante transferencia Western. SCH94.03 reaccionaba con múltiples bandas de todas las células y tejidos examinados, con reactividad prominente frente a bandas a 50, 95, 120 y >200 kDa. La identidad exacta de estas bandas de proteína no se ha determinado.

Se determinó la reactividad de SCH94.03 con varios autoantígenos de proteína purificados mediante ELISA en fase sólida (Figura 8A-8C). SCH94.03 mostró una fuerte reactividad frente al antígeno de RBC espectrina, pero mostró también una reactividad consistente frente a hemoglobina, actina, tubulina y vimentina, y tiroglobulina, aunque en un grado cualitativo menor que frente a espectrina. No se observó reactividad con miosina, transferrina, albúmina, lisozima ni proteína básica de mielina en las condiciones de ensayo de los inventores. Se ensayaron también otros seis controles de IgM monoclonal o de mieloma XXMEN-OE5 (Figura 8NB), A2B5, MOPC104E, TEPC183, 01 y CH12 (Figura 8C), y no se observó reactividad con ninguno de los antígenos ensayados.

Para confirmar la monoclonalidad de SCH94.03, se ensayó en 18 subclones de SCH94.03 (9 de cada SCH94.03 y SCH04.32 originales) la polirreactividad mediante ELISA en fase sólida. Los 18 subclones mostraron idénticos patrones de reactividad con el panel de antígenos de proteína que el SCH94.03 original. Para apoyar adicionalmente la conclusión de que la polirreactividad de SCH94.03 era mediante su región Fab, los inventores generaron fragmentos F(ab)_{2}' y evaluaron su reactividad con los antígenos de proteína mediante ELISA (Figura 9). Los fragmentos F(ab)_{2}' de SCH94.03 mostraron una polirreactividad similar a la molécula de IgM completa.

Se construyó un panel de haptenos químicos acoplados a albúmina de suero bovino (BSA) y se utilizó para evaluar la reactividad de SCH94.03 mediante ELISA en fase sólida (Figura 10A-10C). SCH94.03 mostró una fuerte reactividad frente a fluoresceína (FL) y ácido 4-hidroxi-3-nitrofenilacético (NP), una moderada reactividad frente a feniloxazolona (PhOx), y una débil reactividad frente a 2,4,6-trinitrofenilo (TNP) y ácido p-azofenilarsónico (Ars). No se detectó reactividad con p-azofeniltrimetilamonio (TMA), p-azofenilfosforilcolina (PC) ni la proteína vehículo BSA. Las IgM control (Figura 10B y 10C) no mostraron unión significativa con ninguno de los haptenos ensayados, con las excepciones de la reactividad de CH12 con TMA, que se ha reseñado anteriormente, y la reactividad de A2B5 con NP.

Se investigó adicionalmente si las cadenas ligera (L) (SEC Nº ID 1 y 2) y pesada (H) (SEC Nº ID 6 y 7) de Ig de SCH94.03 estaban codificadas por genes de Ig de línea germinal (Figura 11). Las secuencias nucleotídicas de región variable (V_{L}) y región de unión (J_{L}) de cadena ligera de SCH94.03 (SEC Nº ID 1 y 2) tenían un 99,4% de identidad con las secuencias publicadas anteriormente de genes de línea germinal V\kappa10 (SEC Nº ID 4) y J\kappa1 (SEC Nº ID 5), con sólo dos cambios silenciosos en el extremo 3' de ambas regiones V_{L} y J_{L}. La secuencia nucleotídica de la región V_{H} de SCH94.03 (SEC Nº ID 6 y 7) era idéntica a la secuencia V_{H}23 (SEC Nº ID 10) de línea germinal publicada anteriormente, la secuencia de la región J_{H} difería de la secuencia J_{H}2(SEC Nº ID 11) de línea germinal publicada por un nucleótido en el extremo 5' de la región J, y la región de diversidad (D) contenía 15 nucleótidos contiguos derivados del gen DFL16.1 de línea germinal. Había 8 nucleótidos en la unión V-D, y uno en la unión D-J, que no correspondían a ningún gen de la región V o D de línea germinal conocido, y probablemente representan nucleótidos no codificados (N) insertados mediante la enzima desoxinucleótido transferasa terminal durante la recombinación de V-D-J. Los únicos cambios de los genes de línea germinal en la cadena pesada de SCH94.03 ocurrieron en la unión V-D o D-J, y por lo tanto podrían representar nucleótidos N o el resultado de una unión imprecisa, en lugar de mutaciones somáticas. Además, ambas regiones variables de la cadena ligera y pesada de SCH94.03 mostraron una similitud de secuencia extensa con la IgM producida por el linfoma CH12 de células B (SEC Nº ID 3, 8 y 9) (Figura 11).

SCH94.03 es un autoanticuerpo natural

Estos resultados de reactividad antigénica preliminares sugieren que SCH94.03 es un autoanticuerpo natural. Aunque esta conclusión no presenta fácilmente un mecanismo de cómo SCH94.03 estimula la remielinización en el sistema nervioso central, sugiere una función fisiológica importante de los autoanticuerpos naturales. Los autoanticuerpos que se producen durante la fisiología normal, o en respuesta a daño de tejido y la posterior liberación de los antígenos previamente secuestrados, podrían participar activamente para promover la reparación del tejido dañado. En consonancia con las funciones anteriormente propuestas de los autoanticuerpos naturales, esta participación activa podría ser facilitar la eliminación del tejido dañado, enmascarar los autoantígenos evitando así una respuesta autoinmune patogénica vigorosa, modular la respuesta inmune que dio como resultado realmente la destrucción de tejido, permitiendo así que ocurra una reparación de tejido endógena normal, o estimular directamente las células implicadas en el proceso de reparación.

Por tanto, como resultado del trabajo descrito en la presente memoria, se ha demostrado ahora que se generó un autoanticuerpo y, examinada su capacidad de unión a autoantígeno, promueve también la remielinización del SNC. Los ratones infectados crónicamente con TMEV y tratados i.v. o i.p. con mAb de IgM de hibridomas SCH94.03 o SCH94.32 tenían significativamente más reparación del SNC que animales control, medida mediante una evaluación morfológica cuantitativa detallada de la remielinización del SNC. Además, los datos preliminares sugieren que el autoanticuerpo SCH94.03 es también eficaz para promover la remielinización en mamíferos aquejados por encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Por tanto, es razonable predecir que los autoanticuerpos, tales como SCH94.03, desempeñan un papel crítico en la detención del proceso mediado por el sistema inmune de desmielinización en enfermedades del SNC.

Pueden proponerse dos mecanismos potenciales mediante los que los Ab promueven la remielinización. En primer lugar, los Ab podrían inhibir algún componente patogénico del proceso patológico, tal como una actividad viral, una respuesta inmune que induce directamente la desmielinización, o una respuesta inmune que previene la remielinización. Si el efecto de la enfermedad está basado en un equilibrio entre la destrucción y la reparación de tejido, la inhibición de componentes patogénicos permitiría predominar una respuesta de reparación fisiológica. Las evidencias experimentales y clínicas apoyan esta hipótesis. Se observa la remielinización espontánea del SNC en pacientes con EM y en varios modelos experimentales de desmielinización del SNC así como se describe en la presente memoria, demostrando remielinización espontánea en ratones control. Esto indica que la remielinización es una respuesta fisiológica normal ante el daño de mielina. Además, el tratamiento de ratones infectados crónicamente con TMEV con diversos regímenes inmunosupresores promueve la remielinización, pero no reduce la desmielinización, indicando que hay un componente inmunológico que inhibe la remielinización (Rodríguez, M. y Lindsley, M.D., Neurology, 42: 348-357 (1992)). Los estudios preliminares de la función inmunológica han indicado que los animales tratados con SCH94.03 tenían números similares de células B y T (tanto CD4+ como CD8+) en sus bazos en comparación con animales control, tenían respuestas proliferativas de esplenocito in vitro similares frente a mitógenos y antígenos, y desencadenaban respuestas de Ab comparables frente a antígenos tanto dependientes de células T como independientes de células T.

La segunda hipótesis es que ciertos Ab pueden estimular activamente la remielinización del SNC, quizás mediante la estimulación de la proliferación de oligodendrocitos y/o la diferenciación in vivo, como se ha demostrado in vitro (Díaz, M. et al., Brain Res., 154: 231-239 (1978); Raine, C.S., et al., Lab. Invest., 38: 397-403 (1979); Lehrer, G.M., et al., Brain Res., 172: 557-560 (1979); Bansal, R. et al., J. Neurosci. Res., 21: 260-267 (1988); Benjamins, J.A. y Dyer, C.A., Ann. NY Acad. Sci., 605: 90-100 (1990); Dyer, C.A., Mol. Neurobiol. 7: 1-22 (1993)). El mAb SCH94.03 puede estimular directamente las células gliales precursoras que son conocidas por estar presentes en los bordes de lesiones del SNC tanto humanas como experimentales que muestran remielinización activa. Como alternativa, SCH94.03 puede trabajar indirectamente, mediante la activación de astrocitos u otras células accesorias, que podrían liberar factores importantes para la supervivencia o la proliferación de células en el linaje oligodendroglial. La formación de complejos Ab-antígeno in situ con componentes de tejido liberados tras la destrucción de mielina puede participar también en la desmielinización del SNC mediada por Ab. Aunque SCH94.03 no es específico del SNC, el reconocimiento tanto de antígenos de superficie como citoplasmáticos en células gliales por el mAb apoya la hipótesis del mecanismo activo. En contraste con la hipótesis inmunomodulatoria, que no requeriría necesariamente que los Ab tuvieran acceso directo al SNC, la hipótesis de que los Ab estimulan activamente la remielinización del SNC implica el prerrequisito de acceso directo al SNC. Esto es contrario a la visión de la permeabilidad selectiva de la barrera hematoencefálica, especialmente frente a moléculas grandes como la IgM pentamérica. Sin embargo, durante afecciones inflamatorias crónicas tales como infección por TMEV o EM, los leucocitos periféricos migran al SNC, indicando una alteración de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, proteínas grandes tales como Ig de suero podrían entrar también, mediante difusión pasiva a través del endotelio "abierto", o quizás mediante un mecanismo de transporte activo no identificado.

Tratamiento de enfermedades desmielinizantes

Los resultados de los experimentos descritos en la presente memoria tienen aplicaciones prácticas a esclerosis múltiple (EM), EAE y otros trastornos desmielinizantes del sistema nervioso central relacionados. Se encuentran raros ejemplos de remielinización del SNC de tipo espontáneo ("placas sombreadas") en EM, y se encuentra remielinización de tipo ocasional en el sistema nervioso periférico (SNP) en placas de médula espinal desmielinizadas cerca de la zona de entrada de raíz. Los oligodendrocitos son infrecuentes en el centro de las placas crónicas en EM, pero parecen proliferar en la periferia de las placas, donde se asocian a remielinización abortiva. El proceso de remielinización puede correlacionarse con la remisión espontánea y las mejoras observadas clínicamente en EM. Estas observaciones clínicas indican que es posible la formación de mielina nueva en EM. La remielinización que se ha estimulado en ratones con desmielinización inducida por TEMV utilizando un mAb puede ser prometedora para aplicación terapéutica en esclerosis múltiple.

Es de importancia clínica la pregunta de si la regeneración morfológica de vainas de mielina finas contribuye a la recuperación funcional. Las simulaciones informáticas indican que la formación de mielina nueva incluso mediante vainas inapropiadamente finas mejora la conducción de impulsos. Puesto que la membrana del axón de fibras mielinizadas normalmente está altamente diferenciada, es necesario que estén presentes canales de sodio con alta densidad en el nodo de Ranvier para propagar la conducción saltatoria. Las evidencias experimentales sugieren que los nodos recién formados desarrollan la alta densidad de canal de sodio necesaria como se demuestra por la unión de saxitoxina. Los datos hasta la fecha sugieren que la remielinización incluso mediante mielina inapropiadamente fina mejora la conducción en un axón previamente desmielinizado. Por lo tanto, cualquier estrategia para promover este fenómeno morfológico tiene el potencial de producir una recuperación funcional.

Los datos presentados en la presente memoria demuestran, por primera vez, que la administración de un anticuerpo monoclonal a un mamífero es capaz de estimular la remielinización de axones del sistema nervioso central in vivo. Específicamente, el tratamiento de ratones infectados con TMEV infectados crónicamente con del orden de 10 \mug de SCH94.03 dio como resultado un aumento de 4 a 5 veces del área total de mielinización del SNC en comparación con ratones tratados con un mAb control.

Por tanto, como resultado de los experimentos descritos en la presente memoria, el procedimiento de la presente invención puede utilizarse para tratar mamíferos, incluyendo seres humanos y animales domésticos, aquejados por trastornos desmielinizantes, y para estimular la remielinización de axones del SNC. Como se describe en la presente memoria, puede administrarse una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal mediante inyección intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). La cantidad eficaz de anticuerpo puede variar dependiendo del tamaño del mamífero que se esté tratando, de la gravedad de la enfermedad, de la vía de administración, y del curso de tratamiento. Por ejemplo, cada dosis de mAb administrada puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 400 mg/kg, con el intervalo preferido de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg. Es importante observar que una dosis del orden de 10 \mug (0,5 mg/kg) era eficaz para promover la remielinización de axones del SNC en ratones. La dosis de mAb dependerá también de la vía de administración. Por ejemplo, la dosis i.v. administrada a ratones era de 0,5 mg/kg, y la dosis i.p. era de 5,0 mg/kg. El curso de tratamiento incluye la frecuencia de administración del mAb (por ejemplo diariamente, semanalmente, o bisemanalmente) y la duración del tratamiento (por ejemplo de cuatro semanas a cuatro meses). Por tanto, por ejemplo, puede administrarse una cantidad mayor de mAb diariamente durante cuatro a cinco semanas, en contraposición con una cantidad menor de mAb administrada durante cuatro meses.

La eficacia de la cantidad de anticuerpo monoclonal que se está administrando puede evaluarse utilizando cualquier serie de criterios clínicos, por ejemplo como se describe en el ejemplo 3, incluyendo la apariencia global del mamífero, la actividad del mamífero y la extensión de la parálisis del mamífero. La eficacia de la cantidad de anticuerpo monoclonal necesaria para inducir la remielinización en seres humanos puede evaluarse también en un ensayo controlado de doble ciego. Pueden tratarse pacientes con déficit neurológicos fijos por enfermedad desmielinizante con anticuerpo monoclonal o controles. La mejora de la fuerza muscular isométrica detectada mediante ensayos musculares biomecánicos cuantitativos podría utilizarse como punto final terapéutico primario.

Una cantidad eficaz de anticuerpo monoclonal puede combinarse, o diluirse, con un vehículo apropiado farmacéuticamente aceptable, tal como un tampón fisiológico, o solución salina. Adicionalmente, el anticuerpo monoclonal puede alterarse genéticamente, por ejemplo "humanizarse" mediante la sustitución de secuencias nucleotídicas de anticuerpo humano en regiones no variables de mAb de murina para reducir la inmunogenicidad.

Además de los procedimientos in vivo de promoción de la remielinización, los procedimientos ex vivo de estimular la remielinización en axones del SNC están también abarcados por la presente invención. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal puede utilizarse in vitro para estimular la proliferación y/o diferenciación de células gliales, tales como oligodendrocitos, como se describe en el ejemplo 2. Estas células gliales exógenas pueden introducirse después en el SNC de mamíferos utilizando técnicas conocidas. La remielinización de axones del SNC aumentaría al aumentar el número de células gliales endógenas presentes (las células gliales tales como oligodendrocitos desempeñan un papel crítico en la producción de mielina).

Los procedimientos in vitro de producción de células gliales o de estimulación de la proliferación de células gliales de cultivo mixto (por ejemplo célula de nervio óptico de rata o cultivos de célula cerebral de rata) están también abarcados por esta invención. Por ejemplo, se cultivan células obtenidas de nervio óptico de rata o cerebro de rata que contienen células gliales en forma de un cultivo mixto en condiciones suficientes para promover el crecimiento de las células. Se añade después una cantidad eficaz de mAb capaz de promover la remielinización de axones del SNC, tal como SCH94.03, al cultivo mixto de células y se mantiene en condiciones suficientes para el crecimiento y la proliferación de células. El mAb estimula la proliferación de células gliales en el cultivo mixto. Por tanto, la proliferación de células gliales cultivadas en presencia de mAb aumenta, respecto a la proliferación de células gliales crecidas en ausencia de mAb.

La invención se ilustrará adicionalmente y más específicamente mediante los siguientes ejemplos, que no se pretende que sean limitantes en modo alguno.

Ejemplo 1 Producción, examen y purificación de anticuerpo monoclonal Animales

Se utilizaron bazos de dos ratones SJL/J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) que se habían inyectado dos veces con homogeneizado de médula espinal (SCH) en coadyuvante incompleto de Freund como fuente de células B para fusión y producción de hibridoma. Se fusionaron los esplenocitos con células de mieloma NS-1 utilizando polietienglicol, y las fusiones celulares viables se seleccionaron con medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) y se clonaron mediante dilución limitada como se describe en (Katzmann, J.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 162-166 (1981)).

ELISA

Se examinó en sobrenadantes de hibridoma de clones productores de Ig viables la unión a SCH mediante un ensayo de inmunosorción de enzimas ligadas (ELISA). Se utilizaron los siguientes antígenos para examinar los mAb: SCH - (10 \mug) reconstituido en tampón carbonato-bicarbonato (pH 8,53), MBP (1 \mug) disuelto en PBS, GC (1 \mug) disuelto en alcohol absoluto, PLP (1 \mug) disuelto en agua. El PLP se proporcionó por el Dr. W. Macklin (UCLA), que ha publicado un inmunoensayo en fase sólida para PLP. Para ELISA de SCH, MBP o GC, se recubrieron placas Immuno II con antígeno preparado (100 \mul/pocillo), que se incubó durante una noche a 4ºC. Al día siguiente se lavaron los pocillos con PBS y se bloquearon con PBS + 1% de suero durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavaron de nuevo las placas con PBS y se añadieron diluciones en serie de Ab primario diluido con PBS/0,1% de BSA, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Se lavaron las placas en PBS/0,05% de Tween y se añadió Ab secundario apropiado conjugado con fosfatasa alcalina (1:1000 en PBS con 0,1% de BSA). Se incubaron las placas a 37ºC durante 2 horas, se lavaron con PBS y 0,05% de Tween y se añadió el sustrato (comprimido de sustrato de fosfatasa Sigma 104 en 5 ml de tampón de dietanolamina) durante 30 min. Se terminó la reacción con 50 \mul de NaOH 1 N. Se leyeron las placas en un lector de placas ELISA Dynatech.

Producción de ascitis

Se inyectaron los hibridomas elegidos para experimentos de tratamiento en ratones BALB/c tratados con pristano para la producción de ascitis. Se dejaron crecer también hibridomas en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal para la producción de IgM. Se purificaron los mAb de IgM mediante precipitación con sulfato de amonio y filtración en gel en una columna Sephacryl S-400 HR (Sigma) para los experimentos de transferencia iniciales, o mediante cromatografía de afinidad utilizando IgM de cabra anti-ratón (específica de cadena \mu; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) acoplada a matriz Reacti-Gel 6X (Pierce, Rockford, IL) para experimentos de transferencia posteriores.

Ejemplo 2 Ensayo in vitro de anticuerpos monoclonales Selección de mAb que promueven la proliferación de células gliales

Se ensayó la capacidad de los mAb de promover la proliferación de células gliales in vitro. Se sembraron células gliales aisladas de cerebro de rata o nervios ópticos en placas Falcon Microtest II a una concentración de 2 x 10^{4} células por pocillo en 0,1 ml de DME. Se diluyeron en serie Ig o mAb purificados con suero completo (SCH, IFA, MBP, GC, MBP/GC, PBS o PLP), se añadió una alícuota de 0,1 ml a células y se ensayó por triplicado. Tres días después, se añadió ^{3}H-timidina (1 \muCi/ml) y se recogieron las células después de 17 horas con un recolector celular automatizado (Mash II Harvester). Para documentar a identidad de las células proliferantes (concretamente astrocitos, células gliales progenitoras, macrófagos), se incubaron cultivos seleccionados después de exposición a ^{3}H-timidina con un Ab apropiado específico de tipo celular seguido de la técnica de inmunoperoxidasa ABC. Después de la reacción del reactivo de Hanker-Yates, se sumergieron los portaobjetos en emulsiones nucleares K2 de Ilford, se expusieron durante 4 días a 4ºC y se revelaron.

Los mAb 94.03 y 94.32 inducen la proliferación de cultivos cerebrales de nervio óptico de rata mixtos

Se sacrificaron ratas de uno a dos días de edad con éter. Mediante una cuidadosa disección, se retiraron los nervios ópticos del quiasma de nervio óptico al ojo. Se transfirieron los nervios a tubos de centrífuga que contenían 2 ml de DMEM. Se añadió un volumen igual de tripsina al 0,25% y se incubó a 37ºC en un baño de agua durante 45 min. Se añadieron 0,2 ml de FCS para terminar la tripsinación. Se pasaron los nervios a través de una aguja y jeringuilla estériles (calibre nº 21) y después se centrifugaron a 1400 rpm durante 10 min. Se ajustó el recuento celular para proporcionar una concentración de 5 x 10^{5} células/100 \mul de medio en bandejas de 24 pocillos en DMEM + 0,5% de FCS. Después de 12 a 16 horas, se añadieron anticuerpos o medios de crecimiento apropiados según los protocolos experimentales.

Se extirparon cerebros de ratas de 1-2 días de edad y se dispusieron en solución salina equilibrada de Hank con tampón HEPES 10 mM (HBSS/H), aproximadamente 1-2 ml por cerebro. El tallo cerebral, el cerebelo y el cerebro medio se desecharon, mientras que el proencéfalo se trituró con una jeringuilla doblada. Se desestabilizó adicionalmente el tejido mediante pasadas repetidas a través de una pipeta de 10 ml y se transfirió a un tubo cónico de 50 ml. Se agitó la suspensión de tejido en un agitador rotatorio (75 rpm) durante 30 min a 37ºC. Se añadió tripsina a una concentración final de 0,125% y se agitó la suspensión durante 60 min adicionales. Se detuvo la digestión de tripsina añadiendo FCS (al 10%). Se pasó la suspensión celular secuencialmente a través de Nytex de 120 y 54 \mum, se centrifugó, se resuspendió en medio exento de suero con 10% de FCS y se filtró de nuevo a través de Nytex de 54 \mum. El medio exento de suero era DMEM con bicarbonato de sodio 3,7 g/l, glucosa 6,0 g/l, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 nM, insulina 5 \mug/ml, transferrina 5 \mug/ml, selenita 5 ng/ml, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 \mug/ml. Se recontaron las células, se sembraron en matraces o placas de cultivo de tejido no recubiertas a 5 x 10^{4} células/cm^{2} y se cultivaron a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se cambió el medio después de 72 horas, y cada 48 horas después de ello. El día 8 después del inicio del cultivo, se aspiró el medio y se reemplazó por SFM con diversos suplementos (por ejemplo anticuerpo). Para la mayoría de los experimentos, se dejaron crecer las células durante 48 horas adicionales antes de recoger. Se sometieron las células a pulsos con [^{3}H]-timidina (5 \muCi/ml) durante las 1824 horas finales de cultivo.

Procedimiento de transferencia Western

Se desnaturalizaron antígenos y se solubilizaron mediante calentamiento a 100ºC en tampón de muestra de dodecilsulfato de sodio (SDS). Se sometieron a electroforesis las muestras en geles apilados y separadores que contienen 4,75% y 12,0% de acrilamida a 200 voltios. Después de la electroforesis, se equilibraron los geles y las membranas de nitrocelulosa durante 30 min en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 20% de metanol, pH 8,1-8,3). Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente. Se sometieron a electrotransferencia los geles durante 1 h a 100 V o durante una noche a 30 V utilizando el aparato Mini Trans-blot de Bio-Rad. Se cortó la membrana de nitrocelulosa en tiras y se lavó 3 x TBS (NaCl 100 mM, TriG 50 mM, pH 7,6) con Tween 20 al 0,03%. Se bloquearon las tiras de nitrocelulosa (TBS con 3% de leche desnatada y 0,03% de Tween 20) durante 2-4 horas, se lavaron 3x y se incubaron con Ab primario o antisueros (diluidos en tampón de bloqueo) durante 4 horas o durante una noche. Después de la incubación de Ab primario, se lavaron las tiras 3x, se incubaron con Ab secundario marcado con biotina o fosfatasa alcalina (diluido en tampón de bloqueo) durante 2 horas, se lavaron 3x y se incubaron con estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina (diluida en tampón de bloqueo) durante 2 horas si se utiliza el sistema de biotina. Se lavaron las tiras de nitrocelulosa 4x (lavado final en TBS sin Tween 20) y se incubaron con solución de sustrato (BCIP 0,165 mg/ml y NBT 0,33 mg/ml en NaCl 100 mM, TriG 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, pH 9,5) hasta que se desarrolló suficiente color (aproximadamente 10-15 minutos). Se detuvo la reacción añadiendo PBS con EDTA 5 mM.

Se lisaron líneas celulares o cultivos de cerebro mixtos en tampón reductor de muestra 1x SDS (2,3% de SDS, 10% de 2-ME, Tris 0,125 M, 20% de glicerol) y se calentaron a 85ºC durante 15 min. Se cizallaron los ácidos nucleicos mediante pasada repetida del lisado a través de agujas de calibre 21-27. Se separaron las proteínas del lisado en un gel reductor de acrilamida al 12%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se transfirieron con diversos anticuerpos como se describe anteriormente.

Ejemplo 3 Promoción de la remielinización del SNC utilizando un anticuerpo monoclonal Virus

Se obtuvo la cepa DA de TMEV de los Dr. J. Lehrich y B. Arnason después de 8 pasadas en células BHK. Se pasó el virus cuatro veces adicionales a una multiplicidad de infección de 0,1 unidades formadoras de placa (UFP) por célula. Se liberó el virus asociado a célula mediante congelación-descongelación de los cultivos seguido de sonicación. Se clarificó el lisado mediante centrifugación y se almacenó en alícuotas a -70ºC. Todos los experimentos posteriores utilizarán virus de 12 pasadas. Este aislamiento viral causa patología de la materia blanca sin destrucción de las células corneales anteriores.

Ensayo de neutralización de TMEV in vitro

Se realizaron ensayos de placa viral como se describe anteriormente (Patick, A.K., et al., J. Neuropath. Exp. Neurol. 50: 523-537 (1991)). Para evaluar la neutralización, se incubaron alícuotas de TMEV (200 UFP/ml) con diversas concentraciones de Ab durante 1 hora a temperatura ambiente antes de sembrar en células L2 confluyentes. Como control positivo, los inventores utilizaron suero de ratones sensibles infectados crónicamente con TMEV. En las condiciones de ensayo descritas anteriormente, una dilución de suero de 1:34.000 proporcionó un 50% de neutralización, que correspondía a una estimación de 20 ng/ml de Ab específicos de TMEV, suponiendo una concentración total de Ig de suero de 15 mg/ml, y una fracción específica de TMEV de un 5%.

Protocolo de desmielinización

Se indujo la desmielinización en ratones SJL/J hembra de 4 a 6 semanas de edad de Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Se inocularon los ratones por vía intracerebral con 2 x 10^{5} unidades formadoras de placa de virus DA en un volumen de 10 \mul. Los ratones infectados crónicamente con TMEV (4 a 6 meses después de la infección) se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento.

Protocolo de tratamiento y evaluación clínica de la enfermedad

Se administraron a ratones infectados crónicamente inyecciones intraperitoneales (i.p.) o intravenosas (i.v.) de mAb dos veces por semana durante 4-5 semanas. En cada inyección de tratamiento, se evaluaron clínicamente los ratones mediante tres criterios: apariencia, actividad y parálisis. Se dio una calificación para cada criterio en el intervalo de 0 (sin enfermedad) a 3 (enfermedad grave). Para apariencia, 1 indicaba cambio mínimo del pelaje, 2 indicaba un cambio moderado (apariencia sucia) y 3 indicaba un cambio grave (incontinencia y pelaje descolorido). Para actividad, 1 indicaba movimientos espontáneos reducidos (ataxia mínima), 2 indicaba retardo moderado (movimientos espontáneos mínimos), y 3 indicaba retardo grave (sin movimientos espontáneos). Para parálisis, 0,5 indicaba una extremidad espástica, 1 indicaba una extremidad paralizada, 1,5 indicaba dos o más extremidades espásticas, 2 indicaba dos extremidades paralizadas (incapaz de andar), 2,5 indicaba falta de respuesta de enderezamiento y 3 indicaba tres o cuatro extremidades paralizadas (moribundo). La calificación total para cada ratón era el total acumulado de cada criterio (máximo de 9). Ya que la calificación clínica era una escala ordinal pero no cardinal, se utilizó el cambio en la calificación clínica para evaluar la enfermedad clínica. Los datos de evaluación clínica no se dieron a conocer hasta después de completar la evaluación morfológica de la remielinización.

Preparación de fotografías de microscopía de luz y electrónica y evaluación de la remielinización

Se realizaron la preparación de secciones de microscopía de luz y electrónica y la evaluación morfológica de la remielinización. Brevemente, se anestesiaron con pentobarbital (0,2 mg i.p.) ratones tratados, se les extrajo sangre mediante punción cardiaca y se sacrificaron mediante perfusión intracardiaca con fijador de Trump (tampón fosfato 100 mM, pH 7,2 con 4% de formaldehído y 1,5% de glutaraldehído). Se extirpó la médula espinal completa cuidadosamente de la columna vertebral y se seccionó en bloques transversales de 1 mm. Un bloque de cada tres se fijó con tetróxido de osmio al 1% y se embebió en Araldite (Polysciences, Warrington, PA). Se cortaron secciones de un micrómetro de cada bloque y se tiñeron con p-fenilendiamina. En cada sección, se cuantificó la remielinización utilizando un sistema de análisis digital interactivo Zeiss (ZIDAS) y una cámara lúcida unida a un microscopio de luz Zeiss (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY). Se utilizaron vainas de mielina anormalmente finas respecto al diámetro axonal como criterio para la remielinización del SNC. Se examinaron diez secciones de médula espinal de cada ratón; esto correspondió a 8-9 mm^{2} de materia blanca examinada por ratón. Para evitar sesgos, se codificaron los portaobjetos y se realizó la cuantificación sin conocimiento de los grupos de tratamiento.

Medidas de grosor de mielina y diámetro axonal y cuantificación de los axones mielinizados

Se tomaron imágenes de fotografías por microscopio electrónico de axones normales y remielinizados a partir de secciones de médula espinal embebidas en plástico con una cámara de vídeo Hamamatsu, se digitalizaron y se analizaron utilizando un sistema de análisis de imágenes IBAS 2000 (Kontron, Múnich, Alemania). Se midió el área de sección transversal axonal con y sin la vaina de mielina, y se utilizaron cálculos circulares equivalentes para determinar el diámetro axonal y el grosor de la vaina de mielina. Para la cuantificación del axón mielinizado, se contó el número de axones mielinizados en lesiones de las secciones de médula espinal embebidas en plástico utilizando el sistema de análisis descrito anteriormente unido a un microscopio Axiophot (Carl Zeiss, Inc.) Se analizaron 17 lesiones remielinizadas y 15 desmielinizadas en secciones de médula espinal de animales tratados con el mAb SCH94.03, IgM control o sólo tampón. Esto correspondía a un área remielinizada de 0,6 mm^{2} y de 0,8 mm^{2} de área desmielinizada. El criterio para la selección de una lesión como desmielinizada fue la presencia de desmielinización sustancial con reparación mínima, mientras que las lesiones remielinizadas se eligieron basándose en la presencia de remielinización casi completa a lo largo de la lesión.

Inmunotinción

Se dejaron crecer células gliales 5.5B8 de rata en portaobjetos con cámara recubiertos con poli-D/L-lisina en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con D-glucosa 1,5 g/l, SeO_{2} 30 nM, triyodotironina 15 nM, biotina 10 ng/ml, ZnCl_{2} 100 \muM, gentamicina 50 \mug/ml y suero bovino fetal al 10%. Todas las etapas de tinción se realizaron a temperatura ambiente. Para la tinción de superficie, se aclararon brevemente los portaobjetos con PBS y se fijaron ligeramente las células con 1% de formaldehído en PBS durante 10 min para prevenir la separación celular durante las etapas de tinción posteriores. Para tinción citoplasmática, se aclararon dos veces los portaobjetos con PBS y se secaron al aire durante 1 hora o se incubaron con 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 10 min. Se bloquearon las células en BSA al 2% durante 30 min, se lavaron, se incubaron con IgM control o mAb SCH94.03 (10 \mug/ml en 1% de BSA) durante 1 hora y se lavaron extensamente con PBS. Después de la fijación con formaldehído al 4% durante 15 min, se incubaron los portaobjetos con IgM de cabra anti-ratón marcada con fluoresceína (Jackson Immunoresearch) durante 1 hora, se lavaron con PBS, se cubrieron con 10% de MOWIOL® (Hoechst) en Tris 100 mM, 25% de glicerol, pH 8,5 con 1,4-diazobiciclo-[2.2.2]-octano (DABCO) 25 \mug/ml para prevenir el atenuamiento, y se dejó reposar durante una noche en la oscuridad. Para las secciones de tejido congeladas, se congeló rápidamente tejido de cerebro cortical neonatal fresco de rata, adulto de ratón o humano de autopsia en isopentano enfriado con nitrógeno líquido antes del almacenamiento en nitrógeno líquido. Se transfirieron las fracciones congeladas (10 \mum) a portaobjetos de vidrio de microscopio gelatinizados, se secaron al aire durante 4-8 horas y se almacenaron a -70ºC. Antes de la inmunotinción, se dispusieron los portaobjetos a temperatura ambiente durante una noche. El protocolo de tinción con inmunoperoxidasa fue similar al descrito anteriormente, utilizando el reactivo de inmunoperoxidasa ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA), se reveló con reactivo de Hanker-Yates 1,5 mg/ml (p-fenilendiaminaprocatecol) en Tris 50 mM, pH 7,6 con 0,034% de H_{2}O_{2}, se contratiñó con hematoxilina de Mayer y se montó en Permount (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA).

Análisis de datos

Se utilizó un ensayo de suma de rangos acumulados modificado (O'Brien, P.C., Biometrics, 40: 1079-1087 (1984)) para comparar la remielinización entre los grupos de tratamiento. Este ensayo estadístico tiene en cuenta diversos parámetros numéricamente no relacionados de eficacia terapéutica, y se utiliza rutinariamente para la evaluación de la eficacia de un ensayo clínico. Análisis paralelos utilizando un ensayo de t de Student desapareado estándar para comparar los parámetros individuales de remielinización proporcionaron resultados equivalentes. Las comparaciones de gravedad de la enfermedad y significación de la correlación se determinaron mediante un análisis de varianza de una variable (ANOVA). Los análisis estadísticos se realizaron con los programas de software SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) o EXCEL (Microsoft Corporation, Redmond, WA). Los valores calculados se consideraron significativos cuando p < 0,05.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Mayo Foundation for Medical Education Research

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE PROMUEVEN LA REMIELINIZACIÓN DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

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(A)

REMITENTE: Hamilton, Brook, Smithy & Reynolds, P.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Two Militia Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Lexington

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(D)

ESTADO: Massachusetts

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

C. POSTAL: 02173

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: compatible con PC de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25.

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: U.S. 08/236.520

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 de abril de 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Granahan, Patricia

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 27.227

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: MMV92-01 PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 617-61-6240

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 617-861-9540

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 393 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1...393

\newpage

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 1:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 131 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 324 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 3:

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6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 285 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGACGTTCG GTGGAGGCAC CAAGCTGGAA ATCAAACGT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 429 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1...429

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 6:

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8

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 143 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 7:

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9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 366 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1...366

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 8:

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10

11

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 122 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

12

\newpage

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 351 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACTTTGACT ACTGGGGCCA AGGCACCACT CTCACAGTCT CCTCA

\hfill

45

Claims (5)

1. Un anticuerpo monoclonal de IgM que tiene una cadena ligera de SEC Nº ID 2 y una cadena pesada de SEC Nº ID 7, o una versión humanizada del mismo, que está genéticamente alterado mediante la sustitución de secuencias nucleotídicas de anticuerpo humano en regiones no variables del anticuerpo, tiñendo dicho anticuerpo monoclonal la superficie de oligodendrocitos y estimulando la remielinización de axones del sistema nervioso central.

2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, obtenible a partir del hibridoma que tiene el número de acceso ATCC CRL 11627.

3. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Uso del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad desmielinizante o para estimular la remielinización en un mamífero necesitado de dicho tratamiento.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que el mamífero es un ser humano.