JP3789472B2 - 中枢神経系ミエリン再形成を促進するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
背景技術
多発性硬化症（ＭＳ）は、一般には初期には軸索損傷のない原発性脱髄を病理学的特徴とする慢性のしばしば進行性の炎症性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患である。ＭＳの病因及び発病は不明である。ＭＳのいくつかの免疫学的特徴及びある種の主要組織適合複合体対立遺伝子とのかなりの関連は、ＭＳが免疫仲介疾患であるという憶測を促した（Hafler, D.A. & Weiner, H.L., Immunol. Today, 10:104-107 (1989); Compston, D.A.S.,“多発性硬化症に対する遺伝的感受性”：McAlpin's Multiple Sclerosis (Matthews, B. ed), pp 301-319，ロンドン:チャーチルリビングストーン(1991); Olsson, T., Curr. Opin. Neurol. Neurosurg., 5:195-202 (1992)）。
自己免疫仮説は、実験的自己免疫（アレルギー性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルによって支持され、ある種のミエリン成分を遺伝的に感受性のある動物に注入するとＴ細胞仲介ＣＮＳ脱髄がもたらされる(Kabat, E.A.ら，J. Exp. Med.,85:117-129 (1947); Lublin, F.D., Spinger Semin. Immunopathol., 8:197-208(1985))。しかしながら、特異自己抗原及び病原性ミエリン反応性Ｔ細胞は、ＭＳ患者のＣＮＳにおいても他の自己免疫疾患と関連したＭＳにおいても決定的に同定されていない。疫学的データに基づく別の仮説(Martyn, C.,“多発性硬化症の疫学”:McAlpin's Multiple Sclerosis (Matthews, B. ed), pp 3-40,ロンドン:チャーチルリビングストーン(1991)は、環境因子、おそらく未同定のウイルスがＣＮＳ内に炎症応答を沈着させ、潜在的な誘導自己免疫成分により直接或いは間接(“傍観者”)ミエリン破壊をもたらすというものである(Lampert, P.W., Am. J. Path. 91:176-208 (1978))。この仮説は、ヒト（Rice, G.P.A., Curr. Opin. Neurol. Neurosurg., 5:188-194 (1992)）及び動物（Dal Canto, M.C. & Rabinowitz, S.G., Ann. Neurol., 11:109-127 (1982)）の双方においていくつかの天然に存在するウイルスの感染が脱髄を引き起こすことができるという証拠によって支持されている。共通して用いられた実験的ウイルスモデルは、サイラーのマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）により誘導される(Dal Canto, M.C. & Lipton, H.L., Am. J. Path., 88:497-500 (1977))。
ＭＳ及び他の脱髄性疾患に対する現在の治療の限られた効能（Goodkin, D.E.ら，Clev. Clin. J. Med., 59:63-74 (1992)）が、これらの疾患を改善する新規な治療における興味を刺激した（Martin, R.ら，Ann. Rev. Immunol., 10:153-187 (1992); Steinman, L., Adv. Immunol., 49:357-379 (1992); Weiner, H.L.ら，Science 259:1321-1324 (1993)）。しかしながら、環境因子及び自己免疫因子の双方を潜在的に含むこれらの疾患の明らかに複雑な病因のために、これらの脱髄性疾患の効果的な治療がなお求められている。
発明の開示
本発明は、哺乳動物における中枢神経系軸索のミエリン再形成の促進又は刺激に関する。詳細には、本発明は、正常な哺乳動物（即ち、脱髄性疾患に感染していない）からの脊髄ホモジェネート（ＳＣＨ）で免疫した哺乳動物から得られたモノクローナル抗体を用いて中枢神経系（ＣＮＳ）軸索のミエリン再形成を刺激する方法に関する。そのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、本明細書ではＳＣＨ９４．０３と呼ばれ、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、1994年４月28日にブダペスト条約によってアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を与えられたものである。本明細書に示されるように、ｍＡｂ、ＳＣＨ９４．０３を用いて脱髄性疾患に罹患した哺乳動物を治療することにより、対照ｍＡｂで治療したマウスに比べてＣＮＳミエリン再形成の亢進が得られた。
本発明は、また、ＳＣＨ９４．０３モノクローナル抗体を用いてヒトにおける多発性硬化症のような哺乳動物における脱髄性疾患及び感染後の脳脊髄炎のようなヒト及び家畜の中枢神経系のウイルス性疾患を治療する方法又はこれらの病態における脱髄の開始又は進行を予防的に阻害する方法に関する。本発明は、更に、乏突起神経膠細胞のようなグリア細胞を生産する試験管内方法及びそれらのグリア細胞の増殖を刺激する試験管内方法並びに脱髄性疾患を治療するために使用されるそれらのグリア細胞の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、混合ラット脳培養物中の細胞の抗体仲介増殖の用量応答特徴を示すグラフである。
図２は、混合ラット脳培養物中の細胞の抗体仲介増殖の一過的プロファイルを示すグラフである。
図３Ａ〜図３Ｄは、ｍＡｂＳＣＨ９４．０３によって促進されたＣＮＳミエリン再形成の光学顕微鏡写真及び電子顕微鏡写真を示す図である。（Ａ）ＣＮＳミエリン再形成を示すＳＣＨ９４．０３で治療した慢性的に感染したＳＪＬ／Ｊマウスからの脊髄切片の光学顕微鏡写真。（Ｂ）広範囲にわたる脱髄及びミエリン再形成が相対的に存在しないことを示す対照ＩｇＭで治療した慢性的に感染したＳＪＬ／Ｊマウスからの脊髄切片の光学顕微鏡写真。ミエリン破片を摂取したマクロファージを含む炎症性細胞は、矢印で示される。星印は、代表的な裸軸索を示す。（Ｃ）正常なミエリンを有する脊髄切片の光学顕微鏡写真。（Ｄ）軸索の直径に相対して異常に薄い髄鞘を有する多数の軸索を示すＳＣＨ９４．０３で治療したマウスからの脊髄切片の電子顕微鏡写真。上部右角の星は、正常な厚さの髄鞘を有する軸索を示す。矢じりは、アストログリア細胞の突起を指し、ミエリン再形成軸索と密接に結合している。スケールバーは、Ａ〜Ｃが１３μm及びＤが２μmを示す。
図４は、臨床疾患の変化と形態学的ミエリン再形成間の相関を示すグラフである。
図５は、ｍＡｂＳＣＨ９４．０３による治療とＣＮＳミエリン再形成間の用量応答関係を示すグラフである。種々の用量のｍＡｂＳＣＨ９４．０３で治療したマウスにおけるＣＮＳミエリン再形成の面積（●）及びミエリン再形成を含む病変面積の割合（○）。
図６は、ＴＭＥＶタンパク質のウエスタンブロットを示す図である。感染したＬ２線維芽細胞からの溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移し、ＳＣＨ９４．０３（レーン１）、ＳＣＨ９４．３２（レーン２）、ＴＭＥＶに慢性的に感染した感受性のあるマウスからの血清（レーン３）及びポリクローナルウサギ抗ＴＭＥＶＩｇＧ（レーン４）でブロットした。分子量は、左にキロダルトン（ｋＤａ）で示されている。主要ＴＭＥＶキャプシドタンパク質の位置及び同定は、右に示されている。
図７Ａ〜図７Ｄは、培養したグリア細胞及び凍結したＣＮＳ組織切片のｍＡｂＳＣＨ９４．０３による免疫染色を示す図である。スケールバーは、１５μmを示す。
図８Ａ〜図８Ｃは、ＥＬＩＳＡで求めたタンパク質抗原に対するＳＣＨ９４．０３（図８Ａ）及び対照ＩｇＭ（図８Ｂ及び図８Ｃ）結合の結果を示す図である。
図９は、ＥＬＩＳＡで求めたタンパク質抗原に対するＳＣＨ９４．０３Ｆ（ａｂ２）′結合の結果を示す図である。
図１０Ａ〜図１０Ｃは、ＥＬＩＳＡで求めた化学ハプテンに対するＳＣＨ９４．０３（図１０Ａ）及び対照ＩｇＭ（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）結合の結果を示す図である。
図１１は、ＳＣＨ９４．０３及び対照ＩｇＭ、ＣＨ１２及び生殖系列Ｉｇ遺伝子セグメントの免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変部配列の列を示す図である（配列番号１〜１１）。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、哺乳動物における中枢神経系軸索のミエリン再形成の促進又は刺激に関する。詳細には、本発明は、正常な哺乳動物（即ち、脱髄性疾患に感染していない）からの脊髄ホモジェネートで免疫した哺乳動物から得られたモノクローナル抗体を用いて中枢神経系（ＣＮＳ）軸索のミエリン再形成を刺激する方法に関する。モノクローナル抗体、本明細書でＳＣＨ９４．０３と呼ばれる（また本明細書でＳＣＨ９４．３２と呼ばれる）ＩｇＭモノクローナル抗体の抗原反応性は、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウエスタンブロット法、固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びＩｇ可変部配列決定を含むいくつかの生化学及び分子分析を用いて本発明に記載されるように確認された。ハイブリドーマ産生モノクローナル抗体ＳＣＨ９４．０３は、1994年４月28日にブダペスト条約によってアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を与えられた。寄託物質の利用可能性に関する全ての制限は、特許の付与の際に解除される。
本発明は、また、ＳＣＨ９４．０３モノクローナル抗体を用いてヒトにおける多発生硬化症のような哺乳動物における脱髄性疾患及び感染後脳脊髄炎のようなヒト及び家畜の中枢神経系のウイルス性疾患を治療する方法に関する。脱髄性疾患の発症又は進行を抑制するためにｍＡｂを用いる予防的治療方法も本発明に包含される。
ＣＮＳミエリン再形成を促進するＳＣＨｍＡｂの選択
ＳＣＨを注入した非感染ＳＪＬ／Ｊマウスの脾細胞由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルを、実施例１に詳述するように構築した。初期融合及びクローニング後、生存可能なＩｇ分泌ハイブリドーマを含む９５ウェルのうちの２つがＥＬＩＳＡによって示されるＳＣＨへの結合の著しいｍＡｂを含んでいた。７９及び９４系と呼ばれるこれらの２つのウェルからのハイブリドーマ細胞を限界希釈でサブクローン化し、ＥＬＩＳＡでＳＣＨへの結合をスクリーンした。７９系ハイブリドーマの場合、４９クローンのうちの１４がＳＣＨＥＬＩＳＡで陽性であり、９４系の場合、３２のうちの１７がＳＣＨへの結合に陽性であった。ＥＬＩＳＡデータに基づいて、ＥＬＩＳＡでミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）と両者共反応した２つの７９系ハイブリドーマ（ＳＣＨ７９．０８及びＳＣＨ７９．２７）及びＭＢＰといずれも反応しない３つの９４系ハイブリドーマ（ＳＣＨ９４．０３、ＳＣＨ９４．１１及びＳＣＨ９４．３２）が腹水生成及び生体内伝達実験に選ばれた。
ｍＡｂによるグリア細胞の増殖の促進
実施例２に記載するように、ｍＡｂについて試験管内グリア細胞の増殖促進能を試験した。表１に示されるように、ｍＡｂ９４．０２又は７９．２７の存在下に増殖したラット視神経細胞は、培地のみ又はイソタイプ適合対照ｍＡｂを含む培地中で増殖した対照より［3Ｈ］チミジンの取込みが多かった。データは、同様の結果を示した５回の実験の１つから示されている。
次に、抗体仲介増殖の用量応答特性を試験した。図１に示すように、９４．０３による最大刺激は、１００ng/mlに見られた。対照骨髄腫ＩｇＭＭＯＰＣ １０４Ｅ及びＴＥＰＣ１８３（データは示されていない）も、混合ラット脳培養物を増殖するように刺激した。しかしながら、最大刺激は、ｍＡｂで観察された場合よりも１０倍高い濃度で見られた。
抗体仲介増殖の一過的プロファイルも、図２に示すように試験した。培養開始８日後に、１００ng/ml抗体を培養物に添加した（時間０）。細胞を２４時間おきに収集した。［3Ｈ］チミジンが最後の２４時間の培養に対して存在してその間隔での全増殖を測定した。９４．０３による最大刺激は、抗体添加の７２時間後に見られた。同様の結果が９４．３２で得られた。イソタイプの対照抗体は、いずれも１２０時間の培養中著しい増殖を示さなかった。これらのデータは、ｍＡｂ９４．３２及び９４．０３が共に混合ラット脳培養物のグリア細胞の増殖を誘導することを示している。この増殖は、抗体濃度１００ng/ml及び培養時間抗体添加の７２時間後に最大である。
ｍＡｂＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２によって促進されたＣＮＳミエリン再形成
実施例３に記載するように、ＴＭＥＶに慢性的に感染させたＳＪＬ／Ｊマウスを、０．５mgｉｖ又は５．０mgｉｐの全ｍＡｂ用量で毎週２回に分けて４〜５週間処理した。ＣＮＳミエリン再形成を、各マウスからの脊髄断面について定量的形態学的評価によって測定した。ＣＮＳミエリン再形成の基準は、軸索の直径に相対する異常に薄い髄鞘であった。データは、６回の実験の複合であり、平均±ＳＥＭとして表され、ｎはマウスの数を示す。ミエリン再形成データの統計的比較は、変更した階級和試験を用いてＩｇＭ及びバッファーのみの対照の両者からの累積値と行った。脱髄性病変の数及び脱髄の面積は、一方向ＡＮＯＶＡによって評価した処理グループ間に著しい差がなかった。対照ＩｇＭの場合には、我々は、骨髄腫ＭＯＰＣ１０４Ｅ及びＡＢＰＣ２２（両者ともSigma製）及びＴＢ５−１及び抗ミコバクテリアｍＡｂを用いた。
ＴＭＥＶに慢性的に感染させかつｍＡｂＳＣＨ９４．０３或いはＳＣＨ９４．３２で処理したＳＪＬ／Ｊマウスは、イソタイプ適合対照ｍＡｂ或いはバッファーのみで処理したマウスより著しいＣＮＳミエリン再形成を示した（表２）。
ミエリン再形成は、ｉｖ或いはｉｐ注入により見られた。ＳＣＨ９４．０３又はＳＣＨ９４．３２処理マウスは、対照マウスよりミエリン再形成病変が約２〜３倍多くかつＣＮＳミエリン再形成の全面積が３〜４倍大きかった。これらの２つの治療上の有効性のパラメーターを用いて累積統計的比較を行った場合、ｍＡｂＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２で誘導されたＣＮＳミエリン再形成が非常に顕著であった（ｐ＜０．００５；表２）。ＴＭＥＶ感染のような慢性の進行性疾患では、ＣＮＳ修復の程度は、ＣＮＳ損傷の程度の直接の関数である。ＣＮＳ病変の数及び面積は共に治療グループ間に差がなく、同様の疾患程度を示した（表２）。ＣＮＳミエリン再形成がミエリン再形成を示す病変面積の率として表される場合、累積脱髄性病変面積の約１／３は、ｍＡｂＳＣＨ９４．０３或いはＳＣＨ９４．３２で処理したマウスにおいてＣＮＳミエリン再形成を示した（表２）。
ＣＮＳミエリン再形成の形態
ＣＮＳミエリン再形成は、光学顕微鏡及び電子顕微鏡の双方で形態学的に容易に同定された（図３Ａ〜図３Ｄ）。図３Ａは、ＳＣＨ９４．０３で処理したマウスからのミエリン再形成病変を示す。病変における軸索の大部分は、軸索の直径に相対する異常に薄い髄鞘を有する修復の形態学的証拠を示す（Ludwin, Sk.K.“マウスの中枢神経系のミエリン再形成”：THE PATHOLOGY OF THE MYELINATED AXON(Adachi M, Hirano A, Aronson SM eds), pp 49-79，東京:医学書院(株)(1985);Ludwin, S.K., Adv. Neurol., 47:215-154 (1988)）。比較のため、図３Ｂはミエリン再形成の最小の脱髄性病変を示すが、図３Ｃは厚いミエリン形成軸索を有する正常なミエリン面積である。ミエリン再形成病変内に（図３Ａ）、脱髄病変の１００μm2あたり１．１±０．２ミエリン形成軸索のみと比べて（図３Ｂ）１００μm2あたり１５．３±１．０（平均±ＳＥＭ）ミエリン形成軸索があった。図３Ｃは、正常なミエリンを有する脊髄切片の光学顕微鏡写真を示す。電子顕微鏡で、ＣＮＳミエリン再形成が特に明らかであった（図３Ｄ）。視野内のほとんど全ての軸索は、新しいミエリン形成の証拠を有するが、ミエリン再形成（即ち、ミエリンの厚さ）の程度は個々の軸索間で可変であり、種々の段階の修復過程を示す。軸索直径に対するミエリンの厚さの比率は、正常なミエリン形成軸索の０．２１±０．０１（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３４軸索）に比べてミエリン再形成軸索の０．０８±０．０１（ｎ＝２５軸索）であった。
臨床疾患と形態学的ミエリン再形成間の相関
疾患改善の臨床徴候を有する形態学的ミエリン再形成の相関を実施例３に記載するように評価した。各処理注入において、実施例３に記載するようにマウスを臨床的に評価した。臨床評点の変化は、ミエリン再形成を示す病変面積の率と相関した（図４）。形態学的ミエリン再形成は、ＣＮＳミエリン再形成を示す病変面積の率として表される。臨床評点の変化０は、処理期間（４〜５週間）にわたって安定な疾患を示すが、正の変化は臨床上の疾患の悪化を示し、負の変化は改善を示す。データは、全ての処理グループからの個々のマウスを表す。臨床評点の正の変化は、疾患の悪化を示す。全ての処理グループからのデータを用いると、臨床評点の変化は、中程度であるが重要な負の相関を示し（Ｒ＝−０．４０；ｐ＜０．０４）、病変面積の率はミエリン再形成を示した。数匹のマウスは実際に臨床的に改善した（△臨床評点＜０）が、疾患重篤度が増大したマウス（△臨床評点＞０）は形態学的ミエリン再形成の低い傾向を生じ、臨床的に安定が維持されたマウス（△臨床評点＝０）は最高のミエリン再形成を示した。同様に負の相関は、表２に示すように、ミエリン再形成の他の定量的尺度を用いた（ミエリン再形成病変の数及びミエリン再形成の面積）。これらのデータは、形態学で定量されたミエリン再形成が臨床上の疾患の進行の緩慢さと関係があることを示している。
ｍＡｂＳＣＨ９４．０３用量の力価測定及びＣＮＳミエリン再形成
初期の処理実験に対して、ｉｖ注入用に２５mg/kg及びｉｐ注入用に２５０mg/kgの合計ｍＡｂ用量が経験的に選ばれた。用量応答特性を評価するために及びミエリン再形成を促進するのに必要とされるｍＡｂの最低量を求めるために、慢性的に感染したマウスをＳＣＨ９４．０３の種々のｉｐ用量で処理した。ミエリン再形成病変の数（データは示されていない）及びミエリン再形成の全面積（図５）の双方が多量のＳＣＨ９４．０３で顕著に増加した。ミエリン再形成を表２に記載されるように定量した。データは、ｍＡｂ用量あたり平均値４〜５マウスであり、最終累積用量をグラフに示した。ＳＥＭは、平均値の３５％を平均した。処理グループ間に脱髄病変の数又は脱髄面積の一方向ＡＮＯＶＡによって評価された統計的差がなく、全てのマウスにおいて同様の程度の疾患を示した。脱髄病変の数及び病変面積は、１０００μgグループに対して３３．２±７．５及び１．２５±０．４３、１００μgグループに対して３１．８±８及び１．１１±０．３１、１０μgグループに対して２３．８±３．４及び０．５４±０．１４及びバッファーのみのグループに対して２９．０±６．５及び０．７４±０．２０（グラフには０用量点として表されている）であった。１００μgの対照ＩｇＭ（ＭＯＰＣ１０４Ｅ）で処理したマウスは、バッファーのみで処理した対照マウスと同様のミエリン再形成評点を有した。ｍＡｂＳＣＨ９４．０３の用量とＣＮＳミエリン再形成間の正の相関は、ＣＮＳ疾患の重篤度を考慮すると特に著しかった。ＣＮＳ修復がミエリン再形成を示す病変面積の率として表される場合には、１０００μg、１００μg又は１０μgのＳＣＨ９４．０３の全用量で処理したマウスは、対照マウスより各々６倍、５倍又は４倍以上のミエリン再形成を有した（図５）。１０μg程度の少量のＳＣＨ９４．０３ｉｐ（０．５mg/kg）を投与したマウスは、ＣＮＳミエリン再形成亢進の証拠を示した。これらのデータから、ｍＡｂＳＣＨ９４．０３とＣＮＳミエリン再形成が正の用量応答関係を有すること及び非常に少量のｍＡｂがミエリン修復を促進するのに必要であることが示された。
ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２の抗原特異性
ｍＡｂＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２を非感染マウスの脾細胞から生成し非感染マウスからのＳＣＨに対してスクリーンしたが、ｍＡｂがＴＭＥＶキャプシドタンパク質と反応するか或いは試験管内でウイルス感染力を抑制するかを直接評価した。ウェスタンブッロ法により（図６）、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は慢性的に感染したマウスからの血清或いは精製ＴＭＥＶに感染したウサギからのポリクローナルＩｇＧによって認識されたＴＭＥＶタンパク質と反応しなかった(Rodriguez, M.ら，Ann. Neurol., 13:426-433 (1983))。対照模擬感染Ｌ２細胞からの溶解物のウェスタンブロットは、各々３２ｋＤａ及び４３ｋＤａの慢性的に感染したマウスからの血清及びポリクローナルウサギ抗ＴＭＥＶＩｇＧと単一バンドを示したが、ＳＣＨ９４．０３又はＳＣＨ９４．３２との反応性を示さなかった。
更に、５μg/mlまでのＳＣＨ９４．０３或いはＳＣＨ９４．３２によるＴＭＥＶ感染力の顕著な抑制は、慢性的に感染したマウスからの血清の１：３４，０００希釈液で５０％中和が観察される分析条件下で観察されなかった。これらの結果から、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２の治療効果がウイルスの直接抑制によるものでないことが示された。
始めにｍＡｂＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２によって認識された抗原を確認するために、グリア（ラットＣ６、マウスＧ２６−２０、ヒトＵ３７３ＭＧ及びＵ８７ＭＧ）、神経（ヒト神経芽細胞腫）、線維芽細胞（マウスＬ及び３Ｔ３）、上皮（ヒトＳＣＣ−９がん腫）及びリンパ球（マウスＣＴＬＬ２）起原由来の種々の細胞系を染色した。両ｍＡｂは、試験した細胞系全ての内部抗原を染色し、これらのｍＡｂによって認識されたある一定の抗原は、試験管内でユニークな種類の細胞に制限されないことが示された。ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２の治療効果がＣＮＳ特異的相互作用によるものであるという仮定に基づいて、ラットグリア細胞系５．５Ｂ８を用いてＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２による培養細胞の免疫染色を更に調べた。この不死化グリア細胞系は、ＭＢＰ及び２′，３′−環状ヌクレオチド３′−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）の発現及びグリア線維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）及びｍＡｂＡ２Ｂ５及びＯ４によって認識された脂質又はタンパク質の低いが検出可能な発現によりａｃ及びアストログリア細胞双方の表現型特性を有する（Bozyczko, D.ら，Ann. NY Acad. Sci., 605:350-353 (1990)）。ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は、５．５Ｂ８細胞について表面決定基及び細胞質決定基の双方を認識した。表面染色は、平坦な形態学的に分化した細胞の層の上にある小細胞に最も著しかった（図７Ａ）。表面染色は、生細胞についてフローサイトメトリーで確認された。内部抗原を露出させるために脱水又は非イオン清浄剤によって細胞膜の透過性を上げると、染色パターンがかなり変わった（図７Ｂ）。細胞質染色は、繊維状であり、細胞突起に伸びた密度の濃い周辺核網目構造を有した。このパターンは、中間フィラメント細胞骨格タンパク質ビメンチンの染色パターンに密接に似ている。これらのデータから、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は神経系由来の細胞に制限されない抗原を認識するがグリア細胞の表面決定基及び細胞質決定基双方を認識することが示された。
凍結したマウス、ラット及びヒト組織の免疫組織化学染色から、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２がＣＮＳ特異的ｍＡｂでなくむしろ多臓器反応性を示すことが確認された。両ｍＡｂは、脳、脊髄、視神経、心臓、肝臓、腎臓、胃及び小腸並びに骨格筋を含む試験した主要臓器を全て免疫染色した。しかしながら、臓器内の細胞全部が染色されず、原位置細胞学的特異性を示した。ＣＮＳ内では、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は主に血管、新生児の小脳、脳室周囲及び脳幹の白質に多く含むグリア細胞の形態学的特徴を有する上衣細胞及び星状細胞（図７Ｃ）及び新生児及び成体両方の視神経を染色した。ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２に陽性の同様のグリア細胞は、解剖したヒト脳組織、特に灰白質連結点に見られた（図７Ｄ）。同じ免疫染色結果は、ｍＡｂＳＣＨ９４．３２でも得られた。対照ＩｇＭ（ＭＯＰＣ１０４Ｅ）による免疫染色は、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２で免疫染色した試料及び組織構造の全てに負であった。
“自然”又は“生理的”自己抗体と呼ばれる自己抗体の全ファミリーの同定及び確認は、自己免疫及び自己反応性の伝統的観点に影響した。他のイソタイプも同定されたが典型的にはＩｇＭである、多く実験した自然自己抗体は、細胞骨格タンパク質、表面タンパク質、核酸、リン脂質、リポポリサッカリドのような細菌抗原及び種々の化学ハプテンを含む広範囲の抗原に反応性である(Avrameas & Ternynck, Mol. Immunol., 30:1133-1142(1993))。自然自己抗体は、同様のイディオタイプの発現を含み病原性自己抗体によって発現されるものがある多くのイディオタイプの交差反応性又は“結合性”及び他の抗体上で発現した共通イディオタイプに対する反応性を共有する。分子分析は、自然自己抗体が典型的には変異しない生殖系列免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子でコードされ、体細胞変異があるとしても少なく、特に多くの外因性抗原に曝露されなかった新生児動物においてＩｇレパートリーの実質的画分を表すことを示した。
自然自己抗体の機能は、なぞのままである。生化学及び分子特性に基づいていくつかの仮説が提案された。これらには、（１）老化又は損傷組織のクリアランス、（２）病原曝露とＡｇ特異的免疫応答間の遅滞期の免疫学的防禦の一次系を与えること、（３）潜在的病原性自己免疫応答から自己抗原を遮蔽すること、（４）イディオタイプ網目構造を介して新生児免疫レパートリーの成形を含む免疫モデュレーション及び（５）胸腺におけるＴ細胞に提案された過程と同様の骨髄におけるＢ細胞の正の選択に関与が含まれる。
抗体ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２が自然自己抗体であるという仮定を試験した。ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２の抗原反応性を確認するために、免疫組織化学及び免疫細胞化学、ウェスタンブロット法、固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びＩｇ可変部配列決定を含むいくつかの生化学及び分子分析を用いた。下に記載されるように、全ての生化学分析に対してＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は区別できなかった。更に、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２はＩｇ可変部配列を同定し、同じｍＡｂであることが確認された。
ＳＣＨ９４．０３が中枢神経系におけるミエリン再形成を刺激することができる潜在的機序は、ミエリン形成、主に乏突起膠細胞又はその未熟な前駆体に関係した細胞の増殖及び／又は分化を刺激するものである。即ち、ＳＣＨ９４．０３が種々の細胞の表面を染色するかを試験した。不死化細胞を用いて、ＳＣＨ９４．０３が２種類のグリア細胞系、５．５Ｂ８（図７Ａ）及び２０．２Ｅ１１を染色するが他のいくつかのグリア細胞系（１０．１Ａ３、２０．２Ａ４０、Ｃ６、Ｇ２６−２０）、神経芽腫細胞系（Ｂ１０４）、２種類の繊維芽細胞系（Ｌ２、Ｃｏｓ−１）又は２種類の筋芽細胞腫系（Ｇ８、Ｌ６）の表面を染色しないことが求められた。同様の結果が動物組織から単離し培養内で増殖した細胞で得られた。ＳＣＨ９４．０３は、乏突起膠細胞の表面を染色したが、アストログリア細胞、小膠細胞、シュワン細胞、筋芽細胞又は繊維芽細胞を染色しなかった。
ウェスタンブロット法でＳＣＨ９４．０３とグリア及びリンパ系細胞系からのタンパク質及び脳、肝臓及び腸からの組織溶解物との反応性も評価した。ＳＣＨ９４．０３は、試験した全ての細胞及び組織からの多重バンドと反応し、５０ｋＤａ、９５ｋＤａ、１２０ｋＤａ及び＞２００ｋＤａのバンドに対して反応性が顕著であった。これらのタンパク質バンドの正確な同一性は求められなかった。
ＳＣＨ９４．０３といくつかの精製タンパク質自己抗原との反応性を固相ＥＬＩＳＡにより求めた（図８Ａ〜図８Ｃ）。ＳＣＨ９４．０３は、ＲＢＣ抗原スペクトリンに対して強い反応性を示し、ヘモグロビン、アクチン、チューブリン及びビメンチン及びチログロブリンに対しても一致した反応性を示したが、スペクトリンよりも定性的程度が低かった。我々の分析条件下で、ミオシン、トランスフェリン、アルブミン、リゾチーム又はミエリン塩基性タンパク質との反応性は観察されなかった。他の６種のモノクローナル又は骨髄腫ＩｇＭ対照ＸＸＭＥＮ−ＯＥ５（図８Ｂ）、Ａ２Ｂ５、ＭＯＰＣ１０４Ｅ、ＴＥＰＣ１８３、０１及びＣＨ１２（図８Ｃ）も試験し、試験した抗原のいずれとも反応性は観察されなかった。
ＳＣＨ９４．０３のモノクローナル性を確認するために、ＳＣＨ９４．０３の１８サブクローン（ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２親分子から各々９種類）の多反応性を固相ＥＬＩＳＡにより試験した。１８サブクローンは全て、親ＳＣＨ９４．０３と同一のタンパク質抗原のパネルを有する反応性パターンを示した。ＳＣＨ９４．０３の多反応性がＦａｂ領域を介するという結論を更に支持するために、我々はＦ（ａｂ）2′フラグメントを作成し、タンパク質抗原との反応性をＥＬＩＳＡで評価した（図９）。ＳＣＨ９４．０３（ａｂ）2′フラグメントは、ＩｇＭ全分子と同様の多反応性を示した。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合した化学ハプテンのパネルを構築し、ＳＣＨ９４．０３反応性を固相ＥＬＩＳＡで評価するために用いた（図１０Ａ〜図１０Ｃ）。ＳＣＨ９４．０３は、フルオレセイン（ＦＬ）及び４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル酢酸（ＮＰ）に対して強い反応性、フェニルオキサゾロン（ＰｈＯｘ）に対して中程度の反応性及び２，４，６−トリニトロフェニル（ＴＮＰ）及びｐ−アゾフェニルアルソン酸（Ａｒｓ）に対して弱い反応性を示した。ｐ−アゾフェニルトリメチルアンモニウム（ＴＭＡ）、ｐ−アゾフェニルホスホリルコリン（ＰＣ）又はキャリヤータンパク質ＢＳＡとの反応性は、検出されなかった。対照ＩｇＭ（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）は、以前に報告されているＣＨ１２とＴＭＡとの反応性及びＡ２Ｂ５とＮＰとの反応性を除いて試験したハプテンのいずれにも顕著な結合を示さなかった。
ＳＣＨ９４．０３のＩｇ軽鎖（Ｌ）（配列番号１及び２）及び重鎖（Ｈ）（配列番号６及び７）が生殖系列Ｉｇ遺伝子でコードされているかを更に試験した（図１１）。ＳＣＨ９４．０３からの軽鎖可変部（ＶL）及び結合部（ＪL）ヌクレオチド配列（配列番号１及び２）は、以前に発表された生殖系列ＶK１０（配列番号４）及びＪK１（配列番号５）遺伝子の配列と９９．４％同一性を有し、ＶL及びＪL領域双方の３′端の２つのサイレント変化だけがあった。ＳＣＨ９４．０３ＶH領域（配列番号６及び７）ヌクレオチド配列は、以前に発表された生殖系列ＶH２３配列（配列番号１０）と同一であり、ＪH領域配列は、発表された生殖系列ＶH２（配列番号１１）とＪ領域の５′の１ヌクレオチドだけ異なり、多様性（Ｄ）領域は、生殖系ＤＦＬ１６．１遺伝子由来の１５の相接するヌクレオチドを含んだ。既知の生殖系Ｖ又はＤ領域遺伝子に対応せず、おそらくＶ−Ｄ−Ｊ組換え中に酵素末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによって挿入された非コード（Ｎ）ヌクレオチドを表すＶ−Ｄ連結部に８ヌクレオチド及びＤ−Ｊ連結部に１ヌクレオチドがあった。ＳＣＨ９４．０３の重鎖における生殖系遺伝子からの唯一の変化は、Ｖ−Ｄ或いはＤ−Ｊ連結部に存在し、体細胞変異より不正確な結合のＮヌクレオチド或いはその結果を表す。更に、ＳＣＨ９４．０３の軽鎖及び重鎖可変部は共にＢ細胞リンパ腫ＣＨ１２によって産生したＩｇＭと多くの配列類似性を示した（配列番号３、８及び９）（図１１）。
ＳＣＨ９４．０３は自然自己抗体である
これらの予備的抗原反応性結果は、ＳＣＨ９４．０３が自然自己抗体であることを示している。この結論は、ＳＣＨ９４．０３が中枢神経系においてミエリン再形成をどのように刺激するかに関する機序を直ちに示すものではないが、自然自己抗体の重要な生理的機能を示している。正常な生理学で或いは組織損傷及び以前に隔離された抗原のその後の放出に対する応答で産生される自己抗体は、損傷組織における修復を促進するのに活発に関与する。自然自己抗体の以前に提案された機能と一致して、この活発な関与は、損傷した組織の除去を促進すること、自己抗原を遮蔽し、もって、激しい病原性自己免疫応答を防止すること、組織破壊を実際に生じた免疫応答をモデュレートし、もって、正常な内在性組織修復を起こさせるか又は修復過程に関係する細胞を直接刺激することを可能にすることである。
従って、本明細書に記載された働きの結果として、ここでは自己抗体を作成すると共に自己抗原結合能をスクリーンした自己抗体もＣＮＳミエリン再形成を促進することが証明される。ＴＭＥＶに慢性的に感染しハイブリドーマからのＩｇＭｍＡｂでｉｖ或いはｉｐ処理したマウスは、ＣＮＳミエリン再形成の詳しい定量的形態学的評価により測定したＣＮＳ修復が対照マウスより著しく多かった。更に、予備的データは、自己抗体、ＳＣＨ９４．０３が実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を罹患した哺乳動物においてミエリン再形成を促進するのに有効であることも示している。即ち、ＳＣＨ９４．０３のような自己抗体が、ＣＮＳ疾患において脱髄の免疫仲介過程を停止するのに重要な役割を果たしていること予想することは妥当なことである。
Ａｂがミエリン再形成を促進する２つの潜在的機序が提案される。第１に、Ａｂは、ウイルス活性のような疾患過程の病原性成分、脱髄を直接誘導する免疫応答又はミエリン再形成を防止する免疫応答を阻害するものである。疾患の成果が組織破壊と修復間の釣り合いに基づく場合には、病原性成分の抑制は生理学的修復応答を優先させることができる。実験的及び臨床的証拠は、この仮定を支持する。自然ＣＮＳミエリン再形成は、ＭＳ患者及びＣＮＳ脱髄及び本明細書に記載されるいくつかの実験的モデルに見られ、対照マウスにおいて自然ミエリン再形成を示す。これにより、ミエリン再形成がミエリン損傷に対する正常な生理的応答であることが示される。更に、ＴＭＥＶに慢性的に感染したマウスを種々の免疫抑制群で処理すると、ミエリン再形成は促進されるが、脱髄を減少せず、ミエリン再形成を阻害する免疫学的成分があることを示している。（Rodriguez, M. & Lindsley, M.D., Neurology, 42:348-357 (1992)）。予備的な免疫学的機能の実験から、ＳＣＨ９４．０３で処理されたマウスが脾臓において対照マウスと比べて同じ数のＢ及びＴ細胞（共にＣＤ４＋及びＣＤ８＋）を有し、マイトジェン及び抗原に対して同様の試験管内脾細胞増殖応答を有しかつＴ細胞依存性及びＴ細胞非依存性抗原の双方に対して匹敵しうるＡｂ応答を開始したことが示された。
第２の仮定は、ある一定ののＡｂが試験管内で証明されたようにおそらくは生体内で乏突起膠細胞増殖及び／又は分化の刺激を介してＣＮＳミエリン再形成を活発に刺激することができるというものである（Diaz, M.ら，Brain Res., 154:231-239 (1978); Raine, C.S.ら，Lab. Invest., 38:397-403 (1979); Lehrer,G.M.ら，Brain Res., 172:557-560 (1979); Bansal, R.ら，J. Neurosci. Res., 21:260-267 (1988); Benjamins, J.A. & Dyer, C.A.,Ann. NY Acad. Sci., 605:90-100 (1990); Dyer, C.A., Mol. Neurobiol., 7:1-22 (1993)）。ｍＡｂＳＣＨ９４．０３は、活発なミエリン再形成を示すヒト及び実験的ＣＮＳ病変の双方の縁に存在することが既知である前駆グリア細胞を直接刺激することができる。また、ＳＣＨ９４．０３は、希突起神経膠系統における細胞の生存又は増殖に重要な因子を放出することができるアストログリア細胞又は他の補助細胞の活性化を介して間接に働くことができる。ミエリン破壊の際に放出された組織成分との原位置でのＡｂ抗原複合体の形成は、Ａｂ仲介ＣＮＳミエリン再形成にも関与することができる。ＳＣＨ９４．０３はＣＮＳ特異的でないが、ｍＡｂによるグリア細胞上の表面抗原及び細胞質抗原双方の認識は、活性な機序の仮説を支持するものである。ＡｂがＣＮＳに直接接近することを必ずしも必要としない免疫モジュレーション仮定と対照的に、ＡｂがＣＮＳミエリン再形成を活発に刺激するという仮定は、ＣＮＳに直接接近するという前提条件を意味する。これは、特に５量体ＩｇＭのような大きな分子に対する血液脳関門の選択透過性の観点と対照的である。しかしながら、ＴＭＥＶ感染又はＭＳのような慢性の炎症状態で、末梢白血球はＣＮＳに移動し、血液脳関門透過性に変化を示す。従って、血清Ｉｇのような大きなタンパク質も、“開放した”内皮を通る受動拡散を介して或いはおそらくは未同定の活性輸送機序を介して入ることができる。
脱髄性疾患の治療
本明細書に記載された実験の結果は、多発性硬化症（ＭＳ）、ＥＡＥ及び関連する他の中枢神経系脱髄性疾患に実用的用途がある。自然ＣＮＳ型ミエリン再形成(“シャドウプラーク”)の稀な例がＭＳに見られ、末梢神経系（ＰＮＳ）型ミエリン再形成が根入口帯近傍の脱髄脊髄プラークにしばしば見られる。乏突起膠細胞は、ＭＳの慢性プラークの中心には稀であるが、不稔性ミエリン再形成と関連のあるプラークの周囲に増殖していると考えられる。ミエリン再形成の過程は、ＭＳに臨床的に観察される自然寛解傾向及び改善と相関するものである。これらの臨床的所見は、新しいミエリン形成がＭＳにおいて可能であることを示している。ｍＡｂを用いることによりＴＭＥＶ誘導脱髄を有するマウスにおいて刺激されたミエリン再形成は、多発性硬化症の治療的用途に有望であるものである。
薄い髄鞘の形態学的再生が機能上の回復にあずかるかの問題は臨床上重要である。コンピュータシミュレーションは、新しいミエリン形成が不適切な薄い髄鞘によってさえインパルス伝導を改善することを示している。正常な有髄線維の軸索膜は高度に分化されるので、跳躍伝導を伝えるためにはナトリウムチャンネルがランビエ絞輪に高密度で存在することが必要である。実験的証拠は、新たに形成された狭窄部がサキシトキシン結合によって示されるように必要な高いナトリウムチャンネル密度を生じることを示している。現在までのデータは、ミエリン再形成が不適切な薄いミエリンによってさえ以前の脱髄した軸索の伝導を改善することを示している。従って、この形態学的現象を促進する方法は、機能上の回復を生じる可能性がある。
本明細書に提示されたデータは、モノクローナル抗体を哺乳動物へ投与すると生体内で中枢神経系軸索のミエリン再形成を刺激することができることをはじめて証明するものである。詳細には、慢性的に感染したＴＭＥＶ感染マウスを１０μg程度の少量のＳＣＨ９４．０３で処理することにより、対照ｍＡｂで処理したマウスと比べてＣＮＳミエリン化の全面積が４〜５倍増加した。
従って、本明細書に記載された実験の結果として、本発明の方法は、脱髄性疾患に罹患したヒト及び家畜を含む哺乳動物を治療するために及びＣＮＳ軸索のミエリン再形成を刺激するために用いられる。本明細書に記載されるように、モノクローナル抗体の有効量は、静脈内（ｉｖ）又は腹腔内（ｉｐ）注入で投与される。抗体の有効量は、治療される哺乳動物のサイズ、疾患の重篤度、投与経路及び治療過程によって変動させることができる。例えば、投与されるｍＡｂの各用量は、約０．５〜約４００mg/kg、好ましくは約０．５〜約２５０mg/kgの範囲とすることができる。１０μg（０．５mg/kg）程度の低い用量がマウスにおいてＣＮＳ軸索のミエリン再形成を促進するのに有効であることを留意することは重要である。ｍＡｂの用量は、投与経路にも依存する。例えば、マウスに投与されるｉｖ用量は０．５mg/kgであり、ｉｐ用量は５．０mg/kgであった。治療過程としては、ｍＡｂの投与回数（例えば、毎日、毎週又は隔週）及び治療期間（例えば、４週間〜４ヵ月）が含まれる。即ち、例えば、多量のｍＡｂは毎日４〜５週間投与されるのに対して少量のｍＡｂは４ヵ月間投与される。
モノクローナル抗体の投与量の有効性は、例えば実施例３に記載するように哺乳動物の全体の外観、哺乳動物の活動度及び哺乳動物の麻痺の程度を含む臨床基準のいずれを用いても評価される。ヒトにおいてミエリン再形成を誘導するのに必要なモノクローナル抗体量の有効性もまた、二重盲検制御試験で評価される。脱髄性疾患からの一定の神経学的損失を有する患者は、モノクローナル抗体又は対照で治療される。定量的生物力学筋試験によって検出される等尺性筋力の改善は、治療上の一次終点として用いられる。
モノクローナル抗体の有効量は、生理的バッファー又は塩類溶液のような適切な薬学的に許容しうる担体と混合されるか又はそれで希釈される。更に、モノクローナル抗体は、マウスｍＡｂの非可変部のヒト抗体ヌクレオチド配列の置換により遺伝的に変えて、例えば“人間化”して免疫原性を減じることができる。
ミエリン再形成を促進する生体内方法のほかに、ＣＮＳ軸索におけるミエリン再形成を刺激する生体外方法も本発明に包含される。例えば、実施例２に記載するように乏突起膠細胞のようなグリア細胞の増殖及び／又は分化を刺激するためにモノクローナル抗体が試験管内で用いられる。次に、これらの外因性グリア細胞が既知の手法を用いて哺乳動物のＣＮＳに導入される。ＣＮＳ軸索のミエリン再形成は、存在する内在性グリア細胞数を増やすことにより亢進される（乏突起膠細胞のようなグリア再形成はミエリン生産に重要な役割を果たしている）。
グリア細胞を生産するか又は混合培養物（例えば、ラット視神経細胞又はラット脳細胞培養物）からのグリア細胞の増殖を刺激する試験管内方法も本発明に包含される。例えば、グリア細胞を含むラット視神経又はラット脳から得られた細胞は、細胞の発育を促進するのに十分な条件下に混合培養物として培養される。次に、ＳＣＨ９４．０３のようなＣＮＳ軸索のミエリン再形成を促進することができるｍＡｂの有効量が、細胞の混合培養物に加えられ、細胞の発育及び増殖に十分な条件下で維持される。ｍＡｂは、混合培養物においてグリア細胞の増殖を刺激する。即ち、ｍＡｂの存在下に培養されたグリア細胞の増殖は、ｍＡｂを存在させないで発育させたグリア細胞の増殖に相対して高められる。
下記の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、決して限定するものではない。
実施例１：モノクローナル抗体生産、スクリーニング及び精製
動物
不完全フロイントアジュバント中脊髄ホモジェネート（ＳＣＨ）を２回注入した２匹のＳＪＬ／Ｊマウス（Jackson Laboratories、メイン州、バーハーバー）の脾臓を、融合及びハイブリドーマ生産用Ｂ細胞源として用いた。脾細胞をポリエチレングリコールを用いてＮＳ−１骨髄腫細胞と融合し、生存可能な細胞融合物をヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地で選択し、（Katzmann, J.A.ら，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78:162-166 (1981)）に記載されたように限界希釈でクローン化した。
ＥＬＩＳＡ
生存可能なＩｇ産生クローンからのハイブリドーマ上清について、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）でＳＣＨに対する結合をスクリーンした。ｍＡｂをスクリーニングするために次の抗原を用いた：炭酸塩−重炭酸塩バッファー（ｐＨ８．５３）中で再構成したＳＣＨ−（１０μg）、ＰＢＳに溶解したＭＢＰ−（１μg）、無水アルコールに溶解したＧＣ（１μg）、水に溶解したＰＬＰ（１μg）。ＰＬＰは、ＰＬＰに対する固相免疫検定を発表したDr. W. Macklin(UCLA)により提供された。ＳＣＨ、ＭＢＰ又はＧＣＥＬＩＳＡに対して、ＩｍｍｕｎｏＩＩプレートを４℃で一晩インキュベートした調製抗原（１００μl/ウェル）で被覆した。翌日ウェルをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ＋１％血清を用いて室温で１時間阻止した。プレートをＰＢＳで再び洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで希釈した一次Ａｂの連続希釈液を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％トゥイーンで洗浄し、アルカリ性ホスファターゼに結合した適切な二次Ａｂ（ＰＢＳ０．１％ＢＳＡ中１：１０００）を加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ０．０５％トゥイーンで洗浄し、基質（５mlのジエタノールアミンバッファー中シグマ１０４ホスファターゼサブストレートタブレット）を３０分間加えた。反応を５０μlの１N ＮａＯＨで終結させた。プレートをダイナテックＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。
腹水生成
治療実験に選ばれたハイブリドーマを腹水生成のためにプリスタン処理ＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。ハイブリドーマをＩｇＭ生産のために１０％ウシ胎児血清で補足したＲＰＭ１−１６４０培地中で増殖した。ＩｇＭｍＡｂを初期伝達実験用に硫酸アンモニウム沈殿及びセファクリルS-400 HR(Sigma)カラムによるゲルろ過或いは後期伝達実験用にリアクチ−ゲル6Xマトリックス（Pierce、イリノイ州、ロックフォード）に結合したヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異的；Jackson Immunoresearch，ペンシルバニア州、ウェストグローブ）を用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
実施例２：モノクローナル抗体の試験管内試験
グリア細胞増殖を促進するｍＡｂの選択
試験管内でグリア細胞を増殖するｍＡｂの促進能を試験した。ラット脳又は視神経から単離したグリア細胞を、ファルコンマイクロテストＩＩプレートに０．１mlのＤＭＥ中１ウェルあたり２×１０4細胞の濃度で播種した。全血清（ＳＣＨ、ＩＦＡ、ＭＢＰ、ＧＣ、ＭＢＰ／ＧＣ、ＰＢＳ又はＰＬＰ）、精製Ｉｇ又はｍＡｂを連続希釈し、０．１mlの分割量を細胞に加え、３回の実験で分析した。３日後3Ｈチミジンを加え（１μCi/ml）、１７時間後に自動細胞ハーベスター（Mash II Harvester）を用いて細胞を収集した。増殖している細胞（即ち、アストログリア細胞、前駆グリア細胞、マクロファージ）の同一性を証明するために、3Ｈチミジンに曝露した後に選ばれた培養物を、細胞の種類に特異的な適切なＡｂとインキュベートした後にＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ法を続けた。ハンカー・ヤテス試薬の反応後、スライドをイルフォードＫ２核エマルジョンに浸漬し、４℃で４日間曝露し、展開した。
ｍＡｂ９４．０３及び９４．３２による混合ラット視神経脳培養物の増殖の誘導
生後１〜２日のラットをエーテル殺した。注意深く解剖して視神経を目の視神経十字から取り出した。神経を２mlのＤＭＥＭを含む遠心管に移した。等量の０．２５％トリプシンを加え、水浴中で４５分間３７℃までインキュベートした。０．２mlのＦＣＳを加えてトリプシン処理を終結させた。神経を滅菌した針と注射器（ゲージno.21）に通過させ、次に、１４００rpmで１０分間遠心した。細胞数を調整してＤＭＥＭ＋０．５％ＦＣＳ中５×１０5細胞／１００μlの２４ウェルトレー中の培地の濃度を得た。１２〜１６時間後、実験プロトコールにより適切な抗体又は増殖培地を加えた。
生後１〜２日のラットの脳を取り出し、１０mMＨＥＰＥＳバッファーを含むハンク液（ＨＢＳＳ／Ｈ）、１脳あたり約１〜２mlに入れた。脳幹、小脳及び中脳を捨てるが、前脳を曲がった注射器でミンチにした。更に、組織を１０mlのピペットに繰り返し通過させて破壊し、５０mlの三角管に移した。組織浮遊液を回転シェーカー（７５rpm）により３７℃で３０分間振盪した。トリプシンを最終濃度０．１２５％まで加え、その浮遊液を更に６０分間振盪した。ＦＣＳ（１０％）を加えることによりトリプシン消化を停止させた。細胞浮遊液を１２０μm及び５４μmのNytexに連続して通過させ、遠心し、１０％ＦＣＳを含む無血清培地に再懸濁し、５４μm Nytexでろ過した。無血清培地は、３．７g/l重炭酸ナトリウム、６．０g/lグルコース、２mMＬ−グルタミン、０．１nM非必須アミノ酸、５μg/mlインスリン、５μg/mlトランスフェリン、５ng/ml亜セレン酸塩、１００U/mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシンを含むＤＭＥＭとした。細胞を計数し、被覆されていない組織培養フラスコ又はプレートに５×１０4細胞／cm2で入れ、５％ＣＯ2中３７℃で培養した。培地を７２時間後に変え、その後４８時間毎に変えた。培養開始の８日後に、培地を吸引し、種々の補足物（例えば、抗体）を含むＳＦＭで置き換えた。ほとんどの実験に対して、細胞を更に４８時間増殖した後に収集した。最後の１８２４時間の培養に対して細胞を[3Ｈ]チミジン（５μCi/ml）で短時間標識した。
ウェスタンブロット法
抗原を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）試料バッファー中１００℃で加熱することにより変性及び可溶化した。試料を４．７５％及び１２．０％アクリルアミドを含有する濃縮用及び分離用ゲルにより２００ボルトで電気泳動した。電気泳動後、ゲルとニトロセルロース膜をトランスファバッファー（２５mMトリス、１９２mMグリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．１〜８．３）中で３０分間平衡化した。全段階を室温で行った。ゲルを、バイオ−ラドミニトランス−ブロット装置を用いて１００Vで１時間或いは３０Vで一晩エレクトロブロッティングした。ニトロセルロース膜を細片に切断し、０．０３％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（１００mMＮａＣｌ、５０mMＴｒｉＧ、ｐＨ７．６）で３回洗浄した。ニトロセルロース片を２〜４時間阻止し（３％脱脂乳及び０．０３％トゥイーン２０を含むＴＢＳ）、３回洗浄し、一次Ａｂ又は抗血清（阻止バッファーで希釈した）と４時間又は一晩インキュベートした。一次Ａｂインキュベーション後、細片を３回洗浄し、ビオチン或いはアルカリ性リン酸塩標識二次Ａｂ（阻止バッファーで希釈した）で２時間インキュベートし、３回洗浄し、ビオチン系が用いられる場合にはアルカリ性ホスファターゼ標識ストレプタビジン（阻止バッファーで希釈した）と２時間インキュベートした。ニトロセルロース片を４回洗浄し（最後の洗浄はトゥイーン２０を含まないＴＢＳで）、基質溶液（１００mMＨａＣｌ、１００mMＴｒｉＧ、５mMＭｇＧｌ２、ｐＨ９．５中０．１６５mg/mlＢＣＩＰ及び０．３３mg/mlＮＢＴ）と十分に発色するまで（約１０〜１５分）インキュベートした。５mMＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えることにより反応を停止させた。
細胞系又は混合脳培養物を１×ＳＤＳ還元試料バッファー（２．３％ＳＤＳ、１０％２−ＭＥ、０．１２５Mトリス、２０％グリセロール）に溶解し、８５℃まで１５分間加熱した。溶解物を２１〜２７ゲージ針に繰り返し通過させて核酸を剪断した。溶解物のタンパク質を１２％アクリルアミド還元ゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移し、以前に記載された種々の抗体でブロットした。
実施例３：モノクローナル抗体を用いるＣＮＳミエリン再形成の促進
ウイルス
ＢＨＫ細胞中８継代後のＴＭＥＶのＤＡ株を、Drs. J. Lehrich & B. Arnasonから入手した。そのウイルスを１細胞あたり０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染多重度で更に４回継代した。培養物を凍結−解凍するのに続いて音波処理することにより細胞関連性ウイルスを遊離させた。溶解物を遠心分離により清澄化し、−７０℃において分割量で保存した。その後の実験は全て１２継代ウイルスを用いる。このウイルス単離物は、前角細胞を破壊せずに白質病変を引き起こすものである。
試験管内ＴＭＥＶ中和分析
ウイルスプラーク分析を以前に記載されたように行った（Patick, A.K.ら，J. Neuropath, Exp. Neurol., 50:523-537 (1991)）。中和を評価するために、ＴＭＥＶ（２００ＰＦＵ／ml）の分割量を種々の濃度のＡｂと室温で１時間インキュベートした後、集密的Ｌ２細胞にプレーティングした。正の対照としては、我々は、ＴＭＥＶに慢性的に感染した感受性マウスからの血清を用いた。上記分析条件下に１：３４，０００の血清希釈液が５０％中和を得、これは、全血清Ｉｇ濃度を１５mg/ml、ＴＭＥＶ特異的画分を５％と仮定すると、２０ng/mlのＴＭＥＶ特異的Ａｂに対応する。
脱髄プロトコール
Jackson Laboratory、メイン州、バーハーバーからの４〜６週齢の雌ＳＪＬ／Ｊマウスに脱髄を誘導した。マウスに２×１０5プラーク形成単位のＤＡウイルスを１０μl量で脳内に接種した。ＴＭＥＶに慢性的に感染した（感染が４〜６ヵ月続く）マウスを治療グループにランダムに割り当てた。
治療プロトコール及び臨床疾患評価
慢性的に感染させたマウスにｍＡｂを毎週２回４〜５週間腹腔内（ｉｐ）或いは静脈内（ｉｖ）注射した。各治療注射において、マウスを次の３つの基準で臨床的に評価した：外観、活動度及び麻痺。各基準の評点を０（疾患なし）〜３（重篤な疾患）の範囲とした。外観の場合、１は外皮の最小の変化を示し、２は中程度の変化（みすぼらしい外観）を示し、３は激しい変化（失調及び染色した外皮）を示した。活動度の場合、１は自発的運動の低下（最小の運動失調）を示し、２は中程度の緩慢（最小の自発的運動）を示し、３は激しい緩慢（自発的運動なし）を示した。麻痺の場合、０．５は痙攣性四肢を示し、１は麻痺した四肢を示し、１．５は２肢以上の痙攣性四肢を示し、２は２肢の麻痺した四肢（歩行が不可能）を示し、２．５は直立する応答を示さず、３は３又は４肢の麻痺した四肢（瀕死）を示した。各マウスの全評点は、各基準からの累積合計とした（最大９）。臨床評点は序数であるが基数ではないので、臨床疾患を評価する臨床評点の変化を用いた。臨床評価データは、ミエリン細胞の形態学的評価の完了後まで示さなかった。
光学及び電子顕微鏡写真の標品及びミエリン再形成の評価
光学及び電子顕微鏡切片の調製及びミエリン再形成の形態学的評価を行った。簡単に言えば、治療したマウスをペントバルビタール（０．２mgｉｐ）で麻酔し、心臓穿刺で瀉血させ、トランプ固定液（４％ホルムアルデヒド及び１．５％グルタルアルデヒドを含む１００mMリン酸塩バッファー、ｐＨ７．２）で心臓内灌流により殺した。脊髄全体を脊柱管から注意して取り出し、１mmの横ブロックの切片にした。３ブロック毎に１％四酸化オスミウムに後固定し、アラルダイト（Polysciences、ペンシルバニア州、ワーリントン）に埋め込んだ。各ブロックからの１ミクロン切片を切断し、ｐ−フェニレンジアミンで染色した。各切片について、ツァイス相互作用ディジタル分析システム（ＺＩＤＡＳ）及びツァイス写真用顕微鏡（Carl Zeiss Inc.、ニューヨーク州、トルンウッド）に取り付けたカメラルーシダを用いて定量した。軸索直径に相対する異常に薄い髄鞘をＣＮＳミエリン再形成の基準として用いた。各マウスからの１０脊髄切片を試験した。これは、１マウスあたり８〜９mm2の試験白質に相当した。偏りを避けるために、スライドをコード化し、治療グループの知識なしで定量化を行った。
ミエリンの厚さ及び軸索の直径の測定及びミエリン化軸索の定量化
プラスチック包埋脊髄切片からの正常な軸索及びミエリン再形成軸索の電子顕微鏡を浜松ビデオカメラで映し、ディジタル化し、ＩＢＡＳ２０００画像分析システム（Kontron，ドイツ、ミュンヘン）を用いて分析した。髄鞘を含む及び含まない軸索断面積を測定し、軸索の直径及び髄鞘の厚さを求めるために等価な円計算を用いた。ミエリン化軸索の定量化に対して、プラスチック包埋脊髄切片からの病変のミエリン化軸索数を、アキシオホト顕微鏡（Carl Zeiss Inc.）に取り付けた上記の分析システムを用いて計数した。ｍＡｂＳＣＨ９４．０３、対照ＩｇＭ又はバッファーのみで処理したマウスからの脊髄切片の１７ミエリン再形成病変及び１５脱髄病変を分析した。これは、０．６mm2のミエリン再形成面積及び０．８mm2の脱髄面積に相当した。脱髄した病変の選択基準は、最小修復を含む実質的な脱髄の存在であるが、ミエリン再形成病変は、病変全体のほとんど完全なミエリン再形成の存在に基づいて選択した。
免疫染色
ラット５．５Ｂ８グリア細胞を、１．５g/LＤ−グルコース、３０nMＳｅＯ2、１５nMトリヨードチロニン、１０ng/mlビオチン、１００μM ＺｎＣｌ2、５０μg/mlゲンタマイシン及び１０％ウシ胎児血清で補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）のポリＤ／Ｌリシン被覆チャンバスライド上で増殖した。染色段階は全て室温で行った。表面染色の場合、スライドをＰＢＳで簡単にすすぎ、細胞をＰＢＳ中１％ホルムアルデヒドで１０分間軽く固定してその後の染色段階中の細胞脱離を防止した。細胞質染色の場合、スライドをＰＢＳで２回すすぎ、１時間風乾するか或いはＰＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００とインキュベートした。細胞を２％ＢＳＡ中３０分間阻止し、洗浄し、対照ＩｇＭ又はｍＡｂＳＣＨ９４．０３（１％ＢＳＡ中１０μg/ml）と１時間インキュベートし、ＰＢＳで広範囲にわたって洗浄した。４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した後、スライドをフルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇＭ（Jackson Immunorsearch）と１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、２５μg/ml１，４−ジアゾビシクロ−［2.2.2］−オクタン（ＤＡＢＣＯ）を含む１００mMトリス、２５％グルセロール、ｐＨ８．５中１０％MOWIOL▲Ｒ▼（Hoechst）とカバーグラスで覆って退色を防止し、暗所で一晩放置した。凍結組織切片の場合、新たな生後のラット、成体マウス又は剖検ヒト皮質脳組織を液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結した後、液体窒素保存した。凍結切片（１０μm）をゲル化した顕微鏡ガラススライドに移し、４〜８時間風乾し、−７０℃で保存した。免疫染色前に、スライドを室温に一晩おいた。免疫ペルオキシダーゼ染色プロトコールは、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ試薬（Vector Laboratories、カリフォルニア州、バーリンガム）を用いる上記のものと同様であり、０．０３４％Ｈ２Ｏ２を含む５０mMトリス、ｐＨ７．６中１．５mg/mlハンカー・ヤテス試薬（ｐ−フェニレンジアミン−プロカテコール）で展開し、マイエルヘマトキシリンで対比染色し、パーマウント（Fischer Scientific、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）に取り付けた。
データ分析
治療グループ間のミエリン再形成を比較するために、変更した累積階級和試験(O'Brien, P.C., Biometrics, 40:1079-1087 (1984))を用いた。この統計的試験は、治療上の有効性のいくつかの数字と無関係なパラメーターを考慮し、臨床試験の効能評価に通常用いられる。ミエリン再形成の個々のパラメーターを比較するために対になっていない標準のスチューデントのｔ検定を用いて平行して分析して等価な結果を得た。疾患の重篤度及び相関有意性の比較を、１方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって求めた。統計的分析をシグマスタット（Jandel Scientific、カリフォルニア州、サンラファエル）或いはEXCEL（Microsoft Corporation、ワシントン州、レドモンド）ソフトプログラムで行った。計算値は、ｐが＜０．０５である場合に有意とみなした。
等価物
当業者は、本明細書に記載される個々の実施態様に対する多くの等価物を通常の実験を超えることなく用いて認識し、確認することもできる。そのような等価物は、請求の範囲に包含されるものである。
配列表
（1）一般的な情報：
(i)出願人：医学教育研究のためのメイヨー財団
(ii)発明の名称：中枢神経系ミエリン再形成を促進するモノクローナル抗体
(iii)配列の数：１１
(iv)住所：
（A）受取人：ハミルトン，ブルック，スミシー＆レイノルズ，Ｐ．Ｃ．
（B）町：ツーミリチアドライブ
（C）市：レキシントン
（D）州：マサチューセッツ
（E）国：米国
（F）郵便番号：０２１７３
(v)コンピュータ判続形式：
（A）ミディアムタイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０，バージョン＃１．２５
(vi)現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
(vii)先願データ：
（A）出願番号：米国出願第０８／２３６，５２０号
（B）出願日：１９９４年４月２９日
(viii)弁理士／代理人情報：
（A）名前：グラナハム，パトリシア
（B）登録番号：２７，２２７
（C）参照／整理番号：ＭＭＶ９２−０１ＰＣＴ
(ix)伝送の情報：
（A）電話：６１７−８６１−６２４０
（B）テレファクス：６１７−８６１−９５４０
（2）配列番号１の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３９３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ix)特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．３９３
(xi)配列：配列番号１：
（2）配列番号２の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：１３１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２：
（2）配列番号３の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号３：
（2）配列番号４の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：２８５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号４：
（2）配列番号５の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号５：
（2）配列番号６の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：４２９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ix)特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．４２９
(xi)配列：配列番号６：
（2）配列番号７の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：１４３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号７：
（2）配列番号８の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３６６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ix)特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．３６６
(xi)配列：配列番号８：
（2）配列番号９の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：１２２アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号９：
（2）配列番号１０の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３５１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号１０：
（2）配列番号１１の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：４５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号１１
多発性硬化症（ＭＳ）は、一般には初期には軸索損傷のない原発性脱髄を病理学的特徴とする慢性のしばしば進行性の炎症性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患である。ＭＳの病因及び発病は不明である。ＭＳのいくつかの免疫学的特徴及びある種の主要組織適合複合体対立遺伝子とのかなりの関連は、ＭＳが免疫仲介疾患であるという憶測を促した（Hafler, D.A. & Weiner, H.L., Immunol. Today, 10:104-107 (1989); Compston, D.A.S.,“多発性硬化症に対する遺伝的感受性”：McAlpin's Multiple Sclerosis (Matthews, B. ed), pp 301-319，ロンドン:チャーチルリビングストーン(1991); Olsson, T., Curr. Opin. Neurol. Neurosurg., 5:195-202 (1992)）。
自己免疫仮説は、実験的自己免疫（アレルギー性）脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルによって支持され、ある種のミエリン成分を遺伝的に感受性のある動物に注入するとＴ細胞仲介ＣＮＳ脱髄がもたらされる(Kabat, E.A.ら，J. Exp. Med.,85:117-129 (1947); Lublin, F.D., Spinger Semin. Immunopathol., 8:197-208(1985))。しかしながら、特異自己抗原及び病原性ミエリン反応性Ｔ細胞は、ＭＳ患者のＣＮＳにおいても他の自己免疫疾患と関連したＭＳにおいても決定的に同定されていない。疫学的データに基づく別の仮説(Martyn, C.,“多発性硬化症の疫学”:McAlpin's Multiple Sclerosis (Matthews, B. ed), pp 3-40,ロンドン:チャーチルリビングストーン(1991)は、環境因子、おそらく未同定のウイルスがＣＮＳ内に炎症応答を沈着させ、潜在的な誘導自己免疫成分により直接或いは間接(“傍観者”)ミエリン破壊をもたらすというものである(Lampert, P.W., Am. J. Path. 91:176-208 (1978))。この仮説は、ヒト（Rice, G.P.A., Curr. Opin. Neurol. Neurosurg., 5:188-194 (1992)）及び動物（Dal Canto, M.C. & Rabinowitz, S.G., Ann. Neurol., 11:109-127 (1982)）の双方においていくつかの天然に存在するウイルスの感染が脱髄を引き起こすことができるという証拠によって支持されている。共通して用いられた実験的ウイルスモデルは、サイラーのマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）により誘導される(Dal Canto, M.C. & Lipton, H.L., Am. J. Path., 88:497-500 (1977))。
ＭＳ及び他の脱髄性疾患に対する現在の治療の限られた効能（Goodkin, D.E.ら，Clev. Clin. J. Med., 59:63-74 (1992)）が、これらの疾患を改善する新規な治療における興味を刺激した（Martin, R.ら，Ann. Rev. Immunol., 10:153-187 (1992); Steinman, L., Adv. Immunol., 49:357-379 (1992); Weiner, H.L.ら，Science 259:1321-1324 (1993)）。しかしながら、環境因子及び自己免疫因子の双方を潜在的に含むこれらの疾患の明らかに複雑な病因のために、これらの脱髄性疾患の効果的な治療がなお求められている。
発明の開示
本発明は、哺乳動物における中枢神経系軸索のミエリン再形成の促進又は刺激に関する。詳細には、本発明は、正常な哺乳動物（即ち、脱髄性疾患に感染していない）からの脊髄ホモジェネート（ＳＣＨ）で免疫した哺乳動物から得られたモノクローナル抗体を用いて中枢神経系（ＣＮＳ）軸索のミエリン再形成を刺激する方法に関する。そのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、本明細書ではＳＣＨ９４．０３と呼ばれ、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、1994年４月28日にブダペスト条約によってアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を与えられたものである。本明細書に示されるように、ｍＡｂ、ＳＣＨ９４．０３を用いて脱髄性疾患に罹患した哺乳動物を治療することにより、対照ｍＡｂで治療したマウスに比べてＣＮＳミエリン再形成の亢進が得られた。
本発明は、また、ＳＣＨ９４．０３モノクローナル抗体を用いてヒトにおける多発性硬化症のような哺乳動物における脱髄性疾患及び感染後の脳脊髄炎のようなヒト及び家畜の中枢神経系のウイルス性疾患を治療する方法又はこれらの病態における脱髄の開始又は進行を予防的に阻害する方法に関する。本発明は、更に、乏突起神経膠細胞のようなグリア細胞を生産する試験管内方法及びそれらのグリア細胞の増殖を刺激する試験管内方法並びに脱髄性疾患を治療するために使用されるそれらのグリア細胞の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、混合ラット脳培養物中の細胞の抗体仲介増殖の用量応答特徴を示すグラフである。
図２は、混合ラット脳培養物中の細胞の抗体仲介増殖の一過的プロファイルを示すグラフである。
図３Ａ〜図３Ｄは、ｍＡｂＳＣＨ９４．０３によって促進されたＣＮＳミエリン再形成の光学顕微鏡写真及び電子顕微鏡写真を示す図である。（Ａ）ＣＮＳミエリン再形成を示すＳＣＨ９４．０３で治療した慢性的に感染したＳＪＬ／Ｊマウスからの脊髄切片の光学顕微鏡写真。（Ｂ）広範囲にわたる脱髄及びミエリン再形成が相対的に存在しないことを示す対照ＩｇＭで治療した慢性的に感染したＳＪＬ／Ｊマウスからの脊髄切片の光学顕微鏡写真。ミエリン破片を摂取したマクロファージを含む炎症性細胞は、矢印で示される。星印は、代表的な裸軸索を示す。（Ｃ）正常なミエリンを有する脊髄切片の光学顕微鏡写真。（Ｄ）軸索の直径に相対して異常に薄い髄鞘を有する多数の軸索を示すＳＣＨ９４．０３で治療したマウスからの脊髄切片の電子顕微鏡写真。上部右角の星は、正常な厚さの髄鞘を有する軸索を示す。矢じりは、アストログリア細胞の突起を指し、ミエリン再形成軸索と密接に結合している。スケールバーは、Ａ〜Ｃが１３μm及びＤが２μmを示す。
図４は、臨床疾患の変化と形態学的ミエリン再形成間の相関を示すグラフである。
図５は、ｍＡｂＳＣＨ９４．０３による治療とＣＮＳミエリン再形成間の用量応答関係を示すグラフである。種々の用量のｍＡｂＳＣＨ９４．０３で治療したマウスにおけるＣＮＳミエリン再形成の面積（●）及びミエリン再形成を含む病変面積の割合（○）。
図６は、ＴＭＥＶタンパク質のウエスタンブロットを示す図である。感染したＬ２線維芽細胞からの溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移し、ＳＣＨ９４．０３（レーン１）、ＳＣＨ９４．３２（レーン２）、ＴＭＥＶに慢性的に感染した感受性のあるマウスからの血清（レーン３）及びポリクローナルウサギ抗ＴＭＥＶＩｇＧ（レーン４）でブロットした。分子量は、左にキロダルトン（ｋＤａ）で示されている。主要ＴＭＥＶキャプシドタンパク質の位置及び同定は、右に示されている。
図７Ａ〜図７Ｄは、培養したグリア細胞及び凍結したＣＮＳ組織切片のｍＡｂＳＣＨ９４．０３による免疫染色を示す図である。スケールバーは、１５μmを示す。
図８Ａ〜図８Ｃは、ＥＬＩＳＡで求めたタンパク質抗原に対するＳＣＨ９４．０３（図８Ａ）及び対照ＩｇＭ（図８Ｂ及び図８Ｃ）結合の結果を示す図である。
図９は、ＥＬＩＳＡで求めたタンパク質抗原に対するＳＣＨ９４．０３Ｆ（ａｂ２）′結合の結果を示す図である。
図１０Ａ〜図１０Ｃは、ＥＬＩＳＡで求めた化学ハプテンに対するＳＣＨ９４．０３（図１０Ａ）及び対照ＩｇＭ（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）結合の結果を示す図である。
図１１は、ＳＣＨ９４．０３及び対照ＩｇＭ、ＣＨ１２及び生殖系列Ｉｇ遺伝子セグメントの免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変部配列の列を示す図である（配列番号１〜１１）。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、哺乳動物における中枢神経系軸索のミエリン再形成の促進又は刺激に関する。詳細には、本発明は、正常な哺乳動物（即ち、脱髄性疾患に感染していない）からの脊髄ホモジェネートで免疫した哺乳動物から得られたモノクローナル抗体を用いて中枢神経系（ＣＮＳ）軸索のミエリン再形成を刺激する方法に関する。モノクローナル抗体、本明細書でＳＣＨ９４．０３と呼ばれる（また本明細書でＳＣＨ９４．３２と呼ばれる）ＩｇＭモノクローナル抗体の抗原反応性は、免疫組織化学、免疫細胞化学、ウエスタンブロット法、固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びＩｇ可変部配列決定を含むいくつかの生化学及び分子分析を用いて本発明に記載されるように確認された。ハイブリドーマ産生モノクローナル抗体ＳＣＨ９４．０３は、1994年４月28日にブダペスト条約によってアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を与えられた。寄託物質の利用可能性に関する全ての制限は、特許の付与の際に解除される。
本発明は、また、ＳＣＨ９４．０３モノクローナル抗体を用いてヒトにおける多発生硬化症のような哺乳動物における脱髄性疾患及び感染後脳脊髄炎のようなヒト及び家畜の中枢神経系のウイルス性疾患を治療する方法に関する。脱髄性疾患の発症又は進行を抑制するためにｍＡｂを用いる予防的治療方法も本発明に包含される。
ＣＮＳミエリン再形成を促進するＳＣＨｍＡｂの選択
ＳＣＨを注入した非感染ＳＪＬ／Ｊマウスの脾細胞由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルを、実施例１に詳述するように構築した。初期融合及びクローニング後、生存可能なＩｇ分泌ハイブリドーマを含む９５ウェルのうちの２つがＥＬＩＳＡによって示されるＳＣＨへの結合の著しいｍＡｂを含んでいた。７９及び９４系と呼ばれるこれらの２つのウェルからのハイブリドーマ細胞を限界希釈でサブクローン化し、ＥＬＩＳＡでＳＣＨへの結合をスクリーンした。７９系ハイブリドーマの場合、４９クローンのうちの１４がＳＣＨＥＬＩＳＡで陽性であり、９４系の場合、３２のうちの１７がＳＣＨへの結合に陽性であった。ＥＬＩＳＡデータに基づいて、ＥＬＩＳＡでミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）と両者共反応した２つの７９系ハイブリドーマ（ＳＣＨ７９．０８及びＳＣＨ７９．２７）及びＭＢＰといずれも反応しない３つの９４系ハイブリドーマ（ＳＣＨ９４．０３、ＳＣＨ９４．１１及びＳＣＨ９４．３２）が腹水生成及び生体内伝達実験に選ばれた。
ｍＡｂによるグリア細胞の増殖の促進
実施例２に記載するように、ｍＡｂについて試験管内グリア細胞の増殖促進能を試験した。表１に示されるように、ｍＡｂ９４．０２又は７９．２７の存在下に増殖したラット視神経細胞は、培地のみ又はイソタイプ適合対照ｍＡｂを含む培地中で増殖した対照より［3Ｈ］チミジンの取込みが多かった。データは、同様の結果を示した５回の実験の１つから示されている。
抗体仲介増殖の一過的プロファイルも、図２に示すように試験した。培養開始８日後に、１００ng/ml抗体を培養物に添加した（時間０）。細胞を２４時間おきに収集した。［3Ｈ］チミジンが最後の２４時間の培養に対して存在してその間隔での全増殖を測定した。９４．０３による最大刺激は、抗体添加の７２時間後に見られた。同様の結果が９４．３２で得られた。イソタイプの対照抗体は、いずれも１２０時間の培養中著しい増殖を示さなかった。これらのデータは、ｍＡｂ９４．３２及び９４．０３が共に混合ラット脳培養物のグリア細胞の増殖を誘導することを示している。この増殖は、抗体濃度１００ng/ml及び培養時間抗体添加の７２時間後に最大である。
ｍＡｂＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２によって促進されたＣＮＳミエリン再形成
実施例３に記載するように、ＴＭＥＶに慢性的に感染させたＳＪＬ／Ｊマウスを、０．５mgｉｖ又は５．０mgｉｐの全ｍＡｂ用量で毎週２回に分けて４〜５週間処理した。ＣＮＳミエリン再形成を、各マウスからの脊髄断面について定量的形態学的評価によって測定した。ＣＮＳミエリン再形成の基準は、軸索の直径に相対する異常に薄い髄鞘であった。データは、６回の実験の複合であり、平均±ＳＥＭとして表され、ｎはマウスの数を示す。ミエリン再形成データの統計的比較は、変更した階級和試験を用いてＩｇＭ及びバッファーのみの対照の両者からの累積値と行った。脱髄性病変の数及び脱髄の面積は、一方向ＡＮＯＶＡによって評価した処理グループ間に著しい差がなかった。対照ＩｇＭの場合には、我々は、骨髄腫ＭＯＰＣ１０４Ｅ及びＡＢＰＣ２２（両者ともSigma製）及びＴＢ５−１及び抗ミコバクテリアｍＡｂを用いた。
ＴＭＥＶに慢性的に感染させかつｍＡｂＳＣＨ９４．０３或いはＳＣＨ９４．３２で処理したＳＪＬ／Ｊマウスは、イソタイプ適合対照ｍＡｂ或いはバッファーのみで処理したマウスより著しいＣＮＳミエリン再形成を示した（表２）。
ＣＮＳミエリン再形成の形態
ＣＮＳミエリン再形成は、光学顕微鏡及び電子顕微鏡の双方で形態学的に容易に同定された（図３Ａ〜図３Ｄ）。図３Ａは、ＳＣＨ９４．０３で処理したマウスからのミエリン再形成病変を示す。病変における軸索の大部分は、軸索の直径に相対する異常に薄い髄鞘を有する修復の形態学的証拠を示す（Ludwin, Sk.K.“マウスの中枢神経系のミエリン再形成”：THE PATHOLOGY OF THE MYELINATED AXON(Adachi M, Hirano A, Aronson SM eds), pp 49-79，東京:医学書院(株)(1985);Ludwin, S.K., Adv. Neurol., 47:215-154 (1988)）。比較のため、図３Ｂはミエリン再形成の最小の脱髄性病変を示すが、図３Ｃは厚いミエリン形成軸索を有する正常なミエリン面積である。ミエリン再形成病変内に（図３Ａ）、脱髄病変の１００μm2あたり１．１±０．２ミエリン形成軸索のみと比べて（図３Ｂ）１００μm2あたり１５．３±１．０（平均±ＳＥＭ）ミエリン形成軸索があった。図３Ｃは、正常なミエリンを有する脊髄切片の光学顕微鏡写真を示す。電子顕微鏡で、ＣＮＳミエリン再形成が特に明らかであった（図３Ｄ）。視野内のほとんど全ての軸索は、新しいミエリン形成の証拠を有するが、ミエリン再形成（即ち、ミエリンの厚さ）の程度は個々の軸索間で可変であり、種々の段階の修復過程を示す。軸索直径に対するミエリンの厚さの比率は、正常なミエリン形成軸索の０．２１±０．０１（平均±ＳＥＭ；ｎ＝３４軸索）に比べてミエリン再形成軸索の０．０８±０．０１（ｎ＝２５軸索）であった。
臨床疾患と形態学的ミエリン再形成間の相関
疾患改善の臨床徴候を有する形態学的ミエリン再形成の相関を実施例３に記載するように評価した。各処理注入において、実施例３に記載するようにマウスを臨床的に評価した。臨床評点の変化は、ミエリン再形成を示す病変面積の率と相関した（図４）。形態学的ミエリン再形成は、ＣＮＳミエリン再形成を示す病変面積の率として表される。臨床評点の変化０は、処理期間（４〜５週間）にわたって安定な疾患を示すが、正の変化は臨床上の疾患の悪化を示し、負の変化は改善を示す。データは、全ての処理グループからの個々のマウスを表す。臨床評点の正の変化は、疾患の悪化を示す。全ての処理グループからのデータを用いると、臨床評点の変化は、中程度であるが重要な負の相関を示し（Ｒ＝−０．４０；ｐ＜０．０４）、病変面積の率はミエリン再形成を示した。数匹のマウスは実際に臨床的に改善した（△臨床評点＜０）が、疾患重篤度が増大したマウス（△臨床評点＞０）は形態学的ミエリン再形成の低い傾向を生じ、臨床的に安定が維持されたマウス（△臨床評点＝０）は最高のミエリン再形成を示した。同様に負の相関は、表２に示すように、ミエリン再形成の他の定量的尺度を用いた（ミエリン再形成病変の数及びミエリン再形成の面積）。これらのデータは、形態学で定量されたミエリン再形成が臨床上の疾患の進行の緩慢さと関係があることを示している。
ｍＡｂＳＣＨ９４．０３用量の力価測定及びＣＮＳミエリン再形成
初期の処理実験に対して、ｉｖ注入用に２５mg/kg及びｉｐ注入用に２５０mg/kgの合計ｍＡｂ用量が経験的に選ばれた。用量応答特性を評価するために及びミエリン再形成を促進するのに必要とされるｍＡｂの最低量を求めるために、慢性的に感染したマウスをＳＣＨ９４．０３の種々のｉｐ用量で処理した。ミエリン再形成病変の数（データは示されていない）及びミエリン再形成の全面積（図５）の双方が多量のＳＣＨ９４．０３で顕著に増加した。ミエリン再形成を表２に記載されるように定量した。データは、ｍＡｂ用量あたり平均値４〜５マウスであり、最終累積用量をグラフに示した。ＳＥＭは、平均値の３５％を平均した。処理グループ間に脱髄病変の数又は脱髄面積の一方向ＡＮＯＶＡによって評価された統計的差がなく、全てのマウスにおいて同様の程度の疾患を示した。脱髄病変の数及び病変面積は、１０００μgグループに対して３３．２±７．５及び１．２５±０．４３、１００μgグループに対して３１．８±８及び１．１１±０．３１、１０μgグループに対して２３．８±３．４及び０．５４±０．１４及びバッファーのみのグループに対して２９．０±６．５及び０．７４±０．２０（グラフには０用量点として表されている）であった。１００μgの対照ＩｇＭ（ＭＯＰＣ１０４Ｅ）で処理したマウスは、バッファーのみで処理した対照マウスと同様のミエリン再形成評点を有した。ｍＡｂＳＣＨ９４．０３の用量とＣＮＳミエリン再形成間の正の相関は、ＣＮＳ疾患の重篤度を考慮すると特に著しかった。ＣＮＳ修復がミエリン再形成を示す病変面積の率として表される場合には、１０００μg、１００μg又は１０μgのＳＣＨ９４．０３の全用量で処理したマウスは、対照マウスより各々６倍、５倍又は４倍以上のミエリン再形成を有した（図５）。１０μg程度の少量のＳＣＨ９４．０３ｉｐ（０．５mg/kg）を投与したマウスは、ＣＮＳミエリン再形成亢進の証拠を示した。これらのデータから、ｍＡｂＳＣＨ９４．０３とＣＮＳミエリン再形成が正の用量応答関係を有すること及び非常に少量のｍＡｂがミエリン修復を促進するのに必要であることが示された。
ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２の抗原特異性
ｍＡｂＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２を非感染マウスの脾細胞から生成し非感染マウスからのＳＣＨに対してスクリーンしたが、ｍＡｂがＴＭＥＶキャプシドタンパク質と反応するか或いは試験管内でウイルス感染力を抑制するかを直接評価した。ウェスタンブッロ法により（図６）、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は慢性的に感染したマウスからの血清或いは精製ＴＭＥＶに感染したウサギからのポリクローナルＩｇＧによって認識されたＴＭＥＶタンパク質と反応しなかった(Rodriguez, M.ら，Ann. Neurol., 13:426-433 (1983))。対照模擬感染Ｌ２細胞からの溶解物のウェスタンブロットは、各々３２ｋＤａ及び４３ｋＤａの慢性的に感染したマウスからの血清及びポリクローナルウサギ抗ＴＭＥＶＩｇＧと単一バンドを示したが、ＳＣＨ９４．０３又はＳＣＨ９４．３２との反応性を示さなかった。
更に、５μg/mlまでのＳＣＨ９４．０３或いはＳＣＨ９４．３２によるＴＭＥＶ感染力の顕著な抑制は、慢性的に感染したマウスからの血清の１：３４，０００希釈液で５０％中和が観察される分析条件下で観察されなかった。これらの結果から、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２の治療効果がウイルスの直接抑制によるものでないことが示された。
始めにｍＡｂＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２によって認識された抗原を確認するために、グリア（ラットＣ６、マウスＧ２６−２０、ヒトＵ３７３ＭＧ及びＵ８７ＭＧ）、神経（ヒト神経芽細胞腫）、線維芽細胞（マウスＬ及び３Ｔ３）、上皮（ヒトＳＣＣ−９がん腫）及びリンパ球（マウスＣＴＬＬ２）起原由来の種々の細胞系を染色した。両ｍＡｂは、試験した細胞系全ての内部抗原を染色し、これらのｍＡｂによって認識されたある一定の抗原は、試験管内でユニークな種類の細胞に制限されないことが示された。ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２の治療効果がＣＮＳ特異的相互作用によるものであるという仮定に基づいて、ラットグリア細胞系５．５Ｂ８を用いてＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２による培養細胞の免疫染色を更に調べた。この不死化グリア細胞系は、ＭＢＰ及び２′，３′−環状ヌクレオチド３′−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）の発現及びグリア線維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）及びｍＡｂＡ２Ｂ５及びＯ４によって認識された脂質又はタンパク質の低いが検出可能な発現によりａｃ及びアストログリア細胞双方の表現型特性を有する（Bozyczko, D.ら，Ann. NY Acad. Sci., 605:350-353 (1990)）。ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は、５．５Ｂ８細胞について表面決定基及び細胞質決定基の双方を認識した。表面染色は、平坦な形態学的に分化した細胞の層の上にある小細胞に最も著しかった（図７Ａ）。表面染色は、生細胞についてフローサイトメトリーで確認された。内部抗原を露出させるために脱水又は非イオン清浄剤によって細胞膜の透過性を上げると、染色パターンがかなり変わった（図７Ｂ）。細胞質染色は、繊維状であり、細胞突起に伸びた密度の濃い周辺核網目構造を有した。このパターンは、中間フィラメント細胞骨格タンパク質ビメンチンの染色パターンに密接に似ている。これらのデータから、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は神経系由来の細胞に制限されない抗原を認識するがグリア細胞の表面決定基及び細胞質決定基双方を認識することが示された。
凍結したマウス、ラット及びヒト組織の免疫組織化学染色から、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２がＣＮＳ特異的ｍＡｂでなくむしろ多臓器反応性を示すことが確認された。両ｍＡｂは、脳、脊髄、視神経、心臓、肝臓、腎臓、胃及び小腸並びに骨格筋を含む試験した主要臓器を全て免疫染色した。しかしながら、臓器内の細胞全部が染色されず、原位置細胞学的特異性を示した。ＣＮＳ内では、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は主に血管、新生児の小脳、脳室周囲及び脳幹の白質に多く含むグリア細胞の形態学的特徴を有する上衣細胞及び星状細胞（図７Ｃ）及び新生児及び成体両方の視神経を染色した。ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２に陽性の同様のグリア細胞は、解剖したヒト脳組織、特に灰白質連結点に見られた（図７Ｄ）。同じ免疫染色結果は、ｍＡｂＳＣＨ９４．３２でも得られた。対照ＩｇＭ（ＭＯＰＣ１０４Ｅ）による免疫染色は、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２で免疫染色した試料及び組織構造の全てに負であった。
“自然”又は“生理的”自己抗体と呼ばれる自己抗体の全ファミリーの同定及び確認は、自己免疫及び自己反応性の伝統的観点に影響した。他のイソタイプも同定されたが典型的にはＩｇＭである、多く実験した自然自己抗体は、細胞骨格タンパク質、表面タンパク質、核酸、リン脂質、リポポリサッカリドのような細菌抗原及び種々の化学ハプテンを含む広範囲の抗原に反応性である(Avrameas & Ternynck, Mol. Immunol., 30:1133-1142(1993))。自然自己抗体は、同様のイディオタイプの発現を含み病原性自己抗体によって発現されるものがある多くのイディオタイプの交差反応性又は“結合性”及び他の抗体上で発現した共通イディオタイプに対する反応性を共有する。分子分析は、自然自己抗体が典型的には変異しない生殖系列免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子でコードされ、体細胞変異があるとしても少なく、特に多くの外因性抗原に曝露されなかった新生児動物においてＩｇレパートリーの実質的画分を表すことを示した。
自然自己抗体の機能は、なぞのままである。生化学及び分子特性に基づいていくつかの仮説が提案された。これらには、（１）老化又は損傷組織のクリアランス、（２）病原曝露とＡｇ特異的免疫応答間の遅滞期の免疫学的防禦の一次系を与えること、（３）潜在的病原性自己免疫応答から自己抗原を遮蔽すること、（４）イディオタイプ網目構造を介して新生児免疫レパートリーの成形を含む免疫モデュレーション及び（５）胸腺におけるＴ細胞に提案された過程と同様の骨髄におけるＢ細胞の正の選択に関与が含まれる。
抗体ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２が自然自己抗体であるという仮定を試験した。ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２の抗原反応性を確認するために、免疫組織化学及び免疫細胞化学、ウェスタンブロット法、固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びＩｇ可変部配列決定を含むいくつかの生化学及び分子分析を用いた。下に記載されるように、全ての生化学分析に対してＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２は区別できなかった。更に、ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２はＩｇ可変部配列を同定し、同じｍＡｂであることが確認された。
ＳＣＨ９４．０３が中枢神経系におけるミエリン再形成を刺激することができる潜在的機序は、ミエリン形成、主に乏突起膠細胞又はその未熟な前駆体に関係した細胞の増殖及び／又は分化を刺激するものである。即ち、ＳＣＨ９４．０３が種々の細胞の表面を染色するかを試験した。不死化細胞を用いて、ＳＣＨ９４．０３が２種類のグリア細胞系、５．５Ｂ８（図７Ａ）及び２０．２Ｅ１１を染色するが他のいくつかのグリア細胞系（１０．１Ａ３、２０．２Ａ４０、Ｃ６、Ｇ２６−２０）、神経芽腫細胞系（Ｂ１０４）、２種類の繊維芽細胞系（Ｌ２、Ｃｏｓ−１）又は２種類の筋芽細胞腫系（Ｇ８、Ｌ６）の表面を染色しないことが求められた。同様の結果が動物組織から単離し培養内で増殖した細胞で得られた。ＳＣＨ９４．０３は、乏突起膠細胞の表面を染色したが、アストログリア細胞、小膠細胞、シュワン細胞、筋芽細胞又は繊維芽細胞を染色しなかった。
ウェスタンブロット法でＳＣＨ９４．０３とグリア及びリンパ系細胞系からのタンパク質及び脳、肝臓及び腸からの組織溶解物との反応性も評価した。ＳＣＨ９４．０３は、試験した全ての細胞及び組織からの多重バンドと反応し、５０ｋＤａ、９５ｋＤａ、１２０ｋＤａ及び＞２００ｋＤａのバンドに対して反応性が顕著であった。これらのタンパク質バンドの正確な同一性は求められなかった。
ＳＣＨ９４．０３といくつかの精製タンパク質自己抗原との反応性を固相ＥＬＩＳＡにより求めた（図８Ａ〜図８Ｃ）。ＳＣＨ９４．０３は、ＲＢＣ抗原スペクトリンに対して強い反応性を示し、ヘモグロビン、アクチン、チューブリン及びビメンチン及びチログロブリンに対しても一致した反応性を示したが、スペクトリンよりも定性的程度が低かった。我々の分析条件下で、ミオシン、トランスフェリン、アルブミン、リゾチーム又はミエリン塩基性タンパク質との反応性は観察されなかった。他の６種のモノクローナル又は骨髄腫ＩｇＭ対照ＸＸＭＥＮ−ＯＥ５（図８Ｂ）、Ａ２Ｂ５、ＭＯＰＣ１０４Ｅ、ＴＥＰＣ１８３、０１及びＣＨ１２（図８Ｃ）も試験し、試験した抗原のいずれとも反応性は観察されなかった。
ＳＣＨ９４．０３のモノクローナル性を確認するために、ＳＣＨ９４．０３の１８サブクローン（ＳＣＨ９４．０３及びＳＣＨ９４．３２親分子から各々９種類）の多反応性を固相ＥＬＩＳＡにより試験した。１８サブクローンは全て、親ＳＣＨ９４．０３と同一のタンパク質抗原のパネルを有する反応性パターンを示した。ＳＣＨ９４．０３の多反応性がＦａｂ領域を介するという結論を更に支持するために、我々はＦ（ａｂ）2′フラグメントを作成し、タンパク質抗原との反応性をＥＬＩＳＡで評価した（図９）。ＳＣＨ９４．０３（ａｂ）2′フラグメントは、ＩｇＭ全分子と同様の多反応性を示した。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合した化学ハプテンのパネルを構築し、ＳＣＨ９４．０３反応性を固相ＥＬＩＳＡで評価するために用いた（図１０Ａ〜図１０Ｃ）。ＳＣＨ９４．０３は、フルオレセイン（ＦＬ）及び４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル酢酸（ＮＰ）に対して強い反応性、フェニルオキサゾロン（ＰｈＯｘ）に対して中程度の反応性及び２，４，６−トリニトロフェニル（ＴＮＰ）及びｐ−アゾフェニルアルソン酸（Ａｒｓ）に対して弱い反応性を示した。ｐ−アゾフェニルトリメチルアンモニウム（ＴＭＡ）、ｐ−アゾフェニルホスホリルコリン（ＰＣ）又はキャリヤータンパク質ＢＳＡとの反応性は、検出されなかった。対照ＩｇＭ（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）は、以前に報告されているＣＨ１２とＴＭＡとの反応性及びＡ２Ｂ５とＮＰとの反応性を除いて試験したハプテンのいずれにも顕著な結合を示さなかった。
ＳＣＨ９４．０３のＩｇ軽鎖（Ｌ）（配列番号１及び２）及び重鎖（Ｈ）（配列番号６及び７）が生殖系列Ｉｇ遺伝子でコードされているかを更に試験した（図１１）。ＳＣＨ９４．０３からの軽鎖可変部（ＶL）及び結合部（ＪL）ヌクレオチド配列（配列番号１及び２）は、以前に発表された生殖系列ＶK１０（配列番号４）及びＪK１（配列番号５）遺伝子の配列と９９．４％同一性を有し、ＶL及びＪL領域双方の３′端の２つのサイレント変化だけがあった。ＳＣＨ９４．０３ＶH領域（配列番号６及び７）ヌクレオチド配列は、以前に発表された生殖系列ＶH２３配列（配列番号１０）と同一であり、ＪH領域配列は、発表された生殖系列ＶH２（配列番号１１）とＪ領域の５′の１ヌクレオチドだけ異なり、多様性（Ｄ）領域は、生殖系ＤＦＬ１６．１遺伝子由来の１５の相接するヌクレオチドを含んだ。既知の生殖系Ｖ又はＤ領域遺伝子に対応せず、おそらくＶ−Ｄ−Ｊ組換え中に酵素末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによって挿入された非コード（Ｎ）ヌクレオチドを表すＶ−Ｄ連結部に８ヌクレオチド及びＤ−Ｊ連結部に１ヌクレオチドがあった。ＳＣＨ９４．０３の重鎖における生殖系遺伝子からの唯一の変化は、Ｖ−Ｄ或いはＤ−Ｊ連結部に存在し、体細胞変異より不正確な結合のＮヌクレオチド或いはその結果を表す。更に、ＳＣＨ９４．０３の軽鎖及び重鎖可変部は共にＢ細胞リンパ腫ＣＨ１２によって産生したＩｇＭと多くの配列類似性を示した（配列番号３、８及び９）（図１１）。
ＳＣＨ９４．０３は自然自己抗体である
これらの予備的抗原反応性結果は、ＳＣＨ９４．０３が自然自己抗体であることを示している。この結論は、ＳＣＨ９４．０３が中枢神経系においてミエリン再形成をどのように刺激するかに関する機序を直ちに示すものではないが、自然自己抗体の重要な生理的機能を示している。正常な生理学で或いは組織損傷及び以前に隔離された抗原のその後の放出に対する応答で産生される自己抗体は、損傷組織における修復を促進するのに活発に関与する。自然自己抗体の以前に提案された機能と一致して、この活発な関与は、損傷した組織の除去を促進すること、自己抗原を遮蔽し、もって、激しい病原性自己免疫応答を防止すること、組織破壊を実際に生じた免疫応答をモデュレートし、もって、正常な内在性組織修復を起こさせるか又は修復過程に関係する細胞を直接刺激することを可能にすることである。
従って、本明細書に記載された働きの結果として、ここでは自己抗体を作成すると共に自己抗原結合能をスクリーンした自己抗体もＣＮＳミエリン再形成を促進することが証明される。ＴＭＥＶに慢性的に感染しハイブリドーマからのＩｇＭｍＡｂでｉｖ或いはｉｐ処理したマウスは、ＣＮＳミエリン再形成の詳しい定量的形態学的評価により測定したＣＮＳ修復が対照マウスより著しく多かった。更に、予備的データは、自己抗体、ＳＣＨ９４．０３が実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を罹患した哺乳動物においてミエリン再形成を促進するのに有効であることも示している。即ち、ＳＣＨ９４．０３のような自己抗体が、ＣＮＳ疾患において脱髄の免疫仲介過程を停止するのに重要な役割を果たしていること予想することは妥当なことである。
Ａｂがミエリン再形成を促進する２つの潜在的機序が提案される。第１に、Ａｂは、ウイルス活性のような疾患過程の病原性成分、脱髄を直接誘導する免疫応答又はミエリン再形成を防止する免疫応答を阻害するものである。疾患の成果が組織破壊と修復間の釣り合いに基づく場合には、病原性成分の抑制は生理学的修復応答を優先させることができる。実験的及び臨床的証拠は、この仮定を支持する。自然ＣＮＳミエリン再形成は、ＭＳ患者及びＣＮＳ脱髄及び本明細書に記載されるいくつかの実験的モデルに見られ、対照マウスにおいて自然ミエリン再形成を示す。これにより、ミエリン再形成がミエリン損傷に対する正常な生理的応答であることが示される。更に、ＴＭＥＶに慢性的に感染したマウスを種々の免疫抑制群で処理すると、ミエリン再形成は促進されるが、脱髄を減少せず、ミエリン再形成を阻害する免疫学的成分があることを示している。（Rodriguez, M. & Lindsley, M.D., Neurology, 42:348-357 (1992)）。予備的な免疫学的機能の実験から、ＳＣＨ９４．０３で処理されたマウスが脾臓において対照マウスと比べて同じ数のＢ及びＴ細胞（共にＣＤ４＋及びＣＤ８＋）を有し、マイトジェン及び抗原に対して同様の試験管内脾細胞増殖応答を有しかつＴ細胞依存性及びＴ細胞非依存性抗原の双方に対して匹敵しうるＡｂ応答を開始したことが示された。
第２の仮定は、ある一定ののＡｂが試験管内で証明されたようにおそらくは生体内で乏突起膠細胞増殖及び／又は分化の刺激を介してＣＮＳミエリン再形成を活発に刺激することができるというものである（Diaz, M.ら，Brain Res., 154:231-239 (1978); Raine, C.S.ら，Lab. Invest., 38:397-403 (1979); Lehrer,G.M.ら，Brain Res., 172:557-560 (1979); Bansal, R.ら，J. Neurosci. Res., 21:260-267 (1988); Benjamins, J.A. & Dyer, C.A.,Ann. NY Acad. Sci., 605:90-100 (1990); Dyer, C.A., Mol. Neurobiol., 7:1-22 (1993)）。ｍＡｂＳＣＨ９４．０３は、活発なミエリン再形成を示すヒト及び実験的ＣＮＳ病変の双方の縁に存在することが既知である前駆グリア細胞を直接刺激することができる。また、ＳＣＨ９４．０３は、希突起神経膠系統における細胞の生存又は増殖に重要な因子を放出することができるアストログリア細胞又は他の補助細胞の活性化を介して間接に働くことができる。ミエリン破壊の際に放出された組織成分との原位置でのＡｂ抗原複合体の形成は、Ａｂ仲介ＣＮＳミエリン再形成にも関与することができる。ＳＣＨ９４．０３はＣＮＳ特異的でないが、ｍＡｂによるグリア細胞上の表面抗原及び細胞質抗原双方の認識は、活性な機序の仮説を支持するものである。ＡｂがＣＮＳに直接接近することを必ずしも必要としない免疫モジュレーション仮定と対照的に、ＡｂがＣＮＳミエリン再形成を活発に刺激するという仮定は、ＣＮＳに直接接近するという前提条件を意味する。これは、特に５量体ＩｇＭのような大きな分子に対する血液脳関門の選択透過性の観点と対照的である。しかしながら、ＴＭＥＶ感染又はＭＳのような慢性の炎症状態で、末梢白血球はＣＮＳに移動し、血液脳関門透過性に変化を示す。従って、血清Ｉｇのような大きなタンパク質も、“開放した”内皮を通る受動拡散を介して或いはおそらくは未同定の活性輸送機序を介して入ることができる。
脱髄性疾患の治療
本明細書に記載された実験の結果は、多発性硬化症（ＭＳ）、ＥＡＥ及び関連する他の中枢神経系脱髄性疾患に実用的用途がある。自然ＣＮＳ型ミエリン再形成(“シャドウプラーク”)の稀な例がＭＳに見られ、末梢神経系（ＰＮＳ）型ミエリン再形成が根入口帯近傍の脱髄脊髄プラークにしばしば見られる。乏突起膠細胞は、ＭＳの慢性プラークの中心には稀であるが、不稔性ミエリン再形成と関連のあるプラークの周囲に増殖していると考えられる。ミエリン再形成の過程は、ＭＳに臨床的に観察される自然寛解傾向及び改善と相関するものである。これらの臨床的所見は、新しいミエリン形成がＭＳにおいて可能であることを示している。ｍＡｂを用いることによりＴＭＥＶ誘導脱髄を有するマウスにおいて刺激されたミエリン再形成は、多発性硬化症の治療的用途に有望であるものである。
薄い髄鞘の形態学的再生が機能上の回復にあずかるかの問題は臨床上重要である。コンピュータシミュレーションは、新しいミエリン形成が不適切な薄い髄鞘によってさえインパルス伝導を改善することを示している。正常な有髄線維の軸索膜は高度に分化されるので、跳躍伝導を伝えるためにはナトリウムチャンネルがランビエ絞輪に高密度で存在することが必要である。実験的証拠は、新たに形成された狭窄部がサキシトキシン結合によって示されるように必要な高いナトリウムチャンネル密度を生じることを示している。現在までのデータは、ミエリン再形成が不適切な薄いミエリンによってさえ以前の脱髄した軸索の伝導を改善することを示している。従って、この形態学的現象を促進する方法は、機能上の回復を生じる可能性がある。
本明細書に提示されたデータは、モノクローナル抗体を哺乳動物へ投与すると生体内で中枢神経系軸索のミエリン再形成を刺激することができることをはじめて証明するものである。詳細には、慢性的に感染したＴＭＥＶ感染マウスを１０μg程度の少量のＳＣＨ９４．０３で処理することにより、対照ｍＡｂで処理したマウスと比べてＣＮＳミエリン化の全面積が４〜５倍増加した。
従って、本明細書に記載された実験の結果として、本発明の方法は、脱髄性疾患に罹患したヒト及び家畜を含む哺乳動物を治療するために及びＣＮＳ軸索のミエリン再形成を刺激するために用いられる。本明細書に記載されるように、モノクローナル抗体の有効量は、静脈内（ｉｖ）又は腹腔内（ｉｐ）注入で投与される。抗体の有効量は、治療される哺乳動物のサイズ、疾患の重篤度、投与経路及び治療過程によって変動させることができる。例えば、投与されるｍＡｂの各用量は、約０．５〜約４００mg/kg、好ましくは約０．５〜約２５０mg/kgの範囲とすることができる。１０μg（０．５mg/kg）程度の低い用量がマウスにおいてＣＮＳ軸索のミエリン再形成を促進するのに有効であることを留意することは重要である。ｍＡｂの用量は、投与経路にも依存する。例えば、マウスに投与されるｉｖ用量は０．５mg/kgであり、ｉｐ用量は５．０mg/kgであった。治療過程としては、ｍＡｂの投与回数（例えば、毎日、毎週又は隔週）及び治療期間（例えば、４週間〜４ヵ月）が含まれる。即ち、例えば、多量のｍＡｂは毎日４〜５週間投与されるのに対して少量のｍＡｂは４ヵ月間投与される。
モノクローナル抗体の投与量の有効性は、例えば実施例３に記載するように哺乳動物の全体の外観、哺乳動物の活動度及び哺乳動物の麻痺の程度を含む臨床基準のいずれを用いても評価される。ヒトにおいてミエリン再形成を誘導するのに必要なモノクローナル抗体量の有効性もまた、二重盲検制御試験で評価される。脱髄性疾患からの一定の神経学的損失を有する患者は、モノクローナル抗体又は対照で治療される。定量的生物力学筋試験によって検出される等尺性筋力の改善は、治療上の一次終点として用いられる。
モノクローナル抗体の有効量は、生理的バッファー又は塩類溶液のような適切な薬学的に許容しうる担体と混合されるか又はそれで希釈される。更に、モノクローナル抗体は、マウスｍＡｂの非可変部のヒト抗体ヌクレオチド配列の置換により遺伝的に変えて、例えば“人間化”して免疫原性を減じることができる。
ミエリン再形成を促進する生体内方法のほかに、ＣＮＳ軸索におけるミエリン再形成を刺激する生体外方法も本発明に包含される。例えば、実施例２に記載するように乏突起膠細胞のようなグリア細胞の増殖及び／又は分化を刺激するためにモノクローナル抗体が試験管内で用いられる。次に、これらの外因性グリア細胞が既知の手法を用いて哺乳動物のＣＮＳに導入される。ＣＮＳ軸索のミエリン再形成は、存在する内在性グリア細胞数を増やすことにより亢進される（乏突起膠細胞のようなグリア再形成はミエリン生産に重要な役割を果たしている）。
グリア細胞を生産するか又は混合培養物（例えば、ラット視神経細胞又はラット脳細胞培養物）からのグリア細胞の増殖を刺激する試験管内方法も本発明に包含される。例えば、グリア細胞を含むラット視神経又はラット脳から得られた細胞は、細胞の発育を促進するのに十分な条件下に混合培養物として培養される。次に、ＳＣＨ９４．０３のようなＣＮＳ軸索のミエリン再形成を促進することができるｍＡｂの有効量が、細胞の混合培養物に加えられ、細胞の発育及び増殖に十分な条件下で維持される。ｍＡｂは、混合培養物においてグリア細胞の増殖を刺激する。即ち、ｍＡｂの存在下に培養されたグリア細胞の増殖は、ｍＡｂを存在させないで発育させたグリア細胞の増殖に相対して高められる。
下記の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、決して限定するものではない。
実施例１：モノクローナル抗体生産、スクリーニング及び精製
動物
不完全フロイントアジュバント中脊髄ホモジェネート（ＳＣＨ）を２回注入した２匹のＳＪＬ／Ｊマウス（Jackson Laboratories、メイン州、バーハーバー）の脾臓を、融合及びハイブリドーマ生産用Ｂ細胞源として用いた。脾細胞をポリエチレングリコールを用いてＮＳ−１骨髄腫細胞と融合し、生存可能な細胞融合物をヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地で選択し、（Katzmann, J.A.ら，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78:162-166 (1981)）に記載されたように限界希釈でクローン化した。
ＥＬＩＳＡ
生存可能なＩｇ産生クローンからのハイブリドーマ上清について、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）でＳＣＨに対する結合をスクリーンした。ｍＡｂをスクリーニングするために次の抗原を用いた：炭酸塩−重炭酸塩バッファー（ｐＨ８．５３）中で再構成したＳＣＨ−（１０μg）、ＰＢＳに溶解したＭＢＰ−（１μg）、無水アルコールに溶解したＧＣ（１μg）、水に溶解したＰＬＰ（１μg）。ＰＬＰは、ＰＬＰに対する固相免疫検定を発表したDr. W. Macklin(UCLA)により提供された。ＳＣＨ、ＭＢＰ又はＧＣＥＬＩＳＡに対して、ＩｍｍｕｎｏＩＩプレートを４℃で一晩インキュベートした調製抗原（１００μl/ウェル）で被覆した。翌日ウェルをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ＋１％血清を用いて室温で１時間阻止した。プレートをＰＢＳで再び洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで希釈した一次Ａｂの連続希釈液を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％トゥイーンで洗浄し、アルカリ性ホスファターゼに結合した適切な二次Ａｂ（ＰＢＳ０．１％ＢＳＡ中１：１０００）を加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ０．０５％トゥイーンで洗浄し、基質（５mlのジエタノールアミンバッファー中シグマ１０４ホスファターゼサブストレートタブレット）を３０分間加えた。反応を５０μlの１N ＮａＯＨで終結させた。プレートをダイナテックＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。
腹水生成
治療実験に選ばれたハイブリドーマを腹水生成のためにプリスタン処理ＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。ハイブリドーマをＩｇＭ生産のために１０％ウシ胎児血清で補足したＲＰＭ１−１６４０培地中で増殖した。ＩｇＭｍＡｂを初期伝達実験用に硫酸アンモニウム沈殿及びセファクリルS-400 HR(Sigma)カラムによるゲルろ過或いは後期伝達実験用にリアクチ−ゲル6Xマトリックス（Pierce、イリノイ州、ロックフォード）に結合したヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異的；Jackson Immunoresearch，ペンシルバニア州、ウェストグローブ）を用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
実施例２：モノクローナル抗体の試験管内試験
グリア細胞増殖を促進するｍＡｂの選択
試験管内でグリア細胞を増殖するｍＡｂの促進能を試験した。ラット脳又は視神経から単離したグリア細胞を、ファルコンマイクロテストＩＩプレートに０．１mlのＤＭＥ中１ウェルあたり２×１０4細胞の濃度で播種した。全血清（ＳＣＨ、ＩＦＡ、ＭＢＰ、ＧＣ、ＭＢＰ／ＧＣ、ＰＢＳ又はＰＬＰ）、精製Ｉｇ又はｍＡｂを連続希釈し、０．１mlの分割量を細胞に加え、３回の実験で分析した。３日後3Ｈチミジンを加え（１μCi/ml）、１７時間後に自動細胞ハーベスター（Mash II Harvester）を用いて細胞を収集した。増殖している細胞（即ち、アストログリア細胞、前駆グリア細胞、マクロファージ）の同一性を証明するために、3Ｈチミジンに曝露した後に選ばれた培養物を、細胞の種類に特異的な適切なＡｂとインキュベートした後にＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ法を続けた。ハンカー・ヤテス試薬の反応後、スライドをイルフォードＫ２核エマルジョンに浸漬し、４℃で４日間曝露し、展開した。
ｍＡｂ９４．０３及び９４．３２による混合ラット視神経脳培養物の増殖の誘導
生後１〜２日のラットをエーテル殺した。注意深く解剖して視神経を目の視神経十字から取り出した。神経を２mlのＤＭＥＭを含む遠心管に移した。等量の０．２５％トリプシンを加え、水浴中で４５分間３７℃までインキュベートした。０．２mlのＦＣＳを加えてトリプシン処理を終結させた。神経を滅菌した針と注射器（ゲージno.21）に通過させ、次に、１４００rpmで１０分間遠心した。細胞数を調整してＤＭＥＭ＋０．５％ＦＣＳ中５×１０5細胞／１００μlの２４ウェルトレー中の培地の濃度を得た。１２〜１６時間後、実験プロトコールにより適切な抗体又は増殖培地を加えた。
生後１〜２日のラットの脳を取り出し、１０mMＨＥＰＥＳバッファーを含むハンク液（ＨＢＳＳ／Ｈ）、１脳あたり約１〜２mlに入れた。脳幹、小脳及び中脳を捨てるが、前脳を曲がった注射器でミンチにした。更に、組織を１０mlのピペットに繰り返し通過させて破壊し、５０mlの三角管に移した。組織浮遊液を回転シェーカー（７５rpm）により３７℃で３０分間振盪した。トリプシンを最終濃度０．１２５％まで加え、その浮遊液を更に６０分間振盪した。ＦＣＳ（１０％）を加えることによりトリプシン消化を停止させた。細胞浮遊液を１２０μm及び５４μmのNytexに連続して通過させ、遠心し、１０％ＦＣＳを含む無血清培地に再懸濁し、５４μm Nytexでろ過した。無血清培地は、３．７g/l重炭酸ナトリウム、６．０g/lグルコース、２mMＬ−グルタミン、０．１nM非必須アミノ酸、５μg/mlインスリン、５μg/mlトランスフェリン、５ng/ml亜セレン酸塩、１００U/mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシンを含むＤＭＥＭとした。細胞を計数し、被覆されていない組織培養フラスコ又はプレートに５×１０4細胞／cm2で入れ、５％ＣＯ2中３７℃で培養した。培地を７２時間後に変え、その後４８時間毎に変えた。培養開始の８日後に、培地を吸引し、種々の補足物（例えば、抗体）を含むＳＦＭで置き換えた。ほとんどの実験に対して、細胞を更に４８時間増殖した後に収集した。最後の１８２４時間の培養に対して細胞を[3Ｈ]チミジン（５μCi/ml）で短時間標識した。
ウェスタンブロット法
抗原を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）試料バッファー中１００℃で加熱することにより変性及び可溶化した。試料を４．７５％及び１２．０％アクリルアミドを含有する濃縮用及び分離用ゲルにより２００ボルトで電気泳動した。電気泳動後、ゲルとニトロセルロース膜をトランスファバッファー（２５mMトリス、１９２mMグリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．１〜８．３）中で３０分間平衡化した。全段階を室温で行った。ゲルを、バイオ−ラドミニトランス−ブロット装置を用いて１００Vで１時間或いは３０Vで一晩エレクトロブロッティングした。ニトロセルロース膜を細片に切断し、０．０３％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（１００mMＮａＣｌ、５０mMＴｒｉＧ、ｐＨ７．６）で３回洗浄した。ニトロセルロース片を２〜４時間阻止し（３％脱脂乳及び０．０３％トゥイーン２０を含むＴＢＳ）、３回洗浄し、一次Ａｂ又は抗血清（阻止バッファーで希釈した）と４時間又は一晩インキュベートした。一次Ａｂインキュベーション後、細片を３回洗浄し、ビオチン或いはアルカリ性リン酸塩標識二次Ａｂ（阻止バッファーで希釈した）で２時間インキュベートし、３回洗浄し、ビオチン系が用いられる場合にはアルカリ性ホスファターゼ標識ストレプタビジン（阻止バッファーで希釈した）と２時間インキュベートした。ニトロセルロース片を４回洗浄し（最後の洗浄はトゥイーン２０を含まないＴＢＳで）、基質溶液（１００mMＨａＣｌ、１００mMＴｒｉＧ、５mMＭｇＧｌ２、ｐＨ９．５中０．１６５mg/mlＢＣＩＰ及び０．３３mg/mlＮＢＴ）と十分に発色するまで（約１０〜１５分）インキュベートした。５mMＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えることにより反応を停止させた。
細胞系又は混合脳培養物を１×ＳＤＳ還元試料バッファー（２．３％ＳＤＳ、１０％２−ＭＥ、０．１２５Mトリス、２０％グリセロール）に溶解し、８５℃まで１５分間加熱した。溶解物を２１〜２７ゲージ針に繰り返し通過させて核酸を剪断した。溶解物のタンパク質を１２％アクリルアミド還元ゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移し、以前に記載された種々の抗体でブロットした。
実施例３：モノクローナル抗体を用いるＣＮＳミエリン再形成の促進
ウイルス
ＢＨＫ細胞中８継代後のＴＭＥＶのＤＡ株を、Drs. J. Lehrich & B. Arnasonから入手した。そのウイルスを１細胞あたり０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染多重度で更に４回継代した。培養物を凍結−解凍するのに続いて音波処理することにより細胞関連性ウイルスを遊離させた。溶解物を遠心分離により清澄化し、−７０℃において分割量で保存した。その後の実験は全て１２継代ウイルスを用いる。このウイルス単離物は、前角細胞を破壊せずに白質病変を引き起こすものである。
試験管内ＴＭＥＶ中和分析
ウイルスプラーク分析を以前に記載されたように行った（Patick, A.K.ら，J. Neuropath, Exp. Neurol., 50:523-537 (1991)）。中和を評価するために、ＴＭＥＶ（２００ＰＦＵ／ml）の分割量を種々の濃度のＡｂと室温で１時間インキュベートした後、集密的Ｌ２細胞にプレーティングした。正の対照としては、我々は、ＴＭＥＶに慢性的に感染した感受性マウスからの血清を用いた。上記分析条件下に１：３４，０００の血清希釈液が５０％中和を得、これは、全血清Ｉｇ濃度を１５mg/ml、ＴＭＥＶ特異的画分を５％と仮定すると、２０ng/mlのＴＭＥＶ特異的Ａｂに対応する。
脱髄プロトコール
Jackson Laboratory、メイン州、バーハーバーからの４〜６週齢の雌ＳＪＬ／Ｊマウスに脱髄を誘導した。マウスに２×１０5プラーク形成単位のＤＡウイルスを１０μl量で脳内に接種した。ＴＭＥＶに慢性的に感染した（感染が４〜６ヵ月続く）マウスを治療グループにランダムに割り当てた。
治療プロトコール及び臨床疾患評価
慢性的に感染させたマウスにｍＡｂを毎週２回４〜５週間腹腔内（ｉｐ）或いは静脈内（ｉｖ）注射した。各治療注射において、マウスを次の３つの基準で臨床的に評価した：外観、活動度及び麻痺。各基準の評点を０（疾患なし）〜３（重篤な疾患）の範囲とした。外観の場合、１は外皮の最小の変化を示し、２は中程度の変化（みすぼらしい外観）を示し、３は激しい変化（失調及び染色した外皮）を示した。活動度の場合、１は自発的運動の低下（最小の運動失調）を示し、２は中程度の緩慢（最小の自発的運動）を示し、３は激しい緩慢（自発的運動なし）を示した。麻痺の場合、０．５は痙攣性四肢を示し、１は麻痺した四肢を示し、１．５は２肢以上の痙攣性四肢を示し、２は２肢の麻痺した四肢（歩行が不可能）を示し、２．５は直立する応答を示さず、３は３又は４肢の麻痺した四肢（瀕死）を示した。各マウスの全評点は、各基準からの累積合計とした（最大９）。臨床評点は序数であるが基数ではないので、臨床疾患を評価する臨床評点の変化を用いた。臨床評価データは、ミエリン細胞の形態学的評価の完了後まで示さなかった。
光学及び電子顕微鏡写真の標品及びミエリン再形成の評価
光学及び電子顕微鏡切片の調製及びミエリン再形成の形態学的評価を行った。簡単に言えば、治療したマウスをペントバルビタール（０．２mgｉｐ）で麻酔し、心臓穿刺で瀉血させ、トランプ固定液（４％ホルムアルデヒド及び１．５％グルタルアルデヒドを含む１００mMリン酸塩バッファー、ｐＨ７．２）で心臓内灌流により殺した。脊髄全体を脊柱管から注意して取り出し、１mmの横ブロックの切片にした。３ブロック毎に１％四酸化オスミウムに後固定し、アラルダイト（Polysciences、ペンシルバニア州、ワーリントン）に埋め込んだ。各ブロックからの１ミクロン切片を切断し、ｐ−フェニレンジアミンで染色した。各切片について、ツァイス相互作用ディジタル分析システム（ＺＩＤＡＳ）及びツァイス写真用顕微鏡（Carl Zeiss Inc.、ニューヨーク州、トルンウッド）に取り付けたカメラルーシダを用いて定量した。軸索直径に相対する異常に薄い髄鞘をＣＮＳミエリン再形成の基準として用いた。各マウスからの１０脊髄切片を試験した。これは、１マウスあたり８〜９mm2の試験白質に相当した。偏りを避けるために、スライドをコード化し、治療グループの知識なしで定量化を行った。
ミエリンの厚さ及び軸索の直径の測定及びミエリン化軸索の定量化
プラスチック包埋脊髄切片からの正常な軸索及びミエリン再形成軸索の電子顕微鏡を浜松ビデオカメラで映し、ディジタル化し、ＩＢＡＳ２０００画像分析システム（Kontron，ドイツ、ミュンヘン）を用いて分析した。髄鞘を含む及び含まない軸索断面積を測定し、軸索の直径及び髄鞘の厚さを求めるために等価な円計算を用いた。ミエリン化軸索の定量化に対して、プラスチック包埋脊髄切片からの病変のミエリン化軸索数を、アキシオホト顕微鏡（Carl Zeiss Inc.）に取り付けた上記の分析システムを用いて計数した。ｍＡｂＳＣＨ９４．０３、対照ＩｇＭ又はバッファーのみで処理したマウスからの脊髄切片の１７ミエリン再形成病変及び１５脱髄病変を分析した。これは、０．６mm2のミエリン再形成面積及び０．８mm2の脱髄面積に相当した。脱髄した病変の選択基準は、最小修復を含む実質的な脱髄の存在であるが、ミエリン再形成病変は、病変全体のほとんど完全なミエリン再形成の存在に基づいて選択した。
免疫染色
ラット５．５Ｂ８グリア細胞を、１．５g/LＤ−グルコース、３０nMＳｅＯ2、１５nMトリヨードチロニン、１０ng/mlビオチン、１００μM ＺｎＣｌ2、５０μg/mlゲンタマイシン及び１０％ウシ胎児血清で補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）のポリＤ／Ｌリシン被覆チャンバスライド上で増殖した。染色段階は全て室温で行った。表面染色の場合、スライドをＰＢＳで簡単にすすぎ、細胞をＰＢＳ中１％ホルムアルデヒドで１０分間軽く固定してその後の染色段階中の細胞脱離を防止した。細胞質染色の場合、スライドをＰＢＳで２回すすぎ、１時間風乾するか或いはＰＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００とインキュベートした。細胞を２％ＢＳＡ中３０分間阻止し、洗浄し、対照ＩｇＭ又はｍＡｂＳＣＨ９４．０３（１％ＢＳＡ中１０μg/ml）と１時間インキュベートし、ＰＢＳで広範囲にわたって洗浄した。４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した後、スライドをフルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇＭ（Jackson Immunorsearch）と１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、２５μg/ml１，４−ジアゾビシクロ−［2.2.2］−オクタン（ＤＡＢＣＯ）を含む１００mMトリス、２５％グルセロール、ｐＨ８．５中１０％MOWIOL▲Ｒ▼（Hoechst）とカバーグラスで覆って退色を防止し、暗所で一晩放置した。凍結組織切片の場合、新たな生後のラット、成体マウス又は剖検ヒト皮質脳組織を液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結した後、液体窒素保存した。凍結切片（１０μm）をゲル化した顕微鏡ガラススライドに移し、４〜８時間風乾し、−７０℃で保存した。免疫染色前に、スライドを室温に一晩おいた。免疫ペルオキシダーゼ染色プロトコールは、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ試薬（Vector Laboratories、カリフォルニア州、バーリンガム）を用いる上記のものと同様であり、０．０３４％Ｈ２Ｏ２を含む５０mMトリス、ｐＨ７．６中１．５mg/mlハンカー・ヤテス試薬（ｐ−フェニレンジアミン−プロカテコール）で展開し、マイエルヘマトキシリンで対比染色し、パーマウント（Fischer Scientific、ペンシルバニア州、ピッツバーグ）に取り付けた。
データ分析
治療グループ間のミエリン再形成を比較するために、変更した累積階級和試験(O'Brien, P.C., Biometrics, 40:1079-1087 (1984))を用いた。この統計的試験は、治療上の有効性のいくつかの数字と無関係なパラメーターを考慮し、臨床試験の効能評価に通常用いられる。ミエリン再形成の個々のパラメーターを比較するために対になっていない標準のスチューデントのｔ検定を用いて平行して分析して等価な結果を得た。疾患の重篤度及び相関有意性の比較を、１方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって求めた。統計的分析をシグマスタット（Jandel Scientific、カリフォルニア州、サンラファエル）或いはEXCEL（Microsoft Corporation、ワシントン州、レドモンド）ソフトプログラムで行った。計算値は、ｐが＜０．０５である場合に有意とみなした。
等価物
当業者は、本明細書に記載される個々の実施態様に対する多くの等価物を通常の実験を超えることなく用いて認識し、確認することもできる。そのような等価物は、請求の範囲に包含されるものである。
配列表
（1）一般的な情報：
(i)出願人：医学教育研究のためのメイヨー財団
(ii)発明の名称：中枢神経系ミエリン再形成を促進するモノクローナル抗体
(iii)配列の数：１１
(iv)住所：
（A）受取人：ハミルトン，ブルック，スミシー＆レイノルズ，Ｐ．Ｃ．
（B）町：ツーミリチアドライブ
（C）市：レキシントン
（D）州：マサチューセッツ
（E）国：米国
（F）郵便番号：０２１７３
(v)コンピュータ判続形式：
（A）ミディアムタイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０，バージョン＃１．２５
(vi)現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
(vii)先願データ：
（A）出願番号：米国出願第０８／２３６，５２０号
（B）出願日：１９９４年４月２９日
(viii)弁理士／代理人情報：
（A）名前：グラナハム，パトリシア
（B）登録番号：２７，２２７
（C）参照／整理番号：ＭＭＶ９２−０１ＰＣＴ
(ix)伝送の情報：
（A）電話：６１７−８６１−６２４０
（B）テレファクス：６１７−８６１−９５４０
（2）配列番号１の情報：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３９３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ix)特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．３９３
(xi)配列：配列番号１：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：１３１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号３：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：２８５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号４：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号５：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：４２９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ix)特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．４２９
(xi)配列：配列番号６：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：１４３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号７：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３６６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(ix)特徴：
（A）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．３６６
(xi)配列：配列番号８：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：１２２アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号９：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：３５１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号１０：
(i)配列の特徴：
（A）長さ：４５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
(xi)配列：配列番号１１
Claims (28)
- 哺乳動物において中枢神経系軸索のミエリン再形成を刺激するための医薬組成物であって、ＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の有効量を含有する医薬組成物。
- 静脈内投与形態にある請求項１記載の医薬組成物。
- 腹腔内投与形態にある請求項１記載の医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗体の投与量が０．５mg/kg〜４００mg/kgである請求項１記載の医薬組成物。
- 哺乳動物において中枢神経系軸索内のグリア細胞の増殖を刺激するための医薬組成物であって、ＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の有効量を含有する医薬組成物。
- 静脈内投与形態にある請求項５記載の医薬組成物。
- 腹腔内投与形態にある請求項５記載の医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗体の投与量が０．５mg/kg〜４００mg/kgである請求項５記載の医薬組成物。
- 哺乳動物において中枢神経系の脱髄性疾患を治療するための医薬組成物であって、ＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の有効量を含有する医薬組成物。
- 前記哺乳動物が多発性硬化症に罹患したヒトであるか又はウイルス性脱髄性疾患又は中枢神経系の後神経性疾患に罹患したヒト又は家畜である請求項９記載の医薬組成物。
- 静脈内投与形態にある請求項９記載の医薬組成物。
- 腹腔内投与形態にある請求項９記載の医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗体の投与量が０．５mg/kg〜４００mg/kgである請求項９記載の医薬組成物。
- 前記哺乳動物がサイラーマウス脳脊髄炎ウイルスのＤＡ株に感染したマウスである請求項９記載の医薬組成物。
- 中枢神経系軸索のミエリン再形成を刺激することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号。
- グリア細胞を生産する試験管内方法であって、
ａ）グリア細胞を細胞増殖に十分な条件下で培養して、グリア細胞培養物を生産する工程；
ｂ）該グリア細胞にＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の有効量を導入して、モノクローナル抗体処理グリア細胞培養物を生産する工程；
ｃ）工程ｂ）の培養物をモノクローナル抗体処理細胞の増殖に十分な条件下に維持する工程；及び
ｄ）該細胞を培養物から収集してグリア細胞を得る工程；
を含む方法。 - 混合細胞培養物からのグリア細胞の増殖を刺激する試験管内方法であって、
ａ）グリア細胞を含む混合細胞培養物を細胞増殖に十分な条件下で培養する工程；
ｂ）該混合培養物にＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の有効量を導入して、モノクローナル抗体処理混合培養物を生産する工程；
ｃ）工程ｂ）の培養物をモノクローナル抗体処理細胞の増殖に十分な条件下に維持して、該混合培養物内のグリア細胞の増殖を生じる工程；
ｄ）該グリア細胞を該混合培養物から収集する工程；
を含む方法。 - 該混合培養物がラット視神経から得られる請求項17記載の方法。
- 該混合培養物がラット脳から得られる請求項17記載の方法。
- ヒト以外の哺乳動物において中枢神経系軸索のミエリン再形成を刺激する方法であって、
ａ）グリア細胞を細胞増殖に十分な条件下で培養して、グリア細胞培養物を生産する工程；
ｂ）該グリア細胞培養物にＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の有効量を導入して、モノクローナル抗体処理グリア細胞培養物を生産する工程；
ｃ）工程ｂ）の培養物をモノクローナル抗体処理細胞の増殖に十分な条件下に維持する工程；
ｄ）該モノクローナル抗体処理細胞を培養から収集してグリア細胞を得る工程；
ｅ）工程ｄ）で得られた該グリア細胞を該哺乳動物の中枢神経系に導入して、中枢神経系軸索のミエリン再形成を刺激する工程；
を含む方法。 - 請求項15記載のハイブリドーマから生産可能なモノクローナル抗体。
- 治療に使用するための請求項21記載のモノクローナル抗体。
- ヒト以外の哺乳動物において中枢神経系軸索のミエリン再形成を刺激するグリア細胞の調製方法であって、
ａ）グリア細胞を細胞増殖に十分な条件下で培養して、グリア細胞培養物を生産する工程；
ｂ）該グリア細胞培養物にＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の有効量を導入して、モノクローナル抗体処理グリア細胞培養物を生産する工程；
ｃ）工程ｂ）の培養物を培養物からのモノクローナル抗体処理細胞の増殖に十分な条件下に維持して、グリア細胞を得る工程；
を含む方法。 - 配列番号２の軽鎖及び配列番号７の重鎖を含むＩｇＭモノクローナル抗体、又は配列番号２の軽鎖及び配列番号７の重鎖を含むＩｇＭモノクローナル抗体の人間化された変異体であって、該抗体が、乏突起膠細胞の表面を染色し、中枢神経系軸索のミエリン再形成を刺激することを特徴とするモノクローナル抗体。
- ＡＴＣＣ受託番号第CRL 11627号を有するハイブリドーマによって産生された請求項24記載のモノクローナル抗体。
- 請求項24又は25記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物であって、脱髄性疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
- 請求項24又は25記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物であって、脱髄性疾患の治療が必要な哺乳動物のミエリン再形成を刺激するための医薬組成物。
- 哺乳動物がヒトである請求項27記載の医薬組成物。
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