CN115260022B - 一种大环二苯庚烷及其制备方法和在制备抗流感病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大环二苯庚烷及其制备方法和在制备抗流感病毒药物中的应用。大环二苯庚烷其结构如式(1)所示。本发明发现了一种具有良好抗甲型流感病毒活性的大环二苯庚烷(‑)‑11‑oxo‑3,12R,17‑trihydroxy‑9‑ene‑[7,0]‑metacyclophane，它在抗流感病毒药物开发方面具有广泛的应用前景。

Description

一种大环二苯庚烷及其制备方法和在制备抗流感病毒药物中 的应用

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种来源于木麻黄(Casuarinaequisetifolia L.)根的大环二苯庚烷-(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane及其制备方法和在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染性疾病。自二十世纪以来，流感已导致多次世界范围的大流行，如1918年西班牙大流感和2009年猪瘟大流行。引起全球爆发性流行的流感病毒以甲型为主，且甲型流感病毒H1N1易变异、感染性强、发病率高、死亡率高。目前常用的抗甲型流感病毒药物主要分为两类，一类是M2离子通道阻滞剂，代表药为金刚烷胺和金刚乙胺；另一类为神经氨酸酶抑制剂，代表药有奥司他韦和扎那米韦。然而，两类药物都面临一个问题：不同程度的流感病毒耐药。因此，有必要开发新型的抗甲型流感病毒药物。

木麻黄(Casuarina equisetifolia L.)系木麻黄科木麻黄属常绿乔木，原产于澳大利亚及太平洋岛屿，现在我国广东、广西、福建、台湾沿海一带广泛种植，常用于沿海防风林。根据《中国中药资源大典》和《中华本草》记载，木麻黄树皮、枝叶、种子可入药，主要功效为止泻止痢。其中，关于木麻黄嫩枝、叶、树皮、凋落物的化学成分及现代药理活性研究较多，但对木麻黄根中活性化学成分的研究较少。

目前，未见木麻黄中具抗甲型流感病毒活性的大环二苯庚烷成分的研究报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种来源于木麻黄(Casuarina equisetifolia L.)根的大环二苯庚烷-(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane。

本发明的(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane，其结构如式(1)所示：

本发明的第二个目的在于提供式(1)所示的(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane的制备方法，其特征在于，(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane是从木麻黄(Casuarina equisetifolia L.)根中制备分离得到的。

具体材料可以是干品或鲜品。

具体步骤优选为：

a、制备总浸膏：将木麻黄的根粉碎后用有机溶剂-水的混合溶液浸提，提取液浓缩除去有机溶剂后得到混悬液，混悬液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩后得到总浸膏；

b、分离纯化：总浸膏经正相硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇从体积比100:0→0:100洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比100：3洗脱的馏分为E6，馏分E6进一步经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯体积比从100:8→100:30洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比100:15洗脱的馏分为E6-3，取馏分E6-3经凝胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1洗脱，所得馏分经纯化得到大环二苯庚烷。

优选，所得馏分经纯化是经岛津LC-6AD半制备高效液相色谱，色谱柱为Cosmosil5C1 8-MS-II column(5μm,10mm×250mm)、流动相为乙腈-水体积比40:60、流速为2mL/min，收集保留时间为22min的馏分，获得(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclopha ne。

所述的有机溶剂-水的混合溶优选为体积分数95％的乙醇水溶液。

本发明的第三个目的是提供木麻黄根在制备如式(1)所示的(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydr oxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane中的应用。

本发明式(1)所示的(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane经体外抗流感病毒H1N1实验证实，其对MDCK细胞的毒性CC₅₀大于100μM，细胞毒性较小，生物安全性高。式(1)所示的(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane对甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)的半数抑制浓度IC₅₀为8.64±2.49μM，说明其具有优秀的抗流感病毒活性。

因此，本发明的第四个目的在于提供式(1)所示的(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene- [7,0]-metacyclophane在制备抗流感病毒药物中的应用。

优选，所述的抗流感病毒药物是抗甲型流感病毒H1N1的药物。

本发明的第五个目的是提供一种抗流感病毒药物，其含有式(1)所示的(-)-11-oxo-3,12 R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane作为活性成分。

本发明从木麻黄的根中分离得到一种具有良好抗甲型流感病毒活性的大环二苯庚烷(-)-1 1-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane，它在抗流感病毒药物开发方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是CD谱图；

图2是化合物1对MDCK细胞的毒性图；

图3是化合物1对甲型流感病毒H1N1的抑制作用图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：本发明式(1)所示(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane的制备

1.1仪器与试剂

供提取用植物材料木麻黄(Casuarina equisetifolia L.)的根样品于2020年6月采自广东省湛江市吴川市塘尾镇。柱层析硅胶(80～100目和200～300目)、薄层硅胶层析板均为烟台江友硅胶开发有限公司生产。NMR谱用Bruker AVIII 500M型超导核磁共振仪测定，以氘代甲醇残留溶剂峰作标定，氘代甲醇为美国剑桥公司(CIL)生产。旋光用PerkinElmer 34 1plus旋光仪测定。CD谱用Jasco J-810圆二色谱仪测定。质谱采用API 2000LC/MS/MS质谱仪测定。

1.2化合物1的制备和结构鉴定

风干的木麻黄根(7.3kg)经过粉碎，95％乙醇提取浓缩得到浸膏(698g)。浸膏用水分溶，依次经过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。萃取所得乙酸乙酯部位(35.6g)经正相硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇(体积比从100:0→0:100)洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比100：3洗脱的馏分为E6。馏分E6进一步经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(体积比从100:8→ 100:30)洗脱得到5个馏分，收集石油醚-乙酸乙酯体积比100:15洗脱的馏分为E6-3；馏分E6-3 经凝胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1洗脱，所得馏分经岛津LC-6AD半制备高效液相色谱，色谱柱为Cosmosil 5C18-MS-II column(5μm,10mm×250mm)、流动相为乙腈-水体积比40:60、流速为2mL/min，收集保留时间为22min的馏分，获得化合物1。

化合物1的结构鉴定为式1所示，命名为(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-meta cyclophane。

式1所示的(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane的性状和结构鉴定数据如下：白色固体；[α]_D ²⁰＝-53.5(c 0.2,CH₃OH)；ESI-MS:m/z 309[M-H]^-,m/z 333 [M+Na]⁺，分子式为C₁₉H₁₈O₄；¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ7.13(overlapped,2H),7.0 5(s,1H),7.01-6.98(overlapped,2H),6.95(d,J＝2.2Hz,1H),6.81(d,J＝8.3Hz,1H),6.75(d,J＝8.1Hz,1H),4.52(dd,J＝5.9,2.5Hz,1H),3.45(m,1H),3.17(m,1H),2. 79-2.94(overlapped,3H),2.45(m,1H)；¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)δ206.1,153.0,152. 2,151.8,136.4,135.6,133.9,130.3,129.9,129.5,128.7,127.6,127.3,117.3,116.7,76.7,39.6,36.2,33.3.

通过实验CD谱图与量子化学计算的CD谱图比较(图1)，确定12位羟基的构型为R。

实施例2：本发明式(1)所示(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane的抗甲型流感病毒活性

2.1实验材料

病毒株：甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)，选择8-9天的鸡胚传代扩增，-80℃保存。

2.2细胞模型

犬肾上皮细胞(MDCK细胞)，培养基为含10％胎牛血清，100U/L青霉素、链霉素的DMEM培养基。

2.3样品的细胞毒性检测

实验步骤：MDCK细胞按1×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层，用不含血清的DMEM培养基梯度稀释样品后加入到96孔板中，每孔200 μL，继续培养48h。弃培养上清，每孔加入100μL含0.5mg/mL MTT的DMEM培养基， 37℃孵育4h。以样品溶解溶剂DMSO作为对照组。采用多功能酶标仪(Genios Pro，Tecan， US)检测570nm处吸光度，以细胞的存活率作为样品对MDCK细胞的毒性的指标。

计算公式：细胞存活率(％)＝E/N×100

E为样品组的吸光度，N为对照组的吸光度。

2.4样品的抗甲型流感病毒活性检测

实验步骤：MDCK细胞按2×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID₅₀的A/WSN/33(H1N1)感染细胞，每孔100μL，37℃孵育 1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/mL TPCK)梯度稀释的化合物1，每孔200μL，继续培养48h，通过MTT法检测化合物1的抗病毒活性，计算半数抑制浓度IC₅₀。以利巴韦林作为阳性对照。此外，实验设空白对照组(正常细胞未感染病毒且未加药物)，病毒组 (病毒感染后未加药物)。

计算公式：病毒抑制率(％)＝1-(E-N)/(P-N)×100

E为样品组的吸光度，N为空白对照组的吸光度，P为病毒组的吸光度。

2.5抗病毒活性结果

化合物(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene-[7,0]-metacyclophane(1)对MDCK细胞的毒性如图2所示，结果表明CC₅₀大于100μM，细胞毒性较小，生物安全性高。化合物1对甲型流感病毒H1N1的抑制作用结果如图3所示，结果表明(-)-11-oxo-3,12R,17-trihydroxy-9-ene -[7,0]-metacyclophane(1)对A/WSN/33(H1N1)的半数抑制浓度IC₅₀为8.64±2.49μM。因此，化合物1对甲型流感病毒H1N1有明显的抑制作用，且存在着明显的剂量关系。阳性对照利巴韦林对A/WSN/33(H1N1)的半数抑制浓度IC₅₀为2.22±1.67μM。

Claims (5)

1.一种大环二苯庚烷的制备方法，其特征在于，大环二苯庚烷是从木麻黄Casuarina equisetifolia L.根中制备分离得到的，具体步骤为：

a、制备总浸膏：将木麻黄的根粉碎后用有机溶剂-水的混合溶液浸提，提取液浓缩除去有机溶剂后得到混悬液，混悬液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩后得到总浸膏；

b、分离纯化：总浸膏经正相硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇从体积比100:0→0:100洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比100：3洗脱的馏分为E6，馏分E6进一步经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯体积比从100:8→100:30洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比100:15洗脱的馏分为E6-3，取馏分E6-3经凝胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1洗脱，所得馏分经纯化得到大环二苯庚烷；

所述的大环二苯庚烷，其结构如式（1）所示：

。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的馏分经纯化是经岛津LC-6AD半制备高效液相色谱，色谱柱为Cosmosil 5C18-MS-II column 5µm, 10 mm×250 mm、流动相为乙腈-水体积比40:60、流速为2 mL/min，收集保留时间为22 min的馏分，获得大环二苯庚烷。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂-水的混合溶液为体积分数95%的乙醇水溶液。

4.大环二苯庚烷在制备抗流感病毒药物中的应用；

所述的大环二苯庚烷，其结构如式（1）所示：

。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗流感病毒药物是抗甲型流感病毒H1N1的药物。

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