CN111228326A - 一种甘草中生物碱类化合物的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘草中生物碱类化合物的制备及其用途，具体为将所述的甘草采用醇‑水体系作溶剂进行提取，之后，生物碱类化合物在酸碱萃取条件下分离，以保证该类化合物的稳定性及完全分离；甘草醇提物经液‑液萃取进行分离，首先用酸性条件下进行萃取，去除部分非生物碱组分，然后经碱性条件下萃取得到甘草生物碱粗组分；同时，本发明涉及甘草生物碱作用靶点的发现及此类组分再临床上的应用。该方法首次提出了可以实现复杂的甘草提取物中甘草生物碱类化合物的分离与制备方法，并提供了活性测试研究结果，为甘草中该类化合物的分离、应用，及新药研发提供技术支撑。

Description

一种甘草中生物碱类化合物的制备方法及用途

技术领域

本发明属于分析化学和生物领域，具体涉及首次提出一种甘草中生物碱类化合物的制备及用途。

背景技术

碱性化合物在制药、生物及化学领域均占有十分重要的地位。据统计，在FDA批准的1000多种小分子药物中，60％以上为碱性药物。生物碱是植物体内的碱性化合物往往具有独特而显著的药理活性，是很多传统中药的药效物质(延胡索、黄连和苦参等)。在已发现的活性天然化合物中，生物碱类化合物占50％以上，所以被认为是天然药物开发中极具潜力的一类化学成分(Facchini PJ.ALKALOID BIOSYNTHESIS IN PLANTS:Biochemistry,Cell Biology,Molecular Regulation,and Metabolic Engineering Applications.[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,2001,52(52):29-66.Watson A A,Fleet GW,Asano N,et al.Polyhydroxylated alkaloids--natural occurrence andtherapeutic applications.[J].Phytochemistry,2010,32(34):32-36.)。

甘草是一味历史悠久的药材，在世界各地都有着广泛的应用。目前发现的最早使用甘草的证据是在古埃及法老的坟墓里，距今已有3000年的历史。其它关于甘草的应用可以追溯到古希腊和古罗马，通常被用作补药和感冒药。在中国，甘草是使用最广泛的一种传统中药，覆盖了约60％的中医药方，甘草首载于《神农本草经》，被列为上品，后代医家不断沿用和发展，到南北朝时期，医药家陶弘景将甘草尊为“国老”，并言：“此药最为众药之王，经方少有不用者”。明代李时珍的巨著《本草纲目》称：“诸药中甘草为君(季宇彬,姜薇,范玉玲,等.甘草黄酮的研究进展[J].中草药,2004,35(9):1007-1008.惠寿年,董阿玲.国内对甘草化学成分的研究进展[J].中草药,1999,30(4):313-315.)。广泛的药理作用离不开甘草丰富的化学成分。迄今为止，从甘草中已经分离得到了400多个化合物，其中不乏一些药理活性显著的化合物如甘草酸等(Hatano T,Yasuhara T,Miyamoto K,et al.Anti-humanimmunodeficiency virus phenolics from licorice[J].Chemical&PharmaceuticalBulletin,1988,36(6):2286-8.)。然而，目前分离、分析得到甘草生物碱类化合物鲜有报道，由于分离制备方法的欠缺，大量非生物碱化合物的存在，严重影响了甘草生物碱类化合物生物分离纯化与活性的研究。

最新研究表明，甘草中含有生物碱类物质的含量约为1.3％左右，且具有一定的活性作用，值得深入研究。然而，由于甘草成分复杂，而且非生物碱类杂质疏水性相似，制备甘草生物碱类组分较为低效、耗时。目前，关于甘草生物碱化合物的分离制备，尚未见报道。因此，发展分离制备方法从甘草中制备生物碱类化合物，对于开展相关生物活性研究和新药研发具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的技术目的是提供一种利用简便、经济、高效的强醇提法结合液液萃取法提取、分离制备甘草中生物碱类组分的方法。具体地说是一种采用回流提取法和液液萃取方法，采用醇提法得到甘草提取物，采用不同的pH条件下萃取得到甘草中生物碱类组分；同时，本发明涉及甘草生物碱作用靶点的发现及此类组分再临床上的应用，体外实验表明，本发明中的甘草生物碱组分作用于M受体，目前研究表明，M受体与心力衰竭、高血压、冠状动脉性心脏病、代谢综合征、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，据此说明甘草生物碱具有一定的临床应用。该方法对甘草生物碱组分的制制备与用途研究表现出良好的参考。

本发明的具体技术方案为：

本发明提供一种甘草中生物碱类化合物的提取、分离制备方法：

1)原料处理：甘草根切成小块阴干，用粉碎机进行粉碎，过20-80目筛，得甘草药材粗粉，备用；

2)甘草提取物的制备：30％-95％(V:V)醇-水溶液作提取溶剂，回流提取法进行提取，经过滤，浓缩，得甘草提取液；

所述的甘草提提取物的制备所使用的溶剂为醇-水溶液为甲醇-水、乙醇-水、正丁醇-水、或异丙醇水中的任一种。

3)甘草生物碱类化合物的制备：将得到的甘草提取物取一定量，用酸水溶解，pH值调至1-4，用有机溶剂萃取1-6次，之后，pH值调至8-12，用有机溶剂萃取1-6次。

所述的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、正己烷或二氯甲烷中的任一种。所述的调pH值所使用的酸为浓度为0.5-5％的醋酸、盐酸、硫酸或酒石酸中的任一种。所述的调pH值所使用的碱为饱和的碳酸钠溶液、0.2-2mol/L氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或15-25％的氨水。

4)得到的萃取溶液经浓缩处理，得到甘草生物碱粗组分。

步骤1)所述的甘草原料处理方法为：将甘草根切成小块、放在阴处晾干2-20天，阴干至含水量为3-8％后，用粉粹机将晾干的甘草根粉萃成粉末，过筛得甘草粉末。

所述的筛为20-80目筛。

步骤2)所述的甘草提取物的制备方法为：称取一定量的甘草药材粉，用5-30倍量的30％-95％(V:V)醇-水溶液回流提取1-5次，每次回流时间为1-6小时，合并提取液，抽滤、浓缩，得到甘草提取物。

所述的甘草提提取物的制备所使用的溶剂为醇-水溶液为甲醇-水、乙醇-水、正丁醇-水、或异丙醇水中的任一种。

步骤3)所述的甘草生物碱类化合物的制备方法为：甘草提取物样品量为5g-1000g，用50ml-5000ml的磷酸、硫酸、或盐酸-水溶液溶解，pH值保持在1-4，用50ml-5000ml的有机溶剂进行萃取1-6次；碱沉，采用0.2-2mol/L的氢氧化钠、0.2-2mol/L氢氧化钾、或氨水进行调节，pH值保持在8-12，之后，用0.5-5倍体积的有机溶剂进行萃取1-6次。

步骤4)所述的甘草生物碱类化合物的制备过程为，将得到的萃取溶液用旋转蒸浓缩、或离心浓缩进行浓缩，即得甘草生物碱类化合物粗碱。浓缩过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-1000Pa。

步骤5)甘草生物碱类化合物用途研究，所述的M受体可能是M1,M2,或M3中的任一种或多种。

本发明的有益效果

该方法采用简便、经济、高效的方法实现了甘草生物碱类化合物的提取、分离与制备，解决了甘草生物碱类化合物由与非生物碱类化合物疏水性相似、含量低等原因被忽略的问题。因此，本发明建立了一种甘草生物碱类化合物提取、分离制备的新方法，为该类化合物生物活性的深入研究和新药研发提供技术支撑。

附图说明

图1为(A)甘草提取物高效液相色谱分析图；

(B)甘草提取物和制备得到的甘草生物碱类化合物液相色谱分

析结果。

图2为(A)buffer、buffer、scopolamine、buffer和甘草生物碱(GCSWJ)处理HEK293-M3细胞后，buffer、CARB、CARB、GCSWJ和CARB在HEK293-M3细胞的RFU信号；

(B)buffer、buffer、scop、buffer和scop处理HEK293-M3细胞后，buffer、CARB、CARB、GCSWJ(50μM)和GCSWJ在HEK293-M3细胞的RFU信号；

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

1)5kg晾干的甘草根用粉粹机进行粉粹，经60目筛，得甘草根药材粉末。

2)1kg甘草粉末用10升70％(v/v)乙醇作提取溶剂(固液比为1:10)，回流提取3h，抽滤，提取3次，合并提取液，浓缩，得甘草提取物(图1(A))。

3)上述提取物，采用0.2％硫酸溶解，硫酸使用量为2L，其pH约为3。采用石油醚进行萃取，石油醚使用量为2L，共萃取3次。分别收集石油醚层和酸水层。酸水部分用25％的氨水调pH至10，氨水使用量为300ml。采用二氯甲烷进行萃取，二氯甲烷用量为2.5L，共萃取3次。

4)针对收集的二氯甲烷层，采用旋转蒸发法，在35℃，真空度为0.6Mpa条件下进行浓缩干燥，及得甘草生物碱类化合物(图1(B))。

实施例2

甘草生物碱(GCSWJ)在HEK293-M3细胞的初步药理学表征：

材料：甘草生物碱类化合物按上述方法制备；HEK293-M3细胞购于中国科学院上海细胞库；莨菪碱、CARB购于sigma公司。检测平台为FLIPRFLIPR高通量细胞水平筛选系统，美国美谷分子公司，检测的信号为相对荧光值(Relative Fluorescent Unit，RFU)。卡巴胆碱(Carbachol)，莨菪碱(Scopolamine)(均购买于TCI)。

对甘草生物碱类化合物进行了M3受体活性筛选；我们利用了稳定表达M3受体的HEK-293细胞系，在96孔板中接种稳定表达M3受体的HEK-293细胞，80,000细胞/孔，37℃细胞培养箱培养过夜，加入Calcium-6dye loading 2小时，以激动剂卡巴胆碱(Carbachol)5nM，以拮抗剂莨菪碱(Scopolamine)1μM作为对照，用LIPR检测钙流，检测甘草生物碱的活性，结果如图2(A)所示：甘草生物碱在200μM浓度下，在M3受体上有明显的激动活性，并且在拮抗剂活性检测时，有效抑制了Carbachol的活性。这很有可能是甘草生物碱的特异性激动活性而产生的脱敏效应。为了进一步确定甘草生物碱在M3受体的激动活性，我们将甘草生物碱浓度降低到50μM检测活性，并且用Scopolamine进行拮抗，结果如图2(B)所示：甘草生物碱在50μM浓度下在M3受体仍具有明显的激动活性，并且可以被M3受体拮抗剂Scopolamine抑制。

甘草可被用于治疗肌肉痉挛和肿胀、风湿性关节炎、咳嗽、哮喘和其他胸部感染和增加胆汁。已确定五种类型的毒蕈碱受体(M1-M5)广泛分布在平滑肌和胃肠道细胞膜表面。毒蕈碱受体M3在收缩中的作用大于M2的作用。有研究表明甘草生物碱可以控制乙酰胆碱引起的兔和豚鼠回肠收缩。这些暗示着甘草生物碱在毒蕈碱受体的潜在活性。实验结果表明，甘草生物碱在M3受体上具有激动活性且可以发生脱敏反应以及被东莨菪碱抑制，表明其在M3受体上具有特异性的激动活性。

该方法首次实现了甘草中生物碱类化合物的制备，并进行了活性筛选实验，结果表明了甘草生物碱类化合物作用于M3受体。而，目前研究表明，M3受体与心力衰竭、高血压、冠状动脉性心脏病、代谢综合征、哮喘、疼痛、炎症和癌症等疾病相关，据此说明甘草生物碱具有一定的临床应用。为该类化合物生物的制备、活性研究和新药研发的深入研究提供技术支撑。

Claims (7)

1.一种甘草中生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：

1)原料处理：甘草根阴干至含水量为3-8％后，粉碎，过20～80目筛，得药粉，备用；

2)甘草提取物的制备：30％～95％醇-水溶液作提取溶剂，浸泡，回流提取法进行甘草样品的提取，经过滤，浓缩，得甘草提取液；

3)甘草生物碱类化合物的制备：将得到的甘草提取液经液液萃取处理，得到甘草生物碱类化合物；

4)以甘草生物碱类化合物为活性成分，研究了M受体活性及其用途。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中醇-水溶液的质量为甘草药材粉5-30倍，回流提取1-5次，每次回流提取时间为1-6小时，合并提取液、抽滤，得到样品溶液，经浓缩得到甘草提取液。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的醇-水溶液为甲醇-水、乙醇-水、正丁醇-水或异丙醇水中的任一种，其中醇和水的比例为30％-95％(V:V)。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述的甘草生物碱类化合物的液液萃取方法为：样品量为5g～1000g，用50ml～5000ml的磷酸、硫酸、或盐酸-水溶液溶解，pH值保持在1-4，用50ml-5000ml的有机溶剂进行萃取1～6次；碱沉，采用0.2-2mol/L的氢氧化钠、0.2-2mol/L氢氧化钾、或氨水进行调节，pH值保持在8-12，之后，用0.5-5倍体积的有机溶剂进行萃取1-6次，得到萃取溶液。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、正己烷或二氯甲烷中的任一种。

6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：将得到的萃取溶液用旋转蒸浓缩、或离心浓缩进行浓缩，即得甘草生物碱类化合物粗碱，浓缩过程中物料温度不得超过70℃，真空度为20-1000Pa。

7.按照权利要求1-6任一制备方法得到的甘草生物碱类化合物的用途，其特征在于：所述的甘草生物碱类化合物作用于M受体，所述的M受体可能是M1,M2,或M3中的任一种或多种。

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