CN1149293C

CN1149293C - 雄性组织优选的调控区以及使用该调控区的方法

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Publication number: CN1149293C
Application number: CNB988084422A
Authority: CN
Inventors: M��C��ɭ; M·C·阿尔伯特森; T·W·福克斯; C·W·加纳特; G·A·胡夫曼; T·L·肯达尔
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1997-06-23
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2004-05-12
Anticipated expiration: 2018-06-19
Also published as: HUP0002578A2; EP0994956B1; BG104095A; JP2001520523A; EP0994956A1; NZ501954A; JP3513157B2; CA2293997C; AU747286B2; DE69828505T2; CA2293997A1; US6037523A; BR9810293A; TR199903234T2; HUP0002578A3; WO1998059061A9; PT994956E; RO119957B1; BRPI9810293B1; AR016280A1

Abstract

本发明涉及一种编码Ms45雄性组织优选的调控区的分离的核酸序列。在一个方面，本发明涉及将所述雄性组织优选的调控区用于调节育性的用途。所述用途的一个例子是生产杂交种子，如用于雄性不育系统生产杂交种子。所述Ms45雄性组织优选的调控区能够可操作地连接于诸如编码细胞毒素的基因、互补核苷酸单位和抑制分子的外源基因上。本发明还涉及含有本发明调控区的植物细胞、植物组织和分化的植株。

Description

雄性组织优选的调控区以及使用该调控区的方法

发明领域

本发明涉及在真核细胞中作为调控区的分离的DNA序列。更具体地讲，本发明涉及源于玉米的分离的DNA序列，该序列作为雄性组织优选的调控区，并在玉米组织中的基因表达中起作用。本发明还涉及一种用于赋予能够或不能够在玉米组织中正常表达的基因以雄性组织优选方式表达的能力的方法。

发明背景

组织和时序特异性基因表达和调控特别存在于真核生物的有性繁殖期间。在植物配子发生中，在花粉发育期间发生了重要的细胞学和生物化学变化，此时，单倍体小孢子的非对称有丝分裂导致两个细胞的形成；每一个细胞具有不同的发育命运。营养细胞支持花粉的生长，而生殖细胞进行有丝分裂，并发育成精细胞。业已在诸如玉米、番茄、烟草、稻、蝴蝶花的植物中鉴定了对花粉中两种途径专一的信使RNA；还鉴定了对花粉或花药中的一种或几种其他类型细胞，如绒毡层、表皮层、和裂口细胞专一的信使RNA。

在分化期间的花粉基因表达估计涉及24,000个基因(Willing等，“源于玉米花粉和芽的mRNA的定量分析和多样性”；理论应用遗传学；75卷；751-753页；(1988))，不过，仅有10％源于cDNA文库的克隆是雄性专一的(Stinson等，“玉米配子体中基因表达及其分离”；植物生理学；83卷；442-447页；(1987))，在花粉中表达的花粉特异性基因的百分比为5-80％(Willing等，“源于玉米花粉和芽的mRNA的定量分析和多样性”；理论应用遗传学；75卷；751-753页；(1988))。所述小孢子发生的复杂过程涉及许多基因产物的顺序产生。

目前，业已从植物中克隆了雄性特异性基因：业已证实其中的两个即玉米Ms45基因(US5,478,369)和拟南芥属Ms2基因(Mark，G.M.等，自然；363卷；715-717页；(1993))为花粉发育所需要。植物中雄性特异启动子的其他例子包括ZM13、PG、和SGB6。

Zm13启动子披露于US5,086,169中。它包括1315个碱基对，并且是源于由Hanson等披露的花粉特异基因(植物细胞；1卷；173-179页；(1989))。该基因与仅存在于花粉中的mRNA杂交。

在US5,412,085中业已分离并鉴定了位于花粉特异聚半乳糖醛酸酶基因(PG)上游的另一个花粉特异性启动子。该启动子区包括2687个碱基对，并且主要在花粉和现出的穗状雄花中表达，但不在现出前的穗状雄花中表达。同样为Allen所拥有的US5,545,546披露了另一种源于玉米聚半乳糖醛酸酶基因的花粉特异性启动子。它仅能在花粉和现出的穗状雄花中表达。

US5,470,359披露了一种源于玉米SGB6基因的调控区，它能产生绒毡层特异性。所述表达组织绒毡层是一层环绕花药中的小孢子发生细胞并为其提供营养的细胞。

在US5,477,002中披露了源于烟草的9个花药特异性cDNA和基因组克隆。通过Northern分析证实所述cDNA克隆是花药特异性的，但在发育方式方面不同，克隆Ant32是绒毡层特异性的。

欧洲专利号0420819A1披露了生产具有wun1基因的雄性不育植物的方法。

PCT WO90/08825披露了花药特异性cDNA TA13、TA26和TA29及其在雄性不育系统中的用途。

PCT WO90/08825披露了雄性不育基因pMS10、pMS14和pMS18及其与GUS报导基因的用途。

US5,589,610详细披露了与花药特异性cDNA和花药优选cDNAAC444相关的启动子。

在植物的遗传学组建中，将植物启动子和外源基因用于实现改变的用途是本领域是公知的(US5,432,068、5,412,085、5,545,546、5,470,359和5,478,369)。以上专利讨论了植物表达框，具有与基因连接的组织特异性启动子，以便影响雄性不育性、可育性、或者基因在特殊组织中的表达。不过，所述专利没有教导将所述雄性组织优选的调控区或所述雄性组织优选的调控区与外源基因用作控制雄性不育性的方法。

本发明涉及雄性组织特异调控区及其使用该调控区的方法。外源基因以雄性组织优选形式的表达，可以调节雄性育性，并可用于诸如杂交种子生产的很多系统。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种用一种表达载体以雄性组织优选形式表达外源基因的方法，所述表达载体能产生外源基因的雄性组织优选表达。该方法可用于恢复育性(如在雄性不育系统中的情形)或以其他方式影响育性，如在杂交种子生产中的情形。本发明的另一个目的是提供一种能产生雄性组织优选基因表达的DNA调控区。本发明的再一个目的是提供一种雄性组织优选的调控区，或者与其具有序列相同性的调控区，所述序列相同性优选为大约70％、75％、或80％，更优选为大约85％或90％，最优选为大约95％或99％。

本发明的一个目的是提供一种编码Ms45雄性组织优选调控区的分离的核酸序列。

本发明的一个目的是提供一种编码源于玉米的Ms45雄性组织优选调控区的分离的核酸序列，该序列包括序列1所示的核酸序列或与其具有序列相同性的序列。本发明的另一个目的是提供一种编码源于玉米的Ms45雄性组织优选调控区的分离的核酸序列，该序列包括序列2所示的核酸序列或与其具有序列相同性的序列。

本发明的一个目的是提供一种含有序列1所示的分离的核酸序列的重组表达载体，或与其具有序列相同性的表达载体，该表达载体可操作地连接于编码外源基因的核苷酸序列，以便所述核苷酸序列以雄性组织优选方式表达，这样，可以促进所述外源基因的表达。

本发明的一个目的是提供一种外源基因，其中，所述外源基因是Ms45。

本发明的一个目的是提供一种生产能以雄性组织优选方式表达外源核苷酸序列的转化过的植物的方法，包括以下步骤：将所述外源核苷酸序列导入植物，该核苷酸序列可操作地连接于一个雄性组织优选的调控区上，该调控区包括序列1所示的核苷酸序列或与其具有序列相同性的序列。其中，该方法的所述导入步骤可以通过微粒轰击完成，可以使用包括Ti质粒的农杆菌属或转移载体。另外，可以有一个拷贝以上的可操作地连接于雄性组织优选调控区上的所述外源核苷酸序列。

本发明的一个目的是提供一种方法，其中，所述调控区在选自下列一组的组织中以雄性组织优选方式表达：花粉、绒毡层、花药、穗状雄花、花粉母细胞和小孢子。

本发明的一个目的是提供一种能以雄性组织优选方式表达外源核苷酸序列的转化过的植物，它具有可操作地连接于序列1所示雄性组织优选调控区上的外源核苷酸序列，或与其具有序列相同性的序列。所述植物是单子叶植物或双子叶植物。可以使用任何能被转化的植物，例如，包括玉米、向日葵、大豆、小麦、canola、稻和高粱。本发明还提供了所述转化植物的转化组织。例如，所述组织可以是花粉、果穗、胚珠、花药、穗状雄花、雄蕊、雌蕊和植物细胞。转化过的植物可以含有连接于雄性组织优选调控区的所述外源核苷酸序列。

本发明的一个目的是提供一种调节植物育性的方法，其中，所述雄性组织优选调控区表达所述外源核苷酸序列，以便影响其育性。所述外源核苷酸序列可以是影响雄性育性的任何序列，例如，可以包括编码所述反义分子的互补核苷酸单位，如callase反义RNA，芽孢杆菌RNA酶反义RNA和查耳酮合酶反义RNA、Ms45反义RNA、或核酶和外部指导序列、或aptamers或单链核苷酸。所述外源核苷酸序列还可以编码生长素、rolB、细胞毒素、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素、或可以选自原核调控系统。另外，所述外源核苷酸序列是雄性不育基因或Ms45结构基因，而所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

本发明的一个目的是提供一种生产杂交种子的方法，包括将按照上述方法生产的雄性可育植株和雄性不育植株以异花授粉的并列形式种植，让所述异花授粉发生，并收获所产生的种子。所述植物可以是玉米植物。

根据本发明的一种实施方案，所述目的和其他目的是通过提供一种分离的DNA分子实现的，其中，所述DNA分子包括序列1所示的核苷酸序列。

根据本发明的另一种实施方案，提供了一种含有外源基因的表达载体，其中，所述外源基因的表达是受雄性组织优选调控区的控制，而所述外源基因的产物影响雄性育性。

根据本发明的另一种实施方案，提供了一种用所述表达载体生产雄性不育植物的方法，包括以下步骤：将一种表达载体导入植物细胞，其中，所述表达载体的外源基因可以是一个互补的核苷酸单位，如反义分子(callase反义RNA、芽孢杆菌RNA酶反义RNA和查耳酮合酶反义RNA、Ms45反义RNA)、核酶和外部指导序列、aptamers或单链核苷酸。所述外源核苷酸序列还可以编码生长素、rolB、细胞毒素、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素、或可以选自原核调控系统。

根据本发明的另一种实施方案，提供了一种用雄性组织优选调控区生产雄性可育杂交植物的方法，包括以下步骤：

a)生产包括一个表达载体的第一亲本雄性不育植物，所述表达载

体包括雄性组织优选的调控区和第一外源基因，其中，所述雄性

组织优选的调控区控制所述第一外源基因的表达，并且，其中，

所述第一外源基因的产物可以破坏雄性育性。

b)生产包括一个表达载体的第二亲本植物，所述表达载体包括第

二外源基因，其中，所述调控区控制所述第二外源基因的表达，

以便它能够在雄性组织中表达；

c)让第一亲本与所述第二亲本杂交，产生杂交植物，其中，所述

杂交植物的雄性组织表达所述第二外源基因，而且，其中，所述

第二外源基因的产物能防止所述第一外源基因的产物对穗状雄花

功能的破坏，从而产生雄性可育的杂交植株。

根据本发明的另一种优选实施方案，提供了一种用雄性组织优选调控区生产雄性可育杂交植物的方法，包括以下步骤：

a)生产第一亲本雄性不育植物，其中，参与雄性育性表达的第一

基因被破坏；

b)生产含有一个表达载体的第二亲本植物，所述表达载体包括雄

性组织优选的调控区，和一个外源基因，其中，所述雄性组织优

选调控区控制所述外源基因的表达，以便它能够在雄性组织中表

达，并能够功能性补充在a)中被破坏的基因的功能；

c)让所述第一亲本与第二亲本杂交授粉，以便产生杂交植物，其

中，所述杂交植物的雄性组织能表达所述外源基因，而且，其中，

所述外源基因的产物能防止破坏穗状雄花的功能，从而产生雄性

可育的杂交植株。

附图的简要说明

图1是Ac4.1Ms45基因组克隆和限制位点的示意图。

图2是PHP6045的质粒图谱。

图3是所述引物延伸产物的放射性自显影图，表示Ms45转录的开始，用G、A、T、C标记的泳道相应于分别用双脱氧核苷酸ddGTP、ddATP、ddTTP、和ddCTP进行的测序反应。泳道1-4相当于用源于(1)穗状雄花、(2)叶片、(3)花药、和(4)叶片的mRNA进行的引物延伸反应。

图4是表示Ms45雄性组织优选调控区的阶段专一性的棒图。

图5表示通过在非雄性组织中缺乏活性证实的组织专一性。

图6表示与雄性可育基因Ms45杂交的凝胶的花药mRNA Northern分析。

图7表示TATA框突变分析结果。

发明内容

所提到的所有文献都被收作本文的参考文献。

除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的普通技术人员一般理解的相同含义。除非另有说明，本文所采用或涉及的技术是本领域普通技术人员所公知的方法。材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而不是限定性的。

在以下说明中，大量使用了多个术语。为了有利于理解本发明，提供了以下定义。

1.定义

序列相同性或相似性，如本领域所公知的，是通过比较有关序列确定的两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，相同性还表示两个多肽或两个多核苷酸之间的序列相关程度，是通过比较所述两个序列而确定的。可以方便地计算相同性和相似性(计算分子生物学；Lesk，A.M.著；牛津大学出版社，纽约；(1988)；生物计算：信息和基因组工程；Smith，D.W.著；学术出版社，纽约；(1993)；序列资料的计算机分析(第I部分)；Griffin，A.M.和H.G.Griffin著；Humana出版社，新泽西(1994)；von Heinje，G.，分子生物学中的序列分析；学术出版社(1987)；和序列分析引物；Gribskov，M.和J.Devereux著；M Stockton出版社，纽约(1991))。尽管存在多种测定两个多核苷酸或两个多肽序列之间的相同性和相似性的方法，这两个术语为本领域技术人员所熟知(vonHeinje，G.，分子生物学中的序列分析；学术出版社(1987)；序列分析引物；Gribskov，M.和J.Devereux著；M Stockton出版社，纽约(1991)；和Carillo，H.，和D.Lipman，SIAM，应用数学杂志；48卷；1073页(1988))。通常被用于测定两个序列之间的相同性或相似性的方法包括，但不限于披露于Carillo，H.，D.Lipman，SIAM，应用数学杂志；48卷；1073页(1988)中的方法。设计测定相同性的优选方法，以便在两个测定的序列之间提供最大的比较。测定相同性和相似性的方法被编码成计算机程序。测定两个序列之间的相同性和相似性的优选计算机程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，核酸研究；12(1)卷；387页；(1984))，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Atschul，S.F.等，分子生物学杂志；215卷；403页(1990))。

雄性组织包括由直接参与或支持雄配子繁殖的细胞统一组成的组织，如花粉、绒毡层、花药、穗状雄花、花粉母细胞和小孢子。绒毡层是花药中与花粉母细胞和小孢子接触最密切的组织，并很可能参与发育花粉粒的营养。花粉母细胞进行两次减数分裂，由此产生单倍体小孢子的四分体。小孢子成熟变成花粉粒。花粉或花粉粒是成熟的雄性配子体，它具有使相容的植物授粉的能力。花药是雄蕊的一部分，在其中产生花粉，雄蕊的其余部分包括花丝，花药就悬挂在花丝上。雄蕊是花的雄性器官。

雄性组织优选的调控区是能指导相关基因在雄性组织中以高于在植物的某些或所有其他组织中的水平转录的核苷酸序列。例如，本文所披露的Ms45基因是在四分体、四分体释放和发育的早单核阶段在花药中检测到的。有关花药发育的细节参见Chang，M.T.和M.G.Neffer，“玉米小孢子发生”；基因组；32卷；232-244页；(1989)。Ms45雄性组织优选的调控区能指导一个可操作地连接的基因在雄性组织中表达。所述表达的优选组织是雄性组织，而不是，例如，根或芽鞘组织。主要的表达是在雄性组织中进行，包括但不限于花粉、绒毡层、花药、穗状雄花、花粉母细胞和小孢子。所述雄性组织优选的表达是指在雄性组织中较高的表达水平，但不一定排除其它组织。

调节是以正面和反面方式影响或影响产量，如育性或任何其它性状。

当非正常育性出现时，雄性育性就受到影响；影响可以是降低育性或提高育性或育性在时序或其他特征方面有所不同。

分离的是指“通过人工手段”改变了其天然状态；即如果它是以天然状态存在的话，就改变了其原始环境或离开了其原始环境，或同时出现这两种情况。例如，天然存在的多核苷酸或以其天然状态存在于活的生物中的多肽不是“分离的”，但从其原始状态的共存材料中分离出来的相同的多核苷酸或多肽是“分离的”，正如本文所使用的该术语。例如，就多核苷酸而言，术语分离的是指将其从天然存在的染色体和细胞中分离出来。作为分离的一部分或者在分离之后，可将所述多核苷酸连接到其他多核苷酸上，如DNA，进行诱变，以形成融合蛋白，并用于在一种宿主中繁殖或表达。可将分离的多核苷酸单独或与诸如载体的其他多核苷酸结合导入培养中的或完整生物的宿主细胞中。在导入培养中的或完整生物的宿主细胞中之后，所述DNA如本文所使用的术语仍然是分离的，因为它们不处于其天然存在的形式或环境。类似地，所述多核苷酸和多肽可存在于组合物中，如用于将多核苷酸或多肽导入细胞的培养基配方、溶液，用于化学或酶促反应的组合物或溶液，例如，该组合物是非天然存在的组合物，而且，保持分离的多核苷酸或多肽处于本文所使用的术语的含义范围内。

外源基因在本说明书中是指被导入或重新导入生物中的DNA序列。例如，任何基因，甚至是ms45结构基因都被视为外源基因，如果该基因被导入或重新导入所述生物中的话。

2.雄性组织优选的调控区的分离

尽管花药特异性启动子和在雄性组织中有活性的基因在本领域中是公知的(McCormick等，“花药特异性基因：转基因植物的分子鉴定和启动子分析”，参见植物繁殖：从花诱导到授粉；Lord等著；128-135页；(1989)；Scott等，国际申请公开号WO92/11379(1992)；van der Meer等，植物细胞；4卷；253页；(1992))，没有识别能在玉米中赋予基因表达的雄性组织表达能力的DNA序列的普遍接受的原则或结构标准。因此，不可能通过筛选产生雄性组织优选的表达的共有序列，从玉米基因组文库中分离雄性组织优选的调控区。

例如，所述序列的杂交可以在较低的严格条件，中等严格条件或者甚至较高严格条件下进行(例如，分别由35％-40％甲酰胺和5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和1×SSPE在37℃下的洗涤严格性所代表的条件；由40％-45％甲酰胺和5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和1×SSPE在42℃下的洗涤严格性所代表的条件；由50％甲酰胺和5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和1×SSPE在42℃下的洗涤严格性所代表的条件)。核酸标准杂交的中等严格性可用于鉴定本文所披露的雄性组织优选的调控区，以及其他基因(例如，参见Sambrook，J.等，分子克隆：实验室手册；冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.；(1982))。一般编码雄性组织优选的调控区的序列应当与其具有以下序列相同性：优选70％、75％、或80％，更优选85％或90％，最优选95％或99％。

本领域存在用于核酸序列杂交的现成方法。平板接种的DNA文库的杂交筛选(例如，参见Sambrook，J.等，分子克隆：实验室手册；冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.；(1982))或用聚合酶链式反应扩增编码序列(例如，参见Innis等PCR方法和应用指南；学术出版社；(199))是分离基因组DNA的众所周知的技术。

可以用功能性分析在基因组亚克隆中鉴定调控区，通常根据报导基因表达在花药组织中的出现和报导基因表达在非花药组织中的减弱或缺乏加以证实。所述一般方法在下面的例3中说明。所述调控区位于转录起始位点的“上游”或5’方向的可能性可以通过将含有所述上游区的DNA片段和小的DNA片段亚克隆到表达载体上，进行瞬时表达实验而测定。预计，较小的片段可能含有雄性组织优选表达所必需的片段。例如，如在US5,352,605中所披露的，业已在源于较大的基因组片段上的较小片段中鉴定了CaMV19S和35S启动子的必需区。

一般，雄性组织优选的调控区的序列应当与该序列具有相同性，其相同性优选为70％、75％或80％，更优选85％或90％，最优选95％或99％。

可以从所述调控区的5’和3’末端进行缺失分析：片段可以通过用聚合酶链式反应进行的接头分区诱变、诱变等方法获得(定向诱变：实践方法：IRL出版社；(1991))。3’缺失可以使雄性组织优选的调控区去线性化，并鉴定3’末端，以便该必需区段随后能够可操作地连接于选择的核心启动子上。一旦鉴定到所述必需区段，就可以通过Ms45的所述雄性组织优选的区段加上核心启动子控制外源基因的转录。所述核心启动子可以是任何一种已知核心启动子，如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(US5,352,605)，遍在蛋白(US5,510,474)，IN2核心启动子(US5,364,780)，或玄参花叶病毒启动子(Gruber等，“植物转化载体”，参见植物分子生物学和生物技术方法；Glick等著；CRC出版社89-119页；(1993))。所述启动子优选是雄性组织优选基因的核心启动子或CaMV 35S核心启动子。所述启动子更优选为雄性组织优选基因的启动子，具体为Ms45核心启动子。

进一步的突变分析可以导入功能性修饰，如在表达水平方面、在表达的时序方面或在表达组织方面的修饰。突变还可以是沉默突变，不具有可观察的效果。

3.将所述片段插入表达载体

为了进行功能性表达试验而进行的合适表达载体的筛选取决于宿主和将所述表达载体导入该宿主的方法，所述方法是本领域技术人员所熟知的。对于真核生物来说，所述载体上的区域包括控制转录开始和控制加工的区域。所述区域可操作地连接于诸如β-葡糖醛酸酶(GUS)基因或荧光素酶的报导基因上。有关植物表达载体和报导基因的一般性说明的例子可以参见Gruber等，植物转化载体，见植物分子生物学和生物技术方法；Glick等著；CRC出版社；89-119页；(1993)。Gus表达载体和Gus基因框由Clonetech出售(Palo Alto，CA)，而荧光素酶表达载体和荧光素酶基因框由Promega公司出售(Madison，WI)。Ti质粒和其他农杆菌属载体披露于Ishida，Y.等，自然生物技术；14卷；745-750页；(1996)和US5,591,616中(转录单子叶植物的方法，申请日为1994年5月3日)。

可以将含有位于基因组片段上的推测调控区的表达载体导入完整的组织中，如阶段花药、胚胎或导入愈伤组织中。输送DNA的方法包括微粒轰击、DNA注射、电穿孔和农杆菌属介导的基因转移(参见Gruber等，“植物转化的载体”，见植物分子生物学和生物技术方法；Glick等著；CRC出版社；89-119页；(1993)，US5,591,616(转化单子叶植物的方法，申请日为1994年5月3日)，和Ishida，Y.等，自然生物技术；14卷；745-750页；(1996))。培养植物组织的一般方法可以参见Gruber等，“植物转化的载体”，见植物分子生物学和生物技术方法；Glick等著；CRC出版社；(1993)。

对于瞬时测定系统来说，将阶段性分离的花药马上放置在用0.5％Phytagel(Sigma，St.Louis)固化的穗状雄花培养基(Pareddy，D.R.和J.S.Petelino，作物科学杂志；29卷；1564-1566页；(1989))上，或放置在其他固化培养基上。5小时之内导入所述表达载体DNA，优选用1.2μ的颗粒以1000-1100Psi的压力通过微粒轰击介导的输送进行。在DNA输送之后，在相同的穗状雄花培养基上在26℃下培养所述花药17小时，并通过制备全组织匀浆物进行分析，测定GUS或荧光素酶活性(参见Gruber等，“植物转化的载体”，见植物分子生物学和生物技术方法；Glick等著；CRC出版社；(1993))。

业已将上述方法用于鉴定以雄性组织优选的方式调控基因表达的DNA序列。所述区业已被鉴定为完整长度的Ms45雄性组织优选的调控区(序列1)。在序列2中鉴定了与完整长度Ms45雄性组织优选的调控区具有序列相同性的TATA框突变。

因此，本发明包括具有序列1所示核苷酸序列(或与其具有序列相同性的序列)并具有雄性组织优选的调控区的功能的DNA分子。

可以按照在下面的例2或在当代分子生物学方法；Ausubel，F.M.等著；John Wiley和Sons，纽约；4.8.1-4.8.5页；(1987)中披露的方法通过引物延伸分析鉴定推测的TATA框。

4.使用雄性组织优选的调控区控制育性

本发明的一个目的是提供用雄性组织优选的调控区控制育性的方法。重要的是，该雄性组织优选的调控区自四分体阶段至发育的早期单核阶段控制花药中外源基因的表达。所述时序的实际意义在于，在该发育阶段，不育性诱导基因的表达会足够早的破坏花药成熟，以便可以在大田中通过肉眼确认该不育性诱导系统的功能。它还可以降低出现“开裂花药”(释放花粉的花药)的可能性。因此，能够在足够早的发育阶段在生产大田中发现不育性诱导基因的作用，以便能够通过人工或机械对任何“可育的逃脱者”进行去雄。所述可育的逃脱者是由于所述不育性诱导系统的部分或全部破坏而产生的。

控制雄性可育性的一种方法是操纵在绒毡层中表达的基因。绒毡层是花药中环绕小孢子发生细胞的一层细胞，并有可能为发育的小孢子提供养分，如还原糖、氨基酸和脂类(Reznickova，C.R.，Acad.Bulg.Sci.；31卷；1067页；(1978)；Nave等，植物生理学杂志；125卷；451页；(1986)；Sawhney等，植物生理学杂志；125卷；467页；(1986))。发现Ms45能在绒毡层中高度表达。绒毡层细胞还产生β(1，3)-葡聚糖酶(“callase”)，该酶能促进小孢子释放(Mepham等，原生质体；70卷；1页；(1970))。因此，在绒毡层和小孢子发生细胞之间存在微妙的关系，并且对绒毡层功能的任何破坏都有可能导致花粉粒的失效。事实上，已知绒毡层生物发生的破坏会导致雄性不育性突变体(Kaul，“高等植物雄性不育”，参见理论和应用遗传学专论；Frankel等著；Springer Verlag；10卷；15-95页；(1988))。在绒毡层发育期间callase的早熟或推迟出现还与某些类型的雄性不育相关(Warmke等，J.Hered；63卷；103页；(1972))。因此，callase基因可用于破坏雄性组织的功能。Scott等，PCT WO93/02197(1993)披露了一种绒毡层特异的callase核苷酸序列。因此，小孢子发育成成熟花粉粒的失败可以用重组DNA分子诱导，该DNA分子包括一个能在绒毡层特异调控序列控制下破坏绒毡层功能的基因。

影响雄性育性的一般方法是构建一种表达载体，其中，所述雄性组织优选的调控区可操作地连接于编码一种能够破坏雄性组织功能，导致不育性的核苷酸序列上。能够破坏雄性组织功能的蛋白包括能够抑制细胞功能必需的大分子合成、能降解细胞功能必需的大分子的酶，能改变植物激素生物合成或代谢的蛋白，结构性蛋白，不适当表达的蛋白和能抑制雄性组织的特殊功能的蛋白。

例如，可以构建一种表达载体，其中，所述雄性组织优选的调控区可操作地连接于编码一种蛋白合成抑制物的核苷酸序列上，所述抑制物可以是，但不限于细胞毒素。例如，白喉毒素是众所周知的真核生物中的蛋白合成抑制物。编码白喉毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)获得，ATCC No.39359或ATCCNo.67011，例如，参见Fabijanski等，EP申请号90902754.2，“杂交种子生产的分子方法”，例如，DAM甲基化酶是众所周知的源于大肠杆菌的酶，它能把序列5’GATC3’上的腺嘌呤残基修饰成N6-甲基腺嘌呤。Cigan和Albertsen披露了如何将DAM甲基化酶用于影响转基因植物的育性(PCT/US95/15229 Cigan，A.M.和Albertsen，M.C.，“转基因植物雄性不育的可逆细胞核遗传系统”)。能破坏育性的蛋白的另一个例子是亲和素，如在US专利申请号08/475,582中所披露的“通过高水平表达亲和素在植物中诱导雄性不育性”，Howard，J.和Albertsen，M.C.。

另外，绒毡层功能的破坏可以用编码能够降解生物学重要大分子的酶的DNA序列实现。例如，Mariani等，自然；347卷；737页；(1990)，业已证实了在绒毡层中表达米曲霉RNase-T1或解淀粉芽孢杆菌RNase(被称为“bamase”)能诱导绒毡层细胞的破坏，导致雄性不育性。Quaas等，欧洲生物化学杂志；173卷；617页；(1988)，披露了RNase-T1的化学合成，而bamase基因的核苷酸序列披露于Hartley，分子生物学杂志；202卷；913页；(1988)中。

例如，RNase-T1和bamase基因可以通过用相互启动的长寡核苷酸合成所述基因而获得。例如，参见当代分子生物学方法；Ausubel，F.M.等著；John Wiley和Sons，纽约；pp8.2.8-8.2.13；(1987)。另外，参见Wosnick等，基因；60卷；115页；(1987)。而且，使用聚合酶链式反应的现有技术提供了合成很大基因的能力(Adang等，植物分子生物学；21卷；1131页；(1993)；Bambot等，PCR方法和应用；2卷；266页；(1993))。

在另一种方案中，花粉生产是通过改变诸如生长素的植物激素的代谢而受到抑制的。例如，毛根农杆菌的rolB基因编码能影响生长素代谢的酶，这种酶通过催化从吲哚基-β-葡糖苷上释放吲哚而实现所述作用。Estruch等，EMBO杂志；11卷；3125页；(1991)和Spena等，理论应用遗传学；84卷；520页；(1992)，业已证实了rolB基因在烟草中的花药特异表达会产生具有枯萎的花药的植物，其中，花粉的产生受到严重减弱。因此，rolB基因是用于控制花粉产生的基因的一个例子。Slightom等，生物化学杂志；261卷；108页；(1985)披露了rolB基因的核苷酸序列。

为了表达能破坏雄性组织功能的蛋白，构建一种表达载体，其中，编码所述蛋白的DNA序列可操作地连接于以雄性组织优选方式调控基因转录的DNA序列上。表达载体的一般要求如上文说明瞬时表达系统时所述。不过，在这里优选的方式是将所述表达载体以如下方式导入植物胚胎组织中，一种外源蛋白将在雄性植株的雄性组织中在发育的晚期阶段表达。可以用植物病毒载体获得有丝分裂稳定性，这种载体能提供染色体外复制。

获得有丝分裂稳定性的另一种优选方法是通过将表达载体序列整合到宿主染色体上而实现。所述有丝分裂稳定性可以通过将表达载体微粒输送到胚胎组织中而提供(Gruber等，“植物转化载体”，参见植物分子生物学和生物技术方法；Glick等著；CRC出版社89-119页；(1993))。

可以找到用于很多植物的转化方法，包括，但不限于向日葵、大豆、小麦、canola、稻和高粱(Knittel，N.等，植物细胞报导杂志；Springer International，柏林，西德；14(2/3)卷；81-86页；(1994)；Chee，P.P.等，植物生理学；美国生理学家协会，Rockville，MD；91(3)卷；1212-1218页；(1989)；Hadi，M.Z.等，植物细胞报导杂志；Springer International，柏林，西德；15(7)卷；500-05页；(1996)；Perl，A.等分子和普通遗传学；235(2/3)卷；279-284页；Zaghmout，O.M.S.和N.L.Trolinder，核酸研究；IRL出版社，牛津；21(4)卷；1048页；(1993)；Chen，J.L.和W.D.Beversdorf，理论应用遗传学；Springer International，柏林，西德；88(2)卷；187-192页；(1994)；Sivamani，E.等，植物细胞报导；Springer International，柏林，西德；15(5)卷；322-327页；(1996)；Hagio，T.等植物细胞报导；10(5)卷；260-264页；(1991))，这也是本领域技术人员所公知的。

为了选择转化过的细胞，所述表达载体含有一个选择标记基因，如抗除草剂基因。例如，所述基因可以产生对膦丝菌素、glyphosate、磺酰脲、阿特拉津、咪唑酮或卡那霉素的抗性。尽管所述表达载体可以含有编码受雄性组织优选调控区控制的外源蛋白的cDNA序列，以及受组成型启动子控制的选择标记基因，所述选择标记基因还可以通过一个独立的选择表达载体输入宿主细胞。下面将说明用含有雄性组织优选的调控区的试验表达载体和选择表达载体对所述胚胎组织进行的“共转化”的过程。

5.不育性的诱导

在另一种方法中，可以通过使用一种表达载体诱导雄性不育性，其中，所述雄性组织优选的调控区可操作地连接于一个编码互补核苷酸单位的核苷酸序列上。可以选择性抑制互补核酸分子与靶分子的结合。例如，如果所述靶分子是mRNA分子，则互补核苷酸单位(此时为RNA)的结合会导致杂交，并导致翻译的抑制(Paterson等，Proc.Natl.Acad.Sci.；74卷；4370页；(1987))。因此，一种合适的反义RNA分子，如Ms45的互补分子(US5,478,369)将具有互补于编码为雄性不育所必需的蛋白的mRNA类型的序列(Fabijanski，参见“杂交种子生产的授粉控制的反义基因系统”，US专利申请号08/288,743)。

例如，callase反义RNA的生产可以抑制callase酶的产生，这种酶是释放小孢子所必需的。另外，可通过用一种表达载体抑制类黄酮生物合成诱导雄性不育性，所述表达载体能产生查耳酮合酶A基因的3’非翻译区的反义RNA(Van der Meer等，植物细胞；4卷；253页；(1992))。所述查耳酮合酶A基因的克隆和鉴定由Koes等，基因；81卷；245页；(1989)和Kose等，植物分子生物学12卷；213页；(1989)披露。

另外，可以构建一种表达载体，其中，所述雄性组织优选的调控区可操作地连接于编码一种核酶的核苷酸序列。核酶可以被设计成表达内切核酸酶活性，所述酶可以针对mRNA分子上的特定靶序列。例如，Steinecke等，EMBO杂志；11卷；1525页；(1992)，用核酶在烟草原生质体中实现了对新霉素磷酸转移酶基因表达的接近100％的抑制。最近，Perriman等，反义研究和发展；3卷；253页；(1993)，用表达修饰的锤头核酶的载体在烟草原生质体中抑制了氯霉素乙酰转移酶活性。在本发明的含义内，核酶的合适的靶RNA分子包括编码为雄性育性所必需的蛋白的mRNA，如callase mRNA和Ms45 mRNA。

在另一种替代方案中，可以构建表达载体，其中，雄性组织优选的调控区指导能促进RNaseP-介导的靶mRNA分子裂解的RNA转录物的产生。根据该方法，可以构建一种外部指导序列，用于引导所述内源核酶RNaseP至特定类型的细胞内mRNA上，该mRNA随后被细胞核酶裂解(US专利号5,168,053；Yuan等，科学；263卷；1269页；(1994))。所述外部指导序列优选包括互补于编码为雄性育性所必需的蛋白的mRNA的10-15个核苷酸序列，和一个3’-RCCA核苷酸序列，其中，R优选为嘌呤。所述外部指导序列转录物通过在mRNA和所述互补的外部指导序列之间形成碱基对结合到所述靶mRNA上，由此促进由RNaseP在碱基配对区5’侧核苷酸上对mRNA的裂解。

另一种替代方案是使用aptamer技术，其中，所述互补核苷酸单位是起着特定靶分子的配体作用的核苷酸(US5472841)。所述靶分子可以是对雄性育性必需的产物或者是能破坏雄性育性的产物。使用这种方法，可以为所述靶分子选择aptamer，例如Ms45或亲和素。它可以结合和抑制所述靶分子的表达。编码所述aptamer的核苷酸序列可以是表达载体的一部分，该载体是这样构建的，使得雄性组织优选的调控区指导aptamer的产生。

还可以通过破坏对雄性育性重要的基因，如Ms45或Ms2基因导入不育性(Mark，G.M.等，自然；363卷；715-717页；(1993))。基因破坏方法是本领域中众所周知的，包括，但不限于转座因子插入和突变诱导。

6.在F1杂种中恢复雄性育性

上述方法可用于产生转基因雄性不育玉米植物，用于大规模生产近交系之间的F1杂种。如果转基因雄性不育植物的卵细胞并不是都含有能破坏绒毡层功能的外源基因，则一部分F1杂种将具有雄性可育表型。另一方面，如果所述外源基因存在于转基因雄性不育植物的所有卵细胞中，则F1杂种将具有雄性不育表型，因为由所述外源基因诱导的不育性是显性的，因此，用一种雄性育性恢复系统提供雄性可育F1杂种的生产是理想的。当收获的产物是种子或者当作物是自花授粉时，所述育性恢复系统具有特别的价值。

另外，当所述雄性组织优选的调控区可操作地连接于诸如在WO89/10396中所披露的诱导型启动子时(Marianai等，具有改性的雄蕊细胞的植物)，而所述诱导型启动子是响应于外部控制的时，所述育性恢复系统具有特别价值。所述连接的雄性组织优选的调控区包括一个雄性组织优选的调控区、一个诱导型启动子和一个外源基因。

雄性育性恢复的一种方法是，让转基因雄性不育植物与含有受雄性组织优选的调控区控制的恢复基因的转基因雄性可育植物杂交。例如，Fabijanski，参见“杂交种子生产的授粉控制反义基因系统”，US专利申请号08/288,734，让表达芽孢杆菌RNA酶抑制物(被命名为“barstar”)的雄性可育植株，与表达芽孢杆菌RNA酶的雄性不育植物杂交。Hartley，分子生物学杂志；202卷；913页；(1988)中披露了barstar的核苷酸序列。

另一种方法是，让在一个重要的雄性育性基因中含有破坏的雄性不育植物与含有连接于诸如Ms45或Ms2基因上的未被破坏的可育基因拷贝的雄性组织优选的调控区的转基因雄性可育植物杂交。Ms45基因的完整序列包含在US5,478,369中，Ms2的完整序列披露于Mark，G.M.等，自然；363卷；715-717页；(1993)。

另外，雄性育性恢复可以通过在雄性可育植物中表达诸如毒素核酶或aptamers的互补核苷酸单位，以便中和雄性不育植物中毒素的作用而实现。因此，通过生产一种雄性可育的转基因植物可以恢复F1杂种的雄性育性，所述转基因植物能合成一种特殊类型的RNA分子或多肽，以便抵消在所述雄性不育转基因植物中表达的特殊外源基因的作用。

在恢复雄性育性的另一种方法中，转基因雄性不育植物含有一个表达载体，该载体具有一个雄性组织优选的调控区，一个原核调控区(源于原核调控系统)和一个能破坏绒毡层功能的外源基因。所生产的转基因雄性可育植物能在雄性组织优选的调控区的控制下表达一种原核肽。在由雄性不育和雄性可育杂交得到的F1杂种中，所述原核肽结合于所述原核调控序列上，并抑制能破坏雄性育性的外源基因的表达。这种育性恢复方法的一个优点是可将一种形式的转基因雄性可育植物用于提供F1育性，而无论被用于在所述转基因雄性不育植物中破坏绒毡层功能的外源基因是什么。

例如，可将LexA基因/LexA操纵子系统用于按照本发明调节基因表达。参见US4,833,080和Wang等，分子细胞生物学；13卷；1805页；(1993)。更具体地讲，所述雄性不育植物的表达载体可以含有LexA操纵子序列，而雄性可育植物的表达载体含有LexA抑制物的编码序列。在F1杂种中，所述LexA抑制物可以结合在LexA操纵子序列上，并抑制编码能够破坏雄性育性的产物的外源基因的转录。所述产物包括，但不限于亲和素、DAM甲基化酶、白喉毒素、RNaseT，芽孢杆菌RNA酶、rolB和查尔酮合酶A。

例如，可以通过合成含有已知的LexA操纵子序列的DNA片段获得LexA操纵子DNA分子。例如，参见US4,833,080和Garriga等，分子和普通遗传学；236卷；125页；(1992)。可以通过合成编码LexA抑制物的DNA分子获得LexA基因。基因合成技术如上文所述，而LexA基因序列由Garriga等披露(分子和普通遗传学；236卷；125页；(1992))。另外，编码LexA抑制物的DNA分子可以从质粒pRB500中获得，该质粒在美国典型培养物保藏中心的保藏号为67758。本领域技术人员利用原核调控系统可以方便地设计出其他雄性育性恢复方法，所述原核调控系统如lac抑制物/lac操纵子系统或trp抑制物或trp操纵子系统。

7.鉴定调控区的必要部分

一个调控区的必要部分的鉴定，可以通过本领域技术人员熟知的方法在调控区缺失、添加和/或取代核苷酸而实现。例如，所述变体可以通过用聚合酶链式反应进行的寡核苷酸定向诱变，接头分区诱变和诱变进行(定向诱变：实践方法；IRL出版社；(1991))。

可以用现有的限制位点构建一系列5’缺失的调控区。可以用上文所述的表达载体测定所得到的启动子片段的活性。可以通过在最小的限制片段上产生较小的改变实现进一步的精修和去线性化，该片段优选为大约50或30个核苷酸，更优选为大约20或10个核苷酸，最优选为大约5或1个核苷酸，所述限制片段仍然能够在报导结构上产生正确的表达(定向诱变：实践方法；IRL出版社；(1991))。可以用导入的或天然的限制位点将所述结构导入所述表达载体。还可以通过上述方法或通过PCR或通过本领域技术人员熟知的方法制备一系列3’缺失(定向诱变：实践方法；IRL出版社；(1991))。可以通过在仍然能在所述报导结构上进行正确表达的最小的限制片段上产生较小的改变，实现进一步的精修和去线性化，所述片段优选为大约50或30个核苷酸，更优选为大约20或10个核苷酸，最优选为大约5或1个核苷酸(定向诱变：实践方法；IRL出版社；(1991))。

因此，所述5’和3’缺失可以使对于模拟所述较长的调控区的正确组织和时序表达所必需的最小片段区线性化。一般，编码雄性组织优选的调控区的所述最小片段的序列与其具有序列相同性，该相同性优选为大约70％、75％、或80％，更优选为85％、或90％，最优选为95％、或99％。

以下内容只是用于说明目的的，而不是要限定本发明的范围。

例1

Ms45启动子的基因组克隆和测序

在US5,478,369中披露了Ms45 cDNA的Ac标记和鉴定，以及Northern分析。

将Ms45的部分cDNA用于筛选B73玉米基因组文库。该文库是通过将SAU3A1克隆到BAMHI消化过的基因组克隆载体上而制成的(λDashII，Stratagene，La Jolla，CA)。用适于基因组DNA的大肠杆菌菌株(ER1647，新英格兰试验室，MA)做宿主筛选大约1×10⁶噬斑。经过三轮筛选之后，将克隆AC4.1纯化至纯合。对AC4.1进行限制作图证实，所述克隆为大约13kb长，并含有2个内部BAMHI位点(图1)。所述位点之一还存在于Ms45部分cDNA上。将两个BamHI片段亚克隆到克隆载体上(Bluseript SK+，La Jolla，CA)。5’末端克隆的长度大约为3.5kb，相当于所述内部BAMHI位点的上游(5’)的序列。3’末端克隆为2.5kb，并含有位于所述内部BAMHI位点下游的Ms45序列。与此同时，分离了推测的完整长度的Ms45 cDNA，并进行测序。通过对所述5’末端克隆和Ms45 cDNA进行序列比较，鉴定了推测的翻译起始位点(图1)。

对Ms45启动子区的测序是用Sanger，F.等的双脱氧链终止方法进行的(“用链终止抑制物进行DNA测序”；Proc.Natl.Acad.Sci.；74卷；5463-5467页；(1977))。用本领域公知的技术，用通用寡聚物和其他序列特异性化合物对基因组克隆pac4.1-5’(图1)进行测序。

所述雄性组织优选的调控区具有导入起始密码子处的NCOI位点，并作为NCOI片段克隆到无启动子的Luci表达载体上。这种新的报导载体被称为质粒pHP6045(图2)ATCC No：97828(保藏日为1996年12月12日；美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD20852)。

例2

引物延伸分析

从含有四分体至单核阶段早期花药的玉米穗状雄花中提取总RNA。用乙醇和氯化镁沉淀所述总RNA。提取1mg的总RNA，并用oligo-dT纤维素纯化polyA+mRNA。用本领域技术人员已知的方法从6日龄玉米幼苗叶片和玉米花药中直接提取polyA+RNA。

用本领域技术人员公知的方法，用单链Ms45寡核苷酸制备测序梯，并将35S-dATP用于标准测序方法。

按照以下方法进行引物延伸：

1.5’-末端标记合成寡核苷酸引物。

混合：5pmol引物N11916(PHL11916)，体积为1.0μl

5μl(50μCi)γ32P-ATP(＞5000Ci/mmole)

0.7μl 10×激酶缓冲液

0.7μl T4多核苷酸激酶

在37℃下培养45分钟

用20μl TE稀释，并加热到65℃，使酶失活。

10×激酶缓冲液调整到1ml

0.5M Tris-HCl，pH7.6-8.0 0.5ml，1M

5mM亚精胺 0.05ml，0.1M

100mM氯化镁 0.1ml，1M

100mM DTT 0.5ml，0.5M

0.1mg/ml明胶或BSA 50μl，2mg/ml

0.1ml水

II.退火的引物和RNA

将激酶处理的引物与源于玉米穗状雄花、6日龄玉米幼苗叶片、玉米花药和6日龄玉米叶片的mRNA退火。将2μl mRNA、1μl激酶处理寡聚物、2μl 5×退火缓冲液(1.25M氯化钾，10mM Tris，pH7.9-8.15)，和1μl 30mM氧钒放在冰上混合在一起。用10mM Tris，pH8.15将总体积调至10μl。将该混合物加热到65℃，并冷却到55℃，在热循环仪加热装置上保持4小时。

III.引物延伸

向每一只试管中加热23μl引物延伸混合物(参见以下配方)和0.4μl反向转录酶(SuperScript，BRL，MD)。通过用移液管吸入和放出对该混合物进行混合，并马上放在48℃下，培养45分钟。引物延伸混合物含有10mM氯化镁、5mM DTT，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.33mM，和DEPC水。

加入300μl乙醇，并在-20℃的冰箱中沉淀过夜，然后在微量离心机中沉淀30分钟。在Speed Vac中干燥沉淀物，并溶解在6μl的0.1 NaOH/1mM EDTA中。通过移液和涡旋搅拌混合试管的内含物，以确保所述沉淀物被溶解。将其在室温下放置2.5小时，并加入6μl测序染料(来自USB测序试剂盒的终止溶液)，并让该溶液在大约95℃的温度下变性。将一半样品加样到6％变性聚丙烯酰胺测序凝胶上，用浓缩缓冲液在55瓦的功率下电泳2小时。在凝胶干燥器中干燥所述凝胶，并对柯达X-AR胶片进行曝光。在为期3天的曝光之后，在玉米穗状雄花mRNA引物延伸反应中观察到转录产物，它相当于位于起始密码子上游42个核苷酸的脱氧胸苷(图3)。该位点被称为+1。还在-3上鉴定到一个小的转录起始位点。

例3

测定Ms45雄性组织优选的调控区的阶段和组织专一性

将完整长度的雄性组织优选的调控区(序列1)与源于萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶报导基因(DeWit，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；82卷；7870-7873页；(1985))融合在源于马铃薯的PinII-3’非翻译区上(An，G.等，“马铃薯创伤诱导型蛋白酶抑制物II基因的3’控制区的功能分析”；植物细胞；1卷；115-122页；(1989))。将各个发育阶段的玉米花药放在用琼脂(Phytagar，Sigma，St.Louis)固化的穗状雄花培养基(Pareddy等，理论应用遗传学；77卷；521-526页；(1989))上。对来自每一个小花的三个花药中的一个进行阶段分级，并通过阶段分级将其余的花药合并在一起，并铺平板以便进行微粒轰击，通常每一个平板上有8个花药。用1.8μ钨颗粒以1100p.s.i.的压力冲击所述花药，在所述钨颗粒上沉淀有Ms45雄性组织优选的调控区-荧光素酶报导结构的DNA。位于特定平板上的所有花药处在相同的阶段：减数分裂前，减数分裂I，减数分裂II，四分体，小孢子释放，单核小孢子早期，或单核小孢子中期。对每一个阶段进行3个重复的冲击。在26℃下过夜培养花药18小时。用来自每一个平板的花药制备粗提物，并测定荧光素酶活性和蛋白含量。将所述荧光素酶活性对蛋白浓度进行校准，并在图4中作为发育阶段的函数进行作图。主要活性出现在发育中四分体和小孢子释放阶段，较小的活性出现在减数分裂I和II阶段，而在单核阶段早期几乎检测不到活性。在减数分裂前期或单核花药中期没有高出背景的明显活性。

另外，用相同方法轰击在含有2.0μg/ml 2，4-D的MS培养基上培养的胚胎发生愈伤组织，所不同的是轰击压力为650p.s.i.，钨颗粒上涂有与Ms45雄性组织优选的调控区融合或者与玉米遍在蛋白启动子融合(US5,510,474)的荧光素酶报导基因和与玉米遍在蛋白启动子融合的uidA(GUS)报导基因。荧光素酶校准为β-葡糖醛酸酶。如图5所示，Ms45雄性组织优选的调控区不能够在胚胎发生愈伤组织和芽中启动瞬时表达，尽管所述遍在蛋白启动子能够表达。类似地，将玉米种子吸涨并在蒸馏水中萌发2天，并放置在潮湿的滤纸上，对其进行微粒轰击，并测定其下胚轴中荧光素酶和β-葡糖醛酸酶。所述遍在蛋白调控区(启动子)是有活性的，但Ms45雄性组织优选的调控区没有活性。

将所述结果与RNA杂交分析的结果进行比较。收集各个发育阶段的玉米花药，并按以下方法处理。将来自每一个小花的3个花药中的一个固定在(3∶1乙醇∶冰乙酸)微量滴定板的一个孔中，在另一个微量滴定板的相应的位置上的一个孔中用液氮对2个花药进行冷冻。对固定的花药进行阶段分级；然后，通过阶段分级合并相应的冷冻花药，从20个花药中提取PolyA+RNA(RNA微量快速制备试剂盒，Pharmacia Uppsila，Sweden)，将来自每一个合并阶段的花药的相同体积的RNA放在1.2％琼脂糖上，在MOPS缓冲液+甲醛中电泳。通过吸印将RNA样品转移到尼龙膜上，通过UV交联固定(Stratalinker，Stratagene公司，La Jolla)，并与³²P-标记的探针片段杂交，所述探针片段包括所有的Ms45 cDNA编码区和3’区。图4所示的结果证实了在四分体至单核早期阶段可检测到的稳态Ms45转录物，而且有可能提前到，但不早于减数分裂的末期II。在减数分裂期间由Ms45雄性组织优选的调控区产生的转录物含量没有积累到足于通过RNA杂交检测到的水平，或者在瞬时测定中观察到的减数分裂阶段雄性组织优选的调控区活性在植物中不存在。

因此，Ms45雄性组织优选的调控区(序列1)被鉴定为具有至少从花药发育的四分体阶段到四分体释放阶段的雄性组织优选的表达，在减数分裂和单核阶段早期有可能具有较低水平的表达。

例4

TATA框分析

在编码Ms45雄性组织优选的调控区的DNA的1388bp片段中，转录的主要起点被确定为+1，次要的转录起点相对所述主要转录起点确定为-3，推测的TATA框(CATTAAA)被确定为-33。业已发现，位于-30处的序列TAAAGAT应当是实际TATA框的候选者。将所述1388bp片段可操作地连接于一个报导基因框上，该框包括源于萤火虫的荧光素酶编码区(Pareddy等，理论应用遗传学；77卷；521-526页；(1989))，其后是源于马铃薯蛋白酶抑制物II的3’非翻译区(An，G.等，“马铃薯创伤诱导型蛋白酶抑制物II基因的3’控制区的功能分析”；植物细胞；1卷；115-122页)。

本领域一种众所周知的分析TATA框的方法是通过突变进行。在另一种衍生物中，在特定的衍生物中对推定的TATA框的1-6个核苷酸进行改变。将BGLII位点导入-38位点，将推测的TATA框从CATTAAA改变成TATTAAA，后者与规范的TATA框序列TATATAA更加吻合。

本领域技术人员可以理解的是，在TATA框里进行的某些取代可能影响所述启动子的表达水平，而不影响组织专一性。如图7所示，在-38处引入的与BgIII相关的TATA框的改变，可在花药中显著提高瞬时表达的水平，这进一步的表明，位于-33处的序列是真正的TATA框。在-40、-43、-51、或-53处引入BGLII位点不会提高所述启动子的活性(数据未显示)，这表明，在-38BGLII位点处导入观察到的提高与BGLII位点本身不相关。

为了进一步测定其功能，引入了对推测TATA框的其他修饰。将推测的TATA框序列从CATTAAA改变成GATTAAA、CATGGAA或GGGCCCA都能降低在花药中的瞬时表达水平，这进一步表明该序列作为TATA框的重要性。另人吃惊的是，所述突变没有一个会破坏瞬时活性；不过，业已报导了在缺乏TATA框样序列甚至无TATA启动子的情况下在其他系统中存在瞬时活性(Guan，L.，和J.G.Scandalios，植物杂志；3卷；527-536页；(1993)；Close，P.S.，“玉米线粒体侣伴蛋白60的两个核基因的克隆和分子鉴定”；(学位论文)；衣阿华大学，Ames，衣阿华；92页，128；(1993))。

尽管前面披露了本发明的优选实施方案，本领域技术人员可以理解的是，可以进行改变和改进，而仍然落在本发明的范围内。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：Pioneer Hi-Bred International，Inc.

(ii)发明名称：雄性组织优选的调控区以及使用该调控区的方法

(iii)序列数：2

(iv)相关地址：

(A)收件人：Pioneer Hi-Bred International，Inc.

(B)街道：800Capital Square，Locust Street

(C)城市：Des Moines

(D)州：Iowa

(E)国家：美国

(F)邮编：50309

(v)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30

(vi)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类号：

(viii)律师/代理人资料：

(A)姓名：Sweeney，Particia A

(B)注册号：32,733

(C)资料/档案号：0578-PCT

(ix)通信资料：

(A)电话：(515)248-4800

(B)传真：(515)334-6883

(2)序列1资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1394个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：序列1：

CCATGGTGTC TCTATGAAAA AGATGAGTAC AATGTGTCTA TATCCGTTTT CTTAGGGTCC 60

CTTCTTCTGC CTTATTACTG ACTGAATCGG GGTTACAAAA AACTTCCACG GGTGCATGAT 120

CTCCATGTTC CACTTCTCCC ACCTCGCGTT GCACATTTCT TGGATGTCGG TGGTTCCCAT 180

CTGACCGAGG CCCATCAGAC ACCTTTCGGG ACACCCATCA AGGGCCTTTC GGATGGCCCA 240

CGAGACGTAT CGGGTCGTGG TGATCCAGGG GATATATGTC CCCCACAATC GTCACCTATA 300

TTATTATTCT TTAGATATTA TTTAATTTTT GGAAAAATAA CAAACTTATA CTTTTGTGTA 360

GGGCCTCAGC ATAGATTTTC GCTTAGGGCC CAGAAATGCG AGGACCAGCC ATGTCTAGTG 420

TCCACTATTG GCACTACCCA GAACAAGATT TAAAAAAATA ACCAAAGTAA CTAATCCACT 480

CGAAAGCTAT CATGTAATGT TTAAAGAAAC ATCTATTAAA ACCACGATCC TCTTAAAAAA 540

CAAGCATATT TCGAAAGAGA CAAATTATGT TACAGTTTAC AAACATCTAA GAGCGACAAA 600

TTATATCGAA AGGTAAGCTA TGACGTTCAG ATTTTTCTTT TTCATTCTTG TTATTTTGTT 660

ATTGTTTTTA TATACATTTT CTTCTCTTAC AATAGAGTGA TTTTCTTCCG ATTTTATAAA 720

ATGACTATAA AGTCATTTTT ATATAAGAGC ACGCATGTCG TAGATTCTCG TTCAAAAATC 780

TTTCTGATTT TTTTAAGAGC TAGTTTGGCA ACCCTGTTTC TTTCAAAGAA TTTTGATTTT 840

TTCAAAAAAA ATTAGTTTAT TTTCTCTTTA TAAAATAGAA AACACTTAGA AAAATAGAGT 900

TGCCAGACTA GCCCTAGAAT GTTTTCCCAA TAAATTACAA TCACTGTGTA TAATTATTTG 960

GCCAGCCCCA TAAATTATTT AAACCGAAAC TGAAATCGAG CGAAACCAAA TCTGAGCTAT 1020

TTCTCTAGAT TAGTAAAAAG GGAGAGAGAG AGGAAGAAAT CAGTTTTAAG TCATTGTCCC 1080

TGAGATGTGC GGTTTGGCAA CGATAGCCAC CGTAATCATA GCTCATAGGT GCCTACGTCA 1140

GGTTCGGCAG CTCTCGTGTC ATCTCACATG GCATACTACA TGCTTGTTCA ACCGTTCGTC 1200

TTGTTCCATC GTCCAAGCCT TGCCTATTCT GAACCAAGAG GATACCTACT CCCAAACAAT 1260

CCATCTTACT CATGCAACTT CCATGCAAAC ACGCACATAT GTTTCCTGAA CCAATCCATT 1320

AAAGATCACA ACAGCTAGCG TTCTCCCGCT AGCTTCCCTC TCTCCTCTGC CGATCTTTTT 1380

CGTCCACCAC CATG 1394

(2)序列2资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1394个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：序列2：

CCATGGTGTC TCTATGAAAA AGATGAGTAC AATGTGTCTA TATCCGTTTT CTTAGGGTCC 60

CTTCTTCTGC CTTATTACTG ACTGAATCGG GGTTACAAAA AACTTCCACG GGTGCATGAT 120

CTCCATGTTC CACTTCTCCC ACCTCGCGTT GCACATTTCT TGGATGTCGG TGGTTCCCAT 180

CTGACCGAGG CCCATCAGAC ACCTTTCGGG ACACCCATCA AGGGCCTTTC GGATGGCCCA 240

CGAGACGTAT CGGGTCGTGG TGATCCAGGG GATATATGTC CCCCACAATC GTCACCTATA 300

TTATTATTCT TTAGATATTA TTTAATTTTT GGAAAAATAA CAAACTTATA CTTTTGTGTA 360

GGGCCTCAGC ATAGATTTTC GCTTAGGGCC CAGAAATGCG AGGACCAGCC ATGTCTAGTG 420

TCCACTATTG GCACTACCCA GAACAAGATT TAAAAAAATA ACCAAAGTAA CTAATCCACT 480

CGAAAGCTAT CATGTAATGT TTAAAGAAAC ATCTATTAAA ACCACGATCC TCTTAAAAAA 540

CAAGCATATT TCGAAAGAGA CAAATTATGT TACAGTTTAC AAACATCTAA GAGCGACAAA 600

TTATATCGAA AGGTAAGCTA TGACGTTCAG ATTTTTCTTT TTCATTCTTG TTATTTTGTT 660

ATTGTTTTTA TATACATTTT CTTCTCTTAC AATAGAGTGA TTTTCTTCCG ATTTTATAAA 720

ATGACTATAA AGTCATTTTT ATATAAGAGC ACGCATGTCG TAGATTCTCG TTCAAAAATC 780

TTTCTGATTT TTTTAAGAGC TAGTTTGGCA ACCCTGTTTC TTTCAAAGAA TTTTGATTTT 840

TTCAAAAAAA ATTAGTTTAT TTTCTCTTTA TAAAATAGAA AACACTTAGA AAAATAGAGT 900

TGCCAGACTA GCCCTAGAAT GTTTTCCCAA TAAATTACAA TCACTGTGTA TAATTATTTG 960

GCCAGCCCCA TAAATTATTT AAACCGAAAC TGAAATCGAG CGAAACCAAA TCTGAGCTAT 1020

TTCTCTAGAT TAGTAAAAAG GGAGAGAGAG AGGAAGAAAT CAGTTTTAAG TCATTGTCCC 1080

TGAGATGTGC GGTTTGGCAA CGATAGCCAC CGTAATCATA GCTCATAGGT GCCTACGTCA 1140

GGTTCGGCAG CTCTCGTGTC ATCTCACATG GCATACTACA TGCTTGTTCA ACCGTTCGTC 1200

TTGTTCCATC GTCCAAGCCT TGCCTATTCT GAACCAAGAG GATACCTACT CCCAAACAAT 1260

CCATCTTACT CATGCAACTT CCATGCAAAC ACGCACATAT GTTTCCTGAA CAGATCTATT 1320

AAAGATCACA ACAGCTAGCG TTCTCCCGCT AGCTTCCCTC TCTCCTCTGC CGATCTTTTT 1380

CGTCCACCAC CATG 1394

Claims

1.一种编码Ms45雄性组织偏好的调控区的分离的核酸，包括序列1的核苷酸序列或至少与其有90％相同性的序列。

2.一种编码Ms45雄性组织偏好的调控区的分离的核酸，包括序列2的核苷酸序列或至少与其有90％相同性的序列。

3.一种重组表达载体，包括权利要求1所述的分离的核酸，该核酸可操作地连接于编码一种外源基因的核苷酸序列上，以便该外源基因以雄性组织偏好的方式表达。

4.一种生产能以雄性组织偏好方式表达外源核苷酸序列的转化植物的方法，包括将可操作地连接于雄性组织偏好的调控区上的所述外源核苷酸序列导入植物中，所述调控区包括序列1的核苷酸序列或至少与其有90％相同性的序列。

5.如权利要求4的方法，其中，所述导入步骤是通过微粒轰击进行的。

6.如权利要求4的方法，其中，所述导入步骤使用农杆菌属。

7.如权利要求6的方法，其中，所述农杆菌属包括Ti质粒。

8.如权利要求4的方法，其中，所述调控区以雄性组织偏好方式在选自下列一组的组织中表达：花粉、绒毡层、花药、穗状雄花、花粉母细胞和小孢子。

9.如权利要求4的方法，其中，所述雄性组织偏好的调控区的雄性组织偏好的表达部分是以一个以上拷贝存在。

10.如权利要求4的方法，其中，所述外源核苷酸序列包括编码一种原核调控系统的DNA序列。

11.如权利要求4的方法，其中，所述外源核苷酸序列编码一种细胞毒基因。

12.如权利要求4的方法，其中，所述外源核苷酸序列编码一种亲和素基因。

13.如权利要求4的方法，其中，所述外源核苷酸序列编码一种DAM甲基化酶基因。

14.如权利要求4的方法，其中，所述外源核苷酸序列编码可操作地连接于一个互补的核苷酸单位上的雄性组织偏好的调控区。

15.如权利要求14的方法，其中，所述互补的核苷酸单位选自下列一组：callase反义RNA、芽孢杆菌RNA酶反义RNA、查尔酮合酶反义RNA和Ms45反义RNA。

16.如权利要求14的方法，其中，所述互补的核苷酸单位选自下列一组：核酶和外部指导序列。

17.一种调节植物育性的方法，包括生产一种转化植物，其中，如权利要求1所述的雄性组织偏好的调控区可操作地连接于一个外源基因上，表达所述外源核苷酸序列，以便影响其育性。

18.如权利要求17的方法，其中，所述外源核苷酸序列编码选自下列一组的产物：生长素、rolB和白喉毒素。

19.如权利要求17的方法，其中，所述外源核苷酸序列是雄性不育基因。

20.如权利要求19的方法，其中，所述雄性不育基因是Ms45。

21.如权利要求17的方法，其中，所述植物是单子叶植物。

22.如权利要求17的方法，其中，所述植物是双子叶植物。

23.一种生产杂交种子的方法，包括将第一雄性可育植株和按照权利要求4的方法生产的第二雄性不育植株以异花授粉的并列形式种植，让所述异花授粉发生，并收获所产生的种子。

24.如权利要求23的方法，其中，所述植物是玉米。

25.一种以雄性组织偏好的方式表达外源核苷酸序列的转化植物的组织，其中所述组织包含可操作地连接于雄性组织偏好的调控区上的外源核苷酸序列，所述调控区包括序列1或序列2的核苷酸序列。

26.如权利要求25的组织，其中，调控区的雄性组织偏好的表达部分可以以一个以上的拷贝存在。

27.如权利要求25的组织，其中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

28.如权利要求25的组织，其中，所述植物选自玉米、向日葵、大豆、小麦、加拿大油菜、稻和高粱。

29.如权利要求25的组织，其选自：花粉、果穗、胚珠、花药、穗状雄花、雄蕊、雌蕊和植物细胞。

30.一种以雄性组织偏好的方式表达外源核苷酸序列的转化植物的细胞，其中所述细胞包含可操作地连接于雄性组织偏好的调控区上的外源核苷酸序列，所述调控区包括序列1或序列2的核苷酸序列。

31.如权利要求30的细胞，其中，调控区的雄性组织偏好的表达部分可以以一个以上的拷贝存在。

32.如权利要求30的细胞，其中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

33.如权利要求30的细胞，其中，所述植物选自玉米、向日葵、大豆、小麦、加拿大油菜、稻和高粱。