DE69828505T2 - Regulatorische region, spezifisch für männliche gewebe und verfahren zu deren anwendung - Google Patents

Regulatorische region, spezifisch für männliche gewebe und verfahren zu deren anwendung Download PDF

Info

Publication number
DE69828505T2
DE69828505T2 DE69828505T DE69828505T DE69828505T2 DE 69828505 T2 DE69828505 T2 DE 69828505T2 DE 69828505 T DE69828505 T DE 69828505T DE 69828505 T DE69828505 T DE 69828505T DE 69828505 T2 DE69828505 T2 DE 69828505T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
male
plant
tissues
nucleotide sequence
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69828505T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69828505D1 (de
Inventor
C. Marc ALBERTSEN
W. Timothy FOX
W. Carl GARNAAT
A. Gary HUFFMAN
L. Timmy KENDALL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pioneer Hi Bred International Inc
Original Assignee
Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pioneer Hi Bred International Inc filed Critical Pioneer Hi Bred International Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE69828505D1 publication Critical patent/DE69828505D1/de
Publication of DE69828505T2 publication Critical patent/DE69828505T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12N9/1037—Naringenin-chalcone synthase (2.3.1.74), i.e. chalcone synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01039—Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase (3.2.1.39)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01003—Long-chain-fatty-acid-CoA ligase (6.2.1.3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf isolierte DNA-Sequenzen, welche als regulatorische Regionen in eukaryotischen Zellen fungieren. Insbesondere, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf isolierte DNA-Sequenzen aus Mais, welche als regulatorische Regionen, spezifisch für männliches Gewebe fungieren und eine Rolle in der Expression von Genen in männlichen Geweben spielen. Die vorliegende Erfindung ist ebenso auf ein Verfahren gerichtet, das einem Gen, das normalerweise oder normalerweise nicht in männlichen Geweben exprimiert wird, die Fähigkeit verleiht in einer für männliches Gewebe spezifischen Art und Weise, exprimiert zu werden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Gewebe- und zeitspezifische Genexpression und Regulation werden unter anderem während der sexuellen Reproduktion in Eukaryoten angetroffen. In der Pflanzengamatogenese treten wichtige zytologische und biochemische Veränderungen während der Pollenentwicklung auf, wenn die asymmetrische mitotische Teilung der haploiden Mikrospore zu der Bildung von zwei Zellen führt, beide mit unterschiedlichen Entwicklungsschicksalen. Die vegetativen Zellen unterstützen Pollenwachstum während die regenerativen Zellen eine Mitose durchmachen und sich in Samenzellen entwickeln. Zu beiden Wegen wurden innerhalb des Pollens spezifische Messenger-RNAs in Pflanzen wie beispielsweise Mais, Tomate, Tabak, Reis und Stiefmütterchen identifiziert und spezifische Botschaften für Pollen oder einen oder mehrere andere Zelltypen innerhalb der Anthere wie beispielsweise Tapetum, Epidermis und Stomium ebenso identifiziert.
  • Die Pollengenexpression während der Differenzierung involviert schätzungsweise 24.000 Gene (Willing, et al., "An Analysis of the Quantity and Diversity of mRNA's From Pollen and Shoots of Zea mays"; Theor. Appl. Genet.; Vol. 75, S. 751–753; (1988)), wenngleich nur 10% der Klone aus einer cDNA-Bibliothek mann-spezifisch sind (Stinson, et al., "Genes Expressed in the Male Gametophyte and Their Isolation"; Plant Physiol.; Vol. 83; S. 442–447; (1987) und der Prozentsatz der Gene, die in Pollen exprimiert werden, die pollenspezifisch sind, zwischen 5% und 80% liegt (Willing, et al., "An Analysis of the Quantity and Diversity of mRNA's From Pollen and Shoots of Zea mays"; Theor. Appl. Genet.; Vol. 75; S. 751–753; (1988)). Dieser komplexe Prozess der Mikrosporogenese involviert die sequenzielle Herstellung von vielen Genprodukten.
  • Bis heute wurden Mann-spezifische Gene aus Pflanzen kloniert: für zwei von denen, das Mais Ms45-Gen (U.S. Pat. Nr. 5,478,369) und das Arabidopsis-Ms2-Gen (Mark, G. M., et al., Nature; Vol. 363, S. 715–717 (1993)), wurde gezeigt, dass sie für die Pollenentwicklung benötigt werden. Andere Beispiele von Mann-spezifischen Promotoren in Pflanzen schließen Zm13, PG und SGB6 ein.
  • Der Zm13 Promotor ist in U.S. Pat. Nr. 5,086,169 offenbart. Er besteht aus 1315 Basenpaaren und ist aus einem pollenspezifischen Gen durch Hanson, et al. beschrieben, Plant Cell; Vol. 1; S. 173–179; (1989). Dieses Gen hybridisiert mit mRNA, die nur in Pollen gefunden wird.
  • Ein anderer pollenspezifischer Promotor wurde isoliert und charakterisiert stromaufwärts des pollenspezifischen Polygalacturonasegens (PG) U.S. Pat. Nr. 5,412,085. Diese Promotorregion umfasst 2687 Basenpaare und wird überwiegend in Pollen und jungen männlichen Blütenständen/Fahnen („tassel") exprimiert, aber nicht vor den jungen männliche Blütenstände/Fahnen. U.S. Pat. Nr. 5,545,546, auch von Allen, beschreibt einen anderen polllenspezifischen Promotor aus dem Maispolygalaktoturonasegen. Er wird nur in Pollen und in jungen männlichen Blütenständen/Fahnen exprimiert.
  • U.S. Pat. Nr. 5.470,359 beschreibt eine regulatorische Region aus dem SGB6-Gen aus Mais, welches Tapetum-Spezifität verlieht. Das Gewebe der Expression, das Tapetum, ist eine Schicht von Zellen, die die mikrosporogenen Zellen in der Anthere umgeben und ihnen Nährstoffe zur Verfügung stellen.
  • Neun Antheren-spezifische cDNA und genomische Klone aus Tabak werden in U.S. Pat. Nr. 5,477,002 beschrieben. Die cDNA Klone wurden Antheren-spezifisch durch Northern-Analyse in den Entwicklungsprofilen unterschieden. Der Klon Ant32 ist Tapetum-spezifisch.
  • Das europäische Pat. Nr. 0 420 819 A1 beschreibt das Verfahren zur Herstellung von männlichen sterilen Pflanzen mit dem wun1 Gen.
  • PCT WO 90/08825 beschreibt die Antheren-spezifischen cDNAs TA13, TA26 und TA29 und deren Verwendung in einem männlichen Sterilitätssystem.
  • PCT WO 90/08825 erklärt die männlichen-Sterilitätsgene pMS10, pMS14 und pMS18 und ihre Verwendung mit einem GUS Reportergen.
  • U.S. Pat. Nr. 5,589,610 erläutert einen Promotor der zu Antheren-spezifischer cDNA und Antheren-bevorzugter cDNA AC444 korrespondiert.
  • Die Verwendung eines Pflanzenpromotors und einem exogenen Gen um einen Wechsel in der genetischen Veranlagung von Pflanzen zu bewirken ist im Stand der Technik bekannt (U.S. Pat. Nr. 5,432,068, 5,412,085, 5,545,546, 5,470,359 und 5,478,369). Diese Patente diskutieren Pflanzenexpressionskassetten mit einem gewebespezifischen Promotor, gebunden an ein Gen, um männliche Sterilität, Fertilität zu beeinflussen oder andererseits, um ein Gen in einem spezifischen Gewebe zu exprimieren. Dennoch lehren diese Patente nicht die Verwendung von dieser regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe, oder die Verwendung dieser regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe mit einem exogenen Gen als einem Verfahren zum Kontrollieren der männlichen Sterilität.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe gerichtet und Verfahren zur Verwendung derselben. Die Expression eines exogenen Gens in einer Art und Weise, spezifisch für männliches Gewebe kann männliche Fertilität vermitteln und ist in vielen Systemen nützlich, wie beispielsweise in der Hybrid-Samenproduktion.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung stellt ein isoliertes Nukleinsäuremolekül zur Verfügung umfassend eine Ms45-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, die in männlichen Geweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben der Pflanze steuert und umfasst:
    • a) eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder 2;
    • b) eine Nukleotidsequenz mit wenigstens 70% Identität zu einer Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder 2, die in männlichen Geweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben der Pflanze steuert;
    • c) eine Nukleotidsequenz, die mit einer Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder 2 unter hochstringenten Bedingungen, dargestellt durch eine Waschstringenz von 50% Formamid mit 5X Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 1X SSPE bei 42°C hybridisiert und in männlichen Pflanzengeweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben der Pflanze steuert;
    • d) ein Fragment einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 oder 2, die in männlichen Pflanzengeweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben der Pflanze steuert; oder
    • e) eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, aus dem Inneren der Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder 2, die in männlichen Geweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben einer Pflanze steuert; verbunden mit einem Core-Promotor.
  • Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Exprimieren exogener Gene in einer Art und Weise, spezifisch für männliches Gewebe unter Verwendung eines Expressionsvektors zur Verfügung zu stellen, der einem exogenen Gen eine Expression, spezifisch für männliches Gewebe, verleiht. Dieses Verfahren kann zur Wiederherstellung (wie in einem männlichen Sterilitätssystem) oder um anderweitig Fertilität zu verleihen, wie in der Hybrid-Samenproduktion, verwendet werden. Es ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung, eine DNA regulatorische Region, die Genexpression, spezifisch für männliches Gewebe verleiht, zur Verfügung stellt. Es ist ein auch ein Gegenstand dieser Erfindung eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe zur Verfügung zu stellen oder jene mit einer Sequenzidentität dazu, bevorzugt mit ungefähr 70%, 75% oder 80%, mehr bevorzugt mit ungefähr 85% oder 90%, und am meisten bevorzugt von ungefähr 95% oder 99%.
  • Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend für die Ms45-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, eine isolierte Nukleinsäuresequenz codierend für eine Ms45-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe aus Zea mays, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 1 oder jene mit Sequenzidentität dazu, zur Verfügung zu stellen. Es ist auch ein Gegenstand dieser Erfindung eine isolierte Nukleinsäuresequenz codierend für eine Ms45-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe aus Zea mays, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 2 oder jene mit Sequenzidentität dazu, zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend die isolierte Nukleinsäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 1 oder jene mit Sequenzidentität dazu, funktionell verknüpft mit einer Nukleotidsequenz codierend für ein exogenes Gen, wie beispielsweise, dass besagte Nukleotidsequenz in einer Art und Weise, spezifisch für männliches Gewebe, derart exprimiert wird, dass es die Expression eines exogenen Gens unterstützt.
  • Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, ein exogenes Gen zur Verfügung zu stellen, wobei besagtes exogenes Gen Ms45 ist.
  • Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Pflanze zur Verfügung zu stellen, die eine exogene Nukleotidsequenz in einer Art und Weise, spezifisch für männliches Gewebe exprimiert, umfassend die Schritte des Einführens besagter exogener Nukleotidsequenz in eine Pflanze, funktionell verknüpft mit einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe, umfassend eine Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist oder jene mit Sequenzidentität dazu. Das Verfahren, wobei besagter Einführungsschritt durch Mikroprojektilbeschuss ("micro projectile bombardment") durchgeführt werden kann unter möglicher Verwendung von Agrobakterium oder einem Transfervektor, umfassend ein Ti-Plasmid. Es kann auch mehr als eine Kopie der besagten exogenen Nukleotidsequenz, funktionell verknüpft an eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe verknüpft sein.
  • Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, worin besagte regulatorische Region in Geweben exprimiert wird, in einer Art und Weise, spezifisch für männliches Gewebe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pollen, Tapetum, Antheren, männlicher Blütenstand/Fahnen („tassel"), Pollenmutterzellen und Mikrosporen.
  • Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, eine transformierte Pflanze, die eine exogene Nukleotidsequenz in einer Art und Weise, spezifisch für männliches Gewebe zur Verfügung zu stellt, die eine exogene Nukleotidsequenz aufweist, die funktionell verknüpft ist mit einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe, gezeigt in SEQ ID NO: 1 oder jenen mit Sequenzidentität dazu. Besagte Pflanze ist eine Monokotyle oder eine Dikotyle. Jede Pflanze, die fähig ist transformiert zu werden, kann verwendet werden, einschließlich beispielsweise Mais, Sonnenblume, Sojabohne, Weizen, Rapsarten ("Granola"), Reis und Sorghum. Diese Erfindung stellt ebenso das transformierte Gewebe der transformierten Pflanze zur Verfügung. Beispielsweise kann das Gewebe Pollen, Ähren, Samenanlagen, Antheren, männlicher Blütenstand/Fahnen („tassel"), Staminapistillen und Pflanzenzellen sein. Die transformierte Pflanze kann mehr als eine Kopie der besagten exogenen Nukleotidsequenz enthalten, funktionell verknüpft an eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe.
  • Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, ein Verfahren zum Vermitteln von Fertilität in einer Pflanze zur Verfügung zu stellen, wobei die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, besagte exogene Nukleotidsequenz exprimiert, sodass es Auswirkungen auf die Fertilität hat. Diese exogene Nukleotidsequenz kann jede Sequenz sein, die Auswirkungen auf die männliche Fertilität hat und kann beispielsweise eine komplementäre nukleotidische Einheit sein codierend für solche Antisensemoleküle wie Kallase-Antisense-RNA, Barnase-Antisense-RNA, Chalconsynthase-Antisense-RNA und Ms45-Antisense-RNA, oder Ribozy me und externe Guide-Sequenzen oder Aptamere oder einzelsträngige Nukleotide sein. Die exogene Nukleotidsequenz kann ebenso für Auxine, rol B, Zytotoxine, Diphtherietoxin, DAM-Methylase, Avidin codieren oder kann ausgewählt sein aus einem prokaryotischen Regulationssystem. Ebenso ist diese exogene Nukleotidsequenz ein männliches Sterilitätsgen oder das Ms45-strukturelle Gen und diese Pflanze ist eine Monokotyle oder eine Dikotyle.
  • Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Hybridsaatgut zur Verfügung zu stellen, umfassend ein Pflanzen in fremdbestäubender Juxtaposition, eine männliche fertile Pflanze und eine männliche infertile Pflanze, hergestellt gemäß des obigen Verfahrens, das Erlauben der Fremdbestäubung stattzufinden und die Ernte des resultierenden Samen. Diese Pflanzen können Maispflanzen sein.
  • Diese und andere Gegenstände können erreicht werden, im Einklang mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch die Bereitstellung eines isolierten DNA-Moleküls, wobei das DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, umfasst.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Expressionsvektor zur Verfügung gestellt, umfassend ein exogenes Gen, wobei die Expression des exogenen Gens der Kontrolle einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe unterliegt und wo das Produkt des exogenen Gens Auswirkungen auf die männliche Fertilität hat.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren zur Verwendung solch eines Expressionsvektors zur Verfügung gestellt um männliche sterile Pflanzen herzustellen, umfassend den Schritt des Einführens eines Expressionsvektors in eine Pflanzenzelle, wobei das exogene Gen des Expressionsvektors eine komplementäre nukleotidische Einheit sein kann, wie beispielsweise Antisensemoleküle (Kallase-Antisense-RNA, Barnase-Antisense-RNA und Chalconsynthase-Antisense-RNA, Ms45-Antisense-RNA), Ribozyme und externe Guide-Sequenzen, ein Aptamer oder einzelsträngige Nukleotide. Die exogene Nukleotidsequenz kann ebenso Auxine, rol B, Zytotoxine, Diphtherietoxin, DAM-Methylase, Avidin codieren oder kann ausgewählt sein aus einem prokaryotischen regulatorischen System.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren zur Verwendung einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe zur Verfügung gestellt, um eine männliche fertile Hybridpflanze herzustellen, umfassend die Schritte:
    • a) Herstellen einer ersten männlichen sterilen Elternpflanze umfassend einen Expressionsvektor, der eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe und ein erstes exogenes Gen umfasst, wobei die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, die Expression des ersten exogenen Gens kontrolliert und wobei das Produkt des ersten exogenen Gens die männliche Fertilität unterbricht;
    • b) Herstellen einer zweiten Elternpflanze, umfassend einen Expressionvektor, der ein zweites exogenes Gen umfasst, wobei die regulatorische Region die Expression des zweiten exogenen Gens kontrolliert, so dass es in männlichen Geweben exprimiert werden kann;
    • c) Kreuzfertilisierung der ersten Eltern mit den zweiten Eltern, um eine Hybridpflanze herzustellen, wobei die männlichen Gewebe der Hybridpflanze das zweite exogene Gen exprimieren, und wobei das Produkt des zweiten exogenen Gens die Unterbrechung der Fahnenfunktion („tassel function") durch das Produkt des ersten exogenen Gens verhindert, unter Herstellung einer männlichen fertilen Hybridpflanze.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren zur Verwendung einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe, zur Verfügung gestellt, um eine männliche fertile Hybridpflanze herzustellen, umfassend die Schritte:
    • 1. Herstellen einer ersten männlichen sterilen Elternpflanze, wobei ein erstes Gen, involviert in die Expression der männlichen Fertilität unterbrochen wird;
    • 2. Herstellen einer zweiten Elternpflanze umfassend einen Expressionsvektor, der eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe und ein exogenes Gen umfasst, wobei die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe die Expression des endogenen Gens kontrolliert, so dass es in männlichen Geweben exprimiert wird und die Funktion des in A unterbrochenen Gens funktionell vervollständigen kann;
    • 3. Kreuzfertilisierung der ersten Eltern mit den zweiten Eltern um eine Hybridpflanze herzustellen, wobei die männlichen Gewebe der Hybridpflanze das exogene Gen exprimieren und wobei das Produkt des exogenen Gens die Unterbrechung der Fahnenfunktion („tassel function") verhindert, unter Herstellung einer männlich fertilen Hybridpflanze.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Diagramm des Ac 4.1 Ms45 genomischen Klons und Restriktionsstellen.
  • 2 ist eine Plasmid-Karte von PHP6045.
  • 3 ist ein Autoradiogramm der Primerextensionsprodukte, die den Start der Transkription von Ms45 anzeigen. Die mit G, A, T, C markierten Bahnen entsprechen den Sequenzierungsreaktionen mit den Deoxynukleotiden insbesondere ddGTP, ddATP, ddTTP, und ddCTP. Die Bahnen 1–4 entsprechen den Primerextensionsreaktionen mit mRNA von (1) Fahnen, (2) Blättern, (3) Antheren und (4) Blättern.
  • 4 ist ein Balkendiagramm, das die Stadiumspezifität der Ms45-regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe erklärt.
  • 5 erklärt Gewebespezifität, erläutert durch einen Mangel an Aktivität in nichtmännlichem Gewebe.
  • 6 zeigt eine Antheren-mRNA-Northern-Analyse gelhybridisiert mit dem männlichen Fertilitätsgen Ms45.
  • 7 zeigt die Ergebnisse einer Mutationsanalyse der TATA-Box.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Wenn nicht anderweitig definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu welchen diese Erfindung gehört, gemeinhin verstanden wird. Wenn nicht anderweitig erwähnt, sind die hierin verwendeten oder erwogenen Techniken Standardmethologien, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind. Die Materialien, Methoden und Beispiele sind erläuternd und nicht begrenzend.
  • In der folgenden Beschreibung werden eine Anzahl von Begriffen weitgehend verwendet. Die folgenden Definitionen werden zur Verfügung gestellt, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern.
  • 1. Definitionen
  • Sequenzidentität- oder Ähnlichkeit, wie im Stand der Technik bekannt, sind Beziehungen zwischen zwei Polypeptidsequenzen oder zwei Polynukleotidsequenzen wie durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt. Im Stand der Technik bedeutet Identität ebenso den Grad der Sequenzverbundenheit zwischen zwei Polypeptid- oder zwei Polynukleotidsequenzen, die durch das Zusammenpassen zwischen zwei Ketten derartiger Sequenzen bestimmt wird. Sowohl die Identität als auch die Ähnlichkeit kann einfach berechnet werden (Computational Molecular Biology; Lesk, A. M. ed.; Oxford University Press, New York (1988); Bio computing: Informatics and Genome Projects; Smith, D. W. ed.; Academic Press, New York; (1993); Computer Analysis of Sequence Data (Part I); Griffin, A. M. and H. G. Griffin eds.; Humana Press, New Jersey; (1994), von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology; Academic Press; (1987); und Sequence Analysis Primer; Gribskov, M. und J. Devereux eds.; M Stockton Press, New York; (1991)). Während eine Anzahl von Verfahren zur Messung der Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Polynukleotid- oder zwei Polypeptidsequenzen vorhanden sind, sind beide Begriffe dem Fachmann gut bekannt (von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology; Academic Press; (1987); Sequence Analysis Primer; Gribskov, M. und J. Devereux eds.; M Stockton Press, New York; (1991); und Carillo, H., und D. Lipman, SIAM, J. Applied Math.; Vol. 48; S. 1073; (1988)). Die im Allgemeinen verwendeten Verfahren zur Bestimmung der Identität oder Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen schließen ein aber sind nicht begrenzt auf jene offenbart in Carillo, H. und D. Lipman, SIAM, J. Applied Math.; Vol. 48, S. 1073; (1988). Bevorzugte Verfahren um die Identität zu bestimmen wurden entworfen, um das größtmögliche Zusammenpassen zwischen den zwei getesteten Sequenzen zu erhalten. Verfahren um die Identität und Ähnlichkeit zu bestimmen sind in Computerprogrammen codifiziert. Bevorzugte Computerprogrammverfahren zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen schließen ein aber sind nicht begrenzt auf GCG Programpaket (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research; Vol. 12(1); S. 387; (1984)), BLASTP, BLASTN und FASTA (Atschul, S. F., et al., J. Molec. Biol.; Vol. 215, S. 403; (1990)).
  • Männliches Gewebe besteht aus Gewebe, hergestellt aus Sammlungen von Zellen, die direkt involviert oder unterstützend sind für die Reproduktion der männlichen Gameten wie beispielsweise Pollen, Tapetum, Antheren, männlicher Blütenstand/Fahnen, Pollenmutterzellen und Mikrosporen. Das Tapetum ist das Gewebe in den Antheren in engstem Kontakt mit den Pollenmutterzellen und den Mikrosporen und ist wahrscheinlich involviert in die Ernährung der sich entwickelnden Pollenkörner. Die Pollenmutterzellen durchlaufen zwei meiotische Teilungen, die eine Tetrade von haploiden Mikrosporen herstellen. Mikrosporen durchlaufen eine Reifung in Pollenkörner. Pollen oder Pollenkörner sind reife männliche Gametophyten, die die Fähigkeit aufweisen können, Pflanzen zu befruchten, die kompatibel sind. Das Anthere ist der Teil des Staubgefäßes, in welchem Pollen hergestellt wird, der Rest des Staubgefäßes bestehend aus dem Filament von welchen das Anthere abhängt. Das Staubgefäß ist das männliche Organ der Blume.
  • Die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe ist eine Nukleotidsequenz, die einen höheren Transkriptionslevel eines assoziierten Gens in männlichen Geweben als in einigen oder allen anderen Geweben einer Pflanze steuert. Beispielsweise wird das hierin beschriebene Ms45-Gen in Antheren während des Quartetts-, des Quartettfreigabe- und im frühen einkernigen Stadium der Entwicklung detektiert. Für Details hinsichtlich Stadien der Antherenentwicklung siehe Chang, M. T. und M. G. Neuffer, "Maize Microsporogenesis"; Genome; Vol. 32; S. 232–244; (1989). Die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe des Ms 45-Gens steuert die Expression eines funktionell verknüpften Gens in männlichen Geweben. Die bevorzugten Gewebe der Expression sind männlich, nicht beispielsweise Wurzel- oder coleoptile Gewebe statt. Die prädominante Expression findet in männlichen Geweben, wie beispielsweise aber nicht begrenzt auf Pollen, Tapetum, Anthere, männlicher Blütenstand/Fahnen, Pollenmutterzellen und Mikrosporen. Diese Expresison, spezifisch für männliches Gewebe, bezieht sich auf höhere Expressionslevel in männlichen Geweben aber nicht notwendigerweise auf den Ausschluss von anderen Geweben.
  • Vermitteln ist Beeinflussen in einer positiven oder negativen Art und Weise oder Beeinflussung des Ergebnisses wie beispielsweise mit Fertilität oder irgendeinem anderen Merkmal.
  • Männliche Fertilität wirkt sich aus, wenn nicht normale Fertilität erfahren wird, dies kann verminderte Fertilität oder erhöhte Fertilität sein oder Fertilität, die unterschiedlich ist im Ausdruck des Timings oder anderer Eigenschaften.
  • Isoliert bedeutet verändernd "durch die Hand des Menschen" von seinem natürlichen Zustand, d.h., dass wenn es in Natur vorkommt, wurde es aus in seiner ursprünglichen Umwelt verändert oder daraus entfernt oder beides. Beispielsweise ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder ein Polypeptid natürlich in einem lebenden Organismus oder seinem natürlichen Zustand vorkommend und nicht "isoliert", aber dasselbe Polynukleotid oder Polypeptid getrennt von dem gemeinsam vorkommenden Material oder seinem natürlichen Zustand ist "isoliert" wie der Begriff hierin verwendet wird. Beispielsweise bedeutet der Begriff isoliert im Hinblick auf Polynukleotide, dass es von dem Chromosom und der Zelle isoliert ist, in welchen es natürlich vorkommt. Als Teil von oder folgender Isolation, können solche Polynukleotide mit anderen Polynukleotiden verbunden sein, wie beispielsweise DNAs zur Mutagenese oder um Fusionsproteine zu bilden und beispielsweise zur Propagation oder Expression in einem Wirt zusammengebracht werden. Die isolierten Polynukleotide, alleine oder verbunden mit anderen Polynukleotiden wie beispielsweise Vektoren, können in Wirtszellen eingebracht werden in Kultur oder in ganze Organismen. Eingeführt in Wirtszellen in Kultur oder in ganze Organismen wäre solche DNA immer noch isoliert wie in dem hierin verwendeten Begriff, da sie nicht in ihrer natürlichen Erscheinungsform oder Umgebung sind. Ähnlicherweise können die Polynukleotide und Polypeptide in einer Zusammensetzung auftreten wie beispielsweise Mediumzusammensetzungen, Lösungen zur Einführung von Polynukleotide oder Polypeptide beispielsweise in Zellen, Zusammensetzungen oder Lösungen für chemische oder enzymatische Reaktionen, beispielsweise welches keine natürlich vorkommenden Zusammensetzungen sind und darin verbleiben isolierte Polynukleotide oder Polypeptide innerhalb der Bedeutung dieses Begriffes wie er hierin verwendet wird.
  • Ein exogenes Gen bezieht sich in der vorliegenden Beschreibung auf eine DNA Sequenz, die in einen Organismus eingeführt oder wiedereingeführt ist. Beispielsweise jedes Gen, sogar das Ms45-Strukturgen wird dafür angesehen, dass es ein exogenes Gen ist, wenn das Gen in einen Organismus eingeführt oder wiedereingeführt wird.
  • 2. Isolierung einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe
  • Obwohl Antheren-spezifische Promotoren und Gene, die in männlichen Geweben aktiv sind, im Stand der Technik bekannt sind (McCormick et al., "Anther-Specific Genes: Molecular Characterization and Promoter Analysis in Transgenic Plants," in Plant Reproduction: From Floral Induction of Pollination; Lord, et al. eds.; S. 128–135; (1989); Scott, et al., Internationale Anmeldungsveröffentlichungsnr. WO 92/11379 (1992); van der Meer, et al., The Plant Cell; Vol. 4; S. 253 (1992)), gibt es keine allgemein akzeptierten Prinzipien oder strukturellen Kriterien zum Erkennen von DNA Sequenzen, die Genexpression in Mais eine Expression von männlichem Gewebe verleihen. Folglich ist es nicht möglich, eine regulatorische Region, spezifisch für männliche Gewebe direkt aus einer Maisgenbibliothek zu isolieren durch Screenen nach der Konsensussequenz, die Expression, die spezifisch für männliches Gewebe ist, verleiht.
  • Beispielsweise kann die Hybridisierung solcher Sequenzen unter Bedingungen der verminderten Stringenz, mittlerer Stringenz oder sogar hochstringenten Bedingungen durchgeführt werden (zum Beispiel, Bedingungen dargestellt durch die Waschstringenz von 35–40% Formamid mit 5X Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 1X SSPE bei 37°C; Bedingungen dargestellt durch die Waschstringenz von 40 bis 45% Formamid mit 5X Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 1X SSPE bei 42°C; und bzw. Bedingungen dargestellt durch die Waschstringenz von 50% Formamid mit 5X Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 1X SSPE bei 42°C). Mittlere Stringenz in einer Standardhybridisierung der Nukleinsäuren wäre nützlich beim Identifizieren der regulatorischen Regionen, spezifisch für männliches Gewebe wie hierin offenbart als auch anderer Gene (siehe zum Beispiel Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; (1982)). Im Allgemeinen werden Sequenzen, welche für eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe codieren eine Sequenzidentität hierzu von vorzugsweise 70%, 75% oder 80%, bevorzugter von 85% oder 90%, und am meisten bevorzugt von 95% oder 99% haben.
  • Verfahren zur Hybridisierung von Nukleinsäuresequenzen sind im Stand der Technik ohne weiteres verfügbar. Hybridisierungsscreening von platierten DNA-Bibliotheken (siehe z.B. Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; (1982)) oder Amplifizieren codierender Sequenzen unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (siehe z.B. Innis, et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications; Academic Press; (1990)) sind gut bekante Techniken zur Isolierung genomischer DNA.
  • Regulatorische Regionen können in dem genomischen Subklon unter Verwendung funktioneller Analyse identifiziert werden, normalerweise verifiziert durch die Beobachtung der Reportergenexpression in Antherengewebe und Verminderung oder Abwesenheit der Reportergenexpression in nicht-antherem Gewebe. Dieser allgemeine Ansatz ist in Beispiel 3 unten erklärt. Die Möglichkeit der regulatorischen Region, die stromaufwärts oder im 5'-Bezirk der transkriptionalen Startstelle liegt, kann durch Subklonierung eines DNA-Fragments, das die Stromaufwärtsregion und subklonierende kleine Fragmente enthält, in dem Expressionsvektor für vorübergehende Expressionsexperimente getestet werden. Es wird erwartet, dass kleinere Fragmente essentielle Regionen für die Expression, spezifisch für männliches Gewebe beinhalten können. Beispielsweise wurden die wesentlichen Regionen der CaMV 19S und 35S Promotoren in relativ kleinen Fragmenten, abgeleitet von großen genomischen Stücken wie im U.S. Pat. Nr. 5,352,605 beschrieben, identifiziert.
  • Im Allgemeinen werden Sequenzen, die für eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe codieren, eine Sequenzidentität hierzu von vorzugsweise 70%, 75% oder 80%, bevorzugter von 85% oder 90% und am meisten bevorzugt von 95% oder 99% haben.
  • Eine Deletionsanalyse kann sowohl vom 5'- als auch vom 3'-Ende der regulatorischen Region stattfinden: Fragmente können durch Linker-Scanning-Mutagenese, Mutagenese unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und dergleichen erhalten werden (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)). Die 3'-Deletion kann die regulatorische Region, bevorzugt für männliches Gewebe beschreiben und das 3'-Ende identifizieren, so dass diese essentielle Region dann funktionell mit einem Core-Promotor der Wahl verknüpft werden kann. Wenn einmal die essentielle Region identifiziert ist, kann die Transkription des exogenen Gens durch die Region des Ms45, spezifisch für männliches Gewebe plus einem Core-Promotor, kontrolliert werden. Der Core-Promotor kann jeder der bekannten Core-Promotoren, wie beispielsweise ein Blumenkohlmosaikvirus ("Cauliflower Mosaic Virus") 35S oder 19S-Promotor (U.S. Pat. Nr. 5,352,605); Ubiquitin (U.S. Pat. Nr. 5,510,474), der IN2 Core-Promotor (U.S. Pat. Nr. 5,364,780), oder ein Figwort-Mosaikvirus-Promotor sein (Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. eds.; CRC Press; S. 89–119 (1993)). Vorzugsweise ist der Promotor ein Core-Promotor eines Gens, spezifisch für männliches Gewebe oder der CaMV-35S-Core-Promotor. Vorzugter ist der Promotor ein Promotor eines Gens, spezifisch für männliches Gewebe und im Besonderen der Ms45-Core-Promotor.
  • Weitere Mutationsanalysen können Modifikationen oder Funktionalitäten wie beispielsweise im Expressionslevel einführen, im Timing der Expression oder im Gewebe der Expression. Mutationen können auch still sein und keinen beobachtbaren Effekt aufweisen.
  • 3. Insertion der Region in einen Ezpressionsvektor
  • Diese Selektion eines geeigneten Expressionsvektors, mit welchem auf funktionelle Expression getestet wird, wird vom Wirt und dem Verfahren zur Einbringung des Expressionsvektors in den Wirt abhängen und solche Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Für Eukaryoten schließen die Regionen im Vektor Regionen ein, die die Initiierung der Transkription und des Kontrollprozessierens kontrollieren. Diese Regionen sind funktionell verknüpft mit einem Reportergen wie beispielsweise dem ☐-Glucuronidase-(GUS)-Gen oder Luciferase. Allgemeine Beschreibungen und Beispiele von Pflanzenexpressionsvektoren und Reportergenen können bei Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al., eds.; CRC Press; S. 89–119; (1993) gefunden werden. GUS-Expressionsvektoren und GUS-Genkassetten sind kommerziell erhältlich von Clonetech, Palo Alto, CA, während Luciferase-Expressionsvektoren und Luciferase-Genkassetten erhältlich sind von Promega Corporation, Madison, WI. Ti-Plasmide und andere Agrobakteriumvektoren sind beschrieben in Ishida, Y., et al., Nature Biotechnology; Vol. 14; S. 745–750; (1996) und in U.S. Pat. Nr. 5,591,616 Method for Transforming Monocotyledons, eingereicht am 3. Mai 1994.
  • Expressionsvektoren, die mutmaßliche Regulationsregionen enthalten, die in genomischen Fragmenten lokalisiert sind, können in intakte Gewebe wie beispielsweise abgestufte Antheren, Embryos oder in Kallus eingeführt werden. Verfahren zur DNA-Lieferung schließen Mikroprojektilobeschuss ("microprojectile bombardment"), DNA-Injektion, Elektroporation und Agrobakterium-vermittelten Gentransfer ein (siehe Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. eds.; CRC Press; (1993); U.S. Pat. Nr. 5,591,616 Method for Transforming Monocotyledons; eingereicht am 3. Mai 1994 und Ishida, Y., et al., Nature Biotechnology; Vol. 14; S. 745–750; (1996)). Allgemeine Verfahren zum Kultivieren von Pflanzengeweben werden in Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. eds.; CRC Press; (1993), gefunden.
  • Für das Kurzzeituntersuchungssystem werden abgestufte, isolierte Antheren sofort auf Fahnenkulturmedium („tassel culture medium") platziert, (Pareddy, D. R. und J. F. Petelino, Crop Sci. 3.; Vol. 29; S. 1564–1566; (1989)) verfestigt mit 0,5% Phytagel (Sigma, St. Louis) oder anderen verfestigenden Medien. Der Expressionsvektor DNA wird innerhalb von 5 Stunden vorzugsweise durch Mikroprojektil-vermittelter Lieferung mit 1,2 μ Partikel bei 1000 –1100 Psi eingeführt. Nach der DNA-Lieferung werden die Antheren bei 26°C auf demselben Fahnenkulturmedium („tassel culture medium") für 17 Stunden inkubiert und analysiert durch Zubereiten eines Gesamtgewebehomogenats und Analysieren nach GUS oder nach Luciferaseaktivität (siehe Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick, et al. eds.; CRC Press; (1993)).
  • Die oben beschriebenen Verfahren wurden verwendet, um die DNA Sequenzen, die die Genexpression in einer Art und Weise, spezifisch für männliche Gewebe regulieren. Solch eine Region wurde als Volllängen-Ms45 regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe identifizier (SEQ ID NO: 1). Eine TATA-Box-Mutation mit Sequenzidentität zu der Volllängen-Ms45-regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe, ist in SEQ ID NO: 2 identifiziert.
  • Folglich umfasst die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist (oder jene mit Sequenzidentität) und die Funktion einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe, aufweist.
  • Eine mutmaßliche TATA-Box kann durch eine Primer-Extensionsanalyse, wie in Beispiel 2 unten oder in Current Protocols in Molecular Biology; Ausubel, F. M., et al., eds.; John Wiley and Sons, New York; S. 4.8.1–4.8.5; (1987) beschrieben, identifizier werden.
  • 4. Verwendung einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe zur Fertilitätskontrolle
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Mittel zur Fertilitätskontrolle zur Verfügung zu stellen unter Verwendung einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe. Bedeutsamerweise kann diese regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, die Expression eines exogenen Gens in Antheren vom Quartett über ein frühes einkerniges Stadium der Entwicklung kontrollieren. Die praktische Bedeutung eines solchen Timings ist, dass die Expression eines sterilitätsinduzierenden Gens während dieses Entwicklungsstadiums die Antherenreifung früh genug unterbricht, um eine visuelle Verifikation der Funktion des sterilitätsinduzierenden Systems auf diesem Gebiet erlaubt. Es kann ebenso die Möglichkeit vermindern, dass "Unterbrecher" ("Breakers") (Antheren, die Pollen abstoßen) auftreten werden. Folglich werden die Effekte des sterilitätsinduzierenden Gens in dem Herstellungsbereich bei einem ausreichenden frühen Stadium der Entwicklung zu erkennen sein, um entweder manuelles oder mechanisches Entfahnen („detasseling") von jeden "fertilen Flüchtlingen" zu erlauben, die aus einem partiellen oder völligem Zusammenbruch des sterilitätsinduzierenden Systems resultieren.
  • Ein Ansatz zur Kontrolle von männlicher Sterilität ist, die Genexpression im Tapetum zu manipulieren. Das Tapetum ist eine Schicht von Zellen, die mikrosporogene Zellen in den Antheren umgeben und wahrscheinlich den sich entwickelnden Mikrosporen Nährstoffe zur Verfügung stellen, wie beispielsweise reduzierende Zucker, Aminosäuren und Lipide (Reznickova, C. R., Acad. Bulg Sci.; Vol. 31; S. 1067; (1978); Nave, et al., J. Plant Physiol.; Vol. 125; S. 451; (1986); Sawhney, et al., J. Plant. Physiol.; Vol. 125; S. 467 (1986)). Es wurde herausgefunden, dass Ms45 hoch in der Tapetumschicht exprimiert wird. Tapetumzellen stellen ebenso ☐(1,3)-Glucanase ("Kallase"), welche Mikrosporenfreisetzung fördert (Mepham, et al., Protoplasma; Vol. 70; S. 1; (1970)). Deshalb besteht eine heikle Beziehung zwischen dem Tapetum und den mikrosporogenen Zellen und jede Unterbrechung der tapetalen Funktion resultiert wahrscheinlich in disfunktionalen Pollenkörnern. Tatsächlich sind Läsionen in der tapetalen Biogenese bekannt dafür, dass sie in männlichen Sterilitätsmutanten resultieren (Kaul, "Male Sterility in Higher Plants" in Monographs on Theoretical and Applied Genetics; Frankel et al. eds.; Springer Verlag; Vol. 10; S. 15–95; (1988)). Ein vorzeitiges oder spätes Erscheinen von Kallase während der Entwicklung des Tapetums wird ebenso mit verschiedenen Arten von männlicher Sterilität in Verbindung gebracht (Warmke, et al., J. Hered.; Vol. 63; S. 103; (1972)). Deshalb kann das Kallasegen dazu verwendet werden, um männliche Gewebefunktion zu unterbrechen. Scott, et al., PCT WO 93/02197 (1993) offenbart die Nukleotidsequenz einer Tapetum-spezifischen Kallase. Folglich kann ein Scheitern der Mikrosporen, sich in reife Pollenkörner zu entwickeln, induziert werden unter Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das ein Gen umfasst, welches in der Lage ist, die Tapetumfunktion unter der Kontrolle von Tapetum-spezifischen Regulationssequenzen zu unterbrechen.
  • Ein genereller Ansatz um männliche Fertilität zu verleihen ist, ein Expressionsvektor zu konstruieren, in welchem die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe funktionell mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die ein Protein codiert, das in der Lage ist, männliche Gewebefunktion zu unterbrechen, resultierend in Infertilität. Proteine, die in der Lage sind, männliche Gewebefunktion zu unterbrechen schließen Proteine ein, die die Synthese von Makromolekülen inhibieren, die für eine zellulare Funktion essentiell sind, Enzyme, die Makromoleküle abbauen, die für zellulare Funktionen essentiell sind, Proteine, die die Biosynthese oder den Metabolismus von Pflanzenhormonen verändern, strukturelle Proteine, unangemessen exprimierte Proteine und Proteine, die eine spezifische Funktion von männlichen Geweben inhibieren.
  • Beispielsweise kann ein Expressionsvektor konstruiert werden, in welchem die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe funktionell mit einer Nukleotidsequenz verknüpft ist, die einen Inhibitor der Proteinsynthese codiert, welcher ein Zytotoxin sein kann aber nicht darauf begrenzt ist. Diphtherietoxin, beispielsweise ist ein gut bekannter Inhibitor der Proteinsynthese in Eukaryoten. DNA-Moleküle, die das Diphtherietoxingen codieren, können von der American Type Culture Collection erhalten werden (Rockville, MD), ATCC Nr. 39359 oder ATCC Nr. 67011 und siehe Fabijanski, et al. E. P. Anmelder. 90902754.2, "Molecular Methods of Hybrid Seed Production" für Beispiele und Verfahren zur Verwendung. DAM-Methylase, beispielsweise ist ein gut bekanntes Enzym aus Escherichia coli, welches den Adeninrest in der Sequenz 5' GATC 3' zu N6-Methyladenin modifiziert. Cigan und Albertsen beschreiben wie DAM-Methylase verwendet werden kann, um transgenen Pflanzen Fertilität zu verleihen (PCT/US95/15229 Cigan, A. M. und Albertsen, M. C., "Reversible Nuclear Genetic System for Male Sterility in Transgenic Plants"). Ein anderes Beispiel eines Proteins, welches die Fertilität unterbricht ist Avidin, wie in U.S. Pat. Anmeldenr. 08/475,582 erläutert "Induction of Male Sterility in Plants by Expression of High Levels of Avidin" von Howard, J. und Albertsen, M. C.
  • Alternativ kann die Unterbrechung der Tapetumfunktion erreicht werden unter Verwendung von DNA-Sequenzen, die Enzyme codieren, die in der Lage sind, ein biologisch wichtiges Makromolekül abzubauen. Beispielsweise, Mariani, et al., Nature; Vol. 347; S. 737 (1990), haben gezeigt, dass Expression im Tapetum von entweder Aspergillus oryzae RNase-T1 oder einer RNase des Bacillus amyloliquefaciens, genannt "Bamase", die Zerstörung der Tapetumzellen induzierten, resultierend in männlicher Infertilität. Quaas, et al., Eur. J. Biochem.; Vol. 173, S. 617; (1988) beschreibt die chemische Synthese der RNase-T1, während die Nukleotidsequenz des Bamasegens in Hartley, J. Molec. Biol.; Vol. 202; S. 913; (1988) offenbart wird.
  • Die RNase-T1- und Bamasegene können beispielsweise erhalten werden durch Synthetisierung der Gene mit gegenseitig primend langen Oligonukleotiden. Siehe, beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology; Ausubel, F. M., et al., eds.; John Wiley and Sons, New York; S. 8.2.8 bis 8.2.13 (1987). Siehe auch Wosnick, et al., Gene; Vol. 60; S. 115; (1987). Darüber hinaus stellen gegenwärtige Techniken unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion die Fähigkeit zur Verfügung, sehr große Gene zu synthetisieren (Adang, et al., Plant Molec. Biol; Vol. 21; S. 1131; (1993); Bambot, et al., PCR Methods and Applications; Vol. 2; S. 266; (1993)).
  • In einem alternativen Ansatz wird die Pollenherstellung durch die Veränderung des Metabolismus der Pflanzenhormone, wie beispielsweise Auxine, inhibiert. Beispielsweise codiert das rolB Gen des Agrobacterium rhizogenes für ein Enzym, das mit dem Auxin-Metabolismus durch Katalysieren der Freisetzung des freien Indols aus Indoxyl-☐-Glucosiden interferiert. Estruch, et al., EMBO J.; Vol. 11, S. 3125; (1991) und Spena, et al., Theor. Appl. Genet.; Vol. 84; S. 520 (1992) haben gezeigt, dass die Antheren-spezifische Expession des rolB Gens in Tabak, in Pflanzen resultierte, die verwelkte Antheren aufweisen, in welchen die Pollenherstellung enorm vermindert war. Deshalb ist das rolB Gen ein Beispiel für ein Gen, das nützlich ist für die Kontrolle der Pollenherstellung. Slightom, et al., J. Biol. Chem.; Vol. 261; S. 108; (1985) offenbart die Nukleotidsequenz des rolB Gens.
  • Um ein Protein zu exprimieren, das männliche Gewebefunktion unterbricht, wird ein Expressionsvektor konstruiert, in welchem eine DNA-Sequenz codierend für das Protein funktionell mit DNA-Sequenzen verknüpft ist, die die Gentranskription in einer Art und Weise, spezifisch für männliches Gewebe reguliert. Die generellen Anforderungen eines Expressionsvektors sind oben im Zusammenhang mit einem Kurzzeit-Expressionssystem beschrieben. Hier ist dennoch die bevorzugte Methode, den Expressionsvektor in pflanzliches, embry onisches Gewebe einzuführen in derartiger Weise, dass ein exogenes Protein in einem späteren Entwicklungsstadium in den männlichem Geweben der erwachsenen Pflanze exprimiert werden wird. Mitotische Stabilität kann, durch Verwendung von pflanzlichen viralen Vektoren, die epichromosomale Replikation zur Verfügung stellen, erreicht werden.
  • Ein alternatives und bevorzugtes Verfahren um mitotische Stabilität zu erreichen, wird durch die Integration von Expressionsvektorsequenzen in Wirtchromosome zur Verfügung gestellt. Solche mitotische Stabilität kann durch die mikroprojektile Lieferung eines Expressionsvektors an ein embryonisches Gewebe zur Verfügung gestellt werden (Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology"; Glick, et al. eds.; CRC Press; (1993)).
  • Eine Transformationsmethodologie kann für viele Pflanzen gefunden werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Sonnenblume, Sojabohne, Weizen, Rapsarten ("canola"), Reis und Sorghum (Knittel, N., et al., J. Plant Cell Rep.; Springer International, Berlin, W. Germany; Vol. 14(2/3); S. 81–86; (1994); Chee, P. P., et al., Plant Physiol.; American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD; Vol. 91(3); S. 1212–1218 (1989); Hadi, M. Z., et al., J. Plant Cell Rep.; Springer Interational, Berlin, W. Germany; Vol. 15(7); S. 500–505; (1996); Perl, A., et al., Molecular and General Genetics; Vol. 235(2-3); S. 279–284; Zaghmout, O. M. F. und N. L. Trolinder, Nucleic Acids Res.; IRL Press, Oxford; Vol. 21(4); S. 1048; (1993); Chen, J. L. und W. D. Beversdorf Theor. Appl. Genet.; Springer International, Berlin, W. Germany; Vol. 88(2); S. 187–192; (1994); Sivamani, E., et al., Plant Cell. Rep.; Springer International, Berlin, W. Germany; Vol. 15(5); S. 322–327; (1996); Hagio, T., et al., Plant Cell Rep.; Vol. 10(5); S. 260–264; (1991)) und sind ebenso dem Fachmann bekannt.
  • Um transformierte Zellen zu selektieren, enthält der Expressionsvektor ein selektierbares Markergen, wie beispielsweise ein Herbizidresistenzgen. Beispielsweise verleihen solche Gene Resistenz gegenüber Phosphinotricin, Glyphosat, Phosphonylharnstoffen, Atrazine, Imidazolinone oder Kanamycin. Obwohl der Expressionsvektor cDNA-Sequenzen enthalten kann, die ein exogenes Protein unter der Kontrolle einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe codieren, als auch das selektierbare Markergen unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors, kann das selektierbare Markergen ebenso in einem separaten Selektionsexpressionsvektor an die Wirtzelle geliefert werden. Solch eine "gemeinsame Transformation" des embryonischen Gewebes mit einem Testexpressionsvektor, enthaltend eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe und einen Selektionsexpressionsvektor ist unten erklärt.
  • 5. Induktion der Sterilität
  • In einem alternativen Ansatz kann männliche Sterilität induziert werden durch die Verwendung eines Expressionsvektors, in welchem die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe funktionell an eine Nukleotidsequenz verknüpft wird, die eine komplementäre nukleotidische Einheit codiert. Das Binden der komplementären Nukleinsäuremoleküle an ein Zielmolekül kann ausgewählt werden, um inhibitorisch zu sein. Zum Beispiel, falls das Ziel ein mRNA-Molekül ist, resultiert das Binden einer komplementären nukleotidischen Einheit in diesem Fall eine RNA, in der Hybridisierung und im Stillstand der Translation (Paterson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; Vol. 74; S. 4370 (1987)). Folglich würde ein geeignetes Antisense RNA-Molekül, wie beispielsweise eines komplementär zu Ms45 (U.S. Pat. Nr. 5,478,369), eine Sequenz aufweisen, die komplementär ist zu dem einer mRNA-Spezies codierend für ein Protein, das notwendig ist für männliche Sterilität (Fabijanski in "Antisense Gene Systems of Pollination Control For Hybrid Seed Production", U.S. Pat. Anmeldungsnr. 08/288,734).
  • Zum Beispiel würde die Herstellung der Kallase-Antisense-RNA die Herstellung des Kallase-Enzyms, welches für die Mikrosporfreisetzung wesentlich ist, inhibieren. Zusätzlich kann männliche Sterilität induziert werden durch die Inhibierung der flavonoiden Biosynthese unter Verwendung eines Expressionsvektors, der Antisense-RNA für die 3'-nichttranslatierte Region des Chalconsynthase A-Gens produziert (Van der Meer, et al., The Plant Cell; Vol. 4; S. 253; (1992)). Die Klonierung und Charakterisierung des Chalconsynthase A-Gens ist offenbart durch Koes, et al., Gene; Vol. 81; S. 245; (1989); und durch Koes, et al., Plant Molec. Biol.; Vol. 12; S. 213; (1989).
  • Alternativ kann ein Expressionsvektor konstruiert werden, in welchem die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, funktionell an eine Nukleotidsequenz, die ein Ribozym codiert, verknüpft ist. Ribozyme können entworfen werden, um Endonukleaseaktivität zu exprimieren, die auf eine bestimmte Zielsequenz in einem mRNA-Molekül gerichtet ist. Beispielsweise erreichte Steinecke, et al., EMBO J.; Vol. 11; S. 1525; (1992) bis zu 100% Inhibierung der Neomycinphosphotransferase-Genexpression durch Ribozyme in Tabak-Protoplasten. Vor kürzerem inhibierte Perriman, et al., Antisense Research and Development; Vol. 3; S. 253; (1993), Chloramphenicolacetyltransferaseaktivität in Tabakprotoplasten unter Verwendung eines Vektors, der ein modifiziertes Hammerhead-Ribozym exprimierte. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schließen geeignete Ziel-RNA-Moleküle für Ribozyme mRNA-Spezien, die Proteine codieren, die essentiell sind für männliche Fertilität, wie beispielsweise Kallase-mRNA und Ms45-mRNA ein.
  • In einem weiteren alternativen Ansatz, können Expressionsvektoren konstruiert werden, in welchen eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe die Herstellung von RNA-Transkripten steuert, die in der Lage sind, eine RNase P-vermittelte Spaltung von Ziel mRNA Molekülen zu fördern, Gemäß dieses Ansatzes kann eine externe Guide-Sequenz konstruiert werden, um das endogene Ribozym, RNase P, auf eine besondere Spezies der intrazellulären mRNA zu richten, welche anschließend durch das zellulare Ribozym gespalten wird (U.S. Pat. Nr. 5,168,053; Yuan, et al., Science; Vol. 263; S. 1269; (1994)). Vorzugsweise umfasst die externe Guide-Sequenz eine zehn bis fünfzehn Nukleotidsequenz komplementär zu einer mRNA Spezies, die ein Protein codiert, welches für männliche Fertilität essentiell ist und eine 3'-RCCA Nukleotidsequenz, wobei R vorzugsweise ein Purin ist. Die externen Guide-Sequenztranskripte binden an die gezielte mRNA-Spezies durch die Bildung von Basenpaaren zwischen der mRNA und den komplementären externen Guide-Sequenzen und fördern folglich die Spaltung von mRNA durch RNase P an dem Nukleotid, das an der 5'-Stelle der basengepaarten Region lokalisiert ist.
  • Ein anderer alternativer Ansatz ist die Nutzung einer Adaptamertechnologie, wo die komplementäre nukleotidische Einheit ein Nukleotid ist, das als ein Ligand für ein spezifiziertes Zielmolekül dient (U.S. Pat. Nr. 5,472,841). Dieses Ziel kann ein Produkt sein, das wesentlich für männliche Fertilität ist oder ein Produkt, das männliche Fertilität unterbricht. Bei der Verwendung dieser Methode könnte ein Aptamer für das Zielmolekül, Ms45 oder Avidin beispielsweise ausgewählt werden, das Binden würde und die Expression des Ziels inhibieren. Die Nukleotidsequenz codierend für das Aptamer würde ein Teil der Expressionsvektoren darstellen, so konstruiert, dass eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, die Produktion des Aptamers steuert.
  • Sterilität kann auch durch Unterbrechung eines Gens, das wichtig für männliche Fertilität ist, wie beispielsweise das Ms45- oder das Ms2-Gen, induziert werden (Mark, G. M., et al., Nature; Vol. 363; S. 715–717; (1993)). Verfahren der Genunterbrechung sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen ein aber sind nicht begrenzt auf vertauschbare Elementinsertion und Mutationsinduktion.
  • 6. Wiederherstellung der männlichen Fertilität in dem F1-Hybrid
  • Die oben beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um transgene männliche sterile Maispflanzen herzustellen für die Herstellung von F1-Hybriden in einem großem Maß stab geleitete Kreuzungen zwischen Inzuchtlinien. Falls die Eizellen der transgenen männlichen sterilen Pflanzen nicht alle das exogene Gen enthalten, das tapetalische Funktion unterbricht, dann werden ein Anteil der F1-Hybriden einen männlichen fertilen Phenotyp aufweisen. Auf der anderen Seite, werden F1-Hybride einen männlichen sterilen Phenotyp aufweisen, wenn das exogene Gen in allen Eizellen der transgenen männlichen sterilen Pflanzen gegenwärtig ist, da Sterilität induziert durch das endogene Gen dominant sein würde. Folglich ist es wünschenswert ein männliches Fertilitätswiederherstellungssystem zu verwenden, um die Herstellung von männlichen fertilen F1-Hybriden zur Verfügung zu stellen. Solch ein Fertilitätswiederherstellungssystem ist von besonderem Wert, wenn das geerntete Produkt Saatgut ist oder wenn die Feldfrüchte selbstbestäubend sind.
  • Ebenso hat ein solches Fertilitätswiederherstellungssystem einen besonderen Wert, wenn die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe funktionell an einen induzierbaren Promotor, wie beispielsweise in WO 89/10396 verknüpft ist (Marianai, et al., Plants with Modified Stamen Cells) und der induzierbare Promotor auf externe Kontrollen anspricht. Diese verknüpfte regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe besteht aus einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe, einem induzierbaren Promotor und einem exogenen Gen.
  • Ein Ansatz für männliche Fertiltätswiederherstellung wäre transgene männliche sterile Pflanzen mit transgenen männlich fertilen Pflanzen, welche ein Fertilitätswiederherstellungsgen enthalten unter der Kontrolle einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe zu kreuzen. Beispielsweise kreutze Fabijanski in "Antisense Gene Systems of Pollination Control For Hybrid Seed Production", U.S. Pat. Anmeldenr. 08/288,734, männliche fertile Pflanzen, die einen Bamase-Inhibitor exprimierten, genannt "Barstar," mit männlichen sterilen Pflanzen, die Bamase exprimierten. Hartley, 3. Mol. Biol.; Vol. 202; S. 913; (1988), offenbart die Nukleotidsequenz von Barstar.
  • Ein anderer Ansatz wäre männlichen sterile Pflanzen enthaltend eine Unterbrechung in einem essentiellen männlichen Fertilitätsgen zu transgenen männlichen fertilen Pflanzen, enthaltend die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe funktionell verknüpft mit einer nicht unterbrochenen Kopie des Fertilitätsgens, wie beispielsweise das Ms45- oder das Ms2-Gen, zu kreuzen. Die volle Sequenz des Ms45-Gens ist enthalten in U.S. Pat. Nr. 5,478,369 und des Ms2 in Mark, G. M., et al., Nature; Vol. 363; S. 715–717; (1993).
  • Alternativ kann männliche Fertilitätswiederherstellung durch exprimieren von komplementären nukleotidischen Einheiten wie beispielsweise Toxin-Ribozymen oder Aptameren in männlichen fertilen Pflanzen erreicht werden, um die Effekte des Toxins in männlichen sterilen Pflanzen zu neutralisieren. Folglich kann männliche Fertilität in den F1-Hybriden wiederhergestellt werden durch Herstellen einer männlichen fertilen transgenen Pflanze, die eine besondere Spezies eines RNA-Moleküls oder Polypeptids synthetisiert, um dem Effekten des besonderen exogenen Gens, exprimiert in den männlichen sterilen transgenen Pflanzen, entgegenzuwirken.
  • In einem alternativen Verfahren zur Wiederherstellung von männlicher Fertilität, enthaltend transgene männliche sterile Pflanzen einen Expressionsvektor, der eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, eine prokaryotische regulatorische Region (aus einem prokaryotischen regulatorischen System) und ein exogenes Gen, das in der Lage ist, die tapetale Funktion zu unterbrechen. Transgene männliche fertile Pflanzen werden hergestellt, die ein prokaryotisches Peptid exprimieren unter der Kontrolle einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe. In den resultierenden F1-Hybriden aus der männlichen sterilen und männlichen fertilen Kreuzung, bindet das prokaryotische Peptide an die prokaryotische, regulatorische Sequenz und unterdrückt die Expression des exogenen Gens, welches in der Lage ist, die männliche Fertilität zu unterbrechen. Ein Vorteil dieses Verfahrens der Fertilitätswiederherstellung ist, das eine Form von transgenen männlichen fertilen Pflanze verwendet werden kann, um F1-Fertilität zur Verfügung zu stellen, ohne Rücksicht auf die Identität des exogenen Gens, das verwendet wurde, um die tapetale Funktion in der transgenen männlichen sterilen Pflanze zu unterbrechen.
  • Beispielsweise kann das LexA-Gen/LexA-Operatorsystem verwendet werden, um Genexpression gemäß der vorliegenden Erfindung zu regulieren. Siehe U.S. Pat. Nr. 4,833,080 und Wang, et al., Mol. Cell. Biol.; Vol. 13; S. 1805; (1993). Im Besonderen würde der Expressionsvektor der männlichen sterilen Pflanze die LexA-Operatorsequenz beinhalten, während der Expressionsvektor der männlichen fertilen Pflanze die codierende Sequenz für den LexA-Repressor enthalten würde. In dem F1-Hybrid würde der LexA-Repressor an die LexA-Operatorsequenz binden und die Transkription des exogenen Gens, das ein Produkt codiert, das in der Lage ist, männliche Fertilität zu unterbrechen, zu inhibieren. Dies würde einschließen aber ist nicht begrenzt auf Avidin, DAM-Methylase, Diphtherietoxin, RNase T, Barmase, rolB und Chalconsynthase A.
  • Die LexA-Operator DNA-Moleküle können beispielsweise erhalten werden durch Synthetisieren von DNA-Fragmenten, die die gut bekannte LexA-Operatorsequenz beinhalten. Siehe beispielsweise U.S. Pat. Nr. 4,833,080 und Garriga, et al., Mol. Gen. Genet.; Vol. 236; S. 125; (1992). Das LexA-Gen kann durch Synthetisieren des DNA-Moleküls, codierend für den LexA-Repressor erhalten werden. Gensynthese-Techniken werden oben diskutiert und LexA-Gensequenzen werden beschrieben beispielsweise von Garriga, et al., Mol. Gen. Genet.; Vol. 236; S. 125; (1992). Alternativ können DNA-Moleküle, die den LexA-Repressor codieren vom Plasmid pRB500 erhalten werden, American Type Culture Collection Accession Nr. 67758. Der Fachmann kann sich leicht andere männliche Fertilitätswiederherstellungsstrategien erdenken unter Verwendung prokaryotischer Regulationssysteme, wie beispielsweise der lac-Repressor/lac-Operonsystem oder das trp-Repressor/trp-Operonsystem.
  • 7. Identifikation der wesentlichen Teile der regulatorischen Region
  • Die Identifikation der wesentlichen Teile der regulatorischen Region können durch Deletieren, Hinzufügen und/oder Ersetzen von Nukleotiden in der regulatorischen Region durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, durchgeführt werden. Solche Varianten können beispielsweise erhalten werden durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese und Mutagenese unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)).
  • Eine Reihe von 5'-Deletionen der regulatorischen Region kann unter Verwendung von bestehenden Restriktionsstellen konstruiert werden. Die resultierenden Promotorfragmente können bezüglich Aktivität getestet werden, unter Verwendung eines Expressionsvektors wie kürzlich diskutiert. Weitere Verbesserung und Beschreibung können durch kleinere Veränderungen, vorzugsweise von ungefähr 50 oder 30 Nukleotiden, bevorzugter von ungefähr 20 oder 10 Nukleotiden und am meisten bevorzugt von ungefähr 5 oder 1 Nukleotid des kleinsten Restriktionfragments, das immer noch saubere Expression unter dem Reporterkonstrukt verleiht, erhalten werden (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)). Diese können in den Expressionsvektor eingeführt werden unter Verwendung eingeführter oder natürlicher Restriktionsstellen. Eine Serie von 3'-Deletionen kann ebenso wie oben diskutiert generiert werden oder durch PCR oder durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)). Weitere Verbesserung und Beschreibung können durch kleinere Veränderungen, vorzugsweise von ungefähr 50 oder 30 Nukleotiden, bevorzugter von ungefähr 20 oder 10 Nukleotiden und am meisten bevorzugt von ungefähr 5 oder 1 Nukleotid des kleinsten Restriktionsfragment, das immer noch saubere Expression unter dem Reporterkonstrukt verlieht, erhalten werden (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)).
  • Diese 5'- und 3'-Deletionen werden folglich die minimale Region, die essentiell ist für das Imitieren der sauberen Gewebe und temporalen Expression der längeren regulatorischen Region beschreiben. Im Allgemeinen werden Sequenzen, welche für diese Minimalregion einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe codieren, eine Sequenzidentität dazu von vorzugsweise ungefähr 70%, 75% oder 80%, bevorzugter von ungefähr 85% oder 90% und am meisten bevorzugt von 95% oder 99% aufweisen.
  • Das folgende wird dargestellt im Wege der Erläuterung und beabsichtigt nicht den Umfang der Erfindung zu begrenzen.
  • BEISPIEL 1
  • Genomisches Klonen und Sequenzieren des Ms45-Promotors
  • Das Ac-Tagging und die Identifikation der Ms45-cDNA und Northern-Analyse wird in U.S. Pat. Nr. 5,478,369 beschrieben.
  • Eine partielle cDNA von Ms45 wurde verwendet um eine B73-Mais genomische Bibliothek zu screenen. Diese Bibliothek wurde hergestellt durch Klonierung von SAU3A1 Teile in einen BAMHI-verdauten genomischen Klonierungsvektor (Lambda Dash II, Stratagene, La Jolla, CA). Etwa 1 × 106 Plaque wurden gescreent unter Verwendung eines E. coli Stamms, geeignet für genomische DNA (ER1647, New England Biolabs, MA) als dem Wirt. Der Klon AC4.1 wurde bis zur Homogenität nach drei Runden des Screenings gereinigt. Eine Restriktionskartierung des AC4.1 zeigte, dass der Klon eine ungefähre Länge von 13 kb aufweist und zwei interne BAMHI-Stellen beinhaltet (1). Eine dieser Stellen wurde ebenso in der Ms45-partiellen cDNA gefunden. Zwei BAMHI-Fragmente wurden in einem Klonierungsvektor subkloniert (Bluescript SK+, Stratagene, La Jolla, CA). Der 5'-Endklon wies eine Länge von ungefähr 3,5 kb auf und entsprach der Sequenz stromaufwärts (5') der internen BAMHI-Stelle. Der 3'-Endklon wies 2,5 kb auf und enthielt die Ms45-Sequenz stromabwärts der internen BAMHI-Stelle. Gleichzeitig wurde eine mutmaßliche Volllängen-Ms45-cDNA isoliert und sequenziert. Durch Sequenzvergleich des 5'-Endklons und der Ms45-cDNA wurde die mutmaßliche Translationsstartstelle identifiziert (1).
  • Die Sequenzierung der Ms45-Promotorregion wurde erreicht unter Verwendung der Dideoxyketten-Terminationsmethode von Sanger, F., et al, "DNA Sequencing with Chain Terminating Inhibitors"; Proc. Natl. Acad. Sci,; Vol. 74; S. 5463–5467; (1977). Der genomische Klon pac4.1-5' (1) wurde sequenziert unter Verwendung des Universaloligos und anderen, die sequenzspezifisch waren, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken.
  • Die reguatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe wies eine NCOI-Stelle auf, eingeführt an dem Startcodon und war als NCOI-Fragment in einen Promotorlosen Luci-Expressionsvektor kloniert worden. Dieser neue Reportervektor wurde als Plasmid PHP6045 benannt (2) ATCC Nr: 97828 (hinterlegt am 12. Dezember 1996; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852).
  • BEISPIEL 2
  • Primeregtensionsanalyse
  • Gesamt-RNA von Maisfahnen, enthaltend Quartett über ein frühes einkernige Stadien der Antheren, wurden isoliert. Die Gesamt-RNA wurde mit Ethanol und Magnesiumchlorid präzipitiert. Ein Milligramm der Gesamt-RNA wurde isoliert und die poly A+ mRNA unter Verwendung von Oligo-dT-Cellulose gereinigt. Poly A+ RNA wurde ebenso direkt aus 6 Tage alten Maissetzlingsblättern und Maisantheren unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Protokollen isoliert.
  • Eine Sequenzierungsleiter („sequencing ladder") wurde unter Verwendung eines einzelsträngigen Ms45-Oligonukleotids und Inkorporation eines 35S-dATP in einem Standardsequenzierungsverfahren, unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Protokollen, hergestellt.
  • Die Primerextension wurde gemäß des Verfahrens unten durchgeführt: I. 5'-Ende markierte synthetische Oligonukleotidprimer.
    Kombiniert: 5 pmol Primer N11916 (PHL11916) in 1,0 μl
    5 μl (50 μCi) Gamma 32P-ATP (> 5000 Ci/mmol)
    0,7 μl 10X Kinasepuffer
    0,7 μl T4 Polynukleotidkinase
  • Inkubiert bei 37°C, 45 Min.
  • Verdünnt mit 20 μl TE und erhitzt auf 65°C, um die Enzyme zu inaktivieren.
    10X Kinasepuffer um 1 ml herzustellen
    0,5 M Tris-HCl, pH 7,6–8,0 0,5 ml von 1 M
    5 mM Spermidin 0,05 ml von 0,1 M
    100 mM MgCl2 0,1 ml von 1 M
    100 mM DTT 0,5 ml von 0,5 M
    0,1 mg/ml Gelatine oder BSA 50 μl von 2 mg/ml
    0,1 ml Wasser
  • II. Wiederverbundene ("annealed") Primer und RNA
  • Kinatesierte („kinased") Primer wurden mit mRNA aus Maisfahnen, 6d Maissetzlingsblätter, Maisantheren und 6d Maisblättern wiederverbunden ("annealed"). Zusammengemischt auf Eis wurden 2 μl mRNA, 1 μl kinatesiertes Oligo, 2 μl 5X Annealingpuffer (1,25 M KCl, 10 mM Tris, pH 7,9–8,15), und 1 μl 30 mM Vanadyl. Das Gesamtvolumen wurde auf 10 μl mit 10 mM Tris, pH 8,15 gebracht. Die Mischung wurde auf 65°C erhitzt und auf 55°C gekühlt für eine 4 Stundenperiode auf einem Thermocycler-Heizblock.
  • III. Primerextension
  • 23 μl Primerextensionmix (siehe Rezept unten) und 0,4 μl reverse Transkriptase (SuperScript, BRL, MD) wurden in jedes Röhrchen hinzugefügt. Dieses wurde durch behutsames Auf- und Niederpepitieren gemischt und sofort in 48°C gestellt und für 45 Minuten inkubiert. Der Primerextensionsmix besteht aus 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,33 mM jedes dATP, dCTP, dGTP, dTTP und DEPC-Wasser.
  • 300 μl Ethanol wurden hinzugefügt und über Nacht in einem –20°C Gefrierschrank präzipitiert, dann 30 Minuten in einer Mikrofuge pelletiert. Die Pellets wurden in einer Speed-Vac getrocknet und in 6 μl 0,1 NaOH/1 mM EDTA aufgelöst. Die Inhalte der Röhrchen wurde gemischt durch Pipettieren und Vortexen, um sicherzustellen, dass die Pellets gelöst waren. Diese wurden bei Raumtemperatur 2,5 Stunden stehengelassen und 6 μl Sequenzierungsfarbstoff (Stop Solution aus USB Sequenzierungskit) hinzugefügt und die Lösung wurde bei ungefähr 95°C denaturiert. Eine Hälfte der Probe wurde auf ein 6% denaturierendes Polyacrylamid-Sequenzierungsgel mit Stackingpuffer geladen und bei 55 Watt für 2 Stunden laufen gelassen. Das Gel wurde in einem Geltrockner getrocknet und einem Kodak X-AR Film ausgesetzt. Nach drei Tagen Belichtung wurde ein Transkriptionsprodukt in der Maifahnen-mRNA-Primerextensionsreaktion, welche einem Deoxythymidin, lokalisiert 42 Nukleotide stromaufwärts des Startcodons (3) entspricht, beobachtet. Diese Position wurde als +1 bezeichnet. Ein unbedeutender Transkriptionsstart wurde ebenso bei –3 identifiziert.
  • BEISPIEL 3
  • Bestimmung der Stadiums- und Gewebespezifität der Ms45 regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe
  • Die Volllängen-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe (SEQ ID NO: 1) wurde mit einem Luciferase-Reportergen aus der Feuerfliege, Photinus pyralis fusioniert (DeWit, T. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Vol. 82; S. 7870–7873; (1985)) mit der PinII-3' nichttranslatierten Region von Kartoffel (An, G., et al., "Functional Analysis of the 3' Control Region of the Potato Wound-Inducible Proteinase Inhibitor II Gene"; Plant Cell; Vol. 1; S. 115–122; (1989)). Maisantheren von verschiedenen Entwicklungsstadien wurden ausplattiert auf Fahnenkulturmedium (Pareddy, et al., Theoret. Appl. Genet.; Vol. 77; S. 521–526; (1989)), verfestigt mit Agar (Phytagar®, Sigma, St. Louis). Eine dieser drei Antheren von jeder Einzelblüte wurden abgestuft und die verbleibenden Antheren wurden durch Abstufen vereint und für den Mikroprojektilbeschuss ("microprojectile bombardment") ausplattiert, typischerweise acht Antheren pro Platte. Auf die Antheren wurde bei 1100 p.s.i. mit 1,8 μ Wolframpartikel geschossen, welche präzipitierte DNA von der Ms45-bevorzugten regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe – Luciferase-Reporterkonstrukt war. Alle Antheren auf einer vorliegenden Platte waren im selben Stadium: prämeiotisch, Meiose I, Meiose II, Quartett, Mikrosporenfreisetzung, frühe einkernige Mikrospore oder mittel einkernige Mikrospore. Drei Wiederholungen wurden für jedes Stadium beschossen. Die Antheren wurden über Nacht bei 26°C für 18 Stunden inkubiert. Ein Rohextrakt wurde hergestellt mit den Antheren aus jeder Platte und auf Luciferase-Aktivität und Proteingehalt hin untersucht. Die Luciferase-Aktivität, normalisiert auf Proteinkonzentration ist in 4 als Funktion des Entwicklungsstadiums graphisch dargestellt. Die Hauptaktivität war in den Quartett- und Mikrosporenfreisetzungsstadien der Entwicklung, mit geringerer Aktivität in Meiose I und II und kaum detektierbarer Aktivität in dem frühen einkernigen Stadium. Keine signifikante Aktivität gegenüber dem Hintergrund wurde in prämeiotischen oder mittelmononuklearen Antheren detektiert.
  • Zusätzlich wurde embryonischer Kallus, kultiviert auf MS-Medium, enthaltend 2,0 μg/ml von 2,4-D auf dieselbe Art und Weise beschossen, ausgenommen bei 650 p.s.i. mit Partikeln beschichtet mit einem Luciferase-Reporter, fusioniert entweder mit der Ms45-regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe oder einem Maisubiquitin-Promotor (U.S. Pat. Nr. 5,510,474) und einem uidA-(GUS)-Reporter, fusioniert mit einem Maisubiquitin-Promotor. Luciferase wurde auf ☐-Glucuronidase normalisiert. Wie in 5 gezeigt, war die Ms45-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe nicht in der Lage die kurzzeitige Expression in embryogenen Kallus und Sprossen, sogar durch den Ubiquitin-Promotor exprimiert, zu steuern. Ebenso wurden Maissamen aufgenommen und in destilliertem Wasser für 2 Tage gekeimt, in nasse Filter platziert und einem Mikroprojektiolbeschuss ausgesetzt und ihre Hypokotylen auf Luciferase und ☐-Glucuronidase hin untersucht. Die Ubiquitin-regulatorische Region (Promotor) war aktiv, aber die Ms45-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe war es nicht.
  • Dieses Ergebnis ist parallelisiert durch die Ergebnisse der RNA-Hybridisierungsanalyse. Maisantheren bei verschiedenen Entwicklungsstadien wurden gesammelt und wie folgt behandelt. Eine der drei Antheren von jeder Einzelblüte wurde fixiert (3 : 1 Ethanol : Eisessig) in einem Well einer Mikrotiterplatte und zwei wurden in flüssigen Stickstoff eingefroren in einem Well auf einer entsprechenden Position einer anderen Mikrotiterplatte. Fixierte Antheren wurden gestaffelt; dann die entsprechenden gefrorenen Antheren vereinigt nach Stadien und poly A+ RNA wurde von 20 Antheren isoliert (RNA Micro-Quick Prep Kit, Pharmacia, Uppsila, Schweden). Identische Volumen der RNA von Antheren von jedem vereinigten Stadium wurden einer Elektrophorese auf 1,2% Agarose in MOPS-Puffer + Formaldehyd unterzogen. RNA Proben wurden durch Blotten auf eine Nylonmembran transferiert, fixiert durch UV-Quervernetzen (Stratalinker, Stratagene Inc., La Jolla) und hybridisiert mit einem 32P-markierten Sondenfragment, bestehend aus der ganzen Ms45-cDNA-codierenden Region und der 3'-Region. Diese in 4 gezeigten Ergebnisse bestätigen den stetigen Zustand des Ms45-Transkripts, detektierbar im Quartett durch frühes einkerniges Stadium und möglicherweise genauso früh, aber nicht früher als Telophase II in der Meiose. Entweder akkumulieren die Transkriptionslevel, die aus der Aktivität der Ms45-regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe während der Meiose resultieren nicht genügend um durch RNA-Hybridisierung detektiert zu werden, oder das meiotische Stadium der Aktivität der regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe, die in Kurzzeituntersuchungen beobachtet wurde, tritt nicht in Pflanzen auf.
  • Folglich wurde die Ms45-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe (SEQ ID NO: 1) charakterisiert, dass sie eine Expression aufweist, spezifisch für männliches Gewebe von mindestens dem Quartettstadium der Antherenentwicklung durch Quartettfreisetzung mit niedriger Level -Expression, die möglich ist im meiotischen und frühem einkernigen Stadium.
  • BEISPIEL 4
  • TATA-Box-Analyse
  • Innerhalb des 1388bp Fragments der DNA, codierend die Ms45-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, wurde der Hauptstart der Transkription bei +1 identifiziert, ein unbedeutender Start der Transkription wurde bei –3, relativ zum Start der Haupttranskription identifiziert und eine mutmaßliche TATA-Box wurde bei –33 (CATTAAA) identifiziert. Es wurde bemerkt, dass die Sequenz TAAAGAT bei –30 ebenso ein Kandidat für die eigentliche TATA-Box sein könnte. Dieses 1388pb Fragment war funktionell verknüpft an eine Reporter gen-Kassette, umfassend die Luciferase codierende Region aus Feuerfliege (Pareddy, et al., Theoret. Appl. Genet.; Vol. 77; S. 521–526; (1989)), gefolgt von der 3'-nichttranslatierten Region des Proteinaseinhibitor II-Gens der Kartoffel. (An, G., et al., "Functional Analysis of the 3' Control Region of the Potato Wound-Inducible Proteinase Inhibitor II Gene"; Plant Cell; Vol. 1; S. 115–122; (1989)).
  • Ein im Stand der Technik gut bekannter Weg um TATA-Boxen zu analysieren ist durch Mutation. In einem anderen Derivat wurden von einem bis sechs Nukleotiden der mutmaßlichen TATA-Box in einem vorliegenden Derivat verändert. Eine BGLII-Stelle wurde bei –38 eingeführt, die die angebliche TATA-Box von CATTAAA auf TATTAAA veränderte, was ein engeres Zusammenpassen der kanonischen TATA-Boxsequenz TATATAA darstellt.
  • Von einem Fachmann wird es geschätzt werden, dass bestimmte Substitutionen innerhalb der TATA-Box durch den Expressionslevel des Promotors ohne Gewebespezifität zu beeinflussen, bewirkt wird. Wie in 7 gezeigt, ist der Wechsel in der TATA-Box mit der BgLII-Stelle, eingeführt bei –38, verbunden mit einem dramatischen angestiegenen kurzzeitigen Expressionslevel in Antheren und schlägt weiter vor, dass die Sequenz bei –33 die authentische TATA-Box aufweist. Das Einführen der BGLII-Stelle bei –40, –43, –51 oder –53 verstärkte nicht die Aktivität des Promotors (Daten nicht gezeigt), beweisend, dass der beobachtete Anstieg in der –38 BGLII-Stellen-Einführung nicht bezogen war auf die BGLII-Stelle per se.
  • Andere Modifikationen der mutmaßlichen TATA-Box wurden eingeführt, um weiter ihre Funktionalität zu testen. Veränderungen der angeblichen TATA-Box-Sequenz von CATTAAA auf GATTAAA, CATGGAA oder GGGCCCA verminderten alle das kurzzeitige Expressionslevel in Antheren, weiter vorschlagend die Bedeutung dieser Sequenz als eine TATA-Box. Überraschenderweise zeigte keiner dieser Mutationen eine kurzzeitige Aktivität, wenngleich es Berichte über kurzzeitige Aktivität in anderen Systemen in der Abwesenheit einer TATA-ähnlichen Sequenz und sogar eines TATA-losen Promotors gab (Guan, L., und J. G. Scandalios, Plant J.; Vol. 3; S. 527–536; (1993); Close, P. S., "Cloning and Molecular Characterization of Two Nuclear Genes for Zea mays Mitochondrial Chaperonin 60"; (Dissertation); Iowa State University; Ames, Iowa; S. 92, 128; (1993)).
  • SEQUENZAUFLISTUNG:
    Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001

Claims (32)

  1. Isoliertes Nucleinsäuremolekül umfassend eine Ms45-regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, die in männlichen Geweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben der Pflanze steuert und umfasst: (a) eine Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder 2; (b) eine Nucleotidsequenz mit wenigstens 70% Identität zu einer Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder 2, die in männlichen Geweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben der Pflanze steuert; (c) eine Nucleotidsequenz, die mit einer Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder 2 unter hoch-stringenten Bedingungen, dargestellt durch eine Waschstringenz von 50% Formamid mit 5X Denhardt' s Lösung, 0,5% SDS und 1X SSPE bei 42°C hybridisiert und in männlichen Pflanzengeweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben der Pflanze steuert; (d) ein Fragment einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 oder 2, die in männlichen Pflanzengeweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben der Pflanze steuert; oder (e) eine regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, aus dem Inneren der Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder 2, die in männlichen Geweben einen höheren Transkriptionslevel als in einigen oder allen anderen Geweben einer Pflanze steuert; verbunden mit einem Core-Promotor.
  2. Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, Teil (e), wobei der Core-Promotor der CAMV 35S- oder 19S-Promotor, der IN2-Core-Promotor, der Ubiquitin-Promotor oder ein Braunwurzmosaikvirus-Promotor ist.
  3. Rekombinanter Expressionsvektor umfassend die isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, funktionell verknüpft mit einer Nucleotidsequenz, codierend ein exogenes Gen, sodass das exogene Gen in männlichen Geweben einer Pflanze zu einem höheren Level als in einigen oder allen anderen Geweben exprimiert wird.
  4. Vektor nach Anspruch 3, wobei das exogene Gen Ms45 ist.
  5. Verfahren zur Herstellung einer transformierten Pflanze, die eine exogene Nucleotidsequenz in männlichen Geweben der Pflanze zu einem höheren Level als in einigen oder allen anderen Geweben exprimiert, umfassend das Einführen der exogenen Nucleotidsequenz, funktionell verknüpft mit einer regulatorischen Region, spezifisch für männliches Gewebe, nach Anspruch 1 oder 2 in eine Pflanze.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Einführungsschritt durch Mikroprojektilbeschuss („microprojectile bombardment") durchgeführt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Einführungsschritt Agrobakterium verwendet.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Agrobakterium ein Ti-Plasmid umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die regulatorische Region in Geweben, ausgewählt aus Pollen, Tapetum, Antheren, Fah nen, Pollenmutterzellen und Mikrosporen, zu einem höheren Level als in einigen oder allen anderen Geweben exprimiert.
  10. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, nach Anspruch 1 oder 2, in mehr als einer Kopie vorhanden ist.
  11. Verfahren zum Vermitteln von Fertilität in einer Pflanze, umfassend die Herstellung einer transformierten Pflanze, wobei die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe nach Anspruch 1 oder 2, funktionell verknüpft mit einem exogenen Gen, die exogene Nucleotidsequenz exprimiert, sodass es Auswirkungen auf die Fertilität hat.
  12. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die exogene Nucleotidsequenz eine DNA-Sequenz, die für ein prokaryotisches regulatorisches System codiert, umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die exogene Nucleotidsequenz für ein cytotoxisches Gen codiert.
  14. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die exogene Nucleotidsequenz für Avidin codiert.
  15. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die exogene Nucleotidsequenz für DAM-Methylase codiert.
  16. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die exogene Nucleotidsequenz für die regulatorische Region, spezifisch für männliches Gewebe, funktionell verknüpft mit einer komplementären nucleotidischen Einheit, codiert.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die komplementäre nucleotidische Einheit ausgewählt ist aus Kallase-Antisense-RNA, Barnase-Antisense-RNA, Chalconsynthase-Antisense-RNA und Ms45-Antisense-RNA.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die komplementäre nucleotidische Einheit ausgewählt ist aus Ribozymen und externen Guide-Sequenzen.
  19. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die exogene Nucleotidsequenz für ein Produkt, ausgewählt aus Auxinen, rolB und Diphtherietoxin codiert.
  20. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die exogene Nucleotidsequenz ein männliches Sterilitätsgen ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das männliche Sterilitätsgen Ms45 ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Pflanze eine Dikotyle ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 5, ferner umfassend ein Pflanzen in fremdbestäubender Juxtaposition einer ersten männlichen, fruchtbaren Pflanze und einer zweiten männlichen, unfruchtbaren Pflanze, das Erlauben der Fremdbestäubung stattzufinden und die Ernte der resultierenden Samen.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Pflanze Mais ist.
  26. Transformierte Pflanze, die eine exogene Nucleotidsequenz in männlichen Geweben zu einem höheren Level als in einigen oder allen anderen Geweben exprimiert, umfassend eine exogene Nucleotidsequenz, funktionell verknüpft mit einer regulatori schen Region, spezifisch für männliches Gewebe, nach Anspruch 1.
  27. Transformierte Pflanze nach Anspruch 20, wobei die Regulatorregion, spezifisch für männliches Gewebe, nach Anspruch 1 oder 2 und die funktionell verknüpfte exogene Nucleotidsequenz in mehr als einer Kopie vorhanden sind.
  28. Transformierte Pflanze nach Anspruch 26, die eine Monokotyle oder eine Dikotyle ist.
  29. Transformierte Pflanze nach Anspruch 26 oder 28, die ausgewählt ist aus Mais, Sonnenblume, Sojabohne, Weizen, Rapsarten („Canola"), Reis und Sorghum.
  30. Transformiertes Gewebe der transformierten Pflanze nach Anspruch 29.
  31. Transformiertes Gewebe nach Anspruch 30, das ausgewählt ist aus Pollen, Ähren, Samenanlagen, Antheren, Fahnen, Staminapistillen und Pflanzenzellen.
  32. Transformierte Pflanzenzellen der transformierten Pflanze nach Anspruch 26.
DE69828505T 1997-06-23 1998-06-19 Regulatorische region, spezifisch für männliche gewebe und verfahren zu deren anwendung Expired - Lifetime DE69828505T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US880499 1997-06-23
US08/880,499 US6037523A (en) 1997-06-23 1997-06-23 Male tissue-preferred regulatory region and method of using same
PCT/US1998/012895 WO1998059061A1 (en) 1997-06-23 1998-06-19 Male tissue-preferred regulatory region and method of using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69828505D1 DE69828505D1 (de) 2005-02-10
DE69828505T2 true DE69828505T2 (de) 2006-01-05

Family

ID=25376411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69828505T Expired - Lifetime DE69828505T2 (de) 1997-06-23 1998-06-19 Regulatorische region, spezifisch für männliche gewebe und verfahren zu deren anwendung

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6037523A (de)
EP (1) EP0994956B1 (de)
JP (1) JP3513157B2 (de)
CN (1) CN1149293C (de)
AR (1) AR016280A1 (de)
AT (1) ATE286538T1 (de)
AU (1) AU747286B2 (de)
BG (1) BG104095A (de)
BR (1) BRPI9810293B1 (de)
CA (1) CA2293997C (de)
DE (1) DE69828505T2 (de)
ES (1) ES2236915T3 (de)
HU (1) HU225002B1 (de)
NZ (1) NZ501954A (de)
PT (1) PT994956E (de)
RO (1) RO119957B1 (de)
TR (1) TR199903234T2 (de)
WO (1) WO1998059061A1 (de)
ZA (1) ZA985408B (de)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7154024B2 (en) * 1997-06-23 2006-12-26 Pioneer Hi-Bred, Inc. Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same
WO2001060997A2 (en) * 2000-02-15 2001-08-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Male tissue-specific regulatory region and method of using same
AU6406800A (en) * 1999-03-16 2000-10-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. SF3 promoter and methods of use
DE10081621D2 (de) * 1999-06-12 2002-05-29 Thomas Roitsch Promotorsystem, dessen Herstellung und Verwendung
US6465217B1 (en) 2000-07-05 2002-10-15 Paradigm Genetics, Inc. Methods and compositions for the modulation of chorismate synthase and chorismate mutase expression or activity in plants
WO2002026789A2 (en) * 2000-09-26 2002-04-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US7517975B2 (en) 2000-09-26 2009-04-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US7612251B2 (en) 2000-09-26 2009-11-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US6956118B2 (en) * 2001-02-08 2005-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promoter sequences providing male tissue-preferred expression in plants
WO2003003816A2 (en) 2001-07-06 2003-01-16 Monsanto Technology Llc Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof
WO2003029492A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Justin Gallivan Metabolic genes and related methods and compositions
US7230168B2 (en) * 2001-12-20 2007-06-12 The Curators Of The University Of Missouri Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase
EP1527183B1 (de) * 2002-07-26 2008-08-20 BASF Plant Science GmbH Neue selektionsverfahren
US7202397B2 (en) * 2002-08-16 2007-04-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chalcone synthase
WO2004085611A2 (en) * 2003-03-21 2004-10-07 The Research Foundation Of State University Of New York Model for mutually exclusive domain folding molecular switch
US20070169227A1 (en) * 2003-12-16 2007-07-19 Pioneer Hi-Bred International Inc. Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same
AU2011265403B2 (en) * 2003-12-16 2012-07-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Dominant gene suppression transgenes and methods of using same
CN104313049A (zh) 2003-12-16 2015-01-28 先锋高级育种国际公司 显性基因抑制性转基因及其使用方法
US20080244765A1 (en) * 2004-12-16 2008-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for pollination disruption
AR052164A1 (es) * 2005-12-15 2007-03-07 Bioceres S A Una molecul a aislada de adn potenciadora de la expresion de una secuencia codificante, fragmento, variante genetica, casete, vector, celula, planta y semilla que contengan la molecula .
US7919676B2 (en) * 2007-08-03 2011-04-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same
US7915478B2 (en) 2007-08-03 2011-03-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same
US7910802B2 (en) * 2007-08-03 2011-03-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. MSCA1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same
EP2173883A1 (de) * 2007-08-03 2010-04-14 Pioneer Hi-Bred International Inc. Msca1-nukleotidsequenzen mit auswirkung auf männliche fruchtbarkeit bei pflanzen und verfahren unter verwendung davon
EP2257076B1 (de) * 2009-05-28 2015-02-25 Advanced Digital Broadcast S.A. Videodatensignal, System und Verfahren zum Steuern der Blendengläser
WO2013138289A2 (en) * 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CN104703998B (zh) 2012-03-13 2020-08-21 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
US9803214B2 (en) 2013-03-12 2017-10-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Breeding pair of wheat plants comprising an MS45 promoter inverted repeat that confers male sterility and a construct that restores fertility
BR112015023304A2 (pt) 2013-03-14 2017-07-18 Pioneer Hi Bred Int método para melhorar a tolerância ao estresse abiótico de uma planta, planta e semente
BR112015023700A2 (pt) 2013-03-15 2017-07-18 Pioneer Hi Bred Int método de aprimoramento da tolerância ao estresse abiótico em uma planta de cultura agrícola , planta de milho transgênica, célula vegetal, semente, método de regulação negativa de um gene de acc oxidase endógeno em uma planta de milho.
CA2918909A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing hybrid brassica seed
CN103733979B (zh) * 2013-12-23 2015-06-03 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率的方法
CN103667277B (zh) * 2013-12-31 2016-02-17 北京大北农科技集团股份有限公司 介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法
WO2016100309A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Restoration of male fertility in wheat
CA2968938A1 (en) 2017-05-31 2018-11-30 Bayer Cropscience Lp Canola hybrid variety 5cn0130
CA2968905A1 (en) 2017-05-31 2018-11-30 Bayer Cropscience Lp Canola hybrid variety 5cn0125
CA3004115A1 (en) 2018-05-07 2019-11-07 Bayer Cropscience Lp Canola hybrid variety 6cn0122
CA3040289A1 (en) 2019-04-12 2020-10-12 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7cn0298
CA3047768A1 (en) 2019-06-21 2020-12-21 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7cn0425
US11672218B2 (en) 2020-04-24 2023-06-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7CN0065
CN114480418B (zh) * 2022-01-24 2023-08-25 上海交通大学 温敏雄性不育基因hsp60-3b及其应用和育性恢复的方法

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5190931A (en) * 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5208149A (en) * 1983-10-20 1993-05-04 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures
US4732856A (en) * 1984-04-03 1988-03-22 Carnegie Institution Of Washington Transposable elements and process for using same
US4833080A (en) * 1985-12-12 1989-05-23 President And Fellows Of Harvard College Regulation of eucaryotic gene expression
GB8901677D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
US5356799A (en) * 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
NZ227835A (en) * 1988-02-03 1992-09-25 Paladin Hybrids Inc Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
GB8810120D0 (en) * 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
GB8901697D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Male flower specific gene sequences
KR920701453A (ko) * 1989-03-17 1992-08-11 미리엄 디. 멕코나헤이 유전자발현의 외부조절
US5168053A (en) * 1989-03-24 1992-12-01 Yale University Cleavage of targeted RNA by RNAase P
WO1990012107A1 (en) * 1989-03-31 1990-10-18 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Recombinant expression system based on satellite tobacco mosaic virus
US5086169A (en) * 1989-04-20 1992-02-04 The Research Foundation Of State University Of New York Isolated pollen-specific promoter of corn
EP0412911B1 (de) * 1989-08-10 2001-07-18 Aventis CropScience N.V. Pflanzen mit modifizierten Blüten
DE3931969A1 (de) * 1989-09-25 1991-04-04 Max Planck Gesellschaft Dna-sequenz, wunl-gen mit gestutztem promotor sowie verwendung derselben
WO1991009957A1 (en) * 1989-12-22 1991-07-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific recombination of dna in plant cells
US5472841A (en) * 1990-06-11 1995-12-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying nucleic acid ligands of human neutrophil elastase
CA2042447C (en) * 1990-06-12 1999-09-28 Marc C. Albertsen Control of microsporogenesis by externally inducible promoter sequences
US5478369A (en) * 1990-06-12 1995-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US5824524A (en) * 1990-06-12 1998-10-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating fertility and method of using same
US5432068A (en) * 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences
CA2087703C (en) * 1990-07-20 1999-09-21 Steven F. Fabijanski Binary cryptocytotoxic method of hybrid seed production
GB9028060D0 (en) * 1990-12-24 1991-02-13 Nickerson Int Seed Recombinant dna
WO1992013957A1 (en) * 1991-02-07 1992-08-20 Plant Genetic Systems, N.V. Stamen-specific promoters from corn
CZ214593A3 (en) * 1991-04-16 1994-07-13 Mogen Int Plants exhibiting male sterility, process of obtaining thereof and recombinant dna for application of such process
GB9115909D0 (en) * 1991-07-23 1991-09-04 Nickerson Int Seed Recombinant dna
JP3418396B2 (ja) * 1992-03-09 2003-06-23 ワシントン ステート ユニバーシティ リサーチ ファンデーション 植物稔性の調節方法
EP0578611B1 (de) * 1992-07-02 2003-11-26 Syngenta Participations AG Anthere-spezifische cDNA-Sequenzen, genomische DNA-sequenzen und rekombinante DNA-sequenzen
AU669384B2 (en) * 1992-07-09 1996-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize pollen-specific polygalacturonase gene
CA2151267A1 (en) * 1992-12-16 1994-06-23 Robert Bruce Knox Developmental regulation in anther tissue of plants
CA2161515A1 (en) * 1993-05-03 1994-11-10 Willem Johannes Stiekema Method for obtaining male-sterile plants
US5470359A (en) * 1994-04-21 1995-11-28 Pioneer Hi-Bred Internation, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
US5837850A (en) * 1994-04-21 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
WO1996013588A1 (en) * 1994-10-28 1996-05-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US5633438A (en) * 1994-11-22 1997-05-27 Pioneer Hi-Bred International Microspore-specific regulatory element
US5763243A (en) * 1994-12-08 1998-06-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
US5733726A (en) * 1995-06-07 1998-03-31 Emory University Cytotoxicity-based genetic selection system (TOXSEL)
JP3761628B2 (ja) * 1995-07-14 2006-03-29 住友化学株式会社 植物プロモーターおよびその利用

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0002578A2 (hu) 2000-12-28
EP0994956B1 (de) 2005-01-05
BG104095A (en) 2000-11-30
JP2001520523A (ja) 2001-10-30
EP0994956A1 (de) 2000-04-26
NZ501954A (en) 2001-06-29
JP3513157B2 (ja) 2004-03-31
CA2293997C (en) 2007-09-11
AU747286B2 (en) 2002-05-16
CA2293997A1 (en) 1998-12-30
US6037523A (en) 2000-03-14
BR9810293A (pt) 2001-11-20
TR199903234T2 (xx) 2000-06-21
HUP0002578A3 (en) 2001-11-28
WO1998059061A9 (en) 1999-04-15
PT994956E (pt) 2005-04-29
RO119957B1 (ro) 2005-06-30
BRPI9810293B1 (pt) 2016-06-14
AR016280A1 (es) 2001-07-04
HU225002B1 (hu) 2006-05-29
CN1149293C (zh) 2004-05-12
ATE286538T1 (de) 2005-01-15
AU8157698A (en) 1999-01-04
DE69828505D1 (de) 2005-02-10
CN1268183A (zh) 2000-09-27
WO1998059061A1 (en) 1998-12-30
ZA985408B (en) 2000-04-03
ES2236915T3 (es) 2005-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69828505T2 (de) Regulatorische region, spezifisch für männliche gewebe und verfahren zu deren anwendung
Zhang et al. Construction of a multicontrol sterility system for a maize male‐sterile line and hybrid seed production based on the ZmMs7 gene encoding a PHD‐finger transcription factor
DE69535040T2 (de) Reversibles kern-genetisches system für männliche sterilität in transgenen pflanzen
US5470359A (en) Regulatory element conferring tapetum specificity
US7151205B2 (en) Plant male tissue-preferred promotor, regulatory regions and methods of use in mediating plant male fertility
DE69832489T2 (de) Induktion von männlicher sterilität in pflanzen durch erhöhte expression von streptavidin
EP0564513B1 (de) Tapetumspezifische promotoren aus brassicaceae spp.
DE69333310T2 (de) Anthere-spezifische cDNA-Sequenzen, genomische DNA-sequenzen und rekombinante DNA-sequenzen
CA2437318A1 (en) Nucleotide sequence mediating male fertility and method of using same
US7154024B2 (en) Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same
CA2392722C (en) Male tissue-preferred regulatory region and method of using same
AU2001238177B2 (en) Male-tissue Specific Regulatory Region and Method of Using Same
CA2373071C (en) Tapetum-specific promoters
AU2001238177A1 (en) Male-tissue Specific Regulatory Region and Method of Using Same
MXPA99012109A (en) Male tissue-preferred regulatory region and method of using same
MXPA96004989A (en) Regulator element conferring tape specificity

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition