JP3513157B2

JP3513157B2 - 雄性組織優先的調節領域およびこれを使用する方法

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Publication number: JP3513157B2
Application number: JP50491099A
Authority: JP
Inventors: シー．アルバートセン，マーク; ダブリュー．フォックス，ティモシー; ダブリュー．ガーナート，カール; エイ．ホフマン，ゲイリー; エル．ケンドール，ティミー
Original assignee: パイオニアハイ−ブレッドインターナショナル，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-06-23
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2004-03-31
Anticipated expiration: 2018-06-19
Also published as: HUP0002578A2; EP0994956B1; BG104095A; JP2001520523A; EP0994956A1; NZ501954A; CA2293997C; AU747286B2; DE69828505T2; CA2293997A1; US6037523A; BR9810293A; TR199903234T2; HUP0002578A3; WO1998059061A9; PT994956E; RO119957B1; BRPI9810293B1; AR016280A1; HU225002B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、真核生物細胞において調節領域として作用
する単離されたDNA配列に関する。より詳細には、本発
明は、雄性組織優先的調節領域として作用し、そして雄
性組織における遺伝子の発現において役割を果たす、ト
ウモロコシ由来の単離されたDNA配列に関する。本発明
はまた、雄性組織において通常発現し得るまたはしなく
てもよい遺伝子に、雄性組織優先的様式で発現されるべ
き能力を与える方法に関する。

発明の背景組織および時間特異的な遺伝子発現および調節が、特
に、真核生物における有性生殖の間に見出される。植物
配偶子形成において、重要な細胞学的および生化学的変
化は、半数体小胞子の非対称有糸分裂が２つの細胞（そ
れぞれが異なる発達運命を有する）の形成を生じると
き、花粉発達の間に起こる。栄養細胞は花粉成長を支持
し、一方、雄原細胞は、有糸分裂を受け、精子細胞に発
達する。花粉内の両経路に特異的なメッセンジャーRNA
は、植物（例えば、トウモロコシ、トマト、タバコ、イ
ネ、およびスミレ）において同定されている；そして花
粉または葯内の１つ以上の他の細胞型（例えば、タペー
タム、表皮、および口辺細胞）に特異的なメッセージも
また同定されている。

分化の間の花粉遺伝子発現は、概算した24,000遺伝子
を包含する（Willingら、「An Analysis of the Qualit
y and Diversity of mRNA's From Pollen and Shoots o
f Zea mays」;Theor.Appl.Genet.;Vol.75;pp.751−753;
（1988））。しかし、cDNAライブラリーからのクローン
の10％のみが雄性特異的であり（Stinsonら、「Genes E
xpressed in the Male Gametophyte and Their Isolati
on」;Plant Physiol.;Vol.83;pp.442−447;（198
7））、花粉特異的である花粉で発現された遺伝子の％
は５％および80％の間である（Willingら、「An Analys
is of the Quality and Diversity of mRNA's From Pol
len and Shoots of Zea mays」;Theor.Appl.Genet.;Vo
l.75;pp.751−753;（1988））。小胞子形成のこの複雑
なプロセスは、多くの遺伝子産物の連続した産生を包含
する。

今日までに、雄性特異的遺伝子が、植物から単離され
ている；これらのうち２つは、トウモロコシMs45遺伝子
（米国特許第5,478,369号）およびアラビドプシスMs2遺
伝子（Mark、G.M.、Nature;Vol.363;pp.751−717;（199
3））は、花粉発達に必要であることが示されている。
植物における雄性特異的プロモーターの他の例は、ZM1
3、PG、およびSGB8を包含する。

Zm13プロモーターは、米国特許第5,086,169号に開示
されている。これは、1315塩基対からなり、そしてHans
onら、Plant Cell;Vol.1;pp.173−179;（1989）により
記載の花粉特異的遺伝子に由来する。この遺伝子は、花
粉においてのみ見出されるmRNAにハイブリダイズする。

花粉特異的ポルガラクツロナーゼ遺伝子（PG）の上流
の別の花粉特異的プロモーターが単離され、そして特徴
付けられている（米国特許第5,412,085号）。このプロ
モーター領域は、2687塩基対を包含し、そして花粉およ
び出現した雄穂において優勢に発現されるが、出現前雄
穂では発現されない。Allenからの米国特許第5,545,546
号もまた、トウモロコシウポリガラクツロナーゼ遺伝子
由来の別の花粉特異的プロモーターを記載している。そ
れは、花粉および出現した雄穂においてのみ発現され
る。

米国特許第5,470,359号は、タペータム特異性を与え
るトウモロコシのSGB6遺伝子由来の調節領域を記載して
いる。この発現組織、すなわちタペータムは、葯におい
て小胞子形成細胞を取り囲み、そしてそれに栄養分を提
供する細胞の層である。

タバコ由来の９つの葯特異的cDNAおよびゲノムクロー
ンは、米国特許第5,477,002号において記載されてい
る。cDNAクローンは、ノーザン分析により葯特異的であ
ったが、発達プロフィールの間でなお異なっていた。ク
ローンAnt32はタペータム特異的である。

欧州特許第0420819A1号は、wun1遺伝子を有する雄性
不稔性植物の生成の方法を記載している。

PCT WO90/08825は、葯特異的cDNAであるTA13、TA26、
およびTA29、ならびに雄性不稔性系におけるそれらの使
用を記載する。

PCT WO90/08825は、雄性不稔性遺伝子であるpMS10、p
MS14、およびpMS18、ならびにGUSレポーター遺伝子を用
いるそれらの使用を説明する。

米国特許第5,589,610号は、葯特異的cDNAおよび葯優
先的cDNA AC444に対応するプロモーターを詳述する。

植物プロモーターおよび外因性遺伝子の植物の遺伝子
構築物に変化を生じさせるための使用が、当該分野にお
いて公知である（米国特許第5,432,068号、第5,412,085
号、第5,545,546号、5,470,359号および5,478,369
号）。これらの特許は、雄性不稔性、稔性を引き起こ
し、またはそうでなければ特異的組織において遺伝子を
発現させる、遺伝子に連結された組織特異的プロモータ
ーを有する植物発現カセットを議論する。しかし、これ
らの特許は、雄性不稔性を制御する方法としてこの雄性
組織優先的調節領域の使用も、外因性遺伝子を有するこ
の雄性組織優先的調節領域の使用も教示していない。

本発明は、雄性組織特異的調節領域およびこれを使用
する方法に関する。雄性組織優先的様式での外因性遺伝
子の発現は、雄性稔性を媒介し得、そして雑種種子生成
のような多くの系において有用である。

発明の要旨外因性遺伝子に雄性組織優先的発現を与える発現ベク
ターを用いて、雄性組織優先的様式に外因性遺伝子を発
現させる方法を提供することが、本発明の目的である。
このプロセスは、雑種種子生成において、稔性を回復さ
せる（雄性不稔性系におけるように）か、またはそうで
なければ稔性に影響を与えるために用いられ得る。雄性
組織優先的遺伝子発現を与えるDNA調節領域を提供する
ことが、本発明のさらなる目的である。雄性組織優先的
調節領域またはそれに対して好ましくは約70％、75％、
または80％、より好ましくは約85％または90％、そして
最も好ましくは約95％または99％の配列同一性を有する
配列を提供することもまた、本発明の目的である。

Ms45雄性組織優先的調節領域をコードする単離された
核酸配列を提供することが、本発明の目的である。

配列番号１に示される核酸配列またはそれに対して配
列同一性を有する配列を含む、トウモロコシ（Zea may
s）由来のMs45雄性組織優先的調節領域をコードする単
離された核酸配列を提供することが、本発明の目的であ
る。配列番号２に示される核酸配列またはそれに対して
配列同一性を有する配列を含む、トウモロコシ（Zea ma
ys）由来のMs45雄性組織優先的調節領域をコードする単
離された核酸配列を提供することもまた、本発明の目的
である。

外因性遺伝子をコードするヌクレオチド配列に、外因
性遺伝子の発現を促進するような方法で、雄性組織優先
的な様式でヌクレオチド配列が発現するように作動可能
に連結された、配列番号１に示される単離された核酸配
列またはそれに対する配列同一性を有する配列を含む、
組換え発現ベクターを提供することが、本発明の目的で
ある。

外因性遺伝子がMs45である、外因性遺伝子を提供する
ことが、本発明の目的である。

外因性ヌクレオチド配列を雄性組織優先的様式で発現
する形質転換植物を生成する方法であって、植物に、配
列番号１に示されるヌクレオチド配列またはそれに対し
て配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む雄性組織
優先的調節配列に作動可能に連結された上記外因性ヌク
レオチド配列を導入する工程を包含する、方法を提供す
ることが、本発明の目的である。上記導入工程がマイク
ロプロジェクタイルボンバードメントによって行われ得
る上記方法は、AgrobacteriumまたはTiプラスミドを含
む移入ベクターを利用し得る。また、雄性組織優先性調
節領域に作動可能に連結された上記外因性遺伝子は、１
つより多いコピーで存在し得る。

上記調節領域が、花粉、タペータム、葯、雄穂、花粉
母細胞、および小胞子からなる群から選択される組織に
おいて、雄性組織優先的様式で発現する方法を提供する
することが、本発明の目的である。

雄性組織優先的様式で外因性ヌクレオチド配列を発現
する形質転換植物であって、配列番号１に示されるかま
たはそれに対して配列同一性を有する、雄性組織優先的
調節領域に作動可能に連結された、外因性ヌクレオチド
配列を有する、形質転換植物を提供することが、本発明
の目的である。上記植物は、単子葉または双子葉であ
る。形質転換され得る任意の植物が用いられ得る。例え
ば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、コムギ、アブラ
ナ、イネ、およびモロコシを包含する。本発明はまた、
形質転換植物の形質転換組織を提供する。例として、組
織は、花粉、穂、胚珠、葯、雄穂、雄蕊（stamens）、
雌蕊（pistils）および植物細胞であり得る。形質転換
植物は、雄性組織優先的調節領域に作動可能に連結され
た上記外因性ヌクレオチド配列の１つより多いコピーを
含み得る。

植物において稔性を媒介する方法であって、雄性組織
優先的調節配列が、稔性が影響を受けるように、上記外
因性ヌクレオチド配列を発現する、方法を提供すること
が、本発明の目的である。この外因性ヌクレオチド配列
は、雄性稔性に影響を与える任意の配列であり得、そし
て例として、カラーゼ（callase）アンチセンスRNA、バ
ルナーゼ（barnase）アンチセンスRNA、およびカルコン
シンターゼアンチセンスRNA、Ms45アンチセンスRNA、ま
たはリボザイムおよび外部ガイド配列、またはアプタマ
ーまたは一本鎖ヌクレオチドのようなアンチセンス分子
をコードする相補的ヌクレオチド単位であり得る。外因
性ヌクレオチド配列はまた、オーキシン、rolB、細胞
毒、ジフテリア毒素、DAMメチラーゼ、アビジンをコー
ドし得るか、または原核生物調節系から選択され得る。
また、この外因性ヌクレオチド配列は、雄性不稔性遺伝
子またはMs45構造遺伝子であり、そしてこの植物は単子
葉または双子葉である。

雑種種子を生成する方法であって、他家受粉整列で雄
性稔性植物および上記方法に従って生成された雄性不稔
性植物を植える工程、上記他家受粉を生じさせる工程、
および得られた種子を収穫する工程を包含する、方法を
提供することが、本発明の目的である。植物はトウモロ
コシ植物であり得る。

これらおよび他の目的は、単離されたDNA分子（ここ
で、DNA分子は配列番号１に示されるヌクレオチド配列
を含む）が提供されることによって、本発明の１つの実
施態様に従って、達成される。

本発明のさらなる実施態様に従って、外因性遺伝子を
含む発現ベクターであって、上記外因性遺伝子の発現が
雄性組織優先的調節領域の制御下にあり、上記外因性遺
伝子の産物が雄性稔性に影響を与える、発現ベクターが
提供されている。

本発明のさらなる実施態様に従って、稔性不稔性植物
を生成するためにこのような発現ベクターを使用する方
法であって、発現ベクターを植物細胞に導入する工程で
あって、ここで発現ベクターの外因性遺伝子がアンチセ
ンス分子（カラーゼアンチセンスRNA、バルナーゼアン
チセンスRNA、およびカルコンシンターゼアンチセンスR
NA、Ms45アンチセンスRNA）、リボザイムおよび外部ガ
イド配列、アプタマーまたは一本鎖ヌクレオチドのよう
な相補的ヌクレオチド単位であり得る、工程を包含す
る、方法が提供された。外因性ヌクレオチド配列はま
た、オーキシン、rolB、細胞毒、ジフテリア毒素、DAM
メチラーゼ、アビジンをコードし得るか、または原核生
物調節系から選択され得る。

本発明のさらなる実施態様に従って、雄性稔性雑種植
物を生成するために雄性組織優先的調節領域を使用する
方法であって、以下の工程を包含する、方法が提供され
た：ａ）雄性組織優先的調節領域および第一の外因性遺伝子
を含む発現ベクターを含む第一の親雄性不稔性植物を生
成する工程であって、ここで上記雄性組織優先的調節領
域は、第一の外因性遺伝子の発現を制御し、そしてここ
で上記第一の外因性遺伝子の産物は、雄性稔性を破壊す
る、工程；ｂ）第二の外因性遺伝子を含む発現ベクターを含む第二
の親植物を生成する工程であって、ここで上記調節領域
は、上記第二の外因性遺伝子の発現を、これが雄性組織
において発現され得るように制御する、工程；ｃ）上記第一の親を上記第二の親と交雑受粉して雑種植
物を生成する工程であって、上記雑種植物の上記雄性組
織が上記第二の外因性遺伝子を発現させ、そして上記第
二の外因性遺伝子の産物が、上記第一の外因性遺伝子の
産物による雄穂機能の破壊を防ぎ、それによって、雄性
稔性雑種植物を生成する、工程。

本発明のさらなる実施態様に従って、以下の工程を包
含する、雄性稔性雑種植物を生成するために雄性組織優
先的調節領域を使用する方法が提供された：ａ）雄性稔性の発現に関与する第一の遺伝子が破壊され
る、第一の親雄性不稔性植物を生成する工程；ｂ）雄性組織優先的調節領域および外因性遺伝子を含む
発現ベクターを含む第二の親植物を生成する工程であっ
て、ここで上記雄性組織優先的調節領域が、上記外因性
遺伝子の発現を、それが雄性組織で発現され得、そして
ａ）で破壊された遺伝子の機能を機能的に相補し得るよ
うに制御する、工程；ｃ）上記第一の親を上記第二の親と交雑受粉して雑種植
物を生成する工程であって、ここで上記雑種植物の雄性
組織は上記外因性遺伝子を発現し、そして上記外因性遺
伝子の産物が雄穂機能の破壊を防ぎ、それによって雄性
稔性雑種植物を生成する、工程。

図面の簡単な説明図１は、Ac 4.1 Ms45ゲノムクローンおよび制限部位
の模式図である。

図２は、PHP6045のプラスミド地図である。

図３は、Ms45の転写開始を示す、プライマー伸長産物
のオートラジオグラムである。Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃと表示し
たレーンはそれぞれ、ジデオキシヌクレオチドddGTP、d
dATP、ddTTP、およびddCTPとの配列決定反応に対応す
る。レーン１〜４は、（１）雄穂、（２）葉、（３）
葯、および（４）葉由来のmRNAとのプライマー伸長反応
に対応する。

図４は、Ms45雄性組織優先的調節領域の段階特異性を
示す棒グラフである。

図５は、非雄性組織における活性の欠如により示され
る組織特異性を示す。

図６は、雄性稔性遺伝子Ms45とハイブリダイズした葯
mRNAノーザン分析ゲルを示す。

図７は、TATAボックスの変異分析の結果を示す。

発明の開示引用された全ての文献は、本明細書中に参考として援
用される。

他に定義されなければ、本明細書中で使用される全て
の技術的および科学的用語は、本発明の属する分野の当
業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有す
る。他に言及されなければ、本明細書中で用いられる
か、または意図される全ての技術は、当業者に周知の標
準的な方法である。材料、方法、および実施例は、例示
のみであって、限定的ではない。

続く記載において、多数の用語が、広範に用いられ
る。以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提
供される。

1.定義配列同一性または類似性は、当該分野で知られるよう
に、２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオ
チド配列を比較することにより決定されるような、これ
らの２つの配列間の関係である。当該分野において、同
一性はまた、このような配列の２つのストリング間の一
致により決定されるような２つのポリペプチドまたは２
つのポリヌクレオチド配列間の配列関係の程度を意味す
る。同一性および類似性の両方が、容易に算定され得る
（Computational Molecular Biology;Lesk,A.M.編;Oxfo
rd University Press.New York;（1988）;Biocomputin
g:Informatics and Genome Projects;Smith,D.W.編、;A
cademic Press,New York;（1993）;Computer Analysis
of Sequence Data（Part I）;Griffin,A.M.およびH.G.G
riffin編;Humana Press,New Jersey;（1994）;von Hein
je,G.Sequence Analysis in Molecular Biology;Academ
ic Press;（1987）；およびSequence Analysis Primer;
Gribskov,MおよびJ.Devereux編;M.Stockton Press,New
York;（1991））。２つのポリヌクレオチドまたは２つ
のポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定する
ために、多数の方法が存在するが、両方の用語は、当業
者に周知である（von Heinje,G.Sequence Analysis in
Molecular Biology;Academic Press,New York;（198
7）;Sequence Analysis Primer;Gribskov,MおよびJ.Dev
ereux編;M.Stockton Press,New York;（1991）；および
Carillo,H.およびD.Lipman,SIAM,J.Applied Math.;Vol.
48;pp.1073;（1988））。２つの配列間の同一性または
類似性を決定するために一般的に利用される方法は、Ca
rillo,H.およびD.Lipman,SIAM,J.Applied Math.;Vol.4
8;pp.1073;（1988）に記載の方法を包含するが、これら
に限定されない。同一性を決定するために好ましい方法
は、試験される２つの配列間の最も大きな適合を与える
ように設計される。同一性および類似性を決定するため
の方法は、コンピュータープログラムにおいて体系化さ
れる。２つの配列間の同一性および類似性を決定するた
めの好ましいコンピュータープログラム方法は、GCGプ
ログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids R
esearch;Vol.12（１）;pp.387;（1984））、BLASTP、BL
ASTIN、およびFASTA（Astchul,S.F.ら、J.Molec.Biol.;
Vol.215;pp.403;（1990）を包含するが、これらに限定
されない。

雄性組織は、花粉、タペータム、葯、雄穂、花粉母細
胞および小胞子のような雄性配偶子の生殖に直接関わる
か、または支持する細胞の集まりで構成された組織から
なる。タペータムは、花粉母細胞および小胞子と最も近
くに接触した葯中の組織であり、おそらく発達中の花粉
粒の栄養とに関与している。花粉母細胞は、半数体であ
る小胞子の四分子を生成する２回の有糸分裂を受ける。
小胞子は、花粉粒への成熟を受ける。花粉または花粉粒
は、和合性である植物を受粉させる能力を有し得る成熟
雄性配偶体である。葯は、花粉が生成される雄蕊の部分
であり、雄蕊の残りの部分は、花糸からなり、そこから
葯が垂れ下がる。雄蕊は、花の雄性器官である。

雄性組織優先的調節領域は、植物のいくらかまたは全
ての他の組織よりも雄性組織において、関連遺伝子の高
レベルの転写を指向する、ヌクレオチド配列である。例
えば、本明細書中に記載のMs45遺伝子は、発達の四分
子、四分子放出、および初期単核期の間に葯で検出され
る。葯発達の段階に関する詳細については、Chang,M.T.
およびM.G.Neuffer,「Maize Microsporogenesis」;Geno
me;Vol.32;pp.232−244;（1989）を参照のこと。Ms45遺
伝子の雄性組織優先的調節領域は、雄性組織において作
動可能に連結された遺伝子の発現を指向する。発現の好
ましい組織は、雄性であり、例えば、根および子葉組織
ではない。優勢発現は、雄性組織（例えば、花粉、タペ
ータム、葯、雄蕊、花粉母細胞および小胞子であるが、
これらに限定されない）における。この雄性組織優先的
発現は、雄性組織における、より高いレベルの発現をい
い、他の組織を除くことを意味する必要はない。

媒介するとは、ポジティブまたはネガティブな方法で
影響を与えること、または結果（例えば、稔性または任
意の他の形質）に影響を与えることである。

雄性稔性は、通常でない稔性を経験するとき、影響が
与えられる；これは、減少した稔性または増大した稔
性、あるいは時期または他の特性によって異なる稔性の
ようなものであり得る。

単離されたとは、その天然状態から「人の手によっ
て」変えられたことを意味する；すなわち、それが天然
状態で存在すれば、そのもとの環境から変化されている
か、または除去されているか、あるいはその両方である
ことを意味する。例えば、天然に存在するポリヌクレオ
チドまたはその天然状態で生存する生物中に存在するポ
リペプチドは、「単離された」ではなく、しかし、その
天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドは、この用語が本明細書中で用い
られるように、「単離された」である。例えば、ポリヌ
クレオチドに関して、用語単離されたは、それが、天然
に存在する染色体および細胞から分離されていることを
意味する。単離の一部としてまたは単離後に、このよう
なポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチド（例え
ば、DNA）に、例えば、変異誘発のために、融合タンパ
ク質を形成するために、および宿主における増殖または
発現のために接続され得る。単離されたポリヌクレオチ
ド（単独または他のポリヌクレオチド（例えば、ベクタ
ー）に接続された）は、宿主細胞、培養物、または全生
物体に導入され得る。宿主細胞、培養物、または全生物
体に導入された、このようなDNAはなお、この用語が本
明細書中で用いられるように、単離されている。なぜな
ら、それらは、天然に存在する形態または環境にないか
らである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは、組成物（例えば、培地処方物、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの例えば細胞への導入のための溶
液、化学または酵素的反応のための組成物または溶液
（例えば天然に存在しない組成物中に存在し得、そして
この中に、本明細書中で用いられるようなこの用語の意
味内の単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド
を維持する。

外因性遺伝子は、本明細書中において、生物に導入ま
たは再導入されたDNA配列を言う。例えば、遺伝子が生
物に導入または再導入される場合、任意の遺伝子（ms45
構造遺伝子でさえ）が、外因性遺伝子であると考えられ
る。

2.雄性組織優先的調節領域の単離葯特異的プロモーターおよび雄性組織で活性な遺伝子
が当該分野で公知である（McCormickら、「Anther−Spe
cific Genes:Molecular Characterization and Promote
r Analysis in Transgenic Plants」、Plant Reproduct
ion:From Floral Induction to Pollination;Lordら編;
pp.128−135;（1989）;Scottら、国際出願公開WO92/113
79（1992）;van der Meerら、The Plant Cell;Vol.4;p
p.253;（1992））が、トウモロコシにおける遺伝子発現
に対して雄性組織発現を与えるDNA配列を認識するため
の一般的に受け入れられている原理および構造的な基準
は存在しない。結果、雄性組織優先的発現を与える共通
配列についてスクリーニングすることにより、トウモロ
コシゲノムライブラリーから直接的に雄性組織優先的調
節領域を単離することは、可能ではない。

例えば、このような配列のハイブリダイゼーション
は、減少したストリンジェンシー条件下、中間のストリ
ンジェンシー条件下、または高いストリンジェンシー条
件下でさえ（例えば、それぞれ、35〜40％ホルムアミド
（５×デンハート溶液、0.5％SDSおよび１×SSPEを有す
る）の37℃での洗浄ストリンジェンシーにより表される
条件;40〜45％ホルムアミド（５×デンハート溶液、0.5
％SDSおよび１×SSPEを有する）の42℃での洗浄ストリ
ンジェンシーにより表される条件；および50％ホルムア
ミド（５×デンハート溶液、0.5％SDSおよび１×SSPEを
有する）の42℃での洗浄ストリンジェンシーにより表さ
れる条件）も実行され得る。核酸の標準的ハイブリダイ
ゼーションにおける中間のストリンジェンシーは、本明
細書中に開示された雄性組織優先的調節領域および他の
遺伝子を同定することにおいて有用である（例えば、Sa
mbrook,J.ら、Molecular Cloning:a Laboratory Manua
l;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor,N.Y.;（1982）を参照のこと）。一般に、雄性組
織優先的調節領域をコードする配列は、それに対して好
ましくは、70％、75％、または80％、より好ましくは、
85％または90％、および最も好ましくは、95％または99
％の配列同一性を有する。

核酸配列のハイブリダイゼーションのための方法は、
当該分野で容易に利用可能である。プレートしたDNAラ
イブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング
（例えば、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:a Labor
atory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,C
old Spring Harbor,N.Y.;（1982）を参照のこと）また
はポリメラーゼ連鎖反応を用いるコード配列の増幅（例
えば、Innisら、PCR Protocols,A Guide to Methods an
d Applications;Academic Press;（1990）を参照のこ
と）は、ゲノムDNAを単離するための周知の技術であ
る。

調節領域は、機能的分析を用いてゲノムサブクローン
において同定され得、通常、葯組織におけるレポーター
遺伝子発現の観察および非葯組織におけるレポーター遺
伝子発現の減少または不在によって確認され得る。この
一般的なアプローチは、以下の実施例３に例示する。転
写開始部位の上流または5'区にある調節領域の可能性
は、上流領域を含むDNAフラグメントをサブクローン化
し、そして一過性発現実験について発現ベクターに小フ
ラグメントをサブクローン化することにより試験され得
る。より小さなフラグメントは、雄性組織優先的発現に
必須の領域を含み得ることが期待される。例えば、CaMV
19Sおよび35Sプロモーターの必須領域は、米国特許第5,
352,605号に記載のようなより大きなゲノム片に由来の
比較的小さなフラグメントにおいて同定されている。

一般に、雄性組織優先的調節領域をコードする配列
は、それに対して好ましくは、70％、75％、または80
％、より好ましくは、85％または90％、および最も好ま
しくは、95％または99％の配列同一性を有する。

欠失分析は、調節領域の5'および3'末端の両方から生
じ得る：フラグメントは、リンカースキャニング変異誘
発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる変異誘発などによっ
て得られ得る（Directed Mutagenesis:A Practical App
roach;IRL Press;（1991））。3'欠失は、雄性組織優先
的調節領域の輪郭を決定し、そして次いで必須領域が選
り抜きのコアプロモーターに作動可能に連結され得るよ
うに3'末端を同定する。いったん必須領域が同定される
と、外因性遺伝子の転写は、Ms45の雄性組織優先的領域
およびコアプロモーターによって制御され得る。コアプ
ロモーターは、公知のコアプロモーター（例えば、カリ
フラワーモザイクウイルス35Sまたは19Sプロモーター
（米国特許第5,352,605号）、ユビキチン（米国特許第
5,510,474号）、IN2コアプロモーター（米国特許第5,36
4,780号）、またはゴマノハグサモザイクウイルスプロ
モーター（Gruberら、「Vectors for Plant Transforma
tion」Methods in Plant Molecular Biology and Biote
chnology;Glickら編;CRC Press;pp.89−119;（1993））
の任意の１つであり得る。好ましくは、プロモーター
は、雄性組織優先的遺伝子のプロモーターまたはCaMV 3
5Sコアプロモーターである。より好ましくは、プロモー
ターは、雄性組織優先的遺伝子のプロモーターであり、
特にMs45コアプロモーターである。

さらなる変異分析は、例えば、発現のレベルにおい
て、発現の時期において、または発現の組織において、
機能性の改変を導入し得る。変異はまた、サイレントで
あり得、そして観測可能な効果を有しないものであり得
る。

3.発現ベクター中への領域の挿入機能的発現の試験のために用いる適切な発現ベクター
の選択は、宿主ならびに宿主に発現ベクターを導入する
方法に依存し、そしてそのような方法は当業者に周知で
ある。真核生物については、ベクターの領域は転写の開
始を制御する領域およびプロセッシングを制御する領域
を含む。これらの領域は、β−グルクロニダーゼ（GU
S）遺伝子またはルシフェラーゼのようなレポーター遺
伝子に作動可能に連結される。植物発現ベクターおよび
レポーター遺伝子の一般的な記載および例は、Gruber
ら、「Vectors for Plant Transformation」、Methods
in Plant Molecular Biology and Biotechnology;Glick
ら、編;CRC Press;89〜119頁；（1993）に見出され得
る。Gus発現ベクターおよびGus遺伝子カセットは、Clon
etech,Palo Alto,CAから市販されており、一方ルシフェ
ラーゼ発現ベクターおよびルシフェラーゼ遺伝子カセッ
トは、Promega Corporation,Madison,WIから入手可能で
ある。Tiプラスミドおよび他のアグロバクテリウムベク
ターは、Ishida,Y.ら、Nature Biotechnology;Vol.14;7
45−750頁；（1996）および1994年５月３日に出願され
た米国特許第5,591,616号、Method for Transforming M
onocotyledons、に記載される。

ゲノムフラグメントに位置する推定の調節領域を含む
発現ベクターを、インタクトな組織（例えば段階的な
葯）、胚、またはカルスに導入し得る。DNA送達の方法
は、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、DNA
注入、エレクトロポレーションおよびアグロバクテリウ
ム媒介遺伝子移入（Gruberら、「Vectors for Plant Tr
ansformation」Methods in Plant Molecular Biology a
nd Biotechnology;Glickら、編;CRC Press;（199
3））、1994年５月３日に出願された米国特許第5,591,6
16号、Method for Transforming Monocotyledons、およ
びIshida,Y.ら、Nature Biotechnology;14巻;745−750
頁；（1996）を含む。植物組織の培養の一般的な方法
は、Gruberら、「Vectors for Plant Transformatio
n」、Methods in Plant Molecular Biology and Biotec
hnology;Glickら、編;CRC Press;（1993）に見出され
る。

一過性アッセイシステムのために、段階的な、単離さ
れた葯を、0.5％ Phytagel（Sigma,St.Louis）または他
の凝固媒体を用いて凝固させた、雄穂培養培地（Paredd
y,D.R.およびJ.F.Petelino,Crop Sci.J.;29巻;1564〜15
66頁（1989））にすぐに置く。発現ベクターDNAを、５
時間以内に、好ましくは1.2μ粒子を用いる、1000〜110
0 Psiでのマイクロプロジェクタイル媒介送達によって
導入する。DNA送達後、葯を、同じ雄穂培養培地上で26
℃で17時間インキュベートし、そして全組織ホモジネー
トを調製すること、およびGUSまたはルシフェラーゼ活
性についてアッセイすることによって分析する（Gruber
ら、「Vectors for Plant Transformation」、Methods
in Plant Molecular Biology and Biotechnology;Glick
ら、編;CRC Press;（1993）を参照のこと）。

上記で述べた方法は、雄性組織優先的様式で遺伝子発
現を調節するDNA配列を同定するために用いられてき
た。このような領域は、全長Ms45雄性組織優先的調節領
域（配列番号１）として同定された。全長Ms45雄性組織
優先的調節領域と配列同一性を有するTATAボックス変異
は、配列番号２で同定される。

従って、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列
（または配列同一性を有するヌクレオチド配列）を有
し、そして雄性組織優先的調節領域の機能を有するDNA
分子を含む。

推定TATAボックスは、以下の実施例２またはCurrent
Protocols in Molecular Biology;Ausubel,F.M.ら、
編、;John Wiley and Sons,New York;4.8.1〜4.8.5頁；
（1987）に記載されるようなプライマー伸長分析によっ
て同定され得る。

4.稔性を制御するための雄性組織優先的調節領域の使用本発明の目的は、雄性組織優先的調節領域を使用し
て、稔性を制御する手段を提供することである。重要な
ことに、この雄性組織優先的調節領域は、発生の四分子
から初期単核期まで、葯において外因性遺伝子の発現を
制御し得る。このような時期の実用的な重要性は、この
発生段階の間の不稔性誘導遺伝子の発現が、圃場での不
稔性誘導系の機能の視覚的な確認を可能にするのに十分
に早く葯成熟を中断させることである。これは、「ブレ
イカー」（花粉を落とす葯）が起こる可能性もまた、減
少させ得る。従って、不稔性誘導遺伝子の効果は、発生
の十分に早い段階で生産圃場において明らかであり、不
稔性誘導系の部分的または全体の崩壊から生ずるいかな
る「稔性逃亡者」もの手動または機械的のいずれかでの
除雄を可能にする。

雄性稔性を制御するための１つのアプローチは、タペ
ータムにおける遺伝子発現を操作することである。タペ
ータムは、葯中の小胞子形成細胞を取り囲む細胞の層で
あり、そしておそらく還元糖、アミノ酸、および脂質の
ような栄養分を発達中の小胞子に供給する（Reznickov
a,C.R.,Acad.Bulg.Sci.;31巻;1067頁；（1978）;Nave
ら、J.Plant Physiol;125巻;451頁；（1986）;Sawhney
ら、J.Plant Physiol;125巻;467頁；（1986））。Ms45
は、タペータムの層において高度に発現することが見出
される。タペータム細胞はまた、小胞子放出を促進する
β（1,3）−グルカナーゼ（「カラーゼ」）を産生する
（Mephamら、Protoplasma;70巻、１頁；（1970））。従
って、タペータムと小胞子形成細胞との間には繊細な関
係が存在し、そしてタペータム機能のいかなる破壊も機
能障害性の花粉粒をおそらく生じる。実際、タペータム
生合成における破壊は、雄性不稔変異体を生ずることが
公知である（Kaul、「高等植物における雄性不稔」、Mo
nographs on Theoretical and Applied Genetics;Frank
elら、編、;Springer Verlag;10巻;15−95頁（198
8））。タペータムの発達の間におけるカラーゼ成熟前
または後期の出現もまた、特定の型の雄性不稔と関連す
る（Warmkeら、J.Hered;63巻、103頁；（1972））。従
って、カラーゼ遺伝子は、雄性組織機能を破壊するため
に使用され得る。Scottら、PCT WO 93/02197（1993）
は、タペータム特異的カラーゼのヌクレオチド配列を開
示する。従って、小胞子の、成熟花粉粒への発達の失敗
は、タペータム特異的調節配列の制御下でタペータム機
能を破壊し得る遺伝子を含む組換えDNA分子を使用して
誘導され得る。

雄性稔性に影響を与える１つの一般的なアプローチ
は、雄性組織優先的調節領域が、雄性組織機能を破壊し
得て不稔性を生ずるタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列に作動可能に連結されている発現ベクターを構築
することである。雄性組織機能を破壊し得るタンパク質
は、細胞機能に必須である巨大分子、細胞機能に必須で
ある巨大分子を分解する酵素、植物ホルモンの生合成ま
たは代謝を変化させるタンパク質、構造タンパク質、不
適切に発現されたタンパク質および雄性組織の特異的機
能を阻害するタンパク質の合成を阻害するタンパク質を
含む。

例えば、雄性組織優先的調節領域が、タンパク質合成
のインヒビター（細胞毒であり得るが、これに限定され
ない）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結
されている発現ベクターが、構築され得る。例えば、ジ
フテリア毒素は、真核生物におけるタンパク質合成の周
知のインヒビターである。ジフテリア毒素遺伝子をコー
ドするDNA分子は、アメリカンタイプカルチャーコレク
ション（Rockville,MD）、ATCC番号39359またはATCC番
号67011から得られ得、そして使用の例および方法につ
いては、Fabijanskiら、E.P.出願番号90902754.2、「Mo
lecular Methods of Hybrid Seed Production」を参照
のこと。例えば、DAMメチラーゼは、Escherichia coli
由来の周知の酵素であり、5'GATC3'の配列においてアデ
ニン残基をN⁶−メチルアデニンに改変する。Ciganおよ
びAlbertsenは、いかにしてDAMメチラーゼがトランスジ
ェニック植物において稔性に影響を与えるために使用さ
れ得るかを記載する（PCT/US95/15229 Cigan,A.M.およ
びAlbertsen,M.C.,「トランスジェニック植物における
雄性不稔に対する可逆的核遺伝システム」）。稔性を破
壊するタンパク質の別の例は、米国特許出願番号08/47
5,582「高レベルのアビジンの発現による植物における
雄性不稔の誘導」、Howard,J.およびAlbertsen,M.C.に
例証されるようなアビジンである。

あるいは、タペータム機能の破壊は、生物学的に重要
な巨大分子を分解し得る酵素をコードするDNA配列を使
用して達成され得る。例えば、Marianiら、Nature;347
巻;737頁；（1990）は、Aspergillus oryzae RNase−T1
またはBacillus amyloliquefaciensのRNase（「バルナ
ーゼ」と呼ばれる）のいずれかのタペータムにおける発
現が、タペータム細胞の破壊を誘導し、雄性不稔を生ず
ることを示した。Quaasら、Eur.J.Biochem.;173巻;617
頁；（1988）は、RNase−T1の化学合成を記載し、一方
バルナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Hartley,J.Mo
lec.Biol.;202巻;913頁；（1988）に開示される。

RNase−T1およびバルナーゼ遺伝子は、例えば、相互
にプライミングする長いオリゴヌクレオチドを用いて遺
伝子を合成することによって得られ得る。例えば、Curr
ent Protocols in Molecular Biology;Ausubel,F.M.
ら、編;John Wiley and Sons,New York;8.2.8〜8.2.13
頁；（1987）を参照のこと。また、Wosnickら、Gene;60
巻;115頁；（1987）も参照のこと。さらに、ポリメラー
ゼ連鎖反応を使用する現在の技法は、非常に大きな遺伝
子を合成する可能性を提供する（Adangら、Plant Mole
c.Biol.;21巻;1131頁（1993）;Bambotら、PCR Methods
and Applications;2巻;266頁（1993））。

代替的なアプローチにおいて、花粉産生は、オーキシ
ンのような植物ホルモンの代謝を変化させることによっ
て阻害される。例えば、Agrobacterium rhizogenesのro
lB遺伝子は、インドキシル−β−グルコシドからの遊離
インドールの放出を触媒することによってオーキシン代
謝を妨害する酵素をコードする。Estruchら、EMBO J.;1
1巻;3125頁；（1991）およびSpenaら、Theor.Appl.Gene
t.;84巻、520頁；（1992）は、タバコにおけるrolB遺伝
子の葯特異的発現が、花粉産生が厳しく減少しているし
わのよった葯を有する植物を生ずることを示した。従っ
て、rolB遺伝子は、花粉産生の制御に有用な遺伝子の例
である。Slightomら、J.Biol.Chem.;261巻;108頁；（19
85）は、rolB遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。

雄性組織機能を破壊するタンパク質を発現するため
に、タンパク質をコードするDNA配列が、雄性組織優先
的様式で遺伝子転写を調節するDNA配列に作動可能に連
結される、発現ベクターが構築される。発現ベクターの
一般的な要件は、一過性の発現系の状況において、上記
に記載される。しかし、ここで、好ましい様式は、外因
性タンパク質が、成体植物の雄性組織における発達のよ
り遅い段階で発現される様式において、発現ベクターを
植物胚組織に導入することである。有糸分裂の安定性
は、上位染色体複製（epichromosomal replication）を
提供する植物ウイルスベクターを使用して達成され得
る。

有糸分裂の安定性を得る代替的かつ好ましい方法は、
宿主の染色体への発現ベクター配列の組み込みによって
提供される。このような有糸分裂の安定性は、胚組織へ
の発現ベクターのマイクロプロジェクタイル送達によっ
て提供され得る（Gruberら、「Vectors for Plant Tran
sformation」、Methods in Plant Molecular Biology a
nd Biotechnology;Glickら、編;CRC Press;（199
3））。

形質転換方法論は、多くの植物について見出され得、
これにはヒマワリ、ダイズ、コムギ、アブラナ、イネ、
およびモロコシを含むが、これらに限定されず（Knitte
l,N.ら、J.Plant Cell Rep.;Springer International,B
erlin,W.Germany;14巻（2/3）;81−86頁；（1994）;Che
e,P.P.ら、Plant Physiol.;American Society of Plant
Physiologists,Rockville,MD;91（３）巻;1212〜1218
頁（1989））;Hadi,M.Z.ら、J.Plant.Cell Rep.;Spring
er International,Berlin,W.Germany;15（７）巻;500〜
505頁；（1996）;Perl,A.ら、Molecular and General G
enetics;235（２−３）巻;279〜284頁;Zaghmout,O.M.F.
およびN.L,Trolinder,Nucleic Acid Res.;IRL Press,Ox
ford;21（４）巻;1048頁；（1993）;Chen,J.L.およびW.
D.Beversdof、Theor.Appl.Genet.;Springer internatio
nal,Berlin,W.Germany;88（２）巻;187〜192頁；（199
4）;Sivamani,E.ら、Plant Cell Rep.;Springer Intern
ational,Berlin,W.Germany;15（５）巻;322〜327頁（19
96）;Hagio,T.ら、Plant Cell Rep.;10（５）巻;260−2
64頁；（1991））、そして形質転換方法論はまた、当業
者に公知である。

形質転換された細胞を選択するために、発現ベクター
は、除草剤耐性遺伝子のような選択マーカー遺伝子を含
む。例えば、そのような遺伝子は、フォスフィノスリシ
ン、グリフォセート、スルホニル尿素、アトラジン、イ
ミダゾリノン、またはカナマイシンに対する耐性を与え
得る。発現ベクターは、雄性組織優先的調節領域の制御
下の外因性タンパク質をコードするcDNA配列、ならびに
構成的プロモーターの制御下の選択マーカー遺伝子を含
み得るが、選択マーカー遺伝子はまた、別個の選択発現
ベクター中で宿主細胞に送達され得る。雄性組織優先的
調節領域および選択発現ベクターを含む試験発現ベクタ
ーを用いる、このような胚組織の「同時形質転換」は、
以下で例証される。

5.不稔性の誘導代替的なアプローチにおいて、雄性不稔性は、雄性組
織優先的調節領域が相補的ヌクレオチド単位をコードす
るヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現ベクタ
ーの使用によって誘導され得る。相補的核酸分子の、標
的分子への結合は、阻害的であるとして選択され得る。
例えば、標的がmRNA分子である場合、相補的ヌクレオチ
ド単位（この場合はRNA）の結合は、ハイブリダイゼー
ションを生じ、翻訳の阻止を生じる（Patersonら、Pro
c.Nat'l.Acad.Sci.;74巻;4370頁（1987））。従って、
適切なアンチセンスRNA分子（例えば、Ms45に相補的な
アンチセンスRNA分子（米国特許第5,478,369号））は、
雄性不稔に必要なタンパク質をコードするmRNA種の配列
に相補的な配列を有する（Fabijanski、「Antisense Ge
ne Systems of Pollination Control For Hybrid Seed
Production」、米国特許出願番号08/288,734）。

例えば、カラーゼアンチセンスRNAの産生は、小胞子
放出に必須のカラーゼ酵素の産生を阻害する。さらに、
雄性不稔は、カルコンシンターゼＡ遺伝子の3'非翻訳領
域についてのアンチセンスRNAを産生する発現ベクター
を使用して、フラボノイド生合成の阻害によって誘導さ
れ得る（Van der Meerら、The Plant Cell;4巻;253頁；
（1992））。カルコンシンターゼＡ遺伝子のクローニン
グおよび特徴付けは、Koesら、Gene;81巻;245頁；（198
9）およびKoesら、Plant Molec.Biol.;12巻;213頁；（1
989）によって開示される。

あるいは、雄性組織優先的調節領域が、リボザイムを
コードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している
発現ベクターが、構築され得る。リボザイムは、mRNA分
子における特定の標的配列に指向されるエンドヌクレア
ーゼ活性を発現するように設計され得る。例えば、Stei
neckeら、EMBO J;11巻;1525頁；（1992）は、タバコプ
ロトプラストにおいて、リボザイムによってネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子発現の100％までの
阻害を達成した。より最近では、Perrimanら、Antisens
e Research and Developmant;3巻;253頁；（1993）は、
改変したハンマーヘッド型リボザイムを発現させたベク
ターを使用して、タバコプロトプラストにおけるクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性を阻害
した。本発明の状況において、リボザイムのための適切
な標的RNA分子は、カラーゼmRNAおよびMs45 mRNAのよう
な、雄性稔性に必須のタンパク質をコードするmRNA種を
含む。

さらなる代替的なアプローチにおいて、雄性組織優先
的調節領域がRNase P媒介の標的mRNA分子の切断を促進
し得るRNA転写物の産生を指向する発現ベクターが、構
築され得る。このアプローチに従って、外部ガイド配列
は、内因性リボザイム、RNasa Pを細胞内mRNAの特定の
種（これらは、続いて細胞リボザイムによって切断され
る（米国特許第5,168,053号;Yuanら、Science;263;126
9;（1994））に指向させることについて構築され得る。
好ましくは、外部ガイド配列は、雄性稔性に必須のタン
パク質をコードするmRNA種に相補的な10〜15ヌクレオチ
ドの配列および3'−RCCAヌクレオチド配列（ここでＲは
好ましくはプリンである）を含む。外部ガイド配列転写
物は、mRNAと相補的外部ガイド配列との間の塩基対の形
成によって標的化されたmRNA種に結合し、従って、塩基
対合領域の5'−側に位置するヌクレオチドでのRNasePに
よるmRNAの切断を促進する。

別の代替的なアプローチは、アプタマー技術の利用で
あり、ここでは相補的ヌクレオチド単位は、規定の標的
分子に対するリガンドとして働くヌクレオチドである
（米国特許第547281号）。この標的は、雄性稔性に必須
の産物であるか、または雄性稔性を破壊する産物であり
得る。この方法を使用して、標的に結合し、かつ標的の
発現を阻害するアプタマーは、標的分子（例えば、Ms45
またはアビジン）について選択され得る。アプタマーを
コードするヌクレオチド配列は、雄性組織優先的調節領
域がアプタマーの産生を指向するように構築された発現
ベクターの一部である。

不稔性はまた、Ms45またはMs2遺伝子のような雄性稔
性において重要な遺伝子の中断によって誘導され得る
（Mark,G.M.ら、Nature;363巻;715−717頁；（199
3））。遺伝子中断の方法は当該分野に周知であり、そ
して転移因子、挿入、および変異誘発を含むが、これら
に限定されない。

6.F1雑種における雄性稔性の回復上記に記載の方法は、近交系間の大規模指向性交雑に
おけるF1雑種の産生についてトランスジェニック雄性不
稔トウモロコシ植物を産生するために使用され得る。ト
ランスジェニック雄性不稔植物の卵細胞が、タペータム
の機能を破壊するすべての外因性遺伝子を含むのではな
い場合、一定の割合のF1雑種は雄性稔性表現型を有す
る。他方、外因性遺伝子がトランスジェニック雄性不稔
植物のすべての卵細胞に存在する場合、F1雑種は雄性不
稔性表現型を有する。なぜなら、外因性遺伝子によって
誘導された不稔性が、優性であるからである。従って、
雄性稔性F1雑種の産生を提供するために雄性稔性回復系
を使用することが望ましい。このような稔性回復系は、
収穫産物が種子である場合、または作物が自家受粉であ
る場合に、特別な価値を有する。

また、このような稔性回復系は、雄性組織優先的調節
領域が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されてい
る場合（例えば、WO89/10396（Marianaiら、Plants wit
h Modified Stamen Cells））、および誘導性プロモー
ターが外部制御に応答性である場合に、特別な価値を有
する。この連結された雄性組織優先的調節領域は、雄性
組織優先的調節領域、誘導性プロモーター、および外因
性遺伝子からなる。

雄性稔性回復への１つのアプローチは、トランスジェ
ニック雄性不稔性植物を、雄性組織優先的調節領域の制
御下にある稔性回復遺伝子を含むトランスジェニック雄
性稔性植物と交雑させることである。例えば、Fabijans
ki「Antisense Gene Systems of Pollination Control
For Hybrid Seed Production」、米国特許出願番号08/2
88,734は、「barstar」と呼ばれるバルナーゼインヒビ
ターを発現する雄性稔性植物を、バルナーゼを発現する
雄性不稔性植物と交雑させた。Hartley、J.Mol.Biol.;2
02巻;913頁；（1988）は、barstarのヌクレオチド配列
を開示する。

別のアプローチは、必須の雄性稔性遺伝子に破壊を含
む雄性不稔性植物を、Ms45またはMs2遺伝子のような稔
性遺伝子の破壊されていないコピーに作動可能に連結さ
れた、雄性組織優先的調節領域を含むトランスジェニッ
ク雄性稔性植物と交雑させることである。Ms45遺伝子の
完全配列は、米国特許第5,478,369号に、そしてMs2の完
全配列は、Mark,G.M.ら、Nature;363巻;715−717頁（19
93）に含まれる。

あるいは、雄性稔性回復は、雄性不稔性植物における
毒素の効果を中和するために、雄性稔性植物において毒
素リボザイムまたはアプタマーのような相補的ヌクレオ
チド単位を発現させることによって達成され得る。従っ
て、雄性稔性は、雄性不稔性トランスジェニック植物に
おいて発現される特定の外因性遺伝子の効果を相殺する
ために、特定の種のRNA分子またはポリペプチドを合成
する雄性稔性トランスジェニック植物を産生することに
よって、F1雑種において回復し得る。

雄性稔性を回復させる代替的な方法において、トラン
スジェニック雄性不稔性植物は、雄性組織優先的調節領
域、原核生物調節領域（原核生物調節系由来の）、およ
びタペータムの機能を破壊し得る外因性遺伝子を有する
発現ベクターを含む。雄性組織優先的調節領域の制御下
で原核生物ペプチドを発現する、トランスジェニック雄
性稔性植物が産生される。雄性不稔性と雄性稔性の交雑
からの得られたF1雑種において、原核生物ペプチドは、
原核生物調節配列に結合し、そして雄性稔性を破壊し得
る外因性遺伝子の発現を抑制する。稔性回復のこの方法
の利点は、トランスジェニック雄性稔性植物の１つの形
態が、トランスジェニック雄性不稔性植物におけるタペ
ータム機能を破壊するために使用された外因性遺伝子の
同一性に関わりなく、F1稔性を提供するために使用され
得ることである。

例えば、LexA遺伝子/LexAオペレーター系が、本発明
に従って遺伝子発現を調節するために使用され得る。米
国特許第4,833,080号およびWangら、Mol.Cell.Biol.;13
巻;1805頁；（1993）。より詳細には、雄性不稔性植物
の発現ベクターは、LexAオペレーター配列を含むが、雄
性稔性植物の発現ベクターは、LexAリプレッサーのコー
ド配列を含む。F1雑種において、LexAリプレッサーは、
LexAオペレーター配列に結合し、そして雄性稔性を破壊
し得る産物をコードする外因性遺伝子の転写を制限す
る。これらは、アビジン、DAMメチラーゼ、ジフテリア
毒素、RNase T、バルナーゼ、rolB、およびカルコンシ
ンターゼＡを含むが、これらに限定されない。

LexAオペレーターDNA分子は、例えば、周知のLexAオ
ペレーター配列を含むDNAフラグメントを合成すること
によって得られ得る。例えば、米国特許第4,833,080号
およびGarrigaら、Mol.Gen.Genet.;236巻;125頁；（199
2）を参照のこと。LexA遺伝子は、LexAリプレッサーを
コードするDNA分子を合成することによって得られ得
る。遺伝子合成技術は上記で議論され、そしてLexA遺伝
子配列は、例えば、Garrigaら、Mol.Gen.Genet.;236巻;
125頁；（1992）によって記載される。あるいは、LexA
リプレッサーをコードするDNA分子は、プラスミドpRB50
0、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号6
7758から得られ得る。当業者は、lacリプレッサー/lac
オペロン系またはtrpリプレッサー/trpオペロン系のよ
うな、原核生物調節系を使用して、他の雄性稔性回復ス
トラテジーを容易に工夫し得る。

7.調節領域の必須部分の同定調節領域の必須部分の同定は、当業者に周知の方法に
よって、調節領域中で、ヌクレオチドの欠失、付加、お
よび／または置換によって行われ得る。このような改変
体は、例えば、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、リ
ンカースキャニング変異誘発、およびポリメラーゼ連鎖
反応を用いる変異誘発によって得られ得る（Directed M
utagenesis:A Practical Approach;IRL Press;（199
1））。

調節領域の一連の5'欠失は、存在する制限部位を使用
して構築され得る。生じるプロモーターフラグメント
は、上記のように発現ベクターを使用して活性について
試験され得る。さらなる精錬および輪郭決めは、レポー
ター構築物になお適切な発現を与える最小の制限フラグ
メントに、より小さい変更、好ましくは約50または30ヌ
クレオチド、より好ましくは約20または10ヌクレオチ
ド、そして最も好ましくは約５または１ヌクレオチドの
変更を行うことにより得られ得る（Directed Mutagenes
is:A Practical Approach;IRL Press;（1991））。これ
らは、導入された制限部位または天然の制限部位を用い
て、発現ベクターに導入され得る。一連の3'欠失もま
た、上記で述べたように、またはPCRにより、または当
業者に周知の方法により生成され得る（Directed Mutag
enesis:A Practical Approach;IRL Press;（1991））。
さらなる精錬および輪郭決めは、レポーター構築物にな
お適切な発現を与える最小の制限フラグメントに、より
小さい変更、好ましくは約50または30ヌクレオチド、よ
り好ましくは約20または10ヌクレオチド、そして最も好
ましくは約５または１ヌクレオチドの変更を行うことに
より得られ得る（Directed Mutagenesis:A Practical A
pproach;IRL Press;（1991））。

それゆえにこれらの5'および3'欠失は、より長い調節
領域の適切な組織および時間的な発現を模倣するのに必
須の最小領域を輪郭決めする。一般的には、雄性組織優
先的調節領域のこの最小領域をコードする配列は、それ
に対して、好ましくは約70％、75％、または80％、より
好ましくは、約85％または約90％、そして最も好ましく
は約95％または99％の配列同一性を有する。

以下は、例示の目的で提示され、そして本発明の範囲
の限定を意図するものではない。

実施例１ Ms45プロモーターのゲノムクローニングおよび配列決定 Ms45 cDNAのAcタグ化および同定、ならびにノーザン
分析は、米国特許第5,478,369号に記載される。

Ms45の部分cDNAを使用して、B73トウモロコシゲノム
ライブラリーをスクリーニングした。このライブラリー
は、SAU3A1部分を、BAMH I消化ゲノムクローニングベク
ター（Lambda Dash II,Stratagene,La Jolla,CA）にク
ローニングすることによって作製した。およそ１×10⁶
プラークを、宿主としてゲノムDNA（ER1647,New Englnd
Biolabs,MA）に適するE.coli株を用いてスクリーニン
グした。クローンAC4.1を、スクリーニングの３ラウン
ド後に均質までに精製した。AC4.1の制限マッピング
は、このクローンが約13kb長であり、そして２つの内部
BAMH I部位を含むことを示した（図１）。これらの部位
のうちの１つは、Ms45部分cDNAにおいてもまた、見出さ
れた。２つのBAMH Iフラグメントを、クローニングベク
ター（Bluescript SK＋,Stratagene,La Jollia,CA）に
サブクローニングした。5'末端クローンは、約3.5kb長
であり、そして内部BAMH I部位の下流（5'）の配列に相
当した。3'末端クローンは、約2.5kb長であり、そして
内部BAMH I部位の下流にMs45配列を含んだ。同時に、推
定全長Ms45 cDNAを単離し、配列決定した。5'末端クロ
ーンとMs45 cDNAとの配列比較により、推定翻訳開始部
位を同定した（図１）。

Ms45プロモーター領域の配列決定を、Sanger,F.ら、
「DNA Sequencing with Chain Terminating Inhibitor
s」、Proc.Nat'l.Acad.Sci.;74巻;5463−5567;（1977）
のジデオキシ鎖終結法を使用して達成した。ゲノムクロ
ーンpac4.1−5'（図１）を、ユニバーサルオリゴおよび
配列特異性である他のオリゴを使用して、当業者に周知
である技術を使用して配列決定した。

雄性組織優先的調節領域を、開始コドンに導入された
NCO I部位を有し、そしてプロモーターを含まないLuci
発現ベクター中にNCO Iフラグメントとしてクローニン
グした。この新しいレポーターベクターは、プラスミド
PHP6045（図２）ATCC番号97828（1996年12月12日に寄
託；アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301
Parklawn Dr.,Rockville,MD 20852）と命名された。

実施例２プライマー伸長分析全RNAを、四分子から初期単核期の葯を含むトウモロ
コシ雄穂から単離した。全RNAを、エタノールおよびMgC
l₂で沈殿させた。全RNAの1mgを単離し、そしてポリＡ＋
mRNAを、オリゴ−dTセルロースを使用することによって
精製した。ポリＡ＋RNAをまた、当業者に公知のプロト
コールを使用して、６日齢トウモロコシ芽生え葉および
トウモロコシ葯から直接的に単離した。

配列決定ラダーを、標準的な配列決定手順において、
当業者に周知のプロトコールを使用して、一本鎖Ms45オ
リゴヌクレオチドおよび35S−dATPの取り込みを使用し
て調製した。

プライマー伸長を、以下の方法に従って行った： I. 5'−末端標識合成オリゴヌクレオチドプライマー。

混合:1.0μｌ中5pmolプライマーN11916（PHL11916） 5μｌ（50μCi）γ32P−ATP（＞5000 Ci/mmol
e） 0.7μl 10×キナーゼ緩衝液 0.7μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ 37℃で45分間インキュベートする 20μｌのTEで希釈し、そして65℃に加熱して酵素を失活
させる。

10×キナーゼ緩衝液 1mlにする 0.5M Tris−HCl,pH7.6−8.0 1Mを0.5ml 5mMスペルミジン 0.1Mを0.05ml 100mM MgCl2 1Mを0.1ml 100mM DTT 0.5Mを0.5ml 0.1mg/mlゲラチンまたはBSA 2mg/mlを50μｌ 0.1ml水 II. アニーリングしたプライマーおよびRNA キナーゼ処理したプライマーを、トウモロコシ雄穂、
６日齢トウモロコシ芽生え葉、トウモロコシ葯、および
６日齢トウモロコシ葉由来のmRNAにアニーリングさせ
た。氷上で、２μl mRNA、１μｌキナーゼ処理オリゴ、
２μl 5×アニーリング緩衝液（1.25M KCl,10mM Tris,p
H 7.9−8.15）、および１μl 30mM vanadylをともに混
合した。全容量を、10mM Tris,pH8.15で10μｌにした。
この混合液を、サーモサイクラーの加熱ブロック上で４
時間の間、65℃に加熱し、そして55℃に冷却した。

III.プライマー伸長 23μｌプライマー伸長混合物（以下のレシピを参照の
こと）および0.4μｌ逆転写酵素（SuperScript,BRL,M
D）を、各々のチューブに入れた。これを穏やかに上下
にピペッティングすることにより混合し、そしてすぐに
48℃中に置き、45分間インキュベートした。プライマー
伸長混合物は、10mM MgCl2、5mM DTT、0.33mM各々のdAT
P、dCTP、dGTP、dTTP、およびDEPC水からなる。

300μｌのエタノールを添加し、そして−20℃のフリ
ーザーで一晩沈殿させ、次いで微量遠心管中で30分間ペ
レット化した。ペレットを、Speed Vac中で乾燥させ、
そして６μｌの0.1 NaCl/1mM EDTAに溶解した。チュー
ブの内容物を、ピペッティングおよびボルテックスによ
って混合し、ペレットが溶解したことを確実にする。こ
れらを室温に2.5時間放置し、そして６μｌの配列決定
色素（USB配列決定キットからの停止溶液）を添加し、
そして溶液を約95℃で変性させた。試料の半分を、スタ
ッキング緩衝液を有する６％変性ポリアクリルアミド配
列決定ゲル上にロードし、55ワットで２時間電気泳動し
た。ゲルをゲルドライヤー中で乾燥させ、そしてKodak
X−ARフィルムに曝露した。３日間の曝露の後、トウモ
ロコシ雄穂mRNAプライマー伸長反応における転写産物を
観察した。これは、開始コドンの42ヌクレオチド上流に
位置するデオキシチミジンに相当した（図３）。この位
置を＋１として表した。主要でない転写開始もまた、−
３において同定された。

実施例３ Ms45雄性組織優先的調節領域の段階および組織特異性の
決定全長雄性組織優先的調節領域（配列番号１）を、ポテ
ト由来のPin II−3'非翻訳領域（An,G.ら、「Functiona
l Analysis of the 3'Control Region of the Patato W
ound−Inducuble Proteinase Inhibitor II Gene」;Pla
nt Cell;1巻;115−122;（1989））とともに、ホタルPho
tinus pyralis由来のルシフェラーゼレポーター遺伝子
（Dewit,T.R.ら、Proc.Nat'l Acad Sci.USA;82巻;7870
−7873頁；（1985））に融合させた。発達の種々の段階
でのトウモロコシ葯を、寒天（Phytagar,Sigma,St.Lo
uis）で凝固させた雄穂培養培地（Pareddyら、Theoret.
Appl.Genet.;77巻;521−526頁；（1989））上にプレー
トした。各々の小花由来の３つの葯のうちの１つを段階
付けし、そして残りの葯を、段階によってプールし、そ
してマイクロプロジェクタイルボンバードメントのため
にプレートする（代表的にはプレートあたり８つの
葯）。葯を、Ms45雄性組織優先的調節領域−ルシフェラ
ーゼレポーター構築物のDNAを沈殿させた1.8μタングス
テン粒子で、1100p.s.i.においてショットした。所定の
プレート上のすべての葯は、同じ段階にあった：減数分
裂前、減数分裂Ｉ、減数分裂II、四分子、小胞子放出、
初期単核小胞子、または中期単核小胞子。各々の段階で
ショットを３回反復した。葯を、26℃で18時間、一晩イ
ンキュベートした。各々のプレート由来の葯を用いて粗
抽出物を調製し、そしてルシフェラーゼ活性およびタン
パク質含量についてアッセイした。タンパク質濃度に対
して規準化したルシフェラーゼ活性を、発生の段階の関
数として図４にグラフ化する。主要な活性は、発達の四
分子期および小胞子放出期において見られ、微量な活性
は、減数分裂ＩおよびIIにおいて、そしてほとんど検出
可能な活性が見られないのは初期単核期においてであっ
た。減数分裂前または中期単核の葯においては、バック
グラウンドを上回る有意な活性は検出されなかった。

さらに、2.0μg/ml 2,4−Ｄを含むMS培地上で培養し
た胚原性カルスを、650p.s.i.において、Ms45雄性組織
優先的調節領域またはトウモロコシユビキチンプロモー
ター（米国特許第5,510,474号）のいずれかと融合させ
たルシフェラーゼレポーター、およびトウモロコシユビ
キチンプロモーターと融合させたuidA（GUS）レポータ
ーでコートした粒子を使用する以外は、同様の様式にて
ボンバードメントした。ルシフェラーゼを、β−グルク
ロニシダーゼに対して基準化した。図５に示すように、
Ms45雄性組織優先的調節領域は、胚原性カルスおよびシ
ュートにおいて、たとえユビキチンプロモーターが発現
された場合でも一過性の発現を駆動し得なかった。同様
に、２日間蒸留水中で吸水および発芽し、そして濡らし
たフィルターの上においたトウモロコシ種子を、マイク
ロプロジェクタイルボンバードメントに供し、そしてそ
れらの胚軸をルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダー
ゼについてアッセイした。ユビキチン調節領域（プロモ
ーター）は活性であったが、Ms45雄性組織優先的調節領
域は不活性であった。

この結果は、RNAハイブリダイゼーション分析の結果
と類似している。種々の発達段階におけるトウモロコシ
葯を、以下のように収集し、そして処理した。各々の小
花由来の３つの葯のうちの１つを、マイクロタイタープ
レートの１つのウェル中で（3:1エタノール：氷酢酸）
中に固定し、そして２つを別のマイクロタイタープレー
トの対応する位置のウェル中で液体窒素中で凍結させ
た。固定した葯を段階付けた；次いで、対応する凍結さ
せた葯を段階によってプールし、そしてポリＡ＋RNA
を、20個の葯から単離した（RNA Micro−Quick Prep ki
t,Pharmacia Uppsila Sweden）。各々のプールした段階
の葯からのRNAの同じ容量を、MOPS緩衝液＋ホルムアル
デヒド中の1.2％アガロース上で電気泳動に供した。RNA
試料を、ナイロンメンブレンにブロッティングすること
により転写し、UV架橋（Stratalinker,Stratagene In
c.,La Jolla）によって固定し、そしてすべてのMs45cDN
Aコード領域および3'領域からなる32P標識プローブフラ
グメントにハイブリダイズさせた。図４に示す結果は、
四分子から初期単核期において、そしておそらく、減数
分裂における終期IIほどの早さでは検出可能であって、
しかしそれより早いと可能でない定常状態のMs45転写物
を確認する。減数分裂の間のMs45雄性組織優先的調節領
域活性から生じる転写レベルは、RNAハイブリダイゼー
ションによって検出され得るに十分に蓄積しないか、ま
たは一過性アッセイで観察された減数分裂期の雄性組織
優先的調節領域活性が、植物で生じないかのいずれかで
ある。

従って、Ms45雄性組織優先的調節領域（配列番号１）
は、葯発達の少なくとも四分子期から四分子放出までに
雄性組織優先的発現を有し、減数分裂および初期単核期
においては低レベルの発現が可能であるものとして特徴
付けられた。

実施例４ TATAボックス分析 Ms45雄性組織優先的調節領域をコードするDNAの1388b
pフラグメント内に、主要な転写の開始は＋１で同定さ
れ、主要でない転写の開始は、主要な転写開始に対して
−３で同定され、そして推定のTATAボックスは−33で同
定された（CATTAAA）。−30の配列TAAAGATもまた、実際
のTATAボックスの候補であることに注意した。この1388
bpフラグメントを、ホタル由来のルシフェラーゼコード
領域（Pareddyら、Theoret.Appl.Genet.;77巻;521−526
頁（1989））、続いてポテトのプロテイナーゼインヒビ
ターII遺伝子由来の3'−非翻訳領域（An,G.ら、「Funct
ional Analysis of the 3' Control Region of the Pot
ato Wound−Inducible Proteinase Inhibitor II Gen
e」;Plant Cell;1巻;115−122頁；（1989））を含むレ
ポーター遺伝子カセットに作動可能に連結した。

TATAボックスを分析するための、当業者に周知の１つ
の方法は、変異を介する。別の誘導体において、推定TA
TAボックスの１つから６つのヌクレオチドを、所定の誘
導体において変化させた。BGL II部位を−38に導入し、
推定TATAボックスをCATTAAAからTATTAAAに改変した。こ
の配列は標準のTATAボックス配列TATATAAにかなり一致
する。

TATAボックス内の特定の置換が、組織特異性に影響す
ることなく、プロモーターの発現レベルに影響し得るこ
とは、当業者によって認識される。図７に示すように、
−38に導入されたBgl II部位に関連したTATAボックスの
変化は、葯における一過性発現レベルを劇的に増加さ
せ、そしてさらに、−33の配列が真のTATAボックスであ
ることを示唆する。−40、−43、−51、または−53での
BGL II部位の導入は、プロモーターの活性を増加させず
（データ示さず）、−38のBGL II部位の導入において観
察される増加は、BGL II部位それ自体とは無関係であっ
たことを立証した。

推定TATAボックスの他の改変を、その機能性について
さらに試験するために導入した。推定TATAボックス配列
の、CATTAAAから、GATTAAA、CATGGAAまたはGGGCCCAへの
変更はすべて、葯における一過性発現レベルを減少さ
せ、さらにTATAボックスとしてのこの配列の重要性を示
唆する。驚くべきことに、これらの変異のいずれもが一
過性活性を消滅させることはなかった；しかし、他の系
においては、TATA様配列およびTATAのないプロモーター
でさえ欠損する場合一過性の活性の報告が存在する（Gu
an,L.およびJ.G.Scandalios,Plant J;3巻;527−536頁；
（1993）;Close,P.S.,「Cloning and Molecular Charac
terization of Two Nuclear Genes for Zea mays Mitoc
hondrial Chaperonin 60」；（学位論文）;Iowa State
University,Ames,Iowa;92頁,128;（1993））。

上記は本発明の好ましい実施態様を記載したが、変更
および改変がなされ得、そしてこれはなお本発明の範囲
内にあることが当業者によって理解される。

配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：パイオニアハイ−ブレッドインタ
ーナショナル，インコーポレイテッド（ii）発明の名称：雄性組織優先的調節領域およびこ
れを使用する方法（iii）配列数:2 （iv）連絡住所：（Ａ）住所：パイオニアハイ−ブレッドインタ
ーナショナル，インコーポレイテッド（Ｂ）番地：ロッカストストリート400,キャピタ
ルスクエア800 （Ｃ）市：デモイン（Ｄ）州：アイオワ（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号:50309 （ｖ）コンピューター読み出し形態：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用（Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.
0,バージョン＃1.30 （vi）現在の出願データ：（Ａ）出願番号:PCT未定（Ｂ）出願日：同日（Ｃ）分類：（viii）代理人／事務所情報：（Ａ）名称：スウィニー，パトリシアエイ．（Ｂ）登録番号:32,733 （Ｃ）照会／記録番号:0578−PCT （ix）通信情報：（Ａ）電話：（515）248−4800 （Ｂ）テレファックス：（515）334−6883 （２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1394塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）（xi）配列：配列番号１（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1394塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）（xi）配列：配列番号２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ガーナート，カールダブリュー. アメリカ合衆国アイオワ，アンケニー，エヌ．イー．インスブラック 401 (72)発明者ホフマン，ゲイリーエイ. アメリカ合衆国アイオワ 50311，デモイン，41エスティーストリート 1431 (72)発明者ケンドール，ティミーエル. アメリカ合衆国アイオワ 50072，アールハム，ホグバックロッジロード 1275 (56)参考文献国際公開96／013588（ＷＯ，Ａ１) 国際公開96／016182（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A01H 5/00 C12N 5/10 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に記載のヌクレオチド配列また
はそのフラグメントを含む単離された核酸であって、該
単離された核酸は、葯において、該単離された核酸に作
動可能に連結された遺伝子の発現を制御し得る、単離さ
れた核酸。
【請求項２】配列番号１に記載のヌクレオチド配列また
はそのフラグメントを含む単離された核酸であって、該
単離された核酸は、葯発達の四分子期から四分子放出期
までの葯において、該単離された核酸に作動可能に連結
された遺伝子の発現を制御し得る、単離された核酸。
【請求項３】請求項１または２に記載の単離された核酸
の改変体であって、該改変体は、該単離された核酸に対
して少なくとも90％の同一性を有し、かつ該改変体は、
葯において、該改変体に作動可能に連結された遺伝子の
発現を制御し得る、改変体。
【請求項４】請求項１または２に記載の単離された核酸
の改変体であって、該改変体は、該単離された核酸の配
列において１または数個の欠失、付加、置換またはそれ
らの組み合わせを有し、かつ該改変体は、葯において、
該改変体に作動可能に連結された遺伝子の発現を制御し
得る、改変体。
【請求項５】配列番号２に記載のヌクレオチド配列また
はそのフラグメントを含む単離された核酸であって、該
単離された核酸は、葯において、該単離された核酸に作
動可能に連結された遺伝子の発現を制御し得る、単離さ
れた核酸。
【請求項６】配列番号２に記載のヌクレオチド配列また
はそのフラグメントを含む単離された核酸であって、該
単離された核酸は、葯発達の四分子期から四分子放出期
までの葯において、該単離された核酸に作動可能に連結
された遺伝子の発現を制御し得る、単離された核酸。
【請求項７】請求項５または６に記載の単離された核酸
の改変体であって、該改変体は、該単離された核酸に対
して少なくとも90％の同一性を有し、かつ該改変体は、
葯において、該改変体に作動可能に連結された遺伝子の
発現を制御し得る、改変体。
【請求項８】請求項５または６に記載の単離された核酸
の改変体であって、該改変体は、該単離された核酸の配
列において１または数個の欠失、付加、置換またはそれ
らの組み合わせを有し、かつ該改変体は、葯において、
該改変体に作動可能に連結された遺伝子の発現を制御し
得る、改変体。
【請求項９】請求項１もしくは２に記載の単離された核
酸または請求項３もしくは４に記載の改変体を含む組換
え発現ベクターであって、該核酸または該改変体は、外
因性遺伝子をコードするヌクレオチド配列に、該外因性
遺伝子が葯優先的様式で発現されるように作動可能に連
結されている、組換え発現ベクター。
【請求項１０】前記外因性遺伝子が、Ms45である、請求
項９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１１】外因性ヌクレオチド配列を葯優先的様式
で発現する形質転換植物を生成する方法であって、植物
に、請求項１もしくは２に記載の単離された核酸または
請求項３もしくは４に記載の改変体を含む葯優先的調節
領域に作動可能に連結された該外因性ヌクレオチド配列
を導入する工程を包含する、方法。
【請求項１２】前記導入する工程がマイクロプロジェク
タイルボンバードメントによって行われる、請求項11に
記載の方法。
【請求項１３】前記導入する工程がAgrobacteriumを利
用する、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】前記AgrobacteriumがTiプラスミドを含
む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】前記葯優先的調節領域の葯優先的発現部
分が、１つより多いコピーで存在し得る、請求項11に記
載の方法。
【請求項１６】植物において稔性を媒介する方法であっ
て、外因性遺伝子に作動可能に連結された請求項１もし
くは２に記載の単離された核酸または請求項３もしくは
４に記載の改変体が、稔性が影響を受けるように該外因
性ヌクレオチド配列を発現する、形質転換された植物を
生成する工程を包含する、方法。
【請求項１７】前記外因性ヌクレオチド配列が、原核生
物調節系をコードするDNA配列を含む、請求項11に記載
の方法。
【請求項１８】前記外因性ヌクレオチド配列が、細胞傷
害性遺伝子をコードする、請求項11に記載の方法。
【請求項１９】前記外因性ヌクレオチド配列が、アビジ
ンをコードする、請求項11に記載の方法。
【請求項２０】前記外因性ヌクレオチド配列が、DAMメ
チラーゼをコードする、請求項11に記載の方法。
【請求項２１】前記外因性ヌクレオチド配列が、相補的
ヌクレオチド単位に作動可能に連結された、前記葯優先
的調節領域をコードする、請求項11に記載の方法。
【請求項２２】前記相補的ヌクレオチド単位が、カラー
ゼアンチセンスRNA、バルナーゼアンチセンスRNA、カル
コンシンターゼアンチセンスRNA、およびMs45アンチセ
ンスRNAからなる群から選択される、請求項21に記載の
方法。
【請求項２３】前記相補的ヌクレオチド単位が、リボザ
イムおよび外部ガイド配列からなる群から選択される、
請求項21に記載の方法。
【請求項２４】前記外因性ヌクレオチド配列が、オーキ
シン、rolB、およびジフテリア毒素からなる群から選択
される産物をコードする、請求項16に記載の方法。
【請求項２５】前記外因性ヌクレオチド配列が、雄性不
稔性遺伝子である、請求項16に記載の方法。
【請求項２６】前記雄性不稔性遺伝子がMs45である、請
求項25に記載の方法。
【請求項２７】前記植物が単子葉である、請求項16に記
載の方法。
【請求項２８】前記植物が双子葉である、請求項16に記
載の方法。
【請求項２９】雑種種子を生成する方法であって、他家
受粉整列で第一の雄性稔性植物および第二の雄性不稔性
植物を植える工程であって、該第二の雄性不稔性植物が
請求項11に記載の方法に従って生成される、工程、該他
家受粉を生じさせる工程、および得られた種子を収穫す
る工程を包含する、方法。
【請求項３０】前記植物がトウモロコシである、請求項
29に記載の方法。
【請求項３１】葯優先的様式で外因性ヌクレオチド配列
を発現する形質転換植物であって、請求項１、２、５も
しくは６のいずれか１つに記載の核酸または請求項３、
４、７もしくは８のいずれか１つに記載の改変体に作動
可能に連結された、外因性ヌクレオチド配列を含む、形
質転換植物。
【請求項３２】前記外因性ヌクレオチド配列が、前記核
酸または前記改変体に作動可能に連結され、該核酸また
は該改変体が１つより多いコピーで存在し得る、請求項
31に記載の形質転換植物。
【請求項３３】前記植物が、単子葉または双子葉であ
る、請求項31に記載の形質転換植物。
【請求項３４】前記植物が、トウモロコシ、ヒマワリ、
ダイズ、コムギ、アブラナ、イネ、およびモロコシから
なる群から選択される、請求項31に記載の形質転換植
物。
【請求項３５】前記植物が、トウモロコシ、ヒマワリ、
ダイズ、コムギ、アブラナ、イネ、およびモロコシから
なる群から選択される、請求項32に記載の形質転換植
物。
【請求項３６】請求項31または請求項32に記載の形質転
換植物の組織。
【請求項３７】請求項31に記載の形質転換植物の形質転
換植物細胞。