RO119957B1 - Regiune de reglare preferată a unui ţesut masculin şi metodă pentru folosirea acesteia - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o secvenţă nucleotidică izolată, care codifică regiunea de reglare preferată a ţesutului masculin Ms45. Un aspect al invenţiei îl constituie folosirea acestei regiuni de reglare preferată ţesutului masculin, în medierea fertilităţii. Un exemplu de astfel de utilizare este producerea seminţei hibride într-un sistem androsteril. Regiunea de reglare preferată ţesutului masculin Ms45 poate fi legată operaţional cu gene exogene, cum ar fi cele care codifică citotoxine, unităţi nucleotidice complementare şi molecule inhibitorii. Această invenţie se referă, de asemenea, la celule de plantă, ţesut de plantă şi plante diferenţiate care conţin regiunea de reglare din această invenţie. ŕ

Description

Invenția se referă la o moleculă izolată de acid nucleic, care acționează ca regiune de reglare în celule eucariote. Mai exact, invenția se referă la secvențe ADN izolate de la porumb care, de preferință acționează ca regiuni de reglare a țesutului masculin și joacă un rol privind expresia genelor în țesuturi masculine.

Invenția se referă, de asemenea, la o metodă prin care se conferă unei gene, abilitatea de a fi exprimată în țesut masculin, într-o modalitate preferată, genă care, în mod normal, poate sau nu să fie exprimată în țesuturi masculine.

Expresia specifică a unei gene și a unui țesut în timp și reglarea acesteia sunt întâlnite printre altele, în timpul reproducerii sexuate la eucariote. în gametogeneza plantei, în timpul dezvoltării polenului, au loc modificări citologice și biochimice importante când prin diviziunea mitotică asimetrică a microsporilor haploizi rezultă două celule, fiecare cu o dezvoltare diferită. Celula vegetativă suportă creșterea polenului, în timp ce celula generativă trece prin mitoză și se transformă în celule sporogene. ARNs mesager specific ambelor căi a fost identificat în polen, la plante ca porumb, tomate, tutun, orez și pansele, au fost, de asemenea identificate și mesaje specifice polenului sau unuia sau mai multor altor tipuri de celule din antere, cum ar fi stratul tapet, epidermă și stomiu.

Expresia genelor de polen, în timpul diferențierii, implică estimativ 24 000 gene (Willing et al., An Analysis of the QuantityandDiversity ofmRNA's From Pollen andShoots ofZeamays, Theor. Anii. Genet., voi. 75, pp. 751...753, (1988)), totuși doar 10% dinclonele din banca cADN sunt specific masculine (Stinson, et al., Genes Expressed in the Mate Gametophyteand Theirlsolation, Plani Physiol., voi. 83, pp. 442...447, (1987)) și procentajul genelor exprimate în polen și care sunt specifice polenului este între 5 și 80% (Willing, et al., An Analysis of the Quantity and Diversity of mRNA 's From Pollen and Shoots ofZea mays,; Theor. Appl. Genet., voi. 75, pp. 751 ...753, (1988)). Acest proces complex al microsporogenezei implică producerea secvențială a mai multor produse ale genei.

Până în prezent, genele specific masculine au fost donate de la plante; două dintre acestea, gena Ms45 de la porumb (US 5478369) și gena Ms2de la Arabidopsis, (Mark, G.M. et al., Nature, voi. 364, pp. 715...717, (1993)), s-au dovedit a fi necesare dezvoltării polenului. Alte exemple de promotori specific masculini în plante includ ZM13, PG și SGB6.

Promotorul Zm 13 este dezvăluit în brevetul US 5086169. El constă din 1315 perechi de baze și este dintr-o genă specifică polenului, descrisă de Hanson, et al., Plant Cell, voi. 1, pp. 173...179, (1989). Această genă hibridizează cu ARNm, găsit doar în polen.

Alt promotor specific polenului a fost izolat și caracterizat în amontele genei poligalacturonază (PG) specifică polenului (US 5412085). Această regiune promotor cuprinde 2687 perechi de baze și este exprimată predominant în polen și mătasea porumbului în dezvoltare, dar nu în mătasea porumbului în fază preemergentă. Brevetul US 5545546, aparținând de asemenea lui Allen, descrie alt promotor specific polenului din gena poligalacturonază de porumb. Acesta este exprimat doar în polen și în mătasea în dezvoltare.

Brevetul US 5470359 descrie o regiune de reglare, din gena SGB6 a porumbului, care conferă specificitate stratului tapet. Țesutul de expresie, adică stratul tapet este un strat de celule care înconjoară celulele microsporogene ale anterei și asigură acestora substanțele nutritive.

în brevetul US 5477002, au fost descrise nouă clone ADNc specifice anterei din genomul de tutun. Clonele ADNc sunt specifice anterei, fapt evidențiat prin analiză Northern, deși erau în diferite stadii de dezvoltare. Clona Ant32 este specifică stratului tapet.

Brevețuț Europeanj0420819A1 descrie metoda de producere de plante androsterile cu gena wun1.

RO 119957 Β1

PCT WO 90/08825 descrie ADNc, specifice anterei, cum sunt TA13, TA26 și TA29 1 și utilizarea lor într-un sistem androsteril.

PCT WO 90/08825 aduce explicații cu privire la genele androsterilității pMS1O, 3 pMS14 și pMSl8, și utilizarea lor cu gena reporter GUS.

Brevetul US 5589610 detaliază un promotor corespunzător ADNc, specific anterei 5 și ADNc AC444 preferențial pentru anteră.

Folosirea unui promotor de plantă și a unei gene exogene, pentru a efectua o schim- 7 bare în structura genetică a plantelor, este cunoscută în domeniu (US 5432068, 5412085, 5545546, 5470359 și 5478369). Aceste brevete prezintă casete de expresie la plante, cu un 9 promotor specific țesutului legat la o genă cu efect asupra androsterilității, fertilității sau a altei expresii a genei, într-un țesut specific. Totuși, aceste brevete nu prezintă utilizarea 11 acestei regiuni de reglare preferată a unui țesut masculin sau utilizarea acestei regiuni de reglare preferată a unui țesut masculin cu o genă exogenă, ca metodă de control a andro- 13 sterilității.

Prezenta invenție este direcționată spre o regiune de reglare specifică țesutului mas- 15 culin și spre metodele de utilizare a acesteia. Expresia genei exogene, într-o manieră preferată țesutului masculin, poate media fertilitatea masculină și este utilă într-o multitudine de 17 sisteme, cum ar fi producerea de sămânță hibridă.

Un obiect al prezentei invenții este de a asigura o metodă pentru expresia genelor 19 exogene, într-o manieră preferată țesutului masculin, utilizând un vector de expresie care conferă expresia preferată țesutului masculin, la o genă exogenă. Acest proces poate fi uti- 21 lizat pentru a restabili (cum ar fi într-un sistem de androsterilitate) sau pentru a influența în vreun fel fertilitatea, ca în producerea de sămânță hibridă. 23

Un alt obiect al acestei invenții este asigurarea unei regiuni de reglare ADN, care conferă expresia genei, de preferință, într-un țesut masculin. De asemenea, un alt obiect al 25 acestei invenții este asigurarea unei regiuni de reglare preferată a unui țesut masculin sau a acelor regiuni cu identitate de secvență cu aceasta, de preferință, de aproximativ 70, 75 27 sau 80%, mai preferabil, de aproximativ 85 sau 90, și mai preferabil, de aproximativ 95 sau 99%. 29

Un obiect al acestei invenții este asigurarea unei secvențe de acid nucleic izolat, care codifică regiuni de reglare preferate ale țesutului masculin Ms45. 31

Un obiect al acestei invenții este asigurarea unei secvențe de acid nucleic care codifică o regiune de reglare preferată a țesutului masculin Ms45 de la Zea mays, care cuprinde 33 o secvență de acid nucleic, prezentată în SEQ ID NR: 1, sau o secvență cu identitate de secvență la aceasta. Metoda, în care numita etapă de introducere poate fi realizată prin bom- 35 bardament cu microproiectile, poate utiliza Agrobacterium sau un vector de transfer cuprinzând un plasmid Ti. De asemenea, pot exista mai multe copii ale numitei secvențe nucleoti- 37 dice exogene, legate operațional la o regiune de reglare preferată a țesutului masculin.

Un obiect al acestei invenții este asigurarea unei metode, în care numita regiune de 39 reglare exprimă, într-o manieră preferată țesutului masculin, în țesuturi selectate din grupul ce constă din polen, stratul tapet, anteră, mătasea porumbului, celule mamă polinice și 41 microspori.

Un obiect al acestei invenții este asigurarea unei plante transformate, care exprimă 43 o secvență nucleotidică exogenă, într-o manieră preferată țesutului masculin, având o secvență nucleotidică exogenă, legată operațional la o regiune de reglare preferată a țesutului 45 masculin, prezentată în SEQ ID NR:1, sau acelea cu identitate de secvență la aceasta.

Numita plantă este o monocotiledonată sau o dicotiledonată. Orice plantă capabilă de a fi 47 transformată poate fi folosită, incluzând, de exemplu, porumbul, floarea-soarelui, fasolea,

RO 119957 Β1 soia, grâul, rapița, orezul și sorgul. De asemenea, această invenție asigură țesutul transformat al plantei transformate. De exemplu, țesuturile pot fi polen, spice, ovule, antere, mătase de porumb, stamine, pistile și celule de plantă. Planta transformată poate conține mai multe copii ale numitei secvențe nucleotidice exogene, legată operațional la o regiune de reglare preferată a țesutului masculin.

Un obiect al acestei invenții este asigurarea unei metode pentru medierea fertilității într-o plantă, în care regiunea de reglare preferată a țesutului masculin exprimă numita secvență nucleotidică exogenă, astfel încât să aibă un impact asupra fertilității. Această secvență nucleotidică exogenă poate fi orice secvență cu impact asupra fertilității masculine și poate fi, de exemplu, o unitate nucleotidică complementară, care codifică astfel de molecule antisens, cum ar fi ARN callaza antisens, ARN barnaza antisens și ARN chalcon sintaza antisens, ARN antisens Ms45, sau ribozime și secvențe de orientare externă, sau aptameri sau nucleotide separate, împletite. Secvența nucleotidică exogenă poate codifica, de asemenea, auxine, rol B, citotoxine, toxina difteriei, metilaza DAM, avidina, sau poate fi selectată dintr-un sistem de reglare procariot. De asemenea, această secvență nucleotidică exogenă este o genă de androsterilitate sau o genă structurală Ms45 și această plantă este o monocotiledonată sau o dicotiledonată.

Un obiect al acestei invenții este asigurarea unei metode pentru producerea de sămânță hibridă, care cuprinde plantarea alăturată, pentru polenizarea încrucișată a unei plante androfertile și a unei plante androsterile, plante produse conform metodei de mai sus, permițând numita polenizare încrucișată și recoltarea semințelor care rezultă. Plantele pot fi plante de porumb.

Acestea și alte obiecte sunt îndeplinite conform unei realizări a prezentei invenții, prin asigurarea unei molecule de ADN izolată, în care molecula de ADN cuprinde o secvență nucleotidică prezentată la SEQ ID NR:1.

în conformitate cu o altă aplicare a prezentei invenții, s-a asigurat o metodă pentru utilizarea unei astfel de vector de expresie, pentru producerea unei plante androsterile, metodă cuprinzând etapa introducerii unui vector de expresie, în celule de plantă, în care gena exogenă a vectorului de expresie poate fi o unitate nucleotidică complementară, om ar fi molecule antisens (ARN calază antisens, ARN barnază antisens și ARN chalcon sintază antisens, ARN Ms45 antisens), ribozime și secvențe de orientare externă, un aptamer sau nucleotide separate, împletite. Secvența nucleotidică exogenă poate codifica, de asemenea auxine, rol B, citotoxine, toxina difteriei, metilaza DAM, avidină, sau poate fi selectată dintrun sistem de reglare procariotic.

în concordanță cu o altă aplicare a prezentei invenții, a fost asigurată o metodă pentru utilizarea unei regiuni de reglare preferată a unui țesut masculin, pentru producerea unei plante hibride androfertile, cuprinzând etapele de:

a) producere a unei prime plante ca genitor androsteril, care conține un vector de expresie, care cuprinde o regiune de reglare preferată a unui țesut masculin și o primă genă exogenă, în care regiunea de reglare preferată a unui țesut masculin controlează expresia primei gene exogene și în care produsul primei gene exogene distruge androfertilitatea;

b) producere a unei a doua plante genitoare, cuprinzând un vector de expresie care conține o a doua genă exogenă, în care regiunea de reglare controlează expresia celei de-a doua gene exogene, astfel încât aceasta poate fi exprimată în țesutul masculin;

c) fertilizarea-încrucișată a primului genitor cu al doilea genitor, pentru producerea unei plante hibride, în care țesuturile masculine ale plantei hibride exprimă a doua genă exogenă și în care produsul celei de-a doua gene exogene previne distrugerea funcției mătasei de porumb, prin produsul primei gene exogene, producând în acest mod o plantă hibridă androfertilă.

RO 119957 Β1 în concordanță cu o altă aplicare a prezentei invenții, s-a asigurat o metodă pentru 1 utilizarea unei regiuni de reglare preferată a unui țesut masculin, pentru producerea unei plante hibride androfertile, cuprinzând etapele de: 3

a) producere a unei prime plante ca genitor androsteril, în care o primă genă implicată în expresia androfertilității este distrusă; 5

b) producere a unei a doua plante genitoare, cuprinzând un vector de expresie care cuprinde o regiune de reglare preferată a unui țesut masculin și o genă exogenă, în care 7 regiunea de reglare preferată a țesutului masculin controlează expresia genei exogene, astfel încât aceasta poate fi exprimată în țesuturi masculine și ar putea fi un complement 9 funcțional pentru funcția genei distruse în a);

c) fertilizarea-încrucișată a primului genitor cu al doilea genitor, pentru producerea 11 unei plante hibride, în care țesuturile masculine ale plantei hibride exprimă gena exogenă și în care produsul genei exogene previne distrugerea funcției mătasei de porumb, în acest 13 mod producând o plantă hibridă androfertilă.

în cele ce urmează, se prezintă o scurtă descriere a figurilor. 15

- fig. 1, diagramă a clonei genomice Ms45 Ac4.1. și a situsurilor de restricție;

- fig. 2, hartă plasmidică a PHP6045; 17

- fig. 3, autoradiogramă a produselor de extensie a primerului care indică startul transcripției Ms45. Benzile marcate G, A, T și C corespund reacțiilor de secvențiere cu dide- 19 oxinucleotidele ddGTP, ddATP, ddTTP și, respectiv ddCTP. Benzile 1 -4 corespund reacțiilor de extindere a primerului cu ARNm, de la (1) mătasea de porumb, (2) frunze, (3) antere și 21 (4) frunze;

- fig. 4, grafic cu bare, care ilustrează specificitatea stagiului regiunii de reglare 23 preferată a țesutului masculin Ms45;

- fig. 5, indică specificitatea țesutului, ilustrată prin pierderea activității în țesuturile 25 nemasculine;

- fig. 6, gel de analiză Northern al ARNm de anteră, hibridizat cu gena Ms45 27 androfertilă;

- fig. 7, rezultatele analizelor mutaționale ale cutiei TATA. 29

Toate referințele susmenționate sunt încorporate aici ca surse de referință.

Mai puțin unde s-au definit altfel, toți termenii tehnici și științifici utilizați aici au semni- 31 ficația înțeleasă în mod obișnuit de un specialist în domeniul căruia îi aparține această invenție. 33

Dacă nu s-au definit altfel, tehnicile folosite sau descrise aici sunt metodologii standard, bine cunoscute specialistului în domeniu. Materialele, metodele și exemplele sunt 35 doar ilustrative și nu limitative.

în descrierea care urmează, un număr de termeni sunt larg folosiți. Definițiile 37 următoare sunt asigurate pentru a facilita înțelegerea invenției.

1. Definiții 39

Identitate sau similaritate de secvență, așa cum se cunoaște în domeniu, reprezintă legăturile dintre două secvențe polipeptidice sau două secvențe polinucleotidice, așa cum 41 se determină prin compararea secvențelor. în domeniu, identitatea înseamnă, de asemenea, gradul de înrudire dintre secvențele a două polipeptide sau două polinucleotide, așa cum se 43 determină prin potrivirea dintre două lanțuri ale unor astfel de secvențe. Atât identitatea, cât și similaritatea pot fi calculate rapid {Computațional Molecular Biology: Lesk, A.M. ed.; 45 Oxford University Press, New York; (1988); Biocomputing; Informating and Genome Projects; Smith, D. W. ed.; Academic Press, New York; (Î993); Computer Analysis of 47

RO 119957 Β1

Sequence Data (Part I); Griffin, A. M. și H. G. Griffin ed.; Humana Press, New Jersey; (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, (1987); și Sequence Analysis Primer, Gribskov, M, și J. Devereuxed., M. Stockton Press, New York; (1991)). Deși există un număr de metode, pentru a măsura identitatea și similaritatea dintre secvențele a două polinucleotide sau două polipeptide, ambii termeni sunt bine cunoscuți specialiștilor (von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, (1987), SequenceAnalysysPrimer, Gribskov, M. și J. Devereuxed., M. Stockton Press, New York, (1991), și Carillo, H. și D. Lipman, SIAM, J. Applied Math; voi. 48, pp. 1073, (1988)). Metode obișnuite, folosite pentru determinarea identității sau similarității dintre două secvențe, includ, dar nu se limitează la cele descrise în Carillo, H. și D. Lipman, SIAM J.AppliedMath., voi. 48, pp. 1073, (1988). Metodele preferate, pentru determinarea identității, sunt desemnate pentru a da cea mai mare potrivire dintre două secvențe testate. Metodele pentru determinarea identității și similarității dintre două secvențe sunt codificate în programe de computer. Metodele cu programe de computer, preferate pentru determinarea identității și similarității dintre două secvențe, includ, dar nu se limitează la pachetul de programe GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, voi. 12(1), pp. 387, (1984)), BLASTP, BLASTN și FASTA (Atscul, S.F. et al., J. Molec. Biol., voi. 215, pp.403, (1990)).

Țesutul masculin constă din țesuturi obținute din colecții de celule care sunt implicate direct sau care sprijină reproducerea gârneților masculini, cum ar fi polen, stratul tapet, anteră, mătase-de-porumb, celule mamă polinice și microspori. Stratul tapet este țesutul din anteră în contact apropiat cu celulele mamă polinice și microspori și este implicat în hrănirea granulelor de polen care se dezvoltă. Celulele mamă polinice suferă două diviziuni meiotice, care produc o tetradă a microsporilor haploizi. Microsporii se maturează într-o granulă de polen. Polenul sau granulele de polen sunt gametofiți masculini maturi, care pot avea capacitatea de a fertiliza plantele care sunt compatibile. Anteră este acea parte din stamină în care este produs polenul, restul staminei constituind filamentul, pe care se fixează antera. Stamina este organul masculin al florii.

Regiunea de reglare preferată a țesutului masculin este o secvență nucleotidică care direcționează nivelul cel mai ridicat al transcripției unei gene asociate, în țesuturile masculine, decât în unele sau în toate țesuturile unei plante. De exemplu, gena Ms45, descrisă aici, este detectată în antere în stadiile de dezvoltare cvartet, de eliberare a cvartetului și stadiul uninucleat timpuriu. Detalii privind stadiile dezvoltării anterei sunt descrise de Chang, M.T. și M.G. Neuffer, Maize Microporogenesis, Genome, voi. 32, pp. 232...244, (1989). Regiunea de reglare preferată a țesutului masculin al genei Ms45 direcționează expresia unei gene legate operațional în țesuturi masculine. Țesuturile preferate ale expresiei sunt cele masculine și nu, de exemplu, țesut de rădăcină sau de coleoptil. Expresia predominantă este în țesuturile masculine, cum ar fi, dar nu este limitată la polen, stratul tapet, anteră, mătase-de-porumb, celule mamă polinice și microspori. Această expresie preferată a țesutului masculin se referă la niveluri mai ridicate ale expresiei în țesuturi masculine, dar nu este necesară excluderea altor țesuturi.

A media înseamnă a influența pozitiv sau negativ sau a influența rezultatul, cum ar fi cel privind fertilitatea sau oricare altă trăsătură.

Un impact asupra androfertilității are loc când ne întâlnim cu o fertilitate anormală; aceasta poate fi o fertilitate redusă sau o fertilitate crescută sau fertilitate care este diferită, privind sincronizarea sau alte caracteristici.

Izolat înseamnă modificat de mâna omului, de la starea sa naturală; adică, dacă aceasta se întâlnește în natură, aceasta a fost schimbată sau îndepărtată din mediul său original, sau ambele. De exemplu, o polinucleotidă care se întâlnește natural sau o polipeptidă

RO 119957 Β1 prezentă natural într-un organism viu în starea sa naturală, nu este izolată, dar aceeași 1 polinucleotidă sau polipeptidă separată din materialele coexistente ale stării sale naturale este izolată, așa cum este folosit termenul aici. De exemplu, referitor la polinucleotide, 3 termenul izolat înseamnă că aceasta este separată din cromozomul și celula în care apare natural. Ca parte a acestora sau în urma izolării ulterioare, astfel de polinucleotide se pot uni 5 cu alte polinucleotide, așa cum ar fi ADNs, pentru mutageneză, pentru a forma proteine fuzionate și pentru propagarea sau expresia într-o gazdă, de exemplu. Polinucleotidele 7 izolate, singure sau legate la alte polinucleotide, așa cum ar fi vectorii, se pot introduce în celule gazdă, în cultură sau în organisme întregi. Introduse în celule gazdă, în cultură sau 9 în organisme întregi, astfel de ADN-uri vor fi tot izolate, cum s-a utilizat aici termenul, deoarece ele nu vor fi întâlnite în forma sau în mediul lor natural. în mod similar, 11 polinucleotidele și polipeptidele pot apărea într-o compoziție, cum ar fi formulări de mediu, soluții pentru introducerea polinucleotidelor sau polipeptidelor, de exemplu, în celule, 13 compoziții sau, de exemplu, soluții pentru reacții chimice sau enzimatice, care nu sunt compoziții întâlnite natural, și așa cum este folosit aici, rămân polinucleotide sau polipeptide 15 izolate, în înțelesul acestui termen.

O genă exogenă se referă, în prezenta descriere, la o secvență ADN care este intro- 17 dusă sau reintrodusă într-un organism. De exemplu, orice genă, chiar și gena structurală ms

45, este considerată a fi o genă exogenă, dacă gena este introdusă sau reintrodusă în orga- 19 nism.

2. Izolarea unei regiuni de reglare preferată a țesutului masculin 21

Deși în domeniu se cunosc promotorii specifici anterei și genele active în țesuturi masculine (McCormick, et al., Anther-Specific Genes: Molecular Characterization and 23 Promoter Analysis in Transgenic Plants, în Plant Reproduction: From Floral Induction to Pollination.; Lord, et al., ed.; pp.128...135; (1989); Scott, et al., Internațional Application 25 Publication No. WO 92/11379 (1992); Van der Meer et al., The Plant Cell; voi. 4, pp. 253, (1992)), nu există principii general acceptate sau criterii structurale, pentru recunoașterea 27 secvențelor ADN care conferă expresia țesutului masculin la expresia genei în porumb. Prin urmare, nu este posibilă izolarea unei regiuni de reglare preferată a țesutului masculin, direct 29 de la o bancă genomică de porumb, prin analiza pentru o secvență consens, care conferă expresie preferată țesutului masculin. 31

De exemplu, hibridizarea unor astfel de secvențe se poate realiza în condiții de stringență redusă, stringență medie sau chiar și condiții de stringență ridicată (de exemplu, con- 33 diții reprezentate printr-o spălare stringentă cu 35...40% formamidă cu 5X soluție Denhardt, 0,5% SDS și 1 xSSPE la 37°C; condiții reprezentate printr-o spălare stringentă cu 40...45% 35 formamidă cu 5X soluție Denhardt, 0,5% SDS și 1 XSSPE la 42°C; și condiții reprezentate printr-o spălare stringentă cu 50% Formamidă cu 5X soluție Denhardt, 0,5% SDS și, res- 37 pectiv 1 XSSPE la 42°C). Stringența medie, într-o hibridizare standard a acizilor nucleici, este utilă în identificarea regiunilor de reglare preferată a țesutului masculin, descrise aici, precum 39 și a altor gene (vezi, de exemplu, Sambrook, J., et al.. Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; (1982)). în general, 41 secvențele care codifică pentru o regiune de reglare preferată a țesutului masculin, vor avea identitate de secvență la aceasta, de preferință 70,75 sau 80%, mai preferat de 85 sau 90% 43 și mult mai preferat, de 95 sau 99%. Metodele pentru hibridizarea secvențelor de acizi nucleici sunt ușor disponibile în domeniu. Cercetarea hibridizării băncilor ADN expuse (vezi, 45 de exemplu, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: a Laboratorv Manual: Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; (1982)) sau a secvențelor care codifică 47

RO 119957 Β1 amplificarea, folosind reacția polimerazică în lanț (vezi, de exemplu, Innis, et al., PCR

Protocols, a Guide to Methods and Applications; Academic Press; (1990)) sunt tehnici binecunoscute pentru izolarea ADN-ului genomic.

Regiunile de reglare pot fi identificate în subclone genomice, folosind analiza funcțională, verificată, de obicei prin observarea expresiei genei raportor în țesutul anterei și reducerea sau absența expresiei genei raportor în țesut neanteral. Această abordare generală este ilustrată în exemplul 3 de mai jos. Există posibilitatea ca regiunile de reglare situate în amonte sau spre capătul 5' al situsului de start al transcripției să fie testate prin subclonarea unui fragment ADN care conține regiunea în amonte și subclonarea fragmentelor mici în vectori de expresie, pentru experimente de expresie tranzitorie. Este de așteptat ca fragmentele mai mici să poată conține regiuni esențiale pentru expresia preferată a țesutului masculin. De exemplu, regiuni esențiale ale promotorilor CaMV 19S și 35S au fost identificate în fragmente relativ mici, derivate de la piese genomice mai mari, așa cum se descrie în brevetul US 5352605.

în general, secvențele care codifică o regiune de reglare preferată a țesutului masculin, vor avea identitate de secvență, la aceasta, de preferință de 70,75 sau 80%, mai preferabil de 85 sau 90%, și mult mai preferabil, de 95 sau 99%.

Analiza deleției poate avea loc la ambele capete 5' și 3', ale regiunii de reglare: fragmentele pot fi obținute prin mutageneza cu cercetarea linkerului, mutageneza care folosește reacția polimerazică în lanț și altele asemenea (Directed Mutagenesis: A Practicai Approach; IRL Press; (1991)). Delețiile 3' pot contura regiunea de reglare preferată a țesutului masculin și identifică capătul 3', astfel încât această regiune esențială poate fi apoi legată funcțional cu miezul unui promotor, la alegere. O dată ce regiunea esențială s-a identificat, transcripția unei gene exogene poate fi controlată prin regiunea preferată a țesutului masculin Ms45 plus un promotor miez. Promotorul miez poate fi oricare dintre promotorii principali cunoscuți, așa cum ar fi promotorul Virusului Mozaicului Conopidei 35S sau 19S (US 5352605), Ubiquitina (US 5510474), promotorul miez IN2 (US 5364780) sau un promotor al Virusului Mozaicului la Scrophulariaceae (Gruber, et al., Vectors for Plant Transformation în Methods in Plant MolecularBiologyandBiotechonogy, Glick, et al., ed.; CRC Press; pp. 89...119; 1993)). De preferință, promotorul este promotorul miez al unei gene preferate a țesutului masculin sau promotorul miez al CaMV 35S. Mai preferabil, promotorul este un promotor miez al unei gene preferate a țesutului masculin și, în special, promotorul miez Ms45.

Analiza mutațională ulterioară poate introduce modificări de funcționalitate, așa cum ar fi nivelul expresiei, sincronizarea expresiei sau țesutul expresiei. Mutațiile pot fi de asemenea silențioase și nu au efect observabil.

3. Inserția regiunii într-un vector de expresie

Selecția unui vector de expresie corespunzător, cu care să se testeze expresia funcțională, va depinde de gazda și metoda introducerii vectorului de expresie în gazdă, și astfel de metode sunt bine cunoscute unui specialist în domeniu. Pentru eucariote, regiunile din vector includ regiuni care controlează inițierea transcripției și procesarea controlului. Aceste regiuni sunt legate operațional la o genă raportor, așa cum ar fi gena β-glucuronidază (GUS) sau gena luciferază. Descrierile generale și exemplele vectorilor de expresie ai plantei și genele raportor pot fi găsite în Gruber, et al., Vectors for Plant Transformation în Methods in Plant Molecular Bioloqy and Biotechnology, Glick et al., ed. CRC Press, pp. 89...119, (1993). Vectorii de expresie Gus și casetele genei Gus sunt disponibile comercial de la Clonetech, Palo Alto, CA, în timp ce vectorii de expresie luciferază și casetele de genă luciferază sunt disponibile de la Promega CorporatiorrrMadison, Wl. Plasmidele Ti și alți vectori

RO 119957 Β1

Agrobacterium sunt descriși de Ischida, Y. et al., în Nature Biotechnology, voi. 14, pp. 1

745.. .750, (1996) și brevetul US 5591616, Method for Transforming Monocotyledons, depus în 3 mai 1994. 3

Vectorii de expresie care conțin regiuni probabile de reglare localizate în fragmente genomice, pot fi introduși în țesuturi intacte, așa cum ar fi antere în dezvoltare, embrioni sau 5 în calus. Metodele de introducere a ADN-ului includ bombardament cu microproiectile, injecția ADN-ului, electroporarea și transferul genei mediat de Acrobacterium (vezi Gruber et al., 7

Vectors forPlant Transformation, în Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology,

Glick et al., ed. ORC Press; (1993), brevetul US 5591616, Method forTransforming Mono-9 cotyledons, depus în 3 mai 1994 și Ishida, Y. et al., Nature Biotechnology, voi. 14, pp.

745.. .750; (1996)). Metode generale pentru cultivarea țesuturilor de plantă se găsesc în 11

Gruber et al., Vectors for Plant Transformation, în Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et. al., ed. ORC Press, (1993).13

Pentru sistemul de testare tranzitoriu, antere în dezvoltare, izolate, se plasează imediat pe mediu de cultură pentru mătasea de porumb (Pareddy, D. R. și J. F. Petelino, Crop 15 Sci. J., voi. 29; pp.1564...1566; (1989)) solidificat cu 0,5% Phytagel (Sigma, St. Louis) sau alte medii care se solidifică. Vectorul de expresie ADN se introduce în timp de până la 5 h,17 de preferință, prin intermediul microproiectilelor cu lansare de particule de 1,2 μ la

1000.. .1100 Psi. După introducerea ADN-ului, anterele sunt incubate la 26°C, pe același 19 mediu de cultură, pentru mătasea de porumb, timp de 17 h și sunt analizate prin prepararea unui omogenat al întregului țesut și analiza pentru GUS sau activitatea luciferazei (vezi 21 Gruber et al., Vectors forPlant Transformation, în Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology, Glick et. al., ed.; ORC Press; (1993)). 23

Metodele descrise mai sus s-au folosit pentru a identifica secvențe ADN care reglează expresia genei, într-o manieră preferată, țesutului masculin. O astfel de regiune a 25 fost identificată ca regiunea de reglare preferată a țesutului masculin Ms45, pe întreaga lungime (SEQ ID NR:1). O mutație a cutiei TATA, cu identitate de secvență cu regiunea de 27 reglare preferată a țesutului masculin Ms45, pe întreaga lungime, s-a identificat în SEQ ID

NR:2. 29

Astfel, prezenta invenție cuprinde o moleculă ADN, având o secvență nucleotidică a SEQ ID NR:1 (sau cele cu identitate de secvență) și având funcția unei regiuni de reglare 31 preferată a țesutului masculin.

O cutie TATA probabilă poate fi identificată prin analiza extensiei primerului cum se 33 descrie în exemplul 2 de mai jos sau în Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.

M. et. al., ed.; John Wiley and Sons, New York; pp. 4.8.1...4.8.5; (1987). 35

4. Utilizarea unei regiuni de reglare preferată a țesutului masculin, pentru a controla fertilitatea 37

Un obiect al prezentei invenții este de a asigura un mijloc pentru controlul fertilității, folosind o regiune de reglare preferată a țesutului masculin. De menționat că această 39 regiune de reglare preferată a țesutului masculin poate controla expresia unei gene exogene în antere, de la stadiul de dezvoltare cvartet până la stadiile uninucleate timpurii. Semnifi- 41 cația practică a unei astfel de sincronizări este că expresia unei gene care induce sterilitate în timpul acestui stadiu de dezvoltate, va perturba maturarea anterei, suficient de timpuriu, 43 pentru a permite verificarea vizuală a funcției sistemului care induce sterilitatea în câmp. De asemenea, poate fi redusă posibilitatea apariției de spargeri (antere care împrăștie polen). 45 Astfel, efectele genei care induce sterilitate, vor fi evidente în câmpul de prodocțterTa o

RO 119957 Β1 etapă suficient de timpurie a dezvoltării, pentru a permite îndepărtarea mătăsii de porumb fie manual, fie mecanic, și a oricărei evadări fertile care rezultă de la divizarea parțială sau totală a sistemului care induce sterilitate.

Un mod de control al androfertilității este de a manipula expresia genei în stratul tapet. Tapet-ul este un strat de celule care înconjoară celule microsporogene ale anterei și care asigură nutrienții, cum ar fi zaharuri reduse, aminoacizi și lipide pentru dezvoltarea microsporilor (Reznickova, CR, Acad. Bula. Sci, voi.31; pp.1067; (1978); Nave et al., J. Plant Physiol., voi. 125; pp. 451; (1986); Sawhney et al., J. Plant Physiol, voi. 125, pp. 467, (1986)). Ms45 a fost găsit ca fiind exprimat la nivel mai ridicat în stratul tapet. Celulele tapetale produc de asemenea β(1,3) -glucanază (calază”) care induce eliberarea microsporului (Mepham et al., Protoplasma, voi. 70, pp. 1, (1970)). în consecință, există o legătură intimă între stratul tapet și celulele microsporogene și orice distrugere a funcției tapetului, probabil are, drept consecință, generarea de granule de polen nefuncționale. în fapt, se cunoaște că leziuni în biogeneza stratului tapet au ca rezultat mutanți androsterili (Kaul, Male Sterilityin Higher Plants în Monographs on Theoretical and Applied Genetics; Frankel et al ed., Springer Verlag, vol.10, pp. 15...95, (1988)). O apariție prematură sau târzie a calazei în timpul dezvoltării stratului tapet este de asemenea asociată cu anumite tipuri de androsterilitate (Warmke et al., J. Hered, voi. 63; pp. 103, (1972)). Din acest motiv, gena calază poate fi folosită pentru a perturba funcția țesutului masculin. Scott et al., PCT WO 93/02197 (1993), descrie secvența nucleotidică a unei calaze specifice stratului tapet. Astfel, o caracteristică a microsporilor, de a se dezvolta în granule de polen matur, poate fi indusă folosind o moleculă ADN recombinantă, care conține o genă capabilă de a distruge funcția tapetală sub controlul secvențelor de reglare specifice stratului tapet.

Un mod de abordare general, cu impact asupra androfertilității, este de construi un vector de expresie, în care regiunea de reglare preferată a țesutului masculin este legată operațional la o secvență nucleotidică ce codifică o proteină capabilă de a distruge funcția țesutului masculin, având drept consecință infertiIitatea. Proteine capabile de a distruge funcția țesutului masculin includ proteine care inhibă sinteza macromoleculeior care sunt esențiale pentru funcția celulară, enzime care degradează macromolecule, care sunt esențiale pentru funcția celulară, proteine care modifică biosinteza sau metabolismul hormonilor plantei, proteinele structurale, proteine exprimate în mod insuficient și proteine care inhibă o funcție specifică a țesuturilor masculine.

De exemplu, poate fi construit un vector de expresie, în care regiunea de reglare preferată a țesutului masculin este legată operațional la o secvență nucleotidică, care codifică un inhibitor al sintezei proteinei, care ar putea fi, dar nu se limitează, la o citotoxină. Toxina difteriei, de exemplu, este un inhibitor bine cunoscut al sintezei proteinelor la eurocariote. Molecule ADN care codifică, de exemplu, gena toxinei difteriei, pot fi obținute de la Americam Type Culture Collection (Rockville, MD), ATCC nr. 39359.sau ATCC Nr. 67011 și vezi Fabijanski et al., Ε. P. Appl. nr. 90902754.2, Molecular Methods of HybridSeedProduction, pentru exemple și metode de folosire. De exemplu, metilaza DAM este o enzimă bine cunoscută de la Escherichia coli, care modifică restul adenină, în secvența 5' GATC 3', la N⁶-metil-adenină. Cigan și Albertsen descriu cum metilaza DAM ar putea fi folosită pentru a influența fertilitatea în plante transgenice (PCT/US95/15229 Cigan, A. M. și Albertsen, M. C., Reversible Nuclear Genetic System for Male Sterility in Transgenic Plants). Alt exemplu al unei proteine care distruge fertilitatea, este avidina, așa cum se ilustrează în cererea de brevet US 08/475582, Induction of Male Sterility in Plants by Expression of High Levels of Avidin, Howard, J. și Albertsen, M.C.

RO 119957 Β1 în mod alternativ, distrugerea funcției tapetale se poate realiza folosind secvențe 1

ADN care codifică enzime capabile de degradare a unei macromolecule importante biologic.

De exemplu, Mariani et al., Nature, voi. 347, pp. 737 (1990), a arătat că expresia în tapet, 3 fie a RNazei-T1 de Aspergillus oryzae, fie a RNazei de Bacillus amyioliquefaciens, desemnată bamază, a indus distrugerea celulelor tapetale, având drept consecință infertilitatea 5 masculină. Quaas etal., Eur. J. Biochem., voi. 173, pp. 617, (1988), descrie sinteza chimică a RNazei-T 1, în timp ce secvența nucleotidică a bamazei este descrisă în Hartley, J. Molec. 7 Biol., voi. 202, pp. 913, (1988).

Genele RNază-T1 și bamază pot fi obținute, de exemplu, prin sintetizarea genelor 9 cu oligonucleotide lungi de inițiere mutuale. Vezi, de exemplu, Current Protocolsm Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al., ed. John Wiley and Sons, New York, pp. 8.2.8 la 8.2.13, 11 (1987). De asemenea, vezi Wosnick etal., Gene, voi. 60, pp. 115, (1987). Mai mult, tehnici curente folosind reacția polimerazică de lanț, asigură capacitatea de a sintetiza gene foarte 13 lungi (Adangetal., PlantMolec. Biol., voi. 21, pp. 1131, (1993); Bambotetal., PCRMethods and Applications, voi. 2, pp. 266, (1993)). 15 într-un mod de abordare alternativ, producerea de polen este inhibată prin modificarea metabolismului hormonilor plantei, așa cum ar fi auxinele. De exemplu, gena rolB de 17 la Agrobacterium rhizogenes codifică o enzimă care interferează cu metabolismul auxinei, prin catalizarea eliberării de indoli liberi de la indoxil-6-glucozide. Estruch et al., EMBO J., 19 voi. 11, pp. 3125 (1991) și Spena et al., Theor. Appl. Genet., voi. 84, pp. 520 (1992), au arătat că expresia genei rolB, specifică anterei la tutun, are ca rezultat plante cu antere ofilite, 21 în care producția de polen a scăzut drastic. Din acest motiv, gena rolB este un exemplu al unei gene care este utilă pentru controlul producției de polen. Slightom et al., J. Biol. Chem., 23 voi. 261, pp. 108, (1985), descrie secvența nucleotidică a genei rolB.

Pentru a exprima o proteină care distruge funcția țesutului masculin, se construiește 25 un vector de expresie, în care o secvență ADN care codifică proteina, este legată operațional la secvențe ADN care reglează transcripția genei, într-o manieră preferată țesutului mas- 27 culin. Cerințele generale ale unui vector de expresie sunt descrise mai jos, în contextul unui sistem de expresie tranzitoriu. Totuși, în acest caz, modul preferat este de a introduce vec- 29 torul de expresie în țesutul embriogen al plantei, în așa fel, încât o proteină exogenă va fi exprimată într-o etapă târzie de dezvoltare, în țesuturile masculine ale plantei adulte. Stabi- 31 litatea mitotică poate fi atinsă folosind vectori virali de plantă, care asigură replicarea epicromozomală. 33

O metodă alternativă și preferată, pentru obținerea stabilității mitotice, este asigurată prin integrarea secvențelor vectorului de expresie în cromozomul gazdei. O astfel de stabili- 35 tate mitotică poate fi asigurată prin introducerea de microproiectile ale unor vectori de expresie în țesutul embriogen (Gruber et al., Vectors for Plant Transformation, în Methods in Plant 37 Molecular biology and Biotechnology, Glick et al., ed. CRC Press, (1993)).

Metodologia de transformare poate fi găsită pentru multe plante, incluzând, dar fără 39 să se limiteze, la floarea-soarelui, fasole soia, grâu, rapiță, orez și sorg (Knittel N. et al., J.

Plant CellRep., Springer Internațional, Berlin, W. Germany, voi. 14(2/3), pp. 81 ...86; (1994); 41

Chee, P. P. etal., PlantPhysiol., AmericanSocietyofPlantPhysiologists, Rockville, MD, voi.

91(3), pp. 1212...1218, (1989); Hadi, Μ. Z. etal., J. Plant Cell pep., Springer Internațional, 43 Berlin, W. Germany, voi. 15 (7), pp. 500...505, (1996); Perl, A. etal., MolecularandGeneral Genetics, voi. 235(2-3), pp. 279...284; Zaghmout, O.M.F. și N. L. Trolinder, Nucleic Acids 45 Res., IRL Press, Oxford, voi. 21 (4), pp. 1048, (1993); Chen, J. L. și W. D. Beversdorf, Theor.

Appl. Genet., Springer Internațional, Berlin, W. Germany, voi. 88(2), pp. 187...192, (1994); 47

RO 119957 Β1

Sivamani, E. etal., Plant Cell Rep., Springer Internațional. Berlin, W. Germany, voi. 15(5), pp. 322...327, (1996); Hagio, T. et al., Plant Cell Rep., voi. 10(5), pp. 260...264, (1991)) și sunt de asemenea cunoscute celor cu pregătire în domeniu.

Pentru a selecta celule transformate, vectorul de expresie conține o genă marker selectabilă, cum ar fi o genă pentru rezistență la un erbicid. De exemplu, astfel de gene conferă rezistență la fosfinotricină, glifosat, sulfoniluree, atrazină, imidazolină sau kanamicină. Deși vectorul de expresie poate conține secvențe ADNc care codifică o proteină exogenă sub controlul unei regiuni de reglare preferată a țesutului masculin, precum și gena marker selectabilă sub controlul promotorului constitutiv, gena marker selectabilă poate, de asemenea, să fie introdusă în celulele gazdei printr-un vector de expresie de selecție separat. Astfel o cotransformare a țesutului embriogen, cu un vector de expresie test conținând o regiune de reglare preferată a țesutului masculin și un vector de expresie de selecție, este ilustrată mai jos.

5. Inducerea sterilității într-un mod de abordare alternativ, androsterilitatea poate fi indusă prin folosirea unui vector de expresie, în care regiunea de reglare preferată a țesutului masculin este legată operațional la o secvență nucleotidică care codifică o unitate nucleotidică complementară. Legarea moleculelor de acid nucleic complementar, la o moleculă țintă, poate fi selectată pentru a fi inhibitorie. De exemplu, dacă ținta este o moleculă ARNm, apoi legarea unei unități nucleotidice complementare, în acest caz un ARN, are drept consecință hibridizarea și împiedicarea translației (Paterson etal., Proc. Nat'l., Acad. Sci., voi. 74, pp. 4370, (1987)). Astfel, o moleculă ARN antisens corespunzătoare, așa cum ar fi una complementară pentru Ms45 (US 5478369), va avea o secvență care este complementară la aceea a unei specii ARNm, care codifică o proteină care este necesară pentru androsterilitate (Fabijanski în Antisense Gene Systems of Pollination Control ForHybridSeedProduction, cererea de brevet US 08/288734).

De exemplu, producerea de ARN antisens al calazei va inhiba producerea unei enzime calază, care este esențială pentru eliberarea microsporului. în plus, androsterilitatea poate fi indusă prin inhibarea biosintezei flavonoidei, folosind un vector de expresie care produce ARN antisens pentru regiunea 3' netranslată a genei chalcon sintază A (Van der Meer et al., The Plant Cell, voi, 4, pp. 253, (1992)). Clonarea și caracterizarea genei chalcon sintază A este descrisă de către Koes et al., 4 Gene, voi. 81, pp. 245, (1989) și de către Koes et al., Plant Molec. Biol., voi. 12, pp. 213, (1989).

în mod alternativ, poate fi construit un vector de expresie, în care regiunea de reglare preferată a țesutului masculin este legată operațional la o secvență nucleotidică care codifică o ribozimă. Ribozimele pot fi desemnate pentru a exprima activitatea endonucleazei, care este direcționată spre o anumită secvență țintă într-o moleculă ARNm. De exemplu, Steinecke et al., EMBOJ.,vo\. 11, pp. 1525, (1992) a realizat până la 100% inhibarea expresiei genei neomicin fosfotransferază, prin ribozime în protoplaști de tutun. Mai recent, Perriman et al., Antisense Research and Development, voi. 3, pp. 253, (1993), a inhibat activitatea cloramfenicol acetil transferazei în protoplaste de tutun, folosind un vector care exprimă o ribozimă cap de ciocan modificat. în contextul prezentei invenții, moleculele ARN țintă, corespunzătoare pentru ribozime, includ specii ARNm care codifică proteinele esențiale pentru androfertilitate, așa cum ar fi ARNm calaza și ARNm MS45.

într-un alt mod de abordare alternativ, pot fi construiți vectori de expresie, în care o regiune de reglare preferată a țesutului masculin direcționează producerea transcriptelor

RO 119957 Β1

ARN capabile de a promova RNaza P care mediază clivajul moleculelor ARNm țintă. în con- 1 formitate cu această abordare, o secvență cu orientare externă poate fi construită pentru orientarea ribozimei endogene, RNazei P, către specii particulare de ARNm intracelular, care 3 este ulterior clivat de ribozima celulară (US 5168053, Yuan et al., Science, voi. 263, pp.

1269, (1994)). De preferință, secvența de orientare externă cuprinde o secvență de zece 5 până la cincisprezece nucleotide, complementară unei specii ARNm care codifică o proteină esențială pentru androfedilitate și o secvență nucleotidică 3'-RCCA, în care R este, de pre- 7 ferință o purină. Transcriptele secvenței ghid de orientare externă se leagă la specia ARNm țintă, prin formarea perechilor de baze între ARNm și secvențele de orientare externă corn- 9 plementare, promovând astfel clivarea ARNm de către RNaza P, la nucleotida localizată la capătul 5'- al regiunii de baze perechi. 11

O altă abordare alternativă este de a utiliza tehnologia aptamer, în care unitatea nucleotidică complementară este o nucleotidă care servește ca un ligand la o moleculă țintă 13 specifică (US 5472841). Această țintă ar putea fi un produs esențial pentru androfertilitate sau un produs care distruge androfertilitatea. Folosind această metodă ar putea fi selectat 15 un aptamer, pentru molecula țintă Ms45 sau avidină, de exemplu, care ar lega și inhiba expresia țintei. Secvența nucleotidică care codifică aptamerul, ar fi parte a vectorilor de 17 expresie, construiți astfel încât o regiune de reglare preferată a țesutului masculin să orienteze producerea aptamerului. 19

Sterilitatea poate, de asemenea să fie indusă prin întreruperea unei gene importante în androfertilitate, așa cum ar fi gena Ms45 sau gena Ms2 (Mark, G.M. et al., Nature, voi. 21 363, pp. 715...717, (1993)). Metode de întrerupere a genei sunt bine cunoscute în domeniu și includ, dar nu se limitează, la inserția elementului transpozabil și inducerea mutației. 23

6. Restaurarea androfertilității în hibridul F1

Metodele descrise mai sus pot fi folosite pentru a produce plante de porumb trans- 25 genice androsterile, pentru producerea hibrizilor F1 pe scară mare, prin încrucișări directe între linii ameliorate. Dacă celulele ou ale plantelor transgenice androsterile nu conțin toate 27 gena endogenă care distruge funcția tapetată, atunci o proporție de hibrizi F1 vor avea un fenotip androfertil. Pe de altă parte, hibrizii F1 vor avea un fenotip androsteril, dacă gena 29 endogenă este prezentă în toate celulele ou ale plantelor transgenice androsterile, deoarece sterilitatea indusă prin gena exogenă va fi dominantă. Astfel, este de dorit să se folosească 31 un sistem de restaurare a androfertilității, pentru a asigura producerea de hibrizi F1 androfertili. Un astfel de sistem de restaurare a fertilității are valoare specială când produsul recol- 33 tat este sămânța sau când speciile cultivate sunt autogame.

De asemenea, un astfel de sistem de restaurare a fertilității are valoare specială când 35 regiunea de reglare preferată a țesutului masculin este legată operațional la un promotor inductiv, așa cum ar fi în WO 89/10396 (Marianai et al., Plants with Modified Stamen Cells) 37 și promotorul inductiv este sensibil la controalele externe. Această regiune de reglare preferată a țesutului masculin legată constă dintr-o regiune de reglare preferată a țesutului mas- 39 culin, un promotor inductiv și o genă exogenă.

Un mod de restaurare a androfertilității va fi prin încrucișarea plantelor transgenice 41 androsterile cu plante transgenice androfertile care conțin o genă de restaurare a fertilității sub controlul unei regiuni de reglare preferată a țesutului masculin. De exemplu, Fabijanski 43 în Antisense Gene Systems of Pollination Control for Hybrid Seed Production, cererea de brevet US 08/288.734, a încrucișat plante androfertile, care exprimă un inhibitor de bamază, 45 desemnat “barstar, cu plante androsterile care exprimă bamaza. Hartley, în J. Mol. Biol., voi. 202, pp. 913, (1988), descrie secvența nucleotidică a barstar-ului. —47

RO 119957 Β1

O altă abordare este de a încrucișa plante androsterile, care conțin o distrugere într-o genă esențială pentru androfertilitate, cu plante transgenice androfertile conținând regiunea de reglare preferată a țesutului masculin legată operațional la o copie nedistrusă a genei fertilității, așa cum ar fi gena Ms45 sau gena Ms2. Secvența întreagă a genei Ms45 este conținută în brevetul US 5478369 și Ms2 în Mark, G. M. et al., Nature, voi. 363, pp.

715...717, (1993).

în mod alternativ, restaurarea androfertilității poate fi realizată prin expresia unităților nucleotidice complementare, cum ar fi ribozimele sau aptamerii, în plante androfertile, pentru a neutraliza efectele toxinei în plante androsterile. Astfel, androfertilitatea poate fi restaurată în hibrizii F1, prin producerea unei plante transgenice androfertile care sintetizează o anumită specie a moleculei ARN sau a polipeptidei, pentru a contracara efectele genei exogene particulare exprimată în plantele transgenice androsterile.

într-o metodă alternativă pentru restaurarea androfertilității, plantele transgenice androsterile conțin un vector de expresie, având o regiune de reglare preferată a țesutului masculin, o regiune de reglare procariotă (de la un sistem de reglare procariot) și o genă exogenă care este capabilă să distrugă funcția tapetală. Plante transgenice androfertile sunt produse care exprimă o peptidă procariotă sub controlul unei regiuni de reglare preferată a țesutului masculin. în hibrizii F1, rezultați de la încrucișarea plantelor androsterile și androfertile, peptidă procariotă se leagă la secvența de reglare procariotă și reprimă expresia genei exogene, care este capabilă să distrugă androfertilitatea. Un avantaj al acestei metode de restaurare a fertilității este că o formă a plantei transgenice androfertile poate fi folosită pentru a asigura fertilitate FI, indiferent de identitatea genei exogene care se folosește pentru a distruge funcția tapetală, în planta transgenică androsterilă.

De exemplu, sistemul gena LexA/operator LexA se poate folosi pentru a regla expresia genei conform prezentei invenții. Vezi brevet US 4833080 și Wang et al., Mol. Cell Biol., voi. 13, pp. 1805, (1993). Mai exact, vectorul de expresie al plantei androsterile va conține secvența operator LexA, în timp ce vectorul de expresie al plantei androfertile conține secvențe care codifică represorul LexA. în hibridul F1, represorul LexA se va lega la secvența operator LexA și va inhiba transcripția genei exogene care codifică un produs capabil de a distruge androfertilitatea. Acestea includ, dar nu se limitează, la avidină, metilază DAM, toxina difteriei, RNază T, bamază, rolB și chalcon sintaza A.

Moleculele ADN operator LexA pot fi obținute, de exemplu, prin sinteza fragmentelor ADN care conțin secvența operator LexA bine cunoscută. Vezi, de exemplu, brevet US 4833080 și Garriga et al., Mol. Gen. Genei, voi. 236, pp. 125, (1992). Gena LexA poate fi obținută prin sinteza unei molecule ADN care codifică represorul LexA. Tehnicile pentru sinteza genei s-au discutat mai sus și secvențele genei LexA sunt descrise, de exemplu, ae către Garriga et al., Mol. Gen. Genet., voi. 236, pp. 125, (1992). în mod alternativ, molecule ADN care codifică represorul LexA, pot fi obținute de la plasmidul pRB500, American Type Culture Collection, numărul de acces fiind 67758. Cei cu pregătire de specialitate în domeniu pot imagina rapid alte strategii de restaurare a androfertilității, folosind sisteme de reglare procariotă, așa cum ar fi sistemul represor /ac/operon lac sau sistemul represor frp/operon trp.

7. Identificarea părților esențiale ale regiunii de reglare

Identificarea părților esențiale ale unei regiuni de reglare poate fi realizată prin deleția, adăugarea și/sau substituirea unei regiuni de reglare prin metode bine cunoscute unui specialist în domeniu. Astfel de variante pot fi obținute, de exemplu, prin mutageneză dirijată prin oligonucleotide, mutageneză prin analiza linkerului și mutageneză folosind reacția polimerazică în lanț (DirectedMutagenesis, A Practicai Approach, IRL Press; (1991)).

RO 119957 Β1

O serie de deleții 5' ale unei regiuni de reglare pot fi construite folosind situsuri de 1 restricție existente. Fragmentele promotor rezultate pot fi testate pentru activitate, folosind un vector de expresie, așa cum s-a discutat anterior. Rafinarea și conturarea ulterioară se 3 pot obține, făcând schimbări mai mici, de preferință de aproximativ 50 sau 30 nucleotide, mai preferabil de aproximativ 20 sau 10 nucleotide, și cel mai preferabil de aproximativ 5 sau 1 5 nucleotidă, la fragmentul de restricție cel mai mic care conferă încă expresie proprie pe constructul raportor (Directed Mutagenesis, A Practicai Approach., IRL Press, (1991)). 7

Acestea pot fi introduse în vectorul de expresie, folosind situsuri de restricție naturale sau introduse. O serie de deleții 3' pot fi generate, de asemenea, așa cum s-a discutat mai sus, 9 sau prin PCR sau prin metode bine cunoscute unui specialist în domeniu (Directed Mutagenesis, A Practicai Approach, IRL Press, (1991)). Rafinarea și conturarea ulterioară 11 pot fi obținute făcând schimbări mai mici, de preferință de aproximativ 50 sau 30 nucleotide, mai preferabil de aproximativ 20 sau 10 nucleotide, și cel mai preferabil de aproximativ 5 sau 13 nucleotidă, la fragmentul de restricție cel mai mic care conferă încă expresie proprie pe constructul raportor (Directed Mutagenesis, A Practicai Approach, IRL Press; (1991)). 15

Din acest motiv, aceste deleții 5' și 3' vor contura regiunea minimală esențială pentru simularea țesutului propriu și expresia temporală a regiunii de reglare mai lungă. în general, 17 secvențele care codifică pentru această regiune minimală a regiunii de reglare preferată a țesutului masculin, vor avea identitate de secvență cu aceasta, de preferință, de aproximativ 19 70,75 sau 80%, mai preferabil, de aproximativ 85 sau 90%, și mult mai preferabil, de aproximativ 95 sau 99%. 21

Ceea ce urmează este prezentat pentru a ilustra pe această cale și nu se intenționează limitarea scopului invenției. 23

Exemplul 1. Clonarea genomică și secvențierea promotorului Ms45.

Marcarea Ac și identificarea ADNc Ms45 și analiza Northern sunt descrise în brevetul 25 US 5478369.

Un ADNc parțial al Ms45 se folosește pentru a cerceta o bancă genomică de porumb 27

B73. Această bancă s-a făcut prin clonarea SAU3A1 parțial într-un vector de donare genomic digerat BAMHI (Lambda Dash II, Stratagene, La Jolla, Ca). S-au studiat aproxi- 29 mativ 1x10⁶ plăci, folosind ca gazdă o tulpină de E. coli corespunzătoare ADN-ului genomic (ER1647, New England Biolabs, MA). S-a purificat clona AC4.1, până la omogenitate, după 31 trei cicluri de analiză. Harta de restricție a AC4.1 a arătat că clona ar fi de aproximativ 13 kb în lungime și a conținut două situsuri interne BAMHI (fig. 1). Unul dintre aceste situsuri s-a 33 găsit, de asemenea în ADNc parțial Ms45. S-au subclonat două fragmente BAMHI la un vector de donare (Bluescrispt SK+, Stratagene, La Jolla, CA). Capătul 5' al clonei a fost de 35 aproximativ 3,5 kb în lungime și a corespuns cu secvența în amonte (5') a situsului intern BAMHI. Capătul 3' al clonei a fost de 2,5 kb și a conținut secvența Ms45 în avalul situsului 37 intern BAMHI. Simultan, s-a izolat un ADNc Ms45, probabil de lungime întreagă și s-a secvențial Prin comparare cu secvența capătului 5' al clonei și ADNc Ms45, s-a identificat posi- 39 bilul situs de start translațional (fig. 1).

Secvențierea regiunii promotor Ms45 s-a realizat folosind metoda terminării catenei 41 dideoxi a lui Sânger, F. et al., DNA Sequencing with Chain Terminating Inhibitors, Proc.

Nat'l. Acad. Sci., voi. 74, pp. 5463...5467, (1977). Clona genomică pac4.1-5‘ (fig. 1) s-a sec- 43 vențiat folosind oligo universal și altele care sunt specifice secvenței, folosind tehnici bine cunoscute în domeniu. 45

Regiunea de reglare preferată a țesutului masculin a avut un situs NCOI introdus la

- codonul de start și s-a donat ca un fragment NCOI într-un vector de expresie Luci fără 47

RO 119957 Β1 promotor. Acest nou vector raportor s-a desemnat ca plasmid PHP6045 (fig. 2) ATCC Nr:

97828 (depus în 12 dec. 1996; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr.,

Rockville, MD 20852).

Exemplul 2. Analiza extensieiprimerului.

S-a izolat ARN total de la mătasea de porumb care conține antere în dezvoltare, începând cu stadiul cvartet până la uninucleat timpuriu. ARN-ul total s-a precipitat cu etanol și MgCI₂. S-a izolat 1 mg ARN total și ARNm Poly A+ s-a purificat prin folosirea celulozei oligo-dT. De asemenea, s-a izolat ARN poli A+ direct din frunze de la plăntuțe de porumb în vârstă de 6 zile și antere de porumb, folosind protocoale cunoscute de specialiștii în domeniu.

O scară de secvențiere s-a preparat folosind o oligonucleotidă Ms45 simplu împletită și încorporarea 35S-dATP, într-un procedeu de secvențiere standard, folosind protocoale bine cunoscute unui specialist în domeniu.

Extensia primerului s-a făcut conform metodei de mai jos.

I. Capătul 5' - care marchează primerul oligonucleotidei sintetice.

Amestec: 5 pmol primer N11916 (PHL11916) în 1,0 pl, pl (50 pCi) gama 32P-ATP (>5000 Ci/mmol),

0,7 μΙ 10X tampon kinază,

0,7 μΙ T4 polinucleotid kinază, incubat la 37°C, 45 min.

Diluat cu 20 μΙ TE și încălzit la 65°C, pentru a inactiva enzima.

10X tampon kinază

0,5 M Tris-HCL, pH=7,6...8,0 mM spermidină

100 mM MgCI₂

100 mM DTT

0,1 mg/ml gelatină sau BSA

II. Primer normalizat și ARN pentru a face 1 ml

0,5 ml de 1 M

0,05 ml de 0,1 M

0,1 ml de 1 M

0,5 ml de 0,5 M μΙ de 2 mg/ml

0,1 ml apă

S-au normalizat primeri kinază la ARNm de la mătasea de porumb, din frunze de la plăntuțe de porumb în vârstă de 6 zile, antere de porumb și frunze de porumb în vârstă de 6 zile. Au fost amestecate pe gheață 2 μΙ ARNm, 1 μΙ oligo kinază. 2 μΙ 5X tampon normalizat (1,25 M KC1,10 mM Tris, pH=7,9...8,15) și 1 μΙ 30 mM vanadil. Volumul total s-a adus până la 10 μΙ cu 10 mM Tris, pH=8,15. Acest amestec s-a încălzit până la 65°C și apoi s-a răcit până la 55°C, timp de 4 h perioadă, pe blocul de încălzire cu termociclu.

III. Extensia primerului

La fiecare eprubetă s-au adăugat 23 μΙ amestec extensie primer (vezi soluția de mai jos) și 0,4 μΙ reverstranscriptază (SuperScript, BRL, MD). Acesta s-a amestecat încet prin pipetare deasupra și jos, s-a plasat imediat la 48°C și s-a incubat timp de 45 min. Amestecul de extensie primer constă din 10 mM MgCI₂, 5 mM DTT, 0,33 mM din fiecare, dATP, dCTP, dGTP, dTTP și apă DEPC.

S-au adăugat 300 μΙ etanol și s-au precipitat la -20°C prin congelare peste noapte, apoi s-au peletat 30 min într-o microfugă. Peletele s-au uscat într-un Speed Vac și s-au dizolvat în 6 μΙ 0,1 NaOH/1 mM EDTA. Conținuturile eprubetelor s-au amestecat prin pipetare și s-au agitat, pentru a se asigura că peletele s-au dizolvat. Acestea s-au lăsat la tempe ratura camerei 2,5 h și s-au adăugat 6 μΙ soluție colorată de secvențiere (soluție Stop de la trusa de secvențiere USB) și soluția s-a denaturat la aproximativ 95’C. O jumătate din probă s-a plasat pe un gel de secvențiere din 6% poliacrilamidă denaturată cu tampon de stivuire

RO 119957 Β1 și a migrat la 55 V, timp de 2 h. Gelul s-a uscat într-un uscător de gel și s-a expus la un film 1

Kodak X-AR. După o expunere de trei zile, s-a observat un produs de transcripție, în reacția de extensie a primerului ARNm din mătasea de porumb, care a corespuns la o deoxitimidină 3 localizată la 42 nucleotide în amontele codonului de start (fig. 3). Această poziție a fost desemnată ca +1. Un start minor al transcripției s-a identificat de asemenea la -3. 5

Exemplul 3. Determinarea etapei și specificității țesutului regiunii de reglare Ms45 preferată a țesutului masculin. 7

Regiunea de reglare preferată a țesutului masculin de lungime întreagă (SEQ ID

NR:1) a fost fuzionată la gena raportor luciferază de la licurici, Photinus pyralis, (DeWit, T.R. 9 et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, voi. 82, pp. 7870...7873, (1985)) cu regiunea Pinll-3' netranslată de la cartof (An, G. et al., Funcțional Analysis of the 3' Control Region of the 11 Potato Wound-lnducible Proteinase Inhibitorii Gene, Plant Celf, voi 1, pp. 115...122, (1989)).

Antere de porumb, în etape diferite de dezvoltare, s-au plasat pe mediu de cultură pentru 13 mătase de porumb (Pareddy et al., Theoret. Appl. Genet., voi. 77, pp. 521...526, (1989)), s-au solidificat cu agar(Phytagar®, Sigma, St. Louis). Una din cele trei antere, de la fiecare 15 floretă, a fost aranjată și anterele rămase s-au colectat în etape și au fost etalate pentru bombardament cu microproiectile, tipic opt antere per placă. Anterele s-au încărcat la 1100 17

p.s.i. cu particule de tungsten de 1,8 μ, pe care a precipitat ADN-ul constructului raportor luciferază-regiunea de reglare preferată a țesutului masculin Ms45. Toate anterele de pe o 19 placă dată au fost în aceeași etapă de dezvoltare: premeioză, meioză I, meioză II, cvartet, microspor eliberat, microspor uninucleat timpuriu sau microspor uninucleat mediu. 21

Pentru fiecare etapă s-au constituit trei repetiții. Anterele s-au incubat peste noapte la 26°C, timp de 18 h. Un extract brut s-a preparat cu anterele de pe fiecare placă și s-a ana- 23 lizat pentru activitatea luciferazei și a conținutului de proteină. Activitatea luciferazei normalizată la concentrația de proteină este prezentată grafic în fig. 4, ca o funcție a etapei de dez- 25 voltare. Activitatea principală a fost la etapele de dezvoltare cvartet și eliberare de microspori, cu activitate minoră în meioză I și II și activitate abia detectabilă în etapa uninucleată 27 timpurie. în contextul celor de mai sus, nu s-a detectat activitate semnificativă în anterele premeiotice sau uninucleate medii. 29 în plus, călușul embriogen cultivat pe mediu MS conținând 2,0 ug/ml 2,4-D, s-a bombardat în același mod, excepție la 650 p.s.i., cu particule acoperite cu un raportor luciferază 31 fuzionat fie la regiunea de reglare preferată a țesutului masculin Ms45, fie la un promotor ubiquitină de porumb (US 5510474) și un raportor uidA (GUS) fuzionat la un promotor ubi- 33 quitină de porumb. Luciferază s-a normalizat la β-glucuronidază. Așa cum se arată în fig. 5, regiunea de reglare preferată a țesutului masculin a fost incapabilă de a conduce la expresia 35 tranzitorie în calus embriogen și muguri, chiar dacă promotorul ubiquitină a fost exprimat.

în mod similar, semințe de porumb îmbibate și germinate în apă distilată, timp de două zile 37 și plasate pe filtre umede s-au supus la bombardament cu microproiectile și hipocotilele lor s-au studiat pentru luciferază și β-glucuronidază. Regiunea (promotor) de reglare ubiquitină 39 a fost activă, dar regiunea de reglare preferată a țesutului masculin Ms45 nu a fost activă.

Acest rezultat este paralel cu rezultatele analizei de hibridizare ARN. Antere de 41 porumb, în etape diferite de dezvoltare, au fost colectate și s-au tratat, după cum urmează.

Una din cele trei antere, de la fiecare floretă, s-a fixat în (3:1 etanol.acid acetic glacial) într- 43 un godeu a unei plăci de microtitrare și două s-au congelat în azot lichid într-un godeu, la poziția corespunzătoare a unei alte plăci de microtitrare. Anterele fixate au fost studiate pri- 45 vind stadiul de dezvoltare; apoi, anterele corespunzătoare congelate au fost colectate în etape și din 20 de antere a fost izolată ARN polyA+ (trusa RNA Micro-Quick Prep, 47

RO 119957 Β1

Pharmacia Uppsila Suedia). Volume identice de ARN colectat din anterele fiecărei etape s-au supus electroforezei pe 1,2% agaroză în tampon MOPS + formaldehidă. Probe de ARN s-au transferat prin colorare pe o membrană de nailon, s-au fixat prin reticulare UV (Stratalinker, Stratagene Inc., La Jolla) și s-au hibridizat la un fragment de probă marcat cu P32, care constă în totalitate din regiunea care codifică ADNc Ms45 și regiunea 3'. Rezultatele arătate în fig. 4 confirmă transcriptul Ms45 stabil, detectabil în cvartet prin stadii uninucleate timpurii și posibil cât de timpurii, dar nu mai timpurii decât telofaza II în meioză. La plante nu se întâlnesc nici nivelurile transcripților care rezultă atât din activitatea regiunii de reglare preferată a țesutului masculin Ms45, în timpul meiozei, insuficient acumulate pentru a fi detectate prin hibridizare ARN, nici activitatea regiunii de reglare preferată a țesutului masculin din etapa meiotică observată în teste tranzitorii.

Astfel, regiunea de reglare preferată a țesutului masculin Ms45 (SEQ ID NR:1) s-a caracterizat ca având expresia preferată țesutului masculin, cel puțin de la etapa cvartet a dezvoltării anterei până la realizarea cvartetului, cu un nivel de expresie posibil mai scăzut în etapele meiotică și uninucleată timpurie.

Exemplul 4. Analiza cutiei TATA.

în fragmentul ADN de 1388 bp care codifică regiunea de reglare preferată a țesutului masculin Ms45, startul principal al transcripției a fost identificat la +1, un start minor al transcripției a fost identificat la -3 referitor la startul principal al transcripției și o cutie TATA posibilă a fost identificată la -33 (CATTAAA). S-a notat că secvența TAAAGAT la -30 ar putea fi un candidat pentru actuala cutie TATA. Acest fragment de 1388 bp s-a legat operațional la o casetă raportor al genei care cuprinde regiunea care codifică luciferaza de la licurici (Pareddy et al., Theoret. Appl, Genet., voi. 77, pp. 521...526, (1989)), urmată de regiunea 3'-netranslată de la gena inhibitor proteinază ll de la cartof. (An, G. et al., Funcțional Analysis ofthe 3' ControlRegion ofthe Potato Wound-lnducible Proteinase InhibitorII Gene, Plani Cell, vol.1, pp. 115...122, (1989)).

Un mod bine cunoscut în domeniu, pentru analiza cutiilor TATA, este prin mutație, în altă derivație au fost schimbate de la una până la șase nucleotide ale cutiei TATA probabile, într-un produs derivat dat. Un situs BGLII a fost introdus la -38, modificând cutia TATA probabilă de la CATTAAA până la TATTAAA, care este o matrice de închidere la secvența TATATAA a cutiei TATA canonică.

J

Se va aprecia de către un specialist în domeniu că anumite substituții în cutia TATA pot modifica nivelul expresiei promotorului fără influențarea specificității țesutului. Așa cum se arată în fig. 1, schimbarea în cutia TATA, asociată cu situsul BGIII introdus la -38, a crescut dramatic nivelurile de expresie tranzitorii în antere și sugerează, suplimentar că secvența la -33 este cutia TATA autentică. Introducerea unui situs BGLII la -40, -43, -51 sau -53 nu a crescut activitatea promotorului (date nearătate), numai dacă creșterea observată în introducerea situsului -38 BGLII nu s-a referit la situsul BGLII per se.

Alte modificări ale cutiei TATA probabile au fost introduse pentru testul suplimentar privind funcționalitatea sa. Modificarea secvenței cutiei TATA probabile, de la CATTAAA până la GATTAAA, CATGGAA sau GGGCCCA, a redus total nivelul expresiei tranzitorii în antere, sugerând suplimentar importanța acestei secvențe ca o cutie TATA. în mod surprinzător, nici una din aceste mutații nu a desființat activitatea tranzitorie; cu toate acestea, au existat rapoarte ale activității tranzitorii în alte sisteme, în absența unei secvențe asemenea TATA și la fel a promotorilor fără TATA (Guan, L. și J. G. Scandalios, Plant J., voi. 3, pp.

527...636; (1993); Close, P. S., Cloning and Molecular Characterization of Two Nuclear Genes forZea Mays Mithochondrial Chaperonin 60; (Dissertation); lowa State University, Ames, lowarpp. 92, 128, (1993)).

Claims (32)

1. Revendicări 1

   1. Moleculă izolată de acid nucleic, cuprinzând o regiune de reglare Ms45, ce se3 exprimă preferențial, într-un țesut masculin, care conduce un nivel mai ridicat al transcripției, în țesutul masculin, decât în altele sau în toate celelalte țesuturi ale plantei, și cuprinde:5 (a) o secvență de nucleotide a SEQ ID NO:1 sau 2;

   (b) o secvență de nucleotide având identitate de cel puțin 70% cu numita secvență7 a SEQ ID NO:1 sau 2, care conduce un nivel mai ridicat al transcripției, în țesutul masculin, decât în altele sau în toate celelalte țesuturi ale plantei;9 (c) o secvență de nucleotide care hibridizează cu numita secvență a SEQ ID NO:1 sau 2, în condiții de mare rigurozitate, reprezentate de o spălare profundă cu formamidă 11 50% cu soluție Denhardt 5x, SDS 0,5% și SSPE 1x, la 42’C, și conduce un nivel mai ridicat al transcripției, în țesutul masculin, decât în altele sau în toate celelalte țesuturi ale plantei; 13 (d) un fragment al numitei secvențe a SEQ ID NO:1 sau 2 care conduce un nivel mai ridicat al transcripției, în țesuturile masculine ale plantei, decât în altele sau în toate celelalte 15 țesuturi ale plantei sau (e) o regiune de reglare care se exprimă preferențial, într-un țesut masculin, din inte- 17 riorul numitei secvențe a SEQ ID NO:1 sau 2 care conduce un nivel mai ridicat al transcripției, în țesutul masculin, decât în altele sau în toate celelalte țesuturi ale plantei, legat la 19 un miez promotor.
2. 2. Acid nucleic izolat, de la revendicarea 1, partea (e), în care promotorul miez este 21

   CAMV 35S sau promotorul 19S, promotorul miez IN2, promotorul ubichitinei sau promotorul virusului mozaicului la iarba neagră. 23
3. 3. Vector de expresie, recombinant, cuprinzând acidul nucleic izolat, de la revendi- carea 1 sau 2, legat operațional la o secvență nucleotidică care codifică o genă exogenă, 25 astfel încât numita genă exogenă este exprimată la un nivel mai ridicat, în țesuturile masculine ale plantei, decât în altele sau în toate celelalte țesuturi. 27
4. 4. Vector de la revendicarea 3, în care numita genă exogenă este Ms45.
5. 5. Metodă de producere a unei plante transformate care exprimă o secvență nucleoti-29 dică exogenă, la un nivel mai ridicat, în țesuturile masculine, decât în altele sau în toate celelalte țesuturi ale numitei plante, cuprinzând introducerea în plantă a numitei secvențe nucleo- 31 tidice, legată operațional la regiunea de reglare de la revendicarea 1 sau 2, care se exprimă, de preferință, într-un țesut masculin.33
6. 6. Metodă conform revendicării 5, în care faza de introducere este realizată prin bombardare cu microproiectile.35
7. 7. Metodă conform revendicării 5, în care, pentru faza de introducere, este folosit

   Agrobacterium.37
8. 8. Metodă conform revendicării 7, în care Agrobacterium cuprinde o plasmidă Ti.
9. 9. Metodă conform revendicării 5, în care numita regiune de reglare se exprimă la39 un nivel mai ridicat, în țesuturi selectate dintre polen, stratul tapet, anteră, panicul, celule mamă polinice și microspori, decât în alte țesuturi sau în toate celelalte țesuturi ale plantei. 41
10. 10. Metodă de la revendicarea 5, în care numita regiune de reglare preferențială a țesutului masculin, de la revendicarea 1 sau 2, este prezentă în mai mult decât o copie.43
11. 11. Metodă de mediere a fertilității într-o plantă, cuprinzând producerea unei plante transformate, în care regiunea de reglare preferențială a țesutului masculin, de la reven- 45 dicarea 1 sau 2, legată operațional la o genă exogenă, exprimă numita secvență nucleotidică exogenă, astfeî încât este modificată fertilitatea. 47

    RO 119957 Β1
12. 12. Metodă conform revendicării 5, în care numita secvență nucleotidică exogenă cuprinde o secvență de ADN care codifică un sistem de reglare procariot.
13. 13. Metodă conform revendicării 5, în care numita secvență nucleotidică exogenă codifică o genă citotoxică.
14. 14. Metodă conform revendicării 5, în care numita secvență nucleotidică exogenă codifică avidina.
15. 15. Metodă conform revendicării 5, în care numita secvență nucleotidică exogenă codifică DAM metilaza.
16. 16. Metodă conform revendicării 5, în care numita secvență nucleotidică exogenă codifică numita regiune de reglare preferențială a țesutului masculin, legată operațional la o unitate nucleotidică complementară.
17. 17. Metodă conform revendicării 16, în care unitatea nucleotidică complementară este selectată dintre ARN calază antisens, ARN barnază antisens, ARN chalcon sintază antisens și ARN Ms45 antisens.
18. 18. Metodă conform revendicării 16, în care unitatea nucleotidică complementară este selectată dintre ribozime și secvențe de orientare externă.
19. 19. Metodă conform revendicării 11, în care secvența nucleotidică exogenă codifică un produs selectat dintre auxine, rolB și toxina difteriei.
20. 20. Metodă conform revendicării 11, în care secvența nucleotidică exogenă este o genă pentru androsterilitate.
21. 21. Metodă conform revendicării 20, în care numita genă pentru androsterilitate este Ms45.
22. 22. Metodă conform revendicării 20, în care planta este o monocotiledonată.
23. 23. Metodă conform revendicării 20, în care planta este o dicotiledonată.
24. 24. Metoda de la revendicarea 5, care, pentru polenizarea încrucișată, cuprinde mai departe plantarea alăturată, a unei plante androfertile și a unei plante androsterile, determinând producerea polenizării încrucișate și recoltarea seminței rezultate.
25. 25. Metodă conform revendicării 24, în care numita plantă este porumbul.
26. 26. Plantă transformată exprimând o secvență nucleotidică exogenă, la un nivel mai ridicat, în țesuturile masculine, decât în altele sau în toate celelalte țesuturi, cuprinzând o secvență nucleotidică exogenă, legată operațional la o regiune de reglare preferențială a țesutului masculin, de la revendicarea 1.
27. 27. Plantă transformată, de la revendicarea 20, în care numita regiune de reglare, de la revendicarea 1 sau 2, și numita secvență nucleotidică exogenă, legate într-o manieră operațională, sunt prezente în mai mult decât o copie.
28. 28. Plantă transformată, de la revendicarea 26, care este o monocotiledonată sau o dicotiledonată.
29. 29. Plantă transformată, de la revendicarea 26 sau 28, care este selectată dintre porumb, floarea soarelui, soia, grâu, răpită, orez și sorg.
30. 30. Țesut transformat al plantei transformate de la revendicarea 29.
31. 31. Țesut transformat, de la revendicarea 30, care este selectat dintre polen, spice, ovule, antere, mătase de porumb, stamine, pistile și celule ale plantei.
32. 32. Celule de plantă transformate ale plantei transformate de la revendicarea 26.