BRPI9810293B1 - processo para produção de uma planta transformada e processo de mediação de fertilidade em uma planta - Google Patents

Abstract

"região reguladora preferida de tecido masculino e processo de utilização da mesma". a presente invenção refere-se a uma seqüência nucléica isolada que codifica a região reguladora preferida de tecido masculino ms45. em um aspecto, esta invenção refere-se ao uso desta região reguladora preferida de tecido masculino na mediação de fertilidade. um exemplo de tal uso é a produção de semente híbrida, tal como em um sistema de esterilidade masculina. a região reguladora preferida de tecido masculino preferida pode ser ligada operativamente aos genes exógenos, tais como aqueles que codificam citotoxinas, unidades nucleotídicas complementares e moléculas inibidoras. esta invenção também se refere às células de plantas, tecido de planta e plantas diferenciadas que contêm a região reguladora desta invenção.

Description

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSFORMADA E PROCESSO DE MEDIAÇÃO DE FERTILIDADE EM UMA PLANTA

Campo da Invenção A presente invenção está relacionada às seqüências de DNA isoladas que atuam como regiões reguladoras nas células eucarióticas. Mais especificamente, a presente invenção está relacionada às seqüências de DNA isoladas de milho, que atuam como regiões reguladoras preferidas de tecido masculino e desempenham um papel importante na expressão de genes em tecidos masculinos. A presente invenção também está voltada para um processo que confere a um gene, que pode ou não ser expresso normalmente em tecidos masculinos, a capacidade de ser expresso de uma maneira preferida de tecido masculino.

Fundamentos da Invenção A expressão e a normalização de gene especifico temporal e de tecido são encontradas, entre outros, durante a reprodução sexual em eucariotos. Na gametogênese vegetal, alteráções citológicas e bioquímicas importantes podem ocorrer durante o desenvolvimento do pólen, quando a divisão mitótica assimétrica do micrósporo haplóide resulta na formação de duas células; cada uma com trajetórias de desenvolvimento diferentes. A célula vegetativa sustenta o desenvolvimento do pólen, enquanto a célula produtiva sofre mitose’ e desenvolve-se em células de esperma. RNAs mensageiros específicos para ambas as conexões dentro do pólen foram identificados em plantas como milho, tomate, tabaco, arroz e amor-perfeito; e mensagens especificas para o pólen ou para um ou mais outros tipos de células dentro da antera, tais como tapete, epiderme e estomio também foram identificados. A expressão do gene de pólen durante a diferenciação envolve uma estimativa de 24.000 genes (Willing e outros, "An Analysis of the Quantity and Diversity of mRNA1s From Pollen and Shoots of Zea mays"; Theor. Appl. Genet.; Volume 75; páginas 751-753; (1988)), contudo apenas 10% dos clones de uma coletânea de cDNA são especificamente masculinos (Stinson e outros, "Genes Expressed in the Male Gametophyte and Their Isolation"; Plant Phvsiol.; Volume 83, páginas 442-447; (1987)) e a porcentagem de genes expressos no pólen que são específicos para pólen está entre 5% e 80% (Willing e outros, "An Analysis of the Quantity and Diversity of mRNA's From Pollen and Shoots of Zea mays"; Theor. Appl, Genet.; Volume 75; páginas 751-753; (1988)). Este processo completo de microesporogênese envolve a produção seqüencial de muitos produtos de gene.

Atualmente, genes especificamente masculinos foram clonados de plantas: dois destes, o gene Ms45 do milho (Patente U.S. número 5.478.369) e o gene Ms2 de Arabidopse (Mark, G.M. e outros, Nature: Volume 363; páginas 715-717; (1993)) mostraram ser necessários ao desenvolvimento do pólen. Outros exemplos de promotores especificamente masculinos em plantas incluem ZM13, PG e SGB6. O promotor Zml3 é revelado na Patente U.S. número 5.086.169. Ele consiste em 1.315 pares de base e é de um gene específico de pólen descrito por Hanson e outros, Plant Cell; Volume 1; páginas 173-179 ; (1989) . Este gene hibridiza em mRNA encontrado apenas no pólen.

Outro promotor não-específico foi isolado e descrito a montante do gene de poligalacturonase específico de pólen (PG) na Patente U.S. número 5.412.085. Esta região promotora engloba 2.687 pares de base e é expressa predominantemente no pólen e pendão emergente, porém não no pendão pré-emergente. A Patente U.S. número 5.545.546, também de Allen, descreve outro promotor específico de pólen, a partir do gene de poligalacturonase do milho. Ele é expresso apenas no pólen e no pendão emergente. A patente U.S. número 5.470.359 descreve uma região reguladora a partir do gene SGB6 do milho que confere especificidade de tapete. O tecido de expressão, o tapete, é uma camada de células que circunda as células microesporogêneas na antera e provê nutrientes para a mesma.

Nove clones de cDNA específicos de antera e genômicos do tabaco são descritos na Patente U.S. número 5.477.022. Os clones de cDNA eram específicos para antera por análise Northern, embora diferissem nos perfis de desenvolvimento. O clone Ant32 é específico para tapetes. A patente Européia número 0.420.819 Al descreve o processo de produção de plantas estéreis masculinas com o gene wunl. O PCT WO 90/08825 descreve cDNAs específicos de antera TA13, TA2 6 e TA2 9 e seu uso em um sistema de esterilidade masculina. O PCT WO 90/08825 explica os genes da esterilidade masculina pMSlO, pMS14 e pMS18 e seu uso com o gene repórter GUS. A patente U.S. número 5.589.610 detalha um promotor correspondente ao cDNA especifico de antera e cDNA preferido de antera AC444. A utilização de um promotor de planta e um gene exógeno para efetuar uma alteração na constituição genética das plantas é conhecida na técnica (Patentes U.S. números 5.432.068, 5.412.085, 5.545.546, 5.470.359 e 5.478.369). Estas patentes discutem os cassetes de expressão de plantas com um promotor específico de tecido ligado a um gene para efetuar a esterilidade masculina, fertilidade ou de outra forma expressar um gene em um tecido específico. Contudo, estas patentes não ensinam o uso desta região reguladora preferida de tecido masculino ou o uso desta região reguladora preferida de tecido masculino com um gene exógeno como um processo de controlar a esterilidade masculina. A presente invenção é dirigida a uma região reguladora específica de tecido masculino e processos de uso da mesma. A expressão de um gene exógeno de uma maneira preferida de tecido masculino pode mediar a fertilidade masculina e é útil em muitos sistemas, tais como produção de sementes híbridas.

Sumário da Invenção É um objetivo da presente invenção prover um processo para a expressão de genes exógenos de uma maneira preferida de tecido masculino, usando um vetor de expressão que confere a expressão preferida de tecido masculino a um gene exógeno. Este processo pode ser usado para restaurar (como em um sistema de esterilidade masculina) ou de outra forma impactar a fertilidade, como na produção de sementes híbridas. É um outro objetivo desta invenção prover uma região reguladora de DNA que confere expressão de gene preferida ao tecido masculino. É também um objetivo desta invenção prover um região reguladora preferida de tecido masculino ou aquela com identidade de seqüência com a mesma, preferivelmente de cerca de 70%, 75% ou 80%, mais preferivelmente de cerca de 85% ou 90% e, mais preferivelmente, de cerca de 95% ou 99%. É um objetivo desta invenção prover uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica as regiões reguladoras preferidas de tecido masculino Ms45. É um objetivo desta invenção prover uma seqüência de ácido nucléico isolado que codifica uma região reguladora preferida de tecido masculino Ms45, a partir de Zea mays que compreende uma seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 1 ou aquelas com identidade com a mesma. É também um objetivo desta invenção prover uma seqüência de ácido nucléico isolada que codifica uma região reguladora preferida de tecido masculino MS45 a partir de Zea mays, que compreende uma seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 2 ou aquela com identidade de seqüência com a mesma. E um objetivo desta invenção prover um vetor de expressão recombinante que compreende a seqüência de ácido nucléico isolada mostrada na SEQ ID NO: 1, ou aquele com identidade de seqüência com o mesmo, operativamente ligado a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um gene exógeno, tal que a dita seqüência de nucleotídeo é expressa de uma maneira preferida de tecido masculino, de tal modo que ela promove a expressão do gene exógeno. É um objetivo desta invenção prover um gene exógeno em que o dito gene exógeno é Ms4 5. É um objetivo desta invenção prover um processo para produção de uma planta transformada que expressa uma seqüência de nucleotídeo exógeno de uma maneira preferida de tecido masculino que compreende as etapas de introduzir dentro da planta a dita seqüência de nucleotídeo exógeno, operativamente ligada a uma região reguladora preferida de tecido masculino, que compreende uma seqüência de nucleotídeo que é mostrada na SEQ ID NO: 1 ou aquelas com identidade de seqüência com a mesma. O processo em que a dita etapa de introdução pode ser realizada por bombardeamento de microprojéteis pode utilizar Agrobacterium ou um vetor de transferência que compreende um plasmídeo Ti. Também pode haver mais do que uma cópia da seqüência de nucleotídeo exógeno ligada de forma operativa a uma região reguladora preferida de tecido masculino. É um objetivo desta invenção prover um processo em que a região reguladora expressa-se de uma maneira preferida de tecido masculino em tecidos selecionados do grupo que consiste em pólen, tapete, antera, células de origem do pólen e micrósporos. É um objetivo desta invenção prover uma planta transformada que expressa uma seqüência de nucleotídeo exógeno de uma maneira preferida de tecido masculino que possui uma seqüência de nucleotídeo exógeno operativamente ligada a uma região reguladora preferida de tecido masculino mostrada na SEQ ID NO: 1 ou aquelas com identidade de seqüência com a mesma. A dita planta é um monocotiledôneo ou um dicotiledôneo. Qualquer planta capaz de ser transformada pode ser usada incluindo, por exemplo, milho, girassol, soja, trigo, canola, arroz e sorgo. Esta invenção também provê o tecido transformado da planta transformada. Como exemplo, o tecido pode ser pólen, espigas, óvulos, anteras, pendões, estames, pistilos e células vegetais. A planta transformada pode conter mais do que uma cópia da dita seqüência de nucleotídeo exógeno operativamente ligada a uma região reguladora preferida de tecido masculino. É um objetivo desta invenção prover um processo para mediar a fertilidade em uma planta, em que a região reguladora preferida de tecido masculino expressa a dita seqüência de nucleotídeo exógeno, tal que a fertilidade é impactada. Esta seqüência de nucleotídeo exógeno pode ser qualquer seqüência que impacte a fertilidade masculina e pode ser, por exemplo, uma unidade nucleotídica complementar que codifica tais moléculas de sentido contrário, como RNA de sentido contrário de calase, RNA de sentido contrário de barnase e RNA de sentido contrário de sintase calcona, RNA de sentido contrário Ms45 ou ribozimas e seqüências de guia externas, ou então aptâmeros ou nucleotídeos filamentados simples. A seqüência de nucleotídeo exógeno pode também codificar auxinas, rol B, citotoxinas, toxina de difteria, metilase DAM, avidina ou pode ser selecionada de um sistema regulador procariótico. Além disso, esta seqüência de nucleotídeo exógeno é um gene de esterilidade masculina ou o gene estrutural Ms45, e esta planta é um monocotiledôneo ou dicotiledôneo. É um objetivo desta invenção prover um processo para produção de semente híbrida, que compreende o plantio em justaposição de polinização cruzada, de uma planta fértil macho e uma planta não-fértil macho produzidas de acordo com o processo acima, permitindo que a polinização cruzada ocorra e colhendo a semente resultante. As plantas podem ser milho.

Estes e outros objetivos são atingidos, de acordo com uma modalidade da presente invenção, pela provisão de uma molécula de DNA isolado em que a molécula de DNA compreende uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO : 1 .

De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é provido um vetor de expressão que compreende um gene exógeno, em que a expressão do gene exógeno está sob o controle de uma região reguladora preferida de tecido masculino e em que o produto do gene exógeno impacta a fertilidade masculina.

De acordo com outra modalidade da presente invenção, é provido um processo para utilização de tal vetor de expressão para produzir uma planta estéril macho, que compreende a etapa de introdução de um vetor de expressão dentro das células da planta, em que o gene exógeno do vetor de expressão pode ser uma unidade nucleotidica complementar, tal como moléculas de sentido contrário (RNA de sentido contrário de calase, RNA de sentido contrário de barnase e RNA de sentido contrário de sintase de calcona, RNA de sentido contrário de Ms45), ribozimas e sequências guia externas, um aptâmero ou nucleotídeos filamentados simples. A seqüência de nucleotídeo exógena pode também codificar auxinas, rol B, citotoxinas, toxina de difteria, metilase DAM, avidina ou pode ser selecionada de um sistema regulador procariótico.

De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, é provido um processo de utilização de uma região reguladora preferida de tecido masculino para prover uma planta híbrida fértil masculina, que compreende as etapas de : a) produção de uma primeira planta de origem estéril-masculina, compreendendo um vetor de expressão que compreende uma região reguladora preferida de tecido masculino e um primeiro gene exógeno, em que a região reguladora preferida de tecido masculino controla a expressão do primeiro gene exógeno e em que o produto do primeiro gene exógeno rompe a fertilidade masculina; b) produção de uma segunda planta de origem compreendendo um vetor de expressão que compreende um segundo gene exógeno, em que a região reguladora controla a expressão do segundo gene exógeno, de modo que ele pode ser expresso em tecidos masculinos; c) fertilização cruzada da primeira planta de origem com a segunda planta de origem para produzir uma planta híbrida, em que os tecidos masculinos da planta híbrida expressam o segundo gene exógeno, e em que o produto do segundo gene exógeno impede o rompimento da função do pendão pelo produto do primeiro gene exógeno, pelo que se produz uma planta híbrida fértil masculina.

De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, foi provido um processo de utilização de uma região reguladora preferida de tecido masculino para produzir uma planta híbrida fértil masculina, que compreende as etapas de: a) produção de uma primeira planta de origem estéril masculina, em que um primeiro gene envolvido na expressão da fertilidade masculina é rompido; b) produção de uma segunda planta de origem compreendendo um vetor de expressão que compreende uma região reguladora preferida de tecido masculino e um gene exógeno, em que a região reguladora preferida de tecido masculino controla a expressão do gene exógeno, de modo que ela pode ser expressa nos tecidos masculinos e poderia complementar, funcionalmente, a função do gene interrompido em a) ; c) fertilização cruzada da primeira planta de origem com a segunda planta de origem para produzir uma planta híbrida, em que os tecidos masculinos da planta híbrida expressam o gene exógeno, e em que o produto do gene exógeno impede a interrupção da função do pendão, pelo que se produz uma planta híbrida fértil masculina.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 é um diagrama do clone genômico.Ac 4.1 Ms45 e sítios de restrição. A figura 2 é um mapa de plasmídeo de PHP6045. A figura 3 é um auto-radiograma dos produtos de extensão da base, indicando o princípio da transcrição de Ms4 5. As pranchas rotuladas G,A,T,C, correspondem às reações de seqüenciamento com dideoxinucleotídeos ddGTP, ddATP, ddTTP e ddCTP, respectivamente. As pranchas 1-4 correspondem às reações de extensão da base com mRNA a partir de (1) pendões, (2) folhas, (3) anteras e (4) folhas. A figura 4 é um gráfico de barras que ilustra a especificidade de estágio da Região Reguladora Preferida de Tecido Masculino Ms45. A figura 5 ilustra a especificidade do tecido ilustrada pela falta de atividade no tecido não-masculino. A figura 6 mostra um gel de análise Northern de mRNA de antera, hibridizado com o gene de fertilidade masculina Ms45. A figura 7 mostra os resultados de uma análise mutacionai do quadro TATA.

Descrição da Invenção Todas as referências citadas são incorporadas aqui como referência. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui possuem o mesmo significado conforme entendido de forma geral por um versado na técnica à qual esta invenção se relaciona. A menos que de outra forma definido, as técnicas empregadas ou contempladas aqui são metodologias padrão bem conhecidas de um versado na técnica. Os materiais, processos e exemplos são apenas ilustrativos e não limitantes.

Na descrição que se segue, vários termos são amplamente usados. As definições que se seguem são fornecidas para facilitar o entendimento da invenção. 1 - Definições Identidade ou similaridade de sequência, c omo conhecido na técnica, são relações entre duas sequências de polipeptídeo ou duas sequências de polinucleotídeo, conforme determinado por comparação das seqüências . Na técnica, a identidade também significa o grau de correlação da sequência entre dois polipeptídeos ou duas seqüências de polinucleotideo, conforme determinado pela combinação entre dois filamentos de tais seqüências. Tanto a identidade quanto a similaridade podem ser prontamente calculadas (Computational Molecular Biology; Lesk, A.M. ed. ; Oxford University Press, New York; (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects; Smith, D.W. ed.; Academic Press, New York; (1993); Computer Analysis of Secruence Data (Parte I) ; Griffin, A. M. e H.G. Griffin eds.; Humana Press, New Jersey; (1994) ; von Heinje, G., Sepuence Analysis in Molecular Biology; Academic Press; (1987) e Secruence Analysis Primer ,· Gribskov, M. e J. Devereux eds. ; M. Stockton Press, New York; (1991). Conquanto existam vários processos para medir a identidade e similaridade entre dois polinucleotídeos ou duas seqüências de polipeptídeo, ambos os termos são bem conhecidos dos versados na técnica (von Heinje, G. , Secruence Analysis in Molecular Biology; Academic Press; (1987); Secruence Analysis Primer; Gribskov, M. e J. Devereux eds.; M Stockton Press, New York; (1991) ; e Carillo, H. e D. Lipman, SIAM, J. Applied Math.; Volume 48; página 1073; (1988) ) . Os processos geralmente empregados para determinar a identidade ou similaridade entre duas seqüências incluem, porém não estão limitados, àqueles revelados em Carillo, H. , e D. Lipman, SIAM J. Applied Math. ; Volume 48; página 1.073; (1988). Processos preferidos para determinar a identidade são designados para fornecer a maior combinação entre as duas seqüências testadas. Os processos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador. Os processos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e similaridade entre duas seqüências incluem, porém não estão limitados, ao pacote de programa GCG (Devereux, J. e outros, Nucleic Acids Research,· Volume 12(1) ; página 387; (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Atschul, S.F. e outros, J. Molec. Biol.; Volume 215; páginas 403; (1990)).

Tecido Masculino consiste em tecidos feitos de coletâneas de células que estão diretamente envolvidas ou suportam a reprodução dos gametas masculinos, tais como pólen, tapete, antera, pendão, células-mães de pólen e micrósporos. O tapete (tapetum) é o tecido na antera em contato mais próximo com as células-mães de pólen e micrósporos e está, provavelmente, envolvido com a nutrição dos grãos de desenvolvimento do pólen. As células-mães de pólen sofrem duas divisões meióticas que produzem um tétrade de micrósporos haplóides. Os micrósporos sofrem maturação em um grão de pólen. Pólen ou grãos de pólen são gametófitos masculinos maduros que podem ter a capacidade de fertilizar plantas que são compatíveis. A antera é aquela porção do estame na qual o pólen é produzido, sendo que o restante do estame consiste no filamento, do qual a antera pende. O estame é o órgão masculino da flor. A região reguladora preferida de tecido masculino é uma sequência de nucleotídeo que dirige um nível mais alto da transcrição de um gene associado em tecidos masculinos do que em alguns ou todos os outros tecidos de uma planta. Por exemplo, o gene Ms45, descrito aqui, é detectado nas anteras durante os estágios de desenvolvimento de quarteto, liberação de quarteto e uninucleato precoce. Para saber mais detalhes com relação aos estágios de desenvolvimento da antera, vide Chang, M.T. e M.G. Neuffer, "Maize Microsporogenesis"; Genome; Volume 32; páginas 232-244; (1989) . A região reguladora preferida de tecido masculino do gene Ms45 dirige a expressão de um gene ligado operativamente em tecidos masculinos. Os tecidos preferidos de expressão são masculinos, não por exemplo, raiz ou tecido coleóptilo. A expressão predominante está nos tecidos masculinos, tais como, porém não limitados ao pólen, tapete, antera, pendão, células-mães de pólen e micrósporos. Esta expressão preferida de tecido masculino refere-se aos níveis mais altos de expressão em tecidos masculinos, porém não necessariamente excluindo outros tecidos.

Mediar é influenciar de modo positivo ou negativo, ou então influenciar o resultado, tal como com a fertilidade ou qualquer outra característica. A fertilidade masculina é impactada quando a fertilidade anormal é experimentada; isto pode ser fertilidade reduzida ou fertilidade aumentada, ou ainda, fertilidade diferente em termos de tempo ou outras características.

Isolado significa alterado "pela mão do homem" em relação ao seu estado natural; isto é, se isto ocorre na natureza, foi alterado ou removido de seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleotideo ou um polipeptídeo que ocorre naturalmente presente em um organismo vivo em seu estado natural não é "isolado", porém o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é "isolado", como o termo é empregado aqui. Por exemplo, com relação aos polinucleotIdeos, o termo isolado significa que ele está separado do cromossomo e célula no qual ele ocorre naturalmente. Como parte de ou seguindo-se ao isolamento, tais polinucleotídeos podem ser ligados a outros polinucleotideos, tais como DNAs, para mutagênese, para formar proteínas de fusão e para propagação ou expressão em um hospedeiro, por exemplo. Os polinucleotídeos isolados, sozinhos ou ligados a outros polinucleotídeos, tais como vetores, podem ser introduzidos nas células hospedeiras, na cultura ou em organismos integrais. Introduzidos nas células hospedeiras na cultura ou em organismos integrais, tais DNAs ainda seriam isolados, como o termo é usado aqui, porque eles não estariam em sua forma ou ambiente de ocorrência natural. Similarmente, os polinucleotídeos e polipeptideos podem ocorrer em uma composição, tal como formulações de meio, soluções para introdução de polinucleotídeos ou polipeptídeos , por exemplo, dentro das células, composições ou soluções para reações químicas ou enzimáticas, por exemplo, que não são composições que ocorrem naturalmente, e lá permanecem polinucleotídeos ou polipeptídeos isolados dentro do significado desse termo como empregado aqui.

Um gene exõgeno refere-se, na presente descrição, a uma seqüência de DNA que é introduzida ou reintroduzida no organismo. Por exemplo, qualquer gene, mesmo o gene estrutural ms45, é considerado um gene exógeno, se o gene é introduzido ou reintroduzido no organismo. 2 - Isolamento de uma Região Reguladora Preferida de Tecido Masculino Embora os promotores específicos de antera e os genes ativos nos tecidos masculinos sejam conhecidos na técnica (McCormick e outros, "Anther-Specific Genes: Molecular Characterization and Promoter Analysis in Transgenic Plants", em Plant Reproduction: From Floral Induction to Pollination,- Lord e outros, eds . ; páginas 128-135; (1989); Scott e outros, Publicação de Pedido Internacional número WO 92/11379 (1992); van der Meer e outros, The Plant Cell; Volume 4; página 253; (1992)), não existem princípios ou critérios estruturais geralmente aceitos para reconhecimento de seqüências de DNA que confiram expressão de tecido masculino à expressão de gene no milho. Consequentemente, não é possível isolar-se uma região reguladora preferida de tecido masculino diretamente de uma coletânea genômica de milho por classificação de uma sequência de consenso que confira expressão preferida de tecido masculino.

Por exemplo, a hibridização de tais seqüências pode ser realizada em condições de severidade reduzida, severidade média ou mesmo condições altamente severas (por exemplo, condições representadas por uma severidade de lavagem de Formamida a 35-40% com solução de Denhardt 5X, SDS a 0,5% e SSPE lx a 37 °C; condições representadas por uma severidade de lavagem de Formamida a 40-45% com solução de Denhardt 5X, SDS a 0,5% e SSPE IX a 42 °C e condições representadas por uma severidade de lavagem de Formamida a 50% com solução de Denhardt 5X, SDS a 0,5% e SSPE IX a 42°C, respectivamente). A severidade média em uma hibridização padrão de ácidos nucléicos seria útil na identificação de regiões reguladoras preferidas de tecido masculino reveladas aqui, bem como outros genes (vide, por exemplo, Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning: a Laboratorv Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; (1982)). Em geral, as seqüências que codificam uma região reguladora preferida de tecido masculino terão identidade de seqüência de preferivelmente 70%, 75% ou 80%, mais preferivelmente de 85% ou 90% e mais preferivelmente de 95% ou 99%.

Os processos estão prontamente disponíveis na técnica para a hibridização de seqüências de ácido nucléico. A classificação de hibridização de coletâneas de DNA em placas (vide por exemplo, Sambrook, J. e outros, Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1982)) ou ampliação das sequências de codificação usando a reação de cadeia de polimerase (vide, por exemplo, Innis e outros, PCR Protocols. a Guide to Methods and Applications.· Academic Press; (1990) são técnicas bem conhecidas para isolamento de DNA genômico.

As regiões reguladoras podem ser identificadas nos subclones genômicos usando análise funcional, geralmente verificada pela observação da expressão de gene repórter em tecido de antera e a redução ou ausência de expressão de gene repórter no tecido que não seja de antera, Esta abordagem geral é ilustrada no Exemplo 3 a seguir. A possibilidade das regiões reguladoras residentes "a montante" ou seção 5' do sítio de início transcripcional pode ser testada por subclonagem de um fragmento de DNA que contém a região a montante e subclonagem de fragmentos pequenos nos vetores de expressão para experimentos de expressão transiente. Espera-se que os fragmentos menores possam conter regiões essenciais para a expressão preferida de tecido masculino. Por exemplo, as regiões essenciais dos promotores CaMV 19S e 35S foi identificada em fragmentos relativamente pequenos derivados de peças genômicas maiores, conforme descrito na Patente U.S. número 5.352.605.

Em geral, as sequências que codificam uma região reguladora preferida de tecido masculino terão uma identidade de sequência para a mesma de preferivelmente 70%, 75% ou 90%, mais preferivelmente de 85% ou 90% e mais preferivelmente de 95% ou 99% . A análise de remoção pode ocorrer de ambos os terminais 5' e 3' da região reguladora: fragmentos podem ser obtidos por mutagênese de varredura de ligante, mutagênese usando a reação de cadeia de polimerase e semelhantes (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)). As remoções 3' podem delinear a região reguladora preferida de tecido masculino e identificar o terminal 3 1 , de modo que esta região essencial pode então ser operativamente ligada a um promotor de núcleo à escolha. Uma vez que a região essencial seja identificada, a transcrição de um gene exógeno pode ser controlada pela região reguladora preferida de tecido masculino de Ms45 mais um promotor de núcleo. 0 promotor de núcleo pode ser qualquer um dos promotores de núcleo conhecidos, tais como promotor do Vírus Mosaico da Couve-Flor 35S ou 19S (Patente U.S. número 5.352.605), Ubiquitin (Patente U.S. número 5.510.474), o promotor de núcleo IN2 (Patente U.S. número 5.364.780) ou um promotor de Vírus Mosaico de Escrofulária (Gruber e outros, "Vectors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolocrv: Glick e outros, eds.; CRC Press; páginas 89-119; (1993)). Preferivelmente, o promotor é o promotor de núcleo de um gene preferido de tecido masculino ou o promotor de núcleo CaMV 35S. Mais preferivelmente, o promotor é um promotor de um gene preferido de tecido masculino e, especificamente, o promotor de núcleo Ms45.

Uma outra análise mutacional pode introduzir modificações de funcionalidade, tais como nos níveis de expressão, na temporização da expressão ou no tecido da expressão. As mutações podem também ser inativas e não possuírem efeito que possa ser observado. 3 - Inserção da região em um vetor de expressão A seleção de um vetor de expressão apropriado com o qual testar a expressão funcional dependerá do hospedeiro e do processo de introdução do vetor de expressão no hospedeiro, e tais processos são bem conhecidos dos versados na técnica. Para eucariotos, as regiões no vetor incluem regiões que controlam a iniciação da transcrição e processamento de controle. Estas regiões são operativamente ligadas a um gene repórter, tal como gene β-glicoronidase (GUS) ou luciferase. As descrições gerais e exemplos de vetores de expressão de planta e genes repórteres podem ser encontradas em Gruber e outros, "Vectors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnoloqy; Glick e outros, eds; CRC Press; páginas 89-119; (1993). Vetores de expressão Gus e cassetes de expressão gus estão disponíveis no comercio através da Clonetech, Paio Alto, CA, enquanto os vetores de expressão de luciferase e cassetes de genes de luciferase estão disponíveis na Promega Corporation, Madison, WI . Os plasmideos Ti e outros vetores Agrobacteriura são descritos em Ishida, Y. e outros, Nature Biotechnoloqy; Volume 14; páginas 745-750; (1996) e Patente U.S. número 5.591.616 Method for Transforming Monocotyledons, depositado em 3 de maio de 1994.

Os vetores de expressão que contêm regiões reguladoras putativas localizados nos fragmentos genômicos podem ser introduzidos nos tecidos intactos, tais como anteras organizadas, embriões ou dentro do calo. Os processos de liberação de DNA incluem bombardeamento de microprojéteis, injeção de DNA, eletroporação e transferência de gene mediado por Agrobacterium (vide Gruber e outros, "Vectors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Biolocrv and Biotechnoloqy; Glick e outros, eds . ; CRC Press; (1993) . A Patente U.S. número 5.591.616 Method for Transforming Monocotyledons, depositada em 3 de maio de 1994, e Ishida, Y. e outros Nature Biotechnoloqv; Volume 14; paginas 745-750; (1996) .

Os processos gerais de cultivo de tecidos de plantas são encontrados em Gruber e outros, "Vectors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnoloqy; Glick e outros, eds.; CRC Press; (1993) .

Para o sistema de teste transiente escalonado, anteras isoladas são imediatamente colocadas no meio de cultura do pendão (Pareddy, D.R. e J.F. Petelino, Çrop_S_iç. J. ; Volume 29; páginas 1.564-1.566; (1989)) solidificadas com Phytagel a 0,5% (Sigma, St. Louis) ou outros meios de solidificação. O DNA do vetor de expressão é introduzido dentro de 5 horas, preferivelmente por liberação mediada por microprojétil com 1,2 μ partículas em 6894,75 - 7584,23 kPa. Após a liberação do DNA, as anteras são incubadas a 26 °C no mesmo meio de cultura do pendão por 17 horas e analisadas por preparação de um homogenato de tecido integral e testando quanto a GUS ou quanto à atividade de luciferase (vide Gruber e outros, "Vectors for Plant Transformation", em Methods in Plant Molecular Bioloav and Biotechnoloqy; Glick e outros, eds.; CRC Press (1993)).

Os processos descritos acima foram usados para identificar as seqüências de DNA que regulam a expressão do gene de uma maneira preferida de tecido masculino. Tal região foi identificada como a região normalizadora preferida de tecido masculino Ms45 de comprimento pleno (SEQ ID NO: 1) . Uma mutação do quadro TATA com identidade de seqüência com a região reguladora preferida de tecido masculino Ms45 de comprimento pleno é identificada na SEQ ID NO: 2.

Assim, a presente invenção engloba uma molécula de DNA que possui uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 (ou aquelas com identidade de seqüência) e que possui a função de uma região reguladora preferida de tecido masculino.

Um quadro TATA putativo pode ser identificado por análise de extensão da base, conforme descrito no Exemplo 2 a seguir ou em Current Protocols in Molecular Bioloqy;

Ausubel, F. Μ. e outros, eds . : John Wiley and Sons, New York; páginas 4.8.1-4.8.5; (1987) . 4 - Uso de uma Região Reguladora Preferida de Tecido Masculino para Controlar a Fertilidade Um objetivo da presente invenção é prover um dispositivo para controlar a fertilidade usando uma região reguladora preferida de tecido masculino. De modo importante, esta região reguladora preferida de tecido masculino pode controlar a expressão de um gene exógeno em anteras, a partir do quarteto através de estágios de desenvolvimento uninucleados precoces. O significado prático de tal regulagem é que a expressão do gene que induz a esterilidade durante este estágio de desenvolvimento interrompe a maturação da antera precocemente o bastante para permitir a verificação visual da função do sistema de indução de esterilidade no campo. Ela também pode reduzir a possibilidade de ocorrência de "rupturas" (anteras que abrigam pólen). Assim, os efeitos do gene de indução de esterilidade seriam evidentes no campo de produção em um estágio suficientemente precoce de desenvolvimento, para permitir destaque do pendão de forma manual ou mecânica de quaisquer "trânsfugas férteis" que resultam de uma ruptura parcial ou total do sistema de indução de esterilidade.

Uma abordagem para controlar a fertilidade masculina é manipular a expressão do gene no tapete. O tapete é uma camada de células que circunda as células microsporogêneas na antera e provavelmente fornece nutrientes, tais como açúcares de redução, aminoácidos e lipídeos aos micrósporos em desenvolvimento. (Reznickova, C.R., Acad. Bulcr. Sei.; Volume 31; página 1.067; (1978); Nave e outros, J. Plant Phvsiol . ; Volume 125; página 451 (1986); Sawhney e outros, J. Plant Physiol.; Volume 125; página 467; (1986)). Foi verificado que o Ms45 é altamente expresso na camada de tapetes. As células de tapetes também produzem β (1,3) -glucanase ("calase"), que promove a liberação do micrósporo (Mepham e outros, Protoplasma; Volume 70; página 1; (1970)). Portanto, existe uma relação delicada entre as células do tapete e as células microsporogêneas, e qualquer interrupção da função do tapete resulta, provavelmente, nos grãos de pólen disfuncionais. De fato, sabe-se que as lesões na biogênese do tapete resultam nos mutantes da esterilidade masculina (Kaul, "Male Sterility in Higher Plants" em Monographs on Theoretical and Applied Genetics; Frankel e outros, eds. ; Springer Verlag; Volume 10, páginas 15-95; (1988)). Uma aparência prematura ou tardia de calase durante o desenvolvimento do tapete está também associada a certos tipos de esterilidade masculina (Warmke e outros, J. Hered;: Volume 63, página 103; (1972)). Portanto, o gene da calase pode ser usado para interromper a função do tecido masculino. Scott e outros, PCT WO 93/02197 (1993), revela a seqüência de nucleotídeo de uma calase específica de tapete. Assim, uma falha dos micrósporos em desenvolver-se em grãos de pólen maduros pode ser induzida usando uma molécula de DNA recombinante que compreende um gene capaz de interromper a função de tapete sob o controle das seqüências reguladoras específicas de tapete.

Uma abordagem geral para impactar a fertilidade masculina é construir um vetor de expressão no qual a região reguladora preferida de tecido masculino é ligada operativamente a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína, capaz de interromper a função do tecido masculino, resultando em infertilidade. As proteínas capazes de interromper a função do tecido masculino incluem proteínas que inibem a síntese das macromoléculas que são essenciais para a função celular, enzimas que degradam macromoléculas que são essenciais para a função celular, proteínas que alteram a biossíntese ou metabolismo dos hormônios de plantas, proteínas estruturais, proteínas expressas inapropriadamente e proteínas que inibem uma função específica dos tecidos masculinos.

Por exemplo, pode ser construído um vetor de expressão no qual a região reguladora preferida de tecido masculino é operativamente ligada a uma sequência de nucleotídeo que codifica um inibidor de síntese de proteína, que podería ser, porém não é limitado, à citotoxina. A toxina de difteria, por exemplo, é um inibidor bem conhecido da síntese de proteína em eucariotos . As moléculas de DNA que codificam o gene de toxina de difteria podem ser obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) , ATCC N° 39359 ou ATCC N° 67011 e vide Fabijanski e outros, Pedido E.P. N° 90902754.2, "Molecular Methods of Hybrid Seed Production" quanto a exemplos e processos de utilização. A metilase DAM, por exemplo, é uma enzima bem conhecida de Escherichia coli que modifica o resíduo de adenina na sequência de 5 1 GATD 3' a N6-metil-adenina. Cigan e Albertsen descrevem como a metilase DAM poderia ser usada para impactar a fertilidade em plantas transgênicas (PCT/US95/15229, Cigan, A. M. e Albertsen, M.C., "Reversible Nuclear Genetic System for Male Sterility in Transgenic Plants"). Outro tipo de proteína que interrompe a fertilidade é a avidina, conforme ilustrado no Pedido de Patente U.S. número 08/475.582 "Induction of Male Sterility in Plants by Expression of High Leveis of Avidin" por Howard, J. and Albertsen, M.C.

Alternativamente, a interrupção da função do tapete pode ser encontrada usando sequências de DNA que codificam enzimas capazes de degradar uma macromolécula biologicamente importante. Por exemplo, Mariani e outros, Nature; Volume 347; página 737; (1990) mostrou que a expressão no tapete tanto de Arpergillus oryzae RNase-Tl quanto um RNase de Bacillus amyloliquefaciens, designado "bamase", induziu a destruição das células de tapete, resultando em infertilidade masculina. Qaas e outros, Eur. J. Biochem. ; Volume 173; página 617 (1988) descreve a síntese química de RNase-Tl, enquanto a sequência de nucleotídeo do gene bamase é revelada em Hartley, J. Molec.

Biol.; Volume 202; página 913; (1988).

Genes RNase-Tl e bamase podem ser obtidos, por exemplo, por síntese dos genes com oligonucleotideos de iniciação mutuamente longa. Vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology; Ausubel, F.M. e outros, eds. ; John Wiley and Sons, New York; páginas 8.2.8 a 8.2.13; (1987). Também, vide Worsnick e outros, Gene;

Volume 60; página 115; (1987). Além disto, as técnicas correntes que utilizam a reação de cadeia de polimerase fornecem a capacidade de sintetizar genes muito grandes (Adang e outros, Plant Molec. Biol.; Volume 21; página 1131; (1993); Bambot e outros, PCR Methods and Applications; Volume 2; página 266 ; (1993)) .

Em uma abordagem alternativa, a produção de pólen é inibida por alteração do metabolismo dos hormônios da planta, tais como auxinas . Por exemplo, o gene rolB do Agrohacterium rhizogen.es codifica uma enzima que interfere com o metabolismo da auxina por catalisação da liberação de indóis livres de indoxil-β-glicosídeos. Estruch e outros, EMBO J.; Volume 11; página 3.125; (1991) e Spena e outros, Theor. Appl. Genet.; Volume 84; página 520; (1992) mostraram que a expressão específica de antera do gene rolB em tabaco resultou em plantas com anteras atrofiadas, nas quais a produção de pólen foi severamente diminuída.

Portanto, o gene rolB é um exemplo de gene que é útil para o controle da produção de pólen. Slightom e outros, J. Biol. Chem.; Volume 261; página 108 (1985), revela a seqüência de nucleotídeo do gene rolB. A fim de expressar uma proteína que interrompe a função do tecido masculino, é construído um vetor de expressão no qual uma seqüência de DNA que codifica a proteína é operativamente ligado às seqüências de DNA que regulam a transcrição de gene de uma maneira preferida do tecido masculino. Os requisitos gerais de um vetor de expressão são descritos acima no contexto de um sistema de expressão transiente. Aqui, contudo, o modo preferido é introduzir o vetor de expressão no tecido embriônico da planta, de tal modo que uma proteína exógena será expressa em um estágio posterior de desenvolvimento nos tecidos masculinos da planta adulta. A estabilidade mitótica pode ser obtida usando vetores viróticos de plantas que fornecem replicação epicromossômica.

Um processo alternativo e preferido para obtenção de estabilidade mitótica é fornecido pela integração de seqüências de vetor de expressão dentro do cromossomo hospedeiro. Tal estabilidade mitótica pode ser provida pela liberação do microprojétil de um vetor de expressão para tecido embriônico (Gruber e outros, "Vectors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Biolocrv and Biotechnoloqv; Glick e outros, eds.; CRC Press; (1993)). A metodologia de transformação pode ser encontrada em muitas plantas, incluindo, porém não limitada ao girassol, soja, trigo, canola, arroz e sorgo (Knittel, N. e outros, J. Plant Cell Rep.; Springer International, Berlim, antiga Alemanha Ocidental; Volume 14(2/3); páginas 81-86; (1994); Chee, P.P. e outros, Plant Phvsiol.; American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD: Volume 91(3); páginas 1.212-1.218; (1989); Hadi, M.Z. e outros, J.

Plant Cell Rep. ; Springer International, Berlim, antiga Alemanha Ocidental; Volume 15(7) ; páginas 500-505; (1996) ;

Perl, A. e outros, Molecular and General Genetics; Vol . 235(2-3); páginas 279-284; Zaghmout, O.M.F. e N.L. Trolinder, Nucleic Acids Res. ; IRL Press, Oxford: Volume 21(4); página 1.048; (1993); Chen, J.L. e W.D. Beversdorf, Theor. Appl. Genet.; Springer International, Berlim, antiga Alemanha Ocidental; Volume 88(2); páginas 187-192 (1994);

Sivamani, E. e outros, Plant Cell Rep. ; Springer International, Berlim, antiga Alemanha Ocidental; Volume 15(5) ; páginas 322-327; (1996) ; Hagio, T. e outros, Plant Cell Rep. ; Volume 10(5); páginas 260-2 64 ; (1991)) e é também conhecida pelos versados na técnica. A fim de selecionar as células transformadas, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável, tal como um gene resistente a herbicida. Por exemplo, tais genes podem conferir resistência a fosfinotricina, glifosfato, sulfoniluréias, atrazina, imidazolinona ou kanamicina. Embora o vetor de expressão possa conter sequências de cDNA que codificam uma proteína exógena sob o controle de uma região reguladora preferida de tecido masculino, bem como o gene marcador selecionável sob controle do promotor constitutivo, o gene marcador selecionável pode também ser liberado para as células hospedeiras em um vetor de expressão de seleção separado. Tal "co-transformação" do tecido embriônico com um vetor de expressão de teste que contém uma região reguladora preferida de tecido masculino e um vetor de expressão de seleção é ilustrada a seguir. 5 - Indução de Esterilidade Em uma abordagem alternativa, a esterilidade masculina pode ser induzida pelo uso de um vetor de expressão no qual a região reguladora preferida de tecido masculino é operativamente ligada a uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma unidade nucleotídica complementar. A ligação das moléculas de ácido nucléico complementares a uma molécula-alvo pode ser selecionada para ser inibidora. Por exemplo, se o alvo é uma molécula de mRNA, então a ligação de uma unidade de nucleotídeo complementar, neste caso um RNA, resulta na hibridização e interrupção da tradução (Paterson e outros, Proc. Nat'1. Acad. Sei . ; Volume 74; página 4.370; (1987)) . Assim, uma molécula de RNA de sentido contrário apropriada, tal como uma complementar ao Ms45 (Patente U.S. número 5.478.369), teria uma seqüência que é complementar aquela de uma espécie de mRNA que codifica uma proteína necessária â esterilidade masculina (Fabijanski em "Antisense Gene Systems of Pollination Control for Hybrid Seed Production", Pedido de Patente U.S. Número 98/288.734).

Por exemplo, a produção de RNA de sentido contrário de calase inibiría a produção da enzima de calase que é essencial à liberação do micrósporo. Além disto, a esterilidade masculina pode ser induzida pela inibição de biossíntese de flavonóide usando um vetor de expressão que produz RNA de sentido contrário para a região 31 não traduzida do gene de sintase A calcona (Van der Meer e outros, The Plant Cell; Volume 4; página 253; (1992)) . A clonagem e caracterização do gene de sintase A de calcona são reveladas por Koes e outros, Gene; Volume 81; página 245; (1989) e por Koes e outros, Plant Molec.Biol.; Volume 12; página 213; (1989).

Alternativamente, pode ser construído um vetor de expressão no qual a região reguladora pi'eferida de tecido masculino é operativamente ligada a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ribozima. As ribozimas podem se designadas para expressar atividade de endonuclease que é dirigida a uma determinada seqüência-alvo em uma molécula de mRNA. Por exemplo, Steinecke e outros, EMBO J. ; Volume 11; página 1.525; (1992) obteve até 100% de inibição da expressão do gene de fosfotransferase de neomicina por ribozimas em protoplastos de tabaco. Mais recentemente, Perriman e outros, Antisense Research and Development ,· Volume 3; página 253; (1993) inibiu a atividade de transferase de acetil cloranfenicol em protoplastos de tabaco usando um vetor que expressou uma ribozima cabeça de martelo modificada. No contexto da presente invenção, moléculas-alvo de RNA apropriadas para ribozimas incluem espécies de mRNA que codificam proteínas essenciais para fertilidade masculina, tais como mRNA de calase e mRNA Ms45 .

Em uma outra abordagem alternativa, podem ser construídos vetores de expressão, nos quais uma região reguladora preferida de tecido masculino dirige a produção de transcriptos de RNA capazes de promover divagem mediada por RNase P das moléculas-alvo de mRNA. De acordo com esta abordagem, uma seqüência guia externa pode ser construída para direcionar a ribozima endógena, RNase P, para uma determinada espécie de mRNA intracelular, que é subsequentemente clivado pela ribozima celular (Patente U.S. Número 5.168.053 ; Yuan e outros, ScienceVolume 2 63 ; página 1269; (1994)). Preferivelmente, a seqüência guia externa compreende uma seqüência de dez a quinze nucleotídeos complementar a uma espécie de mRNA que codifica uma proteína essencial para a fertilidade masculina, e uma seqüência de nucleotídeo 3'-RCCA, em que R é preferivelmente uma purina. Os transcriptos da seqüência guia externa ligam-se à espécie-alvo de mRNA pela formação dos pares de base entre o mRNA e as seqüências-guia externas complementares, promovendo assim a divagem de mRNA por RNase P no nucleotídeo localizado no lado 5' da região de pares de base.

Outra abordagem alternativa é utilizar tecnologia de aptâmero, em que a unidade nucleotídica complementar é um nucleotídeo que serve como um ligante para uma molécula- alvo especifica (Patente U.S. Número 5472841) . Este alvo seria um produto essencial para a fertilidade masculina ou um produto que interrompe a fertilidade masculina. Utilizando este processo, um aptâmero seria selecionado para a molécula-alvo, Ms45 ou avidina, por exemplo, que seria ligado e inibiría a expressão do alvo. A seqüência de nucleotídeo que codifica o aptâmero seria parte dos vetores de expressão construídos, de modo que a região reguladora preferida de tecido masculino dirige a produção do aptâmero. A esterilidade pode também ser induzida por interrupção de um gene importante na fertilidade masculina, tal como o gene Ms45 ou o Ms2 (Mark, G.M. e outros, Nature Volume 363; páginas 715-717; (1993)). Os processos de interrupção de gene são bem conhecidos na técnica e incluem, porém não estão limitados a, inserção de elemento de transporte e indução de mutação. 6 - Restauração da Fertilidade Masculina no Híbrido F1 Os processos descritos acima podem ser usados para produzir milho transgênico masculino-estéril para a produção de híbridos F1 em cruzamentos dirigidos em grande escala entre linhagens congênitas. Se as células-ovo das plantas transgênicas masculinas-estéreis não contêm todas o gene exógeno que interrompe a função do tapete, então uma proporção de híbridos F1 terá um fenótipo masculino-fértil. Por outro lado, híbridos F1 terão um fenótipo masculino- estéril, se o gene exógeno estiver presente em todas as células-ovo das plantas transgênicas masculinas-estéreis, uma vez que a esterilidade induzida pelo gene exógeno seria dominante. Assim, é desejável utilizar-se um sistema de restauração da fertilidade masculina para prover a produção de híbridos F1 masculinos-férteis. Tal sistema de restauração de fertilidade possui valor específico, quando o produto colhido é a semente ou quando as colheitas são autopolinizantes.

Também, tal sistema de restauração de fertilidade possui valor específico quando a região reguladora preferida de tecido masculino é operativamente ligada a um promotor induzível, tal como no WO 89/10396 (Marianai e outros, Plants with Modified Stamen Cells) e o promotor induzível responde aos controles externos. Esta região reguladora preferida de tecido masculino ligada consiste de uma região reguladora preferida de tecido masculino, um promotor induzível e um gene exógeno.

Uma abordagem com relação à restauração da fertilidade masculina seria cruzar plantas transgênicas masculinas-estéreis com plantas transgênicas masculinas-férteis, que contêm um gene de restauração de fertilidade sob o controle de uma região reguladora preferida de tecido masculino. Por exemplo, Fabijanski em "Antisense Gene Systems of Pollination Control For Hybrid Seed Production", Pedido de Patente U.S. Número 08/288.734, cruzou plantas masculinas-férteis que expressaram um inibidor bamase, designado "barstar", com plantas masculinas-estéreis que expressaram bamase. Hartley, J. Mol. Biol. ; Volume 202 ; página 913 (1988) revela a seqüência de nucleotídeo do barstar.

Outra abordagem seria de cruzar plantas masculinas-estéreis que contêm uma interrupção em um gene de fertilidade masculina essencial com plantas transgênicas férteis masculinas que contêm a região reguladora preferida de tecido masculino, operativamente ligada a uma cópia não-interrompida do gene de fertilidade, tal como gene Ms45 ou Ms2 . A seqüência completa do gene Ms45 está contida na Patente U.S. Número 5.478.369 e Ms2 em Mark, G.M. e outros, Nature; Volume 363; páginas 715-717; (1993).

Alternativamente, a restauração da fertilidade pode ser encontrada por expressão das unidades nucleotídicas complementares, tais como ribozimas de toxina ou aptâmeros em plantas masculinas-férteis, para neutralizar os efeitos da toxina nas plantas masculinas-estéreis. Assim, a fertilidade masculina pode ser restaurada nos híbridos F1 por produção de uma planta transgênica masculina-fértil, que sintetiza uma espécie particular de molécula de RNA ou polipeptídeo para neutralizar os efeitos do gene exógeno específico expresso nas plantas transgênicas masculinas-estéreis.

Em um processo alternativo para restaurar a fertilidade masculina, plantas transgênicas masculinas-estéreis contêm um vetor de expressão que possui uma região reguladora preferida de tecido masculino, uma região reguladora procariótica (de um sistema regulador procariótico) e um gene exógeno que é capaz de interromper a função do tapete. São produzidas plantas transgênicas masculinas-férteis, que expressam um peptídeo procariótico sob o controle de uma região reguladora preferida de tecido masculino. Nos híbridos F1 resultantes, a partir de cruzamentos de masculino-estéril e masculino-fértil, o peptídeo procariótico liga-se à seqüência reguladora procariótica e reprime a expressão do gene exógeno que é capaz de interromper a fertilidade masculina. Uma vantagem deste processo de restauração da fertilidade é que uma forma da planta transgênica masculina-fértil pode ser usada para prover fertilidade de Fl, independente da identidade do gene exógeno que foi usado para interromper a função de tapete na planta transgênica masculina-estéril.

Por exemplo, o sistema gene LexA/operador LexA pode ser usado para regular a expressão do gene, de acordo com a presente invenção. Vide Patente U.S. número 4.833.080 e Wang e outros, Mol . Cell. Biol. ; Volume 13; página 1.805 ; (1993) . Mais especificamente, o vetor de expressão da planta masculina-estéril conteria a seqüência operadora LexA, enquanto o vetor de expressão da planta masculina-fértil conteria as seqüências de codificação do repressor LexA. No híbrido Fl, o repressor LexA seria ligado â seqüência operadora LexA e inibiría a transcrição do gene exógeno que codifica um produto capaz de interromper a fertilidade masculina. Estas poderíam incluir, porém não estariam limitadas a avidina, metilase DAM, toxina de difteria, RNase T, bamase, rol B e sintase A de calcona.

As moléculas de DNA operadoras LexA podem ser obtidas, por exemplo, por sintetização de fragmentos de DNA que contêm uma seqüência operadora LexA bem conhecida. Vide, por exemplo, a Patente U.S. número 4.833.080 e Garriga e outros, Mol. Gen. Genet.; Volume 236; página 125; (1992). O gene LexA pode ser obtido por sintetização de uma molécula de DNA que codifica o repressor LexA. As técnicas de sintese genética são discutidas anteriormente e as seqüências de gene LexA são descritas, por exemplo, por Garriga e outros, Mol. Gen. Genet.; Volume 236; página 125; (1992) . Alternativamente, as moléculas de DNA que codificam o repressor LexA podem ser obtidas do plasmídeo pRB500, American Type Culture Collection - número de acesso 67758. Os versados na técnica podem prontamente planejar outras estratégias de restauração da fertilidade masculina usando sistemas reguladores procarióticos, tais como sistema repressor lac/operon lac ou o sistema repressor trp/operon trp. 7 - Identificação de Partes Essenciais da Região Reguladora A identificação das partes essenciais de uma região reguladora pode ser realizada por remoção, adição e/ou substituição de nucleotídeos em uma região reguladora por processos bem conhecidos de um versado na técnica. Tais variantes podem ser obtidas, por exemplo, por mutagênese dirigida por oligonucleotídeos, mutagênese de varredura de ligante e mutagênese usando a reação de cadeia de polimerase (Direct Mutagenesis: A Practical Approach; IRL

Press (1991) ) .

Uma série de remoções de 5 ' de uma região reguladora pode ser construída usando sítios de restrição existentes. Os fragmentos resultantes do promotor podem ser testados quanto à atividade usando um vetor de expressão, conforme discutido anteriormente. Refinamento e delineação adicionais podem ser obtidos através de pequenas alterações, preferivelmente de cerca de 50 ou 30 nucleotídeos, mais preferivelmente de cerca de 20 ou 10 nucleotídeos e, mais preferivelmente, de cerca de 5 ou 1 nucleotídeos, para o fragmento de restrição menor, que ainda confere expressão apropriada, através da construção do repórter (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991) ) . Estes podem ser introduzidos no vetor de expressão usando sítios de restrição introduzidos ou naturais . Uma série de remoções de 3 ' pode também ser gerada conforme discutido anteriormente por PCR ou por processos bem conhecidos dos versados na técnica (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)). Um refinamento e delineação adicionais podem ser obtidos com pequenas alterações, preferivelmente de cerca de 50 ou 30 nucleotídeos, mais preferivelmente de cerca de 20 ou 10 nucleotídeos e, mais preferivelmente, de cerca de 5 ou 1 nucleotídeos, para o fragmento de restrição menor, que ainda confere expressão apropriada, através da construção do repórter (Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press; (1991)).

Estas remoções de 5' e 3' , portanto, delinearão a região mínima essencial para simulação do tecido apropriado e expressão temporal da região reguladora mais comprida. Em geral, as sequências que codificam esta região mínima de uma região reguladora preferida de tecido masculino terão identidade de sequência preferivelmente de 70%, 75% ou 80%, mais preferivelmente de cerca de 85% ou 90% e, mais preferivelmente, de cerca de 95% ou 99%. O que se segue é apresentado como ilustração e não pretende limitar o escopo da invenção.

Exemplo 1 Clonagem genômica e seqüenciamento do promotor Ms45 O et iquetamento de Ac e identificação de cDNA de MS4 5, além da análise Northern, são descritos na Patente U.S. número 5.478.369.

Um cDNA parcial de Ms45 foi usado para classificar uma coletânea genômica de milho B73 . Esta coletânea foi feita por clonagem das partes de SAU3A1 em um vetor de clonagem genômico digerido BAMHI (Lambda Dash II, Stratagene, La Jolla, CA) . Aproximadamente lxlO6 placas foram classificadas usando uma linhagem de E. coli apropriada para DNA genômico (ER1647, New England Biolabs, MA) como o hospedeiro. O clone AC4.1 foi purificado até a homogeneidade após três operações de classificação. O mapeamento de restrição de AC4.1 mostrou que o clone possuía cerca de 13 kb de comprimento e continha dois sítios BAMHI internos (figura 1) . Um destes sítios foi também encontrado no cDNA parcial de MS45. Dois fragmentos de BAMHI foram subclonados em um vetor de clonagem (Bluescript SK+, Stratagene, La Jolla, CA) . O clone de terminal 5' possuía cerca de 3,5 kb de comprimento e correspondeu à sequência a montante (5') do sítio BAMHI interno. O clone de terminal 3' possuía 2,5 kb e continha seqüência Ms45 a jusante do sítio BAMHI interno.

Simultaneamente, um cDNA Ms45 de comprimento pleno putativo foi isolado e seqüenciado. Por comparação de seqüência do clone de terminal 5' e do cDNA Ms45, o sítio de partida de tradução putativa foi identificado (figura 1). O seqüenciamento da região promotora Ms45 foi realizado usando o processo de terminação de cadeia dideóxi de Sanger, F. e outros, "DNA Sequencing with Chain Terminating Inhibitors"; Proc. Nat'1. Acad. Sei. : Volume 74; páginas 5.463-5.467; (1977) . O pac4.1-5 1 do clone genômico (figura 1) foi seqüenciado usando o oligo universal e outros que eram específicos para a seqüência usando técnicas bem conhecidas na técnica. A região reguladora preferida de tecido masculino possuía um sítio NCOI introduzido no códon de partida e foi clonada como um fragmento NCOI dentro de um vetor de expressão Luci isento de promotor. Este novo vetor repórter foi designado como plasmideo PHP6045 (figura 2) ATCC número 97828 (Depositado em 12 de dezembro de 1996; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852).

Exemplo 2 Análise de Extensão de Base RNA total foi isolado de pendões de milho contendo quarteto, através de anteras de estágio uninucleado precoce. O RNA total foi precipitado com etanol e MgCl2. Um miligrama do RNA total foi isolado e o poli A+ mRNA foi purificado utilizando celulose oligo-dT. Poli A+ RNA também foi isolado diretamente de folhas de sementeira de milho com 6 dias e anteras de milho usando protocolos conhecidos dos versados na técnica.

Um espiral de seqüenciamento foi preparado usando um oligonucleotideo Ms45 de filamento simples e a incorporação de 35S-dATP em um procedimento de seqüenciamento padrão, usando protocolos bem conhecidos dos versados na técnica. A extensão da base foi feita de acordo com o processo que se segue: 1 - terminal 5' rotulando base de oligonucleotídio sintético.

Combinado: 5 pmol de base N11916 (PHL11916) em 1,0 μΐ 5 μΐ (50 μΟί^ητηη 32P-ATP (>5000 Ci/mmole) 0,7 μΐ tampão de quinase 10X 0,7 μΐ quinase de polinucleotideo T4 incubado a 37°C por 45 minutos.

Diluído com 2 0 μΐ de TE e aquecido a 65 °C para tornar a enzima inativa.

Tampão de quinase 10X para fabricar 1 ml 0,5M Tris-HCl, pH 7,6-8,0 0,5 ml de 1M

5 mM de espermidina 0,05 ml de 0,1M

100 mM MgCl2 0,1 ml de 1M

100 mM DTT 0,5 ml de 0,5M 0,1 mg/ml de gelatina ou BSA 50 μΐ de 2 mg/ml 0,1 ml de água II - Base e RNA Recombinados Bases contendo quinase foram recombinadas em mRNA a partir do pendão do milho, folhas de sementeira de milho com 6 dias, anteras de milho e folhas de milho com 6 dias. Foram misturados em gelo 2 μΐ de mRNA, 1 μΐ de oligo contendo quinase, 2 μΐ de tampão recombinante 5X (1,25 M KC1, 10 mM Tris, pH 7,9-8,15) e 1 μΐ de 30 mM de vanadila. O Volume total foi ajustado para 10 μΐ com 10 mM Tris, pH 8,15. Esta mistura foi aquecida a 65°C e resfriada a 55°C por um período de 4 horas no bloco de aquecimento de ciclador térmico. III - Extensão de Base Uma mistura de extensão de base de 23 μΐ (vide receita a seguir) e 0,4 μΐ de transcriptase inversa (SuperScript, BRL, MD) foram adicionados a cada tubo. Estes foram misturados por pipetagem branda para cima e para baixo e colocados imediatamente a 48°C e incubados por 3 5 minutos. A Mistura de Extensão de Base consiste em 10 mM de MgCl2, 5 mM de DTT, 0,33 mM de cada um de dATP, dCTP, dGTP, dTTP e água DEPC. 300 μΐ de etanol foram adicionados e precipitados em congelador a -20°C por toda a noite, depois pelotizados durante 30 minutos em um microabafador. As pelotas foram secas em um Speed Vac e dissolvidas em 6 μΐ de 0,1 NaOH/lmM EDTA. O conteúdo do tubo foi misturado por pipetagem e turbilhonamento para assegurar que as pelotas estavam dissolvidas. Estas foram deixadas em temperatura ambiente por 2 horas e meia e 6 μΐ de corante de seqüenciamento (solução Stop do kit USB Sequencing) foram adicionados, e a solução desnaturada aproximadamente a 95°C. Metade da amostra foi carregada em um gel de seqüenciamento de poliacrilamida desnaturante a 6% com tampão de empilhamento e operada a 55 Watts por 2 horas . 0 gel foi seco em um secador de gel e exposto â película Kodak X-AR. Após uma exposição de três dias, um produto de transcrição foi observado na reação de extensão de base de mRNA de pendão de milho, que correspondeu a uma deoxitimidina localizada 42 nucleotídeos a montante do códon de partida (figura 3). Esta posição foi designada como +1 . Uma partida menor da transcrição foi também identificada em -3.

Exemplo 3 Determinação de Especificidade de Estágio e Tecido da Região Reguladora Preferida de Tecido Masculino Ms45 A região reguladora preferida de tecido masculino de comprimento pleno (SEQ ID N° : 1) foi fundida no gene repórter de luciferase do pirilampo, Photinus pyralis (DeWit, T.R. e outros, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA; Volume 82; páginas 7.870-7.873; (1985)) com a região não-traduzida PinII-3' da batata (An, G. e outros, "Functional Analysis of the 3' Control Region of the Potato Wound-Inducible Proteinase Inhibitor II Gene"; Plant Ce11; Volume 1; páginas 115-122; (1989) ) . Anteras de milho em vários estágios de desenvolvimento foram colocadas em placas no meio de cultura de pendão (Pareddy e outros, Theoret. Appl. Genet.; Volume 77; páginas 521-526; (1989)), solidificadas com ágar (Phytagar®, Sigma, St. Louis) . Uma das três anteras de cada florículo foi organizada e as anteras restantes foram agrupadas por estágio e colocadas em placas para bombardeamento por microprojéteis, tipicamente oito anteras por placa. As anteras receberam disparos em 7584,23 kPa com partículas de tungstênio de 1,8 μ, sobre as quais foi precipitado DNA de construção de repórter de luciferase da região reguladora preferida de tecido masculino de Ms45. Todas as anteras em uma dada placa estavam no mesmo estágio, pré-meiótico, meiose I, meiose II, quarteto, liberação de micrósporo, micrósporo de uninucleato precoce ou micrósporo uninucleato médio. Três repetições foram disparadas em cada estágio. As anteras foram incubadas por toda a noite a 26 °C, por 18 horas. Um extrato bruto foi preparado com as anteras de cada placa e testado quanto à atividade de luciferase e teor de proteína. A atividade de luciferase, normalizada à concentração de proteína, é colocada em gráfico na figura 4, como uma função do estágio de desenvolvimento. A atividade principal estava nos estágios de desenvolvimento de quarteto e liberação de miscrósporo, com atividade secundária em meiose I e II e atividade fracamente detectável no estágio uninucleado precoce. Nenhuma atividade significativa foi detectada nas anteras pré-meiótica ou uninucleada média.

Além disto, o calo embriogênico, cultivado em meio MS contendo 2,0 ug/ml de 2,4-D foi bombardeado da mesma maneira, exceto que a 4.481,59 kPa com partículas revestidas com um repórter luciferase fundido, tanto para região reguladora preferida de tecido masculino Ms45, quanto para um promotor de ubiquitina do milho (Patente U.S. número 5.510.474) e um repórter uidA (GUS) fundido para um promotor de ubiquitina de milho. A luciferase foi normalizada para β-glucuronidase. Conforme mostrado na figura 5, a região reguladora preferida de tecido masculino Ms45 foi incapaz de acionar a expressão transiente no calo embriogênico e brotos, embora o promotor de ubiquitina fosse expresso. Similarmente, as sementes de milho, embebidas e germinadas em água destilada por dois dias e colocadas em filtros úmidos, foram submetidas a bombardeamento por microprojétil e seus hipocótilos testados quanto â luciferase e β-glucuronidase. A região reguladora de ubiquitina (promotora) estava ativa, porém a região reguladora preferida de tecido masculino Ms45 não estava ativa.

Este resultado é parecido com os resultados da análise de hibridização de RNA. Anteras de milho em vários estágios de desenvolvimento foram coletadas e tratadas como se segue. Uma das três anteras de cada florículo foi fixada em (3:1 etanol : ácido acético glacial) em uma poça de uma placa de microtitulação e duas foram congeladas em nitrogênio líquido, em uma poça na posição correspondente de outra placa de microtitulação. As anteras fixadas foram organizadas; então as anteras congeladas correspondentes foram agrupadas por estágio e poliA+ RNA foi isolado de 20 anteras (kit RNA Micro-Quick Prep, Pharmacia Uppsila, Suécia) . Volumes idênticos de RNA das anteras em cada estágio agrupado foram submetidos a eletroforese em agarose a 1,2% em tampão MOPS + aldeído f órmico. Amostras de RNA foram transferidas por manchamento para uma membrana de nylon, fixadas por reticulação em UV (Stratalinker, Stratagene, Inc., La Jolla) e hibridizadas em um fragmento de sonda rotulado 32P, consistindo em toda a região de codificação cDNA de Ms45 e região 31. Os resultados mostrados na figura 4 confirmam o estado firme do transcripto de Ms45 detectável no quarteto através de estágios uninucleato precoces e possivelmente tão precocemente como, porém não mais precoce do que telófase II na meiose. Ou os níveis de transcripto resultantes de atividade de região reguladora preferida de tecido masculino MS45 durante a meiose não se acumulam suficientemente para serem detectados por hibridização de RNA, ou então a atividade da região normalizadora preferida de tecido masculino de estágio meiótico observada nos testes transientes não ocorre em plantas.

Assim, compreende-se que a região reguladora preferida de tecido masculino Ms45 (SEQ ID N° : 1) possui expressão preferida de tecido masculino, pelo menos do estágio de desenvolvimento de quarteto da antera através da liberação do quarteto, com expressão de nível inferior possível nos estágios meiótico e uninucleado precoce.

Exemplo 4 Análise de Quadro TATA

Dentro do fragmento de 1388 pares de base de DNA que codificam a região reguladora preferida de tecido masculino, a partida principal da transcrição foi identificada em +1, uma partida menor de transcrição foi identificada em -3 em relação à partida principal de transcrição e um quadro TATA putativo foi identificado em -33 (CATTAAA). Foi observado que a seqüência TAAAGAT em -30 podería também ser candidata ao quadro real TATA. Este fragmento de 1388 pares de base foi operativamente ligado a um cassete de gene repórter que compreende a região de codificação de luciferase de pirilampo (Pareddy e outros, Theoret. Appl. Genet.; Volume 77; páginas 521-526; (1989)) seguido pela região não-traduzida 31 do gene II inibidor de proteinase de batata. (An, G. e outros, "Functional Analysis of the 3 1 Control Region of the Potato Wound-Inducible Proteinase Inhibitor II Gene": Plant Cell; Volume 1; páginas 115-122; (1989)).

Um modo que é bem conhecido na técnica de analisar quadros TATA é através da mutação. Em outro derivado, de um a seis nucleotídeos do quadro TATA putativo foram alterados em um determinado derivado. Um sítio BGLII introduzido em -38 alterou o quadro TATA putativo de CATTAAA para TATTAAA, que é uma combinação mais próxima da sequência canônica TATATAA de quadro TATA.

Será apreciado por um versado na técnica que certas substituições dentro do quadro TATA podem afetar o nível de expressão do promotor, sem influenciar a especificidade do tecido. Conforme mostrado na figura 7, a alteração no quadro TATA, associada ao sítio BglII introduzido em -38, aumentou dramaticamente os níveis de expressão transientes em anteras e sugere ainda que a seqüência em -33 seja o quadro TATA autêntico. A introdução de um sítio BGLII em -40, -43, -51 ou -53 não aumentou a atividade do promotor (dados não mostrados) , provando que o aumento observado na introdução do sítio 38 BGLII não está relacionado ao sítio BGLII propriamente dito.

Outras modificações do quadro TATA putativo foram introduzidas para testar adicionalmente a sua funcionalidade. A alteração da seqüência do quadro TATA putativo de CATTAAA para GATTAAA, CATGGAA ou GGGCCCA reduziu o nível de expressão transiente nas anteras, sugerindo ainda a importância desta sequência como um quadro TATA. Surpreendentemente, nenhuma destas mutações aboliu a atividade transiente; contudo, houve relatórios de atividade transiente em outros sistemas na ausência de uma sequência semelhante a TATA e mesmo de promotores isentos de TATA (Guan, L. e J.G. Scandalios, Plant J. Volume 3, páginas 527-536; (1993); Close, P.S., "Cloning and Molecular Characterization of Two Nuclear Genes for Zea mays Mitochondrial Chaperonin 60"; (Dissertation); Iowa State University, Ames, Iowa; páginas 92, 128; (1993) ) .

Conquanto o precedente descreva as modalidades preferidas da invenção, será entendido pelos versados na técnica que podem ser feitas variações e modificações e ainda assim continuar dentro do escopo da invenção.

Claims (10)

1 - Processo para produção de uma planta transformada que expressa uma sequência de nucleotídeo exógeno de uma maneira preferida de tecido masculino, caracterizado pelo fato de compreender a introdução, na planta, da sequência de nucleotídeo exógeno operativamente ligada a uma região reguladora preferida de tecido masculino que compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID NO: 2, de modo a restaurar a fertilidade da planta estéril.

2 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa de introdução ser realizada por bombardeamento de microprojéteis.

3 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado pelo fato da etapa de introdução utilizar Agrobacterium.

4 - Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato do Agrobacterium compreender um plasmídeo Ti.

5 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da região reguladora expressar-se de uma maneira preferida de tecido masculino, em tecidos selecionados do grupo que consiste em pólen, tapete, antera, pendão, células-mães de pólen e micrósporos.

6 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da porção que expressa tecido masculino preferido da região reguladora preferida de tecido masculino estar presente em mais de uma cópia.

7 - Processo de mediação de fertilidade em uma planta caracterizado pelo fato de compreender a produção de uma planta transformada onde a região reguladora preferida de tecido masculino de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, operativamente ligada ao gene exógeno, expressa a sequência de nucleotideo exógeno, de modo a restaurar a fertilidade da planta estéril.

8 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da sequência de nucleotideo exógeno compreender uma sequência de DNA que codifica um sistema regulador procariótico.

9 - Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato da planta ser um monocotiledôneo.

10 - Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato da planta ser um dicotiledôneo.