HU225002B1 - Hímszövet-specifikus szabályzórégió és alkalmazására szolgáló eljárás - Google Patents
Hímszövet-specifikus szabályzórégió és alkalmazására szolgáló eljárás Download PDFInfo
- Publication number
- HU225002B1 HU225002B1 HU0002578A HUP0002578A HU225002B1 HU 225002 B1 HU225002 B1 HU 225002B1 HU 0002578 A HU0002578 A HU 0002578A HU P0002578 A HUP0002578 A HU P0002578A HU 225002 B1 HU225002 B1 HU 225002B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plant
- male
- tissue
- gene
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 79
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 150
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 128
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 124
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 57
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 55
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 42
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 30
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims description 15
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims description 15
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 9
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 claims description 8
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 101150075111 ROLB gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 7
- 108010031746 Dam methyltransferase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 5
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 claims description 5
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002363 auxin Substances 0.000 claims description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 5
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 claims description 3
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 2
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 claims description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 claims 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims 1
- 108010060641 flavanone synthetase Proteins 0.000 claims 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 17
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 16
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 8
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 7
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 4
- 101710196632 LexA repressor Proteins 0.000 description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 description 3
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 244000275904 brauner Senf Species 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 description 2
- DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N Chalcone Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710190411 Chalcone synthase A Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- -1 media Substances 0.000 description 2
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 2
- 230000023409 microsporogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 2
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 description 2
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007103 stamina Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical compound O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241000189662 Calla Species 0.000 description 1
- 101001033883 Cenchritis muricatus Protease inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000715 Mucilage Polymers 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 241001582367 Polia Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 108050004197 Trp repressor Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 244000047670 Viola x wittrockiana Species 0.000 description 1
- 235000004031 Viola x wittrockiana Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000007152 anther development Effects 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N atrazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NC(C)C)=N1 MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000004049 embossing Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010079502 exoribonuclease T Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000006543 gametophyte development Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000023439 meiosis II Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108090000446 ribonuclease T(2) Proteins 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000016853 telophase Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 235000019505 tobacco product Nutrition 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N vanadium atom Chemical compound [V] LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12N9/1037—Naringenin-chalcone synthase (2.3.1.74), i.e. chalcone synthase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01039—Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase (3.2.1.39)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
- C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
- C12Y602/01003—Long-chain-fatty-acid-CoA ligase (6.2.1.3)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány tárgyát eukarióta sejtekben szabályozórégióként működő, izolált DNS-szekvenciák képezik. Közelebbről, a találmány tárgyát olyan kukoricából származó, izolált DNS-szekvenciák képezik, amelyek hímszövet-specifikus szabályozórégióként képesek működni, és hímszövetekben végbemenő génexpresszióban játszanak szerepet. A találmány felölel egy, a hímszövetekben normálisan akár expresszálható, akár nem expresszálható gének átalakítására szolgáló eljárást is, melynek végrehajtását követően a gén képes lesz hímszövet-specifikus módon expresszálódni.
A találmány szerinti eljárás alkalmas előnyös sajátságokkal rendelkező új transzgenikus haszonnövények előállítására.
Szövetre vagy időpontra specifikus génexpresszió és szabályozás található többek között eukariótákban végbemenő szexuális szaporodás alatt. A növényi gametogenezisben jelentős citológiai és biokémiai változások zajlanak le a pollen kifejlődése alatt, amelyben a haploid mikrospórák aszimmetrikus mitotikus osztódása két sejt kialakulását eredményezi eltérő fejlődési vonallal. A vegetatív sejt a pollennövekedést segíti, míg a generatív sejt mitózison megy keresztül, és spermasejtekké fejlődik. Mindkét folyamatsorra specifikus messenger RNS-eket azonosítottak például az alábbi növényekből származó pollenben: kukorica, dohány, rizs és árvácska; és pollenre vagy a portokban lévő egy vagy több más sejttípusra, például tapétumra, epidermiszre és sztómiumra specifikus mRNS-t is azonosítottak.
A pollenben végbemenő génexpresszióban, a differenciálódás alatt szerepet játszó gének számát 24,000-re becsülik [Willing és munkatársai, „An Analysis of the Quantity and Diversity of mRNA’s From Pollen and Shoots of Zea mays”, Theor. App. Génét. 75, 751-753 (1988)], azonban cDNS-könyvtárból származó kiónoknak csak 10%-a hímspecifikus [Stinson és munkatársai, „Genes Expressed in Male Gametophyte and Their Isolation”, Plánt Physiol. 83, 442-447 (1987)], és pollenben expresszálódó pollenspecifikus gének aránya 5% és 80% között van [Willing és munkatársai, „An Analysis of the Quantity and Diversity of mRNA’s From Pollen and Shoots of Zea mays, Theor. App. Génét. 75, 751-753 (1988)]. A mikrosporogenezis ezen komplex folyamata több géntermék egymás utáni termelődéséből áll.
Növényekből már klónoztak hímspecifikus géneket: ezek közül kettő esetében kimutatták, hogy pollenfejlődéshez szükségesek: a kukoricából származó Ms45-génről (5.478.369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) és az Arabidopsisbó\ származó Ms2-génről [Mark, G. M. és munkatársai, Natúré 363, 715-717 (1993)]. Más, növényi eredetű hímspecifikus promoter: Zm13, PG és SGB6.
A Zm13-promotert az 5.086.169 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik. 1315 bázispárból áll, és Hanson és munkatársai által leírt [Plánt Cell. 1, 173-179 (1989)], pollenspecifikus génből származik. Ez a gén csak pollenben található mRNS-hez hibridizálódik.
Egy másik izolált és jellemzett pollenspecifikus promoter pollenspecifikus poligalakturonázgéntől (PG) szintézisiránnyal szemben található (5.412.085 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Ez a promoterrégió 2687 bázispárból áll, és túlnyomórészt pollenben és kiemelkedett címerben expresszálódik, de még ki nem emelkedett címerben nem. Az 5.545.546 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szintén Allén ismertet egy másik, kukoricában található poligalakturonázgénből származó pollenspecifikus promotert. Ez csak pollenben és kiemelkedett címerben expresszálódik.
Az 5.470.359 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban kukoricából származó, SGB6génből származó szabályozórégiót írnak le, amely tapétumspecifitást határoz meg. Az expresszió helyének szövete, a tapétum egy sejtréteg, amely körbeveszi a mikrosporogén sejteket a portokban, és valószínűleg tápanyagellátást biztosít.
Kilenc dohányból származó, portokspecifikus cDNS-t és genomi kiónt írnak le az 5.477.002 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. A cDNS-klónokat Northern-analízissel portokspecifikusnak találták, fejlődési profiljuk eltérő volt. Az Ant32-klón tapétumspecifikus volt.
A 0420819A1 számú európai közzétételi irat eljárást ismertet hímsteril növények előállítására wun1-gén alkalmazásával.
A PCT WO 90/08825 számú nemzetközi közzétételi iratban TA13, TA26 és TA29 jelű, portokspecifikus cDNS-eket és hímsteril rendszerben való alkalmazásukat ismertetik.
A PCT WO 90/08825 számú nemzetközi közzétételi iratban pMS10, pMS14 és pMS18 jelű hímsterilitást meghatározó géneket és alkalmazásukat ismertetik GUS-riportergénnel.
Az 5.589.610 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy portokspecifikus cDNS-nek megfelelő promotert és AC444 jelű cDNS-t ismertetnek részletesen.
Növényi promoter és exogén gén alkalmazása növény genetikai felépítésének megváltoztatására már ismert a szakirodalomban (5.432.068, 5.412.085, 5.545.546, 5.470.359 és 5.478.369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások). Ezekben a szabadalmi leírásokban olyan növényi expressziós kazettákat tárgyalnak, amelyek szövetspecifikus promotert tartalmaznak egy génhez kapcsolva, ezzel hatással vannak hímsterilitásra, hímtermékenységre vagy más módon biztosítanak génexpressziót specifikus szövetben. Azonban ezen szabadalmi leírások kitanításai szerint nem alkalmaznak hímszövet-specifikus szabályozórégiót vagy hímszövet-specifikus szabályozórégiót exogén génnel a hímsterilitás szabályozására szolgáló eljárásokban.
A találmány tárgyát hímszövet-specifikus szabályozórégió képezi, és alkalmazására szolgáló eljárások. Exogén gén hímszövet-specifikus expressziója képes hímtermékenységet mediálni, és sokféle rendszerben hasznos, például hibrid mag előállítására.
HU 225 002 Β1
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki eljárás kidolgozását exogén gének hímszövet-specifikus expresszálására olyan expressziós vektor alkalmazásával, amely az exogén gén hímszövet-specifikus expresszióját biztosítja. Ezt az eljárást termékenység helyreállítására (mint például hímsteril rendszerben) vagy a termékenység más módon való befolyásolására (mint például hibrid mag előállítására) alkalmazhatjuk. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során további célként tűztük ki olyan DNS-szabályozó régió előállítását is, amely hímszövet-specifikus génexpressziót biztosít. Célul tűztük ki hímszövet-specifikus szabályozórégió előállítását is, vagy ezzel előnyösen körülbelül 70%, 75% vagy 80%, előnyösebben körülbelül 85% vagy 90%, és legelőnyösebben körülbelül 95% vagy 99% szekvenciaazonosságot mutató régió elállítását.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki Ms45-eredetű, hímszövet-specifikus szabályozórégiókat kódoló, izolált nukleinsavszekvencia előállítását.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki Zea maysból származó, Ms45, hímszövet-specifikus szabályozórégiókat kódoló, izolált nukleinsavszekvencia előállítását, amely 1. azonosító számú nukleinsavszekvenciát vagy ezzel szekvenciaazonosságot mutató szekvenciát tartalmaz. Célul tűztük ki Zea maysból származó, Ms45 jelű, hímszövet-specifikus szabályozórégiókat kódoló, olyan izolált nukleinsavszekvencia előállítását is, amely 2. azonosító számú nukleinsavszekvenciát vagy ezzel szekvenciaazonosságot mutató szekvenciát tartalmaz.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki 1. azonosító számú szekvenciával rendelkező vagy ezzel szekvenciaazonosságot mutató, izolált nukleinsavszekvenciát, és ezzel működőképesen kapcsolt, exogén gént kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó rekombináns expressziós vektor előállítását, amelyben a nukleotidszekvencia hímszövet-specifikus módon expresszálódik, ily módon elősegíti az exogén gén expresszióját.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki olyan exogén gén előállítását, amely az Ms45 exogén gén.
Célul tűztük ki exogén nukleotidszekvenciát hímszövet-specifikusan expresszálni képes, transzformált növény előállítására szolgáló eljárás kidolgozását, amelyben bevisszük a növénybe az exogén nukleotidszekvenciát olyan hímszövet-specifikus szabályozórégióhoz kapcsolva, amely 1. azonosító számú szekvenciával rendelkező vagy ezzel szekvenciaazonosságot mutató, izolált nukleotidszekvenciát tartalmaz. Az eljárásban a beviteli lépést végezhetjük mikrorészecskebombázással, alkalmazhatunk Ti-plazmidot tartalmazó Agrobacteriumot vagy transzfervektort. Az exogén nukleotidszekvenciából lehet egynél több kópia is hímszövet-specifikus szabályozórégióhoz működőképesen kapcsolva.
Célul tűztük ki eljárás kidolgozását hímszövet-specifikus expresszióra, a hímszövet-specifikus szabályozórégió alkalmazásával olyan szövetekben, mint például pollenben, tapétumban, portokban, címerben, pollenanyasejtekben vagy mikrospórákban.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki exogén nukleotidszekvenciát hímszövet-specifikusan expresszálni képes, transzformált növény előállítását, amely exogén nukleotidszekvenciát olyan hímszövet-specifikus szabályozórégióhoz kapcsolva tartalmaz, amely 1. azonosító számú szekvenciával rendelkező vagy ezzel szekvenciaazonosságot mutató, izolált nukleotidszekvenciát tartalmaz. A növény egyszikű vagy kétszikű. Bármilyen transzformálható növényt alkalmazhatunk, például kukoricát, napraforgót, szójababot, búzát, kanolát, rizst vagy cirokot. A találmány tárgyát képezi a transzformált növény transzformált szövete. A transzformált szövet származhat például pollenből, kalászokból, magkezdeményekből, portokokból, címerekből, porzólevelek bibéjéből vagy növényi sejtekből. A transzformált növény tartalmazhat egynél több kópia exogén nukleotidszekvenciát hímszövet-specifikus szabályozórégióhoz működőképesen kapcsolva.
Célul tűztük ki eljárás kidolgozását termékenység mediálására növényben, amelyben a hímszövet-specifikus szabályozórégió vezérletével exogén nukleotidszekvenciát expresszálunk, ezáltal befolyásoljuk a termékenységet. Ez az exogén nukleotidszekvencia lehet bármilyen, hímtermékenységet befolyásolni képes szekvencia, és lehet például komplementer nukleotidegység, például antiszensz molekulák (kalláz antiszensz RNS, barnáz antiszensz RNS és kalkon-szintetáz antiszensz RNS, Ms45 antiszensz RNS) vagy ribozimok és külső vezetőszekvenciák, aptamerek vagy egyszálú nukleotidok. Az exogén nukleotidszekvencia kódolhat auxinokat, rolB-t, citotoxinokat, diftériatoxint, DAM-metilázt, avidint is, vagy származhat prokarióta szabályozórendszerből. Az exogén nukleotidszekvencia hímsterilitást biztosító gén vagy Ms45 strukturális gén is lehet, és a növény egyszikű vagy kétszikű.
Célul tűztük ki eljárás kidolgozását hibrid mag előállítására, amelyben egy hímtermékeny növényt és a fentebb leírt eljárás szerint előállított, hímterméketlen növényt keresztbeporzást biztosító juxtapozícióban elültetünk, ezáltal lehetővé tesszük a keresztbeporzást, és az eredményül kapott magokat kifogjuk. A növények lehetnek kukoricanövények.
Ezeket és más célokat a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint egy izolált DNS-molekula előállításával érjük el, amely DNS-molekula 1. azonosító számú nukleotidszekvenciát tartalmaz.
A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány tárgya exogén gént tartalmazó expressziós vektor, amelyben hímszövet-specifikus szabályozórégió vezérli az exogén gén expresszióját, és az exogén gén terméke hatással van a hímtermékenységre.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya eljárás hímsteril növény előállítására ilyen expressziós vektor alkalmazásával, amelyben az expressziós vektort bevisszük nö3
HU 225 002 Β1 vényi sejtekbe, amelyben az expressziós vektor által tartalmazott exogén gén lehet komplementer nukleotidegység, például antiszensz molekulák (kalláz antiszensz RNS, barnáz antiszensz RNS és kalkon-szintetáz antiszensz RNS, Ms45 antiszensz RNS), ribozimok és külső vezetőszekvenciák, aptamer vagy egyszálú nukleotidok. Az exogén nukleotidszekvencia kódolhat auxinokat, rolB-t, citotoxinokat, diftériatoxint, DAM-metilázt, avidint is, vagy szelektálhatjuk prokarióta szabályozórendszerből.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya eljárás hímtermékeny hibrid növény előállítására hímszövet-specifikus szabályozórégió alkalmazásával, amely az alábbi lépéseket tartalmazza:
a) előállítunk egy első szülői hímsteril növényt, amely hímszövet-specifikus szabályozórégiót és egy első exogén gént tartalmazó expressziós vektort tartalmaz, amelyben a hímszövet-specifikus szabályozórégió vezérli az első exogén gén expresszióját, és az első exogén gén terméke megszünteti a hímtermékenységet;
b) előállítunk egy második szülői növényt, amely egy második exogén gént tartalmazó expressziós vektort tartalmaz, amelyben a szabályozórégió úgy vezérli a második exogén gén expresszióját, hogy az hímszövetekben expresszálható;
c) keresztbeporzást végzünk az első szülői növényen a második szülői növénnyel hibrid növény előállítása céljából, amelyben a hibrid növény hímszövetei a második exogén gént expresszálják, és amelyben a második exogén gén terméke megakadályozza a címerfunkció megszüntetését, melyet az első exogén géntermék idéz elő, ezáltal előállítunk hímtermékeny hibrid növényt.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya eljárás hímtermékeny hibrid növény előállítására hímszövet-specifikus szabályozórégió alkalmazásával, amely az alábbi lépéseket tartalmazza:
a) előállítunk egy első szülői hímsteril növényt, amelyben a hímtermékenység expressziójában szerepet játszó első gént hatástalanítjuk;
b) előállítunk egy második szülői növényt, amely hímszövet-specifikus szabályozórégiót és egy második exogén gént tartalmazó expressziós vektort tartalmaz, amelyben a hímszövet-specifikus szabályozórégió úgy vezérli az exogén gén expresszióját, hogy az hímszövetekben expresszálható és funkcionálisan képes komplementálni az a) pontban hatástalanított gént;
c) keresztbeporzást végzünk az első szülői növényen a második szülői növénnyel hibrid növény előállítása céljából, amelyben a hibrid növény hímszövetei az exogén gént expresszálják, és amelyben az exogén gén terméke megakadályozza a címerfunkció megszüntetését, ezáltal előállítunk hímtermékeny hibrid növényt.
Az 1. ábrán az Ac4.1 Ms45 genomi kiónt és restrikciós helyeket ábrázolunk.
A 2. ábrán a PHP6045-plazmid látható.
A 3. ábrán a primer meghosszabbításos reakciók termékeiről készített autoradiogram látható, az Ms45 transzkripciós starthely megjelölésével. G, A, T, C-vel jelölt sávok megfelelnek ddGTP, ddATP, ddTTP és ddCTP dezoxinukleotidokkal sorrendben végzett szekvenálóreakcióknak. Az 1-4. sávok megfelelnek (1) címerekből, (2) levelekből, (3) portokokból és (4) levelekből származó mRNS-sel végzett primer meghosszabbításos reakcióknak.
A 4. ábrán az Ms45-ből származó, hímszövet-specifikus szabályozórégió fejlettségi állapotra vonatkozó specifitását szemléltetjük.
Az 5. ábrán szövetspecifitást szemléltetünk nem hímszövetben.
A 6. ábrán portokból származó mRNS-sel végzett Northern-analízis géljét mutatjuk be, az Ms45 hímtermékenységet biztosító génnel hibridizáltatva.
A 7. ábrán TATA-box mutációs analízisének eredményeit mutatjuk be.
Az idézett valamennyi hivatkozást a kitanítás részének tekintjük. Hacsak másképpen nem definiáljuk, valamennyi műszaki és tudományos kifejezést olyan értelemben alkalmazzuk, ahogyan a találmány tudományterületén jártas szakember számára szokásosan érthető. Hacsak másképpen nem állítjuk, az alkalmazott vagy tervezett technikák szakember által ismert standardmódszerek. Az anyagok, módszerek és példák csak szemléltetés célját szolgálják, amellyel nem kívánjuk az igényelt oltalmi kört korlátozni.
Az alábbi leírásban számos kifejezést használunk széles körben. Az alábbi definíciók a találmány szerinti megoldás megértését segítik elő.
1. Definíciók
Szekvenciaazonosságon vagy -hasonlóságon két polipeptidszekvencia vagy két polinukleotidszekvencia közötti kapcsolatot értünk, melyet a szekvenciák összehasonlításával határozunk meg. Szakember számára az azonosság két polipeptid- vagy két nukleotidszekvencia közötti szekvenciarokonság fokát is jelenti, melyet ilyen szekvenciák két szála közötti egyezések határoznak meg. Az azonosságot és a hasonlóságot egyaránt könnyen ki lehet számítani [„Computational Molecular Biology”, szerk. Lesk, A. M.; Oxford University Press. New York (1988); „Biocomputing: Informatics and Genome Projects”, szerk. Smith, D. W.; Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data” (I. rész), szerk. Griffin, A. M. és Griffin H. G.; Humana Press, New Jersey (1994); von Heinje, G., „Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press (1987); és „Sequence Analysis Primer, szerk. Gribskov, M. és J. Devereux, M. Stockton Press, New York (1991)]. Mivel számos módszer létezik az azonosság és hasonlóság meghatározására két polinukleotid- vagy két polipeptidszekvencia között, szak4
HU 225 002 Β1 ember számára mindkét kifejezés jól ismert [von Heinje, G., „Sequence Analysis in Molecular Biology”, Academic Press (1987); és „Sequence Analysis Primer”, szerk. Gribskov, M. és J. Devereux, M. Stockton Press, New York (1991); és Carillo, H. és D. Lipman, SIAM, J. Applied Math. 48, 1073 (1988)]. Két polinukleotid- vagy két polipeptidszekvencia közötti azonosság vagy hasonlóság meghatározására általánosan alkalmazott módszereket leírnak például Carillo, H. és D. Lipman, SIAM, J. Applied Math. 48, 1073 (1988). Az azonosság meghatározására szolgáló előnyös módszereket úgy tervezik, hogy a legnagyobb egyezést adja a két tesztelt szekvencia között. Az azonosság és hasonlóság meghatározására szolgáló eljárások számítógépes programokon alkalmazhatók. Két szekvencia közötti azonosság és hasonlóság meghatározására szolgáló előnyös számítógépes program például a GCG-programcsomag [Devereux, J. és munkatársai, Nucleic Acids Research 12, 387 (1984)], BLASTP, BLASTN és FASTA [Atschul, S. F. és munkatársai, J. Molec. Bioi. 215,403(1990)].
A hímszövet olyan sejtek által felépített szövetekből áll, amelyek közvetlenül szerepet játszanak hím gaméták, például pollen, tapétum, portok, címer, pollenanyasejtek és mikrospórák reprodukciójában, vagy elősegítik azt. A tapétum a portokban pollenanyasejtekkel és mikrospórákkal legközelebbi kapcsolatban álló szövet, és valószínűleg a fejlődő pollenszemcsék tápanyagellátásában játszik szerepet. A pollenanyasejtek két meiotikus osztódáson mennek keresztül, amelyben haploid mikrospórák tetrádja képződik. A mikrospórák pollenszemcsékké érnek. A pollen vagy pollenszemcsék érett, hím gametofiták, amelyek képesek kompatibilis növényeket megtermékenyíteni. A portok a porzólevél (stamina) része, amelyben a pollen termelődik, a porzólevél fennmaradó része porzószálból (filamentum) áll, amelyen a portok függ. A porzólevél a virág hímszerve.
A hímszövet-specifikus szabályozórégió olyan nukleotidszekvencia, amely asszociált gén fokozott mértékű expresszióját vezérli hímszövetekben, amely expresszió nagyobb mértékű, mint néhány más vagy valamennyi növényi szövetben. Például a leírás szerinti Ms45-gént portokokban lehet detektálni a négyes haploid, négyes haploid kiszabadulási és a korai egysejtmagvas fejlettségi állapotban. A portok fejlődésének fázisait részletesen lásd: Chang, Μ. T. és M. G. Neuffer, „Maize Microsporogenesis”, Genome 32, 232-244 (1989). Az Ms45-gén hímszövet-specifikus szabályozórégiója működőképesen kapcsolt gén expresszióját vezérli hímszövetekben. Az expresszió előnyben részesített szövete hímszövet, nem például gyökér vagy csírahüvely (koleoptil) szövete. A túlsúlyban lévő expresszió hímszövetekben történik, például pollenben, tapétumban, portokban, címerben, pollenanyasejtekben és mikrospórákban. Ez a hímszövet-specifikus expresszió fokozott mértékű expresszióra utal hímszövetekben, de szükségszerűen nem zár ki más szöveteket.
A mediálás pozitív vagy negatív módon való befolyásolást jelent, vagy valamilyen kimenetel befolyásolását, például termékenységgel vagy bármilyen más tulajdonsággal.
A hímtermékenység akkor befolyásolt, ha nem normáltermékenységet tapasztalunk; ez lehet csökkent mértékű termékenység vagy olyan termékenység, amely különbözik időzítésében vagy más tulajdonságában.
Az izolált azt jelenti, hogy emberi beavatkozással megváltoztattuk természetes állapotát; azaz ha természetes körülmények között előfordul, megváltoztattuk eredeti környezetét vagy eltávolítottuk eredeti környezetéből, vagy mindkettő megtörtént. Például egy élő szervezetben természetes körülmények között jelen lévő, természetesen előforduló polinukleotid vagy polipeptid nem „izolált”, de ugyanezt a polinukleotidot vagy polipeptidet elválasztva azon anyagoktól, amelyekkel természetes állapotban együtt előfordul, a leírás szerint „izolált’’-nak tekintjük. Például polinukleotidok vonatkozásában az „izolált” kifejezés azt jelenti, hogy el van választva attól a kromoszómától és sejttől, amelyben természetesen előfordul. Izolálás közben vagy azután ilyen polinukleotidokat más polinukloetidokhoz kapcsolhatunk, például DNS-ekhez, mutagenezis, fúziós fehérjék előállítása és szaporítás vagy például egy gazdaszervezetben való expresszió céljából. Az izolált polinukleotidok, egyedül vagy más polinukleotidokhoz, például vektorokhoz kapcsolva bevihetők gazdasejtekbe, amelyek tenyészetben vagy teljes szervezetekben vannak. Tenyészetben vagy teljes szervezetekben lévő gazdasejtekbe való bevitel után ilyen DNS-ek a leírás szerint izoláltnak tekinthetők, mivel nem természetesen előforduló formájukban vagy környezetükben vannak. Ehhez hasonlóan a polinukloetidok és polipeptidek előfordulhatnak készítményben, például táptalaj formákban, a polinukleotidoknak vagy polipeptideknek például sejtekbe való bevitelére szolgáló oldatokban, kémiai vagy enzimatikus reakciókra szolgáló készítményekben vagy oldatokban, például amelyek nem természetesen előforduló készítmények, és ezekben a polinukleotidok vagy polipeptidek a leírásban alkalmazott értelemben izoláltak maradnak.
A leírásban egy exogén gén olyan DNS-szekvenciát jelent, amelyet bevittünk vagy visszavittünk egy szervezetbe. Például bármilyen gént, még az Ms45 strukturális gént is exogén génnek tekintjük, ha a gént bevittük vagy visszavittük a szervezetbe.
2. Hímszövet-specifikus szabályozórégió izolálása
Bár szakember által ismert, hogy portokspecifikus promoterek és gének aktívak hímszövetekben [McCormick és munkatársai, „Anther-Specific Genes: Molecular Characterization and Promoter Analysis in Transgenic Plants”, „Plánt Reproduction: From Flórái Induction to Pollination” című könyvben, szerk. Lord és munkatársai, 128-135. old. (1989); Scott és munkatársai, WO 92/11379 számú nemzetközi közzétételi irat; van dér Meer és munkatársai, The Plánt Cell. 4, 253 (1992)], nincsen általánosan elfogadott elv vagy strukturális követelmény olyan DNS-szekvenciák felismerésére, amelyek egy gén számára hímszövetben biztosí5
HU 225 002 Β1 tanak expressziót kukoricában. Ennek következtében nem lehet izolálni hímszövet-specifikus szabályozórégiót kukoricából származó genomi könyvtárból olyan konszenzusszekvenciákra való szkríneléssel, amelyek hímszövet-specifikus expressziót tesznek lehetővé.
Például ilyen szekvenciák hibridizációját végre lehet hajtani alacsonyan sztringens, közepesen sztringens, sőt nagymértékben sztringens körülmények között (például olyan körülmények között, amelyet 35-40% formamid 5X Denhardt-féle oldattal, 0,5% SDS és IxSSPE 37 °C-on; olyan körülmények között, amelyet 40-45% formamid 5X Denhardt-féle oldattal, 0,5% SDS és IxSSPE 42 °C-on; olyan körülmények között, amelyet 50% formamid 5X Denhardt-féle oldattal, 0,5% SDS és IxSSPE 42 °C-on végzett mosás, sorrendben, sztringenciája jelent). Nukleinsavak standard hibridizációjához közepesen sztringens körülmények alkalmazása megfelelő a leírás szerinti hímszövet-specifikus szabályozórégiók, valamint más gének azonosítására [lásd például Sambrook és munkatársai, „Molecular Cloning: a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)]. Általában hímszövet-specifikus szabályozórégiót kódoló szekvenciák ezzel előnyösen 70%, 75% vagy 80%, előnyösebben 85% vagy 90%, és legelőnyösebben 95% vagy 99% szekvenciaazonosságot mutatnak.
Nukleinsavszekvenciák hibridizáltatására szolgáló módszerek bőven rendelkezésre állnak a szakirodalomban. Szélesztett DNS-könyvtárak hibridizációs szkrínelésére [lásd például Sambrook és munkatársai, „Molecular Cloning: a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)] vagy kódolószekvenciák amplifikálása polimeráz-láncreakció alkalmazásával [lásd például Innis és munkatársai, „PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications”, Academic Press (1990)] jól ismert technika genomi DNS izolálására.
Szabályozórégiókat funkcionális analízis alkalmazásával lehet azonosítani genomi szubklónokban, melyet rendszerint riportergén expressziójának megfigyelésével igazolunk portokszövetben, és a riportergén expressziójának csökkenésével vagy hiányával nem portok szövetben. Ezt az általános megközelítést szemléltetjük lentebb, a 3. példában. A szabályozórégiók meglétének lehetőségét a transzkripciós starthelytől „szintézisiránnyal szemben” vagy ,,5’-irányban” olyan DNS-fragmens szubklónozásával lehet tesztelni, amely tartalmazza az 5’-végi régiót, így kis fragmenseket szubklónozunk expressziós vektorokba tranziens expressziós kísérletekben. Azt várjuk, hogy kisebb fragmensek hímszövet-specifikus expresszióhoz esszenciális régiókat tartalmaznak. Például a CaMV 19S- és 35S-promoterek esszenciális régióit egy nagyobb genomdarabból származó, viszonylag kis fragmensben azonosították, az 5.352.605 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint.
Általában hímszövet-specifikus szabályozórégiót kódoló szekvenciák ezzel előnyösen 70%, 75% vagy 80%, előnyösebben 85% vagy 90%, és legelőnyösebben 95% vagy 99% szekvenciaazonosságot mutatnak.
Deléciós analízis végezhető a szabályozórégió 5’és 3’-végeiről egyaránt: fragmensekhez juthatunk linkerpásztázó mutagenezissel, polimeráz-láncreakciót alkalmazó mutagenezissel és hasonlókkal [„Directed Mutagenesis; A Practical Approach”, IRL Press (1991)]. A 3’-deléciók nagyjából vázolhatják a hímszövet-specifikus szabályozórégiót, és azonosíthatják a 3’-véget, így ezt az esszenciális régiót azután működőképesen kapcsolhatjuk egy kiválasztott magpromoterhez. Ha egyszer az esszenciális régiót azonosítottuk, exogén gén transzkripcióját lehet szabályozni Ms45-ből származó hímszövet-specifikus régióval plusz egy magpromoterrel. A magpromoter bármilyen ismert magpromoter lehet, például karfiol-mozaikvírusból származó 35S- vagy 19S-promoter (5.352.605 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), ubiqutin (5.510.474 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), az IN2-magpromoter (5.364.780 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) vagy görvélyfű-mozaikvírusból származó promoter [Gruber és munkatársai, „Vectors fór Plánt Transformation”, „Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology” című könyvben, szerk. Glick és munkatársai; CRC Press, 89-119. old. (1993)]. A promoter előnyösen hímszövet-specifikus gén promoteréből származó magpromoter vagy a CaMV 35S-magpromoter. A promoter előnyösebben hímszövet-specifikus gén promoteréből származó magpromoter, különösen Ms45-eredetű magpromoter.
További mutációs analízissel funkcionális módosításokat lehet végezni, például az expresszió mértékében, az expresszió időzítésében vagy az expresszálószövetben. A mutációk lehetnek „csendesek” és megfigyelhető hatás nélküliek.
3. A régió inszertálása expressziós vektorba
Megfelelő expressziós vektor kiválasztása, amellyel funkcionális expressziót kívánunk tesztelni, függ a gazdaszervezettől és az expressziós vektornak a gazdaszervezetbe való bevitelére szolgáló eljárástól, és ilyen eljárások szakember számára jól ismertek. Eukarióták esetén a vektorban lévő régiók olyan régiók, amelyek a transzkripció iniciációját szabályozzák és az érést szabályozzák. Ezek a régiók működőképesen vannak kapcsolva egy riportergénhez, például β-glükuronidázgénhez (GUS-génhez) vagy luciferázhoz. Növényi expressziós vektorok és riportergének általános leírását lásd Gruber és munkatársai, „Vectors fór Plánt Transformation”, „Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology című könyvben, szerk. Glick és munkatársai; CRC Press, 89-119. old. (1993). GUS expressziós vektorok és GUS-génkazetták a kereskedelemben rendelkezésre állnak a Clontech cégnél (Palo Alto, CA), míg luciferáz expressziós vektorok és luciferázgén-kazetták rendelkezésre állnak a Promega Corporation cégnél (Madison, Wl). Ti-plazmidokat és más Agrobacterium-vektorokat leírnak Ishida, Y. és munkatársai, Natúré Biotechnology 14, 745-750 (1996) és az 5.591.616 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban: „Method fór Transforming Monocotyledons”, benyújtva 1994. május 3-án.
HU 225 002 Β1
Genomi fragmensekben lévő, feltételezett szabályozórégiót tartalmazó expressziós vektorokat bevihetünk intakt szövetekbe, például bizonyos fázisban lévő portokokba, embriókba vagy kalluszba. DNS célba juttatására szolgáló módszer például mikrorészecskebombázás, DNS-injekció, elektroporáció és Agrobacterium-közvelitett géntranszfer [Gruber és munkatársai, „Vectors fór Plánt Transformation”, „Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology” című könyvben, szerk. Glick és munkatársai; CRC Press, 89-119. old. (1993); 5.591.616 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás: „Method fór Transforming Monocotyledons”, benyújtva 1994. május 3-án; és Ishida, Y. és munkatársai, Natúré Biotechnology 14, 745-750 (1996)]. Növényi szövetek tenyésztésére szolgáló általános módszerek leírását lásd: Gruber és munkatársai, „Vectors fór Plánt Transformation”, „Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology” című könyvben, szerk. Glick és munkatársai; CRC Press, 89-119. old. (1993).
Tranziens vizsgálati eljárást tartalmazó rendszerben bizonyos állapotban lévő, izolált portokokat azonnal címertenyésztésre alkalmas, 0,5% Phytagellel (Sigma, St. Louis) szilárdított táptalajra [Pareddy, D. R. és J. F. Petelino, Crop. Sci. J. 29, 1564-1566 (1989)] vagy más szilárdított táptalajra helyezünk. Az expressziós vektor-DNS-t 5 órán belül visszük be, előnyösen mikrorészecskeközvetített célba juttatással, 1,2 μ méretű részecskék és 1000-1100 Psi nyomás alkalmazásával. A DNS bevitele után a portokokat 26 °C-on inkubáljuk ugyanezen címertenyésztésre alkalmas táptalajon 17 óra hosszáig, és analízis céljából teljes szövethomogenizátumot preparálunk, és GUS- vagy luciferázaktivitást vizsgálunk [Gruber és munkatársai, „Vectors fór Plánt Transformation”, „Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology” című könyvben, szerk. Glick és munkatársai; CRC Press, 89-119. old. (1993)].
A fentebb leírt módszereket olyan DNS-szekvenciák azonosítására alkalmaztuk, amelyek génexpressziót hímszövet-specifikus módon szabályoznak. Ilyen régiót azonosítottunk teljes hosszúságú, Ms45-eredetű hímszövet-specifikus szabályozórégióként (1. azonosító számú szekvencia). A teljes hosszúságú Ms45-eredetű hímszövet-specifikus szabályozórégióval szekvenciaazonosságot mutató TATA-box-mutánst is azonosítottunk 2. azonosító számú szekvenciaként.
A találmány tárgya tehát 1. azonosító számú szekvenciával (vagy ezzel szekvenciaazonosságot mutató szekvenciával) rendelkező DNS-molekula, és amely hímszövet-specifikus szabályozórégióként működik.
Egy feltételezett TATA-boxot lehet azonosítani primer lánchosszabbításos analízissel a 2. példában leírtak szerint, vagy a „Current Protocols in Molecular Biology” című könyvben leírtak szerint, szerk. Ausubel F. M. és munkatársai, John Wiley and Sons, New York, 4.8.1-4.8.5. old. (1987).
4. Hímszövet-specifikus szabályozórégió alkalmazása termékenység szabályozására A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki módszerek kidolgozását termékenység szabályozására hímszövet-specifikus szabályozórégió alkalmazásával. Nagy jelentősége van annak, hogy ez a hímszövet-specifikus szabályozórégió exogén gén expresszióját képes szabályozni portokokban a négyes haploidtól a korai egysejtmagvas fejlettségi állapotig. Ezen időzítés gyakorlati jelentősége ebben a fejlettségi állapotban az, hogy a sterilitást indukáló gén expressziója elég korán megszünteti a portok érését ahhoz, hogy lehetővé tegye a sterilitásindukáló rendszer funkciójának vizuális megerősítését szántóföldön. Csökkentheti a felrepedések (portokokból kihullanak a pollenek) lehetőségét is. Tehát a sterilitást indukáló gén hatásai a termőföldön elegendően korai fejlettségi állapotban megnyilvánulhatnak ahhoz, hogy ez lehetővé tegyen akár kézi, akár gépi címerezést azokon a „megmenekült termékeny növényeken, amelyeket a sterilitást indukáló rendszer részleges vagy teljes hibája eredményezett.
A hímsterilitás kontrolljának egyik megközelítése a génexpresszió manipulálása a tapétumban. A tapétum egy sejtréteg, amely körbeveszi a mikrosporogén sejteket a portokban, és valószínűleg tápanyagellátást biztosít, például redukálócukrokat, aminosavakat és lipideket biztosít a fejlődő mikrospóráknak [Reznickova, C. R., Acad. Búig. Sci. 31, 1067 (1978); Nave és munkatársai, J. Plánt Physiol. 125, 451 (1986); Sawhney és munkatársai, J. Plánt Physiol. 125, 467 (1986)]. Azt találták, hogy az Ms45 nagymértékben expresszálódik a tapétumrétegben. A tapétumsejtek p-(1,3)glükanázt („kallázt”) is termelnek, amely elősegíti a mikrospórák kiszabadulását [Mepham és munkatársai, Protoplasma 70, 1 (1970)]. Tehát érzékeny egyensúly áll fenn a tapétum és a mikrosporogén sejtek között, és a tapétumfunkció bármilyen megszüntetése nagy valószínűséggel működésképtelen pollenszemcséket eredményez. Valóban ismert, hogy a tapétumban folyó biogenezis hibái hímsteril mutánsokat eredményezhetnek [Kául, „Male Sterility in Higher Plants”, „Monographs on Theoretical and Applied Genetics” című könyvben, szerk. Frankéi és munkatársai, Springer Verlag, 10. kötet, 15-96. old. (1988)]. A kalláz érés előtti vagy késői megjelenése a tapétum kifejlődése alatt szintén bizonyos típusú hímsterilitással asszociált [Warmke és munkatársai, J. Hered. 63, 103 (1972)]. Tehát a kallázgént lehet alkalmazni hímszövetfunkció megszüntetésére. Scott és munkatársai leírták tapétumspecifikus kalláz nukleotidszekvenciáját (PCT WO 93/02197 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés). Tehát azt, hogy a mikrospórák ne fejlődjenek érett pollenszemcsékké, rekombináns DNS-molekula alkalmazásával lehet indukálni, amelyben tapétumfunkciót megszüntetni képes gént alkalmazunk tapétumspecifikus szabályozószekvenciák kontrollja alatt.
A hímsterilitás befolyásolására szolgáló egyik általános megközelítésben olyan expressziós vektort állítanak elő, amelyben hímszövet-specifikus szabályozórégió van olyan nukleotidszekvenciához működőképesen kapcsolva, amely hímszövetfunkciót megszüntetni képes fehérjét kódol, terméketlenséget eredményezve. Hímszövetfunkciót megszüntetni képes fehérjék pél7
HU 225 002 Β1 dául celluláris funkcióhoz esszenciális makromolekulák szintézisét gátló fehérjék, celluláris funkcióhoz esszenciális makromolekulákat lebontani képes enzimek, növényi hormonok bioszintézisét vagy metabolizmusát megváltoztatni képes fehérjék, strukturális fehérjék, nem megfelelően expresszált fehérjék és hímszövetek speciális funkcióját gátolni képes fehérjék.
Például elő lehet állítani olyan expressziós vektort, amelyben hímszövet-specifikus szabályozórégió van olyan nukleotidszekvenciához működőképesen kapcsolva, amely fehérjeszintézist gátolni képes fehérjét kódol, amely lehet például citotoxin. A diftériatoxin például jól ismert fehérjeszintézis-inhibitor eukariótákban. Diftériatoxin-gént kódoló DNS-molekulákat az .American Type Culture Collection”-ből szerezhetünk be (Rockville, MD), ATCC No. 39359 vagy ATCC No. 67011, valamint lásd Fabijanski és munkatársai, EP 90902754.2 számú európai közzétételi iratot, „Molecular Methods of Hybrid Seed Production”, a példák és az alkalmazott eljárások céljából. A DAM-metiláz például jól ismert, Escherichia coliból származó enzim, amely az 5'-GATC-3’-szekvenciában az adenincsoportot módosítja N6-metil-adeninre. Cigan és Albertsen leírják, hogyan lehet alkalmazni a DAM-metilázt a termékenység befolyásolására transzgenikus növényekben (PCT/US95/15229 számú nemzetközi közzétételi irat, Cigan, A. M. és Albertsten, M. C., „Reversible Nuclear Genetic System fór Male Sterility in Transgenic Plants”). Másik példaként szolgáló, termékenységet megszüntető fehérje az avidin, melyet a 08/475.582 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Howard, J. és Albertsen, M. C. írt le, „Induction of Male Sterility in Plants by Expression of High Levels of Avidin” címmel.
Más módszer szerint a tapétumfunkció megszüntetését biológiailag fontos makromolekulát lebontani képes enzimeket kódoló DNS-szekvenciák alkalmazásával lehet elérni. Például Mariani és munkatársai [Natúré 347, 737 (1990)] kimutatták, hogy Aspergillus oryzaeből származó RN-áz-T1 vagy Bacillus amyloliquefaciensből származó RN-áz („barnáz”-nak is hívják) expressziója a tapétumban a tapétumsejtek pusztulását indukálja, hímterméketlenséget eredményezve. Quaas és munkatársai leírták [Eur. J. Biochem. 173, 617 (1988)] az RN-áz-T2 kémiai szintézisét, míg Hartley [J. Molec. Bioi. 202, 913 (1988)] a barnázgént kódoló nukleotidszekvenciát írta le.
RN-áz-T1- és barnázgénhez például úgy juthatunk, hogy megszintetizáljuk a géneket mindkét szegélyezőrégióba kötődő, hosszú láncindító oligonukleotidok alkalmazásával [lásd például „Current Protocols in Molecular Biology, szerk. Ausubel és munkatársai, John Wiley and Sons”, New York, 8.2.8.-8.2.13. old. (1987); lásd még Wosnick és munkatársai, Gene 60, 115 (1987)]. Továbbá polimeráz-láncreakciót alkalmazó, szokásosan alkalmazott technikák lehetővé teszik nagyon nagy gének szintetizálását [Adang és munkatársai, Plánt Molec. Bioi. 21,1131 (1993); Bambotés munkatársai, PCR Methods and Application 2, 266 (1993)].
Egy alternatív megközelítésben pollentermelést gátolnak növényi hormonok, például auxinok metabolizmusának megváltoztatásával. Például Agrobacterium rhizogenesből származó rolB-gén olyan enzimet kódol, amely befolyásolja az auxin metabolizmusát szabad indolok indoxil-p-glükozidokból való felszabadulásának katalizálásával. Estruch és munkatársai [EMBO J. 11, 3125 (1991)], valamint Spena és munkatársai [Theor. Appl. Génét. 84, 520 (1992)] kimutatták, hogy a rolB-gén portokspecifikus expressziója dohányban zsugorodott portokokkal rendelkező növényeket eredményezett, amelyekben a pollentermelés nagymértékben csökkent. Ennélfogva a rolB-gén például olyan gén, amely pollentermelés szabályozására alkalmas. Slightom és munkatársai leírták a rolB-gén nukleotidszekvenciáját [J. Bioi. Chem. 261, 108 (1985)].
Hímszövetfunkciót megszüntető fehérje expressziójának céljából előállítanak olyan expressziós vektort, amelyben a fehérjét kódoló DNS-szekvencia olyan nukleotidszekvenciákhoz van működőképesen kapcsolva, amelyek hímszövet-specifikus módon szabályoznak géntranszkripciót. Az expressziós vektorral szemben támasztott általános követelményeket fentebb leírtuk egy tranziens expressziós rendszer vonatkozásában. Itt azonban az előnyös módszer az expressziós vektor bevitele növényi embrionális szövetbe úgy, hogy az exogén fehérje késői fejlettségi stádiumban expresszálódjon a kifejlett növény hímszövetében. El lehet érni mitotikus stabilitást növényi vírusvektorok alkalmazásával, amelyek epikromoszomális replikációt biztosítanak.
A mitotikus stabilitás biztosítására egy másik és előnyös módszer expressziós vektorszekvencia integrációja a gazdaszervezet kromoszómájába. Ilyen mitotikus stabilitást biztosít expressziós vektor mikrorészecskebombázással való bevitele embrionális szövetbe [Gruber és munkatársai, „Vectors fór Plánt Transformation”, „Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology” című könyvben, szerk. Glick és munkatársai, CRC Press (1993)].
Transzformációs módszereket találhatunk sok növényre, például napraforgóra, szójababra, búzára, kanolára, rizsre vagy cirokra [Knittel, N. és munkatársai, J. Plánt Cell. Rep., Springer International, Berlin, W. Germany 14(2/3), 81-86 (1994); Chee, P. P. és munkatársai, Plánt Physiol. American Society of Plánt Physiologists, Rockville, MD, 91(3), 1212-1218 (1989); Hadi, Μ. Z. és munkatársai, J. Plánt Cell. Rep., Springer International, Berlin, W. Germany 15(7), 500-505 (1996); Perl, A. és munkatársai, Molecular and General Genetics 235(2-3), 279-284; Zaghmout, Ο. M. F. és N. L. Trolinder, Nucleic Acids Rés., IRL Press, Oxford, 21(4), 1048 (1993), Chen, J. L. és W. D. Beversdorf, Theor. Appl. Génét., Springer International, Berlin, W. Germany, 15(5), 322-327 (1996); Hagio és munkatársai, Plánt Cell, Rep., Springer International, Berlin, W. Germany 15(5), 322-327 (1996); Hagio, T. és munkatársai, Plánt Cell. Rep., 10(5), 260-264 (1991)], és szakember számára is ismeretesek.
A transzformált sejtek szelektálása céljából az expressziós vektor szelektálható markergént, például herbicidrezisztencia-gént tartalmaz. Ilyen gének meghatározhatnak rezisztenciát például foszfotricin, glifo8
HU 225 002 Β1 zát, szulfonil-karbamidok, atrazin, imidazolinon vagy kanamicin ellen. Bár az expressziós vektor tartalmazhat exogén fehérjét kódoló cDNS-szekvenciákat hímszövet-specifikus szabályozórégió vezérlete alatt, valamint egyidejűleg szelektálható markergént konstitutív promoter vezérlete alatt, a szelektálható markergént bevihetjük a gazdaszervezet sejtjeibe egy külön szelekciós expressziós vektorban. Embrionális szövet ilyen kotranszformációját hímszövet-specifikus szabályozórégiót tartalmazó, teszt expressziós vektorral és szelekciós expressziós vektorral lentebb szemléltetjük.
5. Sterilitás indukálása
Egy párhuzamos megközelítési módszer szerint hímsterilitást olyan expressziós vektor alkalmazásával is indukálhatunk, amelyben a hímszövet-specifikus szabályozórégió működőképesen kapcsolódik komplementer nukleotidegységet kódoló nukleotidszekvenciához. A komplementer nukleinsavmolekulák kötődése a célmolekulához úgy szelektálható, hogy inhibitorhatású legyen. Ha például a célmolekula mRNS-molekula, akkor a komplementer nukleotidegység, ebben az esetben RNS kötődése hibridizációt és a transzláció blokkolását eredményezi [Paterson és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4370 (1987)]. így egy alkalmas antiszensz RNS-molekulának, például amely az Ms45-tel komplementer, olyan szekvenciával kell rendelkeznie, amely komplementer a hímsterilitáshoz szükséges fehérjét kódoló mRNS-fajta szekvenciájával (Fabijanski, „Antisense Gene Systems of Pollination Control Fór Hybrid Seed Production”, 08/288.734 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).
Például kalláz antiszensz RNS termelése gátolná a kalláz enzim termelését, amely esszenciális a mikrospórák kiszabadulásához. Ezenkívül hímsterilitást indukálhatunk flavonoidbioszintézis gátlásával olyan expressziós vektor alkalmazásával, amely kalkon-szintetáz A-gén 3’ nem transzlálódó régiójának megfelelő antiszensz RNS-t termel [Van dér Meer és munkatársai, The Plánt Cell. 4, 253 (1992)]. A kalkon-szintetáz A-gén klónozását és jellemzését Koes és munkatársai írták le [Gene 81, 245 (1989), és Plánt Molec. Bioi. 12, 213(1989)].
Más módszer szerint olyan expressziós vektort állíthatunk elő, amelyben hímszövet-specifikus szabályozóelem működőképesen kapcsolódik ribozimot kódoló nukleotidszekvenciához. A ribozimokról azt tartják, hogy endonukleázaktivitást fejtenek ki, amely bizonyos célszekvenciákra irányul mRNS-molekulában. Például Steinecke és munkatársai [EMBO J. 11, 1525 (1992)] a neomicin-foszfotranszferáz-gén expressziójának 100%-os gátlását érték el ribozimokkal dohányprotoplasztokban. A közelmúltban Perriman és munkatársai [Antisense Research and Development 3, 253 (1993)] klór-amfenikol acetil-transzferáz-aktivitását gátolták dohányprotoplasztokban olyan vektor alkalmazásával, amely módosított kalapácsfej-ribozimot expresszált. A találmány szerinti megoldásban ribozimoknak megfelelő alkalmas cél-RNS-molekulák olyan RNS-molekulafajták lehetnek, amelyek hímtermékenységhez esszenciális fehérjéket kódolnak, például kallázmRNS-t vagy Ms45-mRNS-t.
Egy további alternatív megközelítés szerint olyan expressziós vektorokat állíthatunk elő, amelyekben hímszövet-specifikus szabályozórégió olyan RNStranszkriptumok termelését vezérli, amelyek célmRNS-molekulák RNáz-P-mediált hasítását képesek elősegíteni. Ebben a megközelítésben egy külső vezetőszekvenciát állíthatunk elő az RNáz-P, endogén ribozim vezérlésére, egy adott típusú intracelluláris mRNS-re specifikusan, amelyet azt követően a celluláris ribozim hasít [5.168.053 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Yuan és munkatársai, Science 263, 1269 (1994)]. Előnyösen a külső vezetőszekvencia 10-15 nukleotidból álló szekvencia, amely egy olyan mRNS-fajtával komplementer, amely hímtermékenységhez esszenciális fehérjét kódol, és egy 3’-RCCA-nukleotidszekvenciával, amelyben az R előnyösen purin. A külső vezetőszekvencia transzkriptumai a cél-mRNS-fajtához kötődnek az mRNS és a komplementer külső vezetőszekvencia között bázispárok kialakulásával, így elősegítik az mRNS RNáz-P általi hasítását azoknál a nukleotidoknál, amelyek a bázispárosodott régió 5’-oldalán találhatók.
Egy másik párhuzamos megközelítésben aptamertechnológiát alkalmaznak, amelyben a komplementer nukleotidegység egy olyan nukleotid, amely ligandumként szolgál egy meghatározott célmolekulához (5472841 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Ez a cél lehet hímtermékenységhez esszenciális termék vagy hímtermékenységet megszüntető termék. Ezen eljárás alkalmazásával a célmolekulára, például Ms45-re vagy avidinra specifikus aptamert szelektálhatunk, amely megköti a célt, és annak expresszióját gátolja. Az aptamert kódoló nukleotidszekvencia lehet olyan expressziós vektorok része, amelyeket úgy állítunk elő, hogy hímszövet-specifikus szabályozórégió vezérelje az aptamer termelését.
Sterilitást indukálhatunk úgy is, hogy hímtermékenységhez fontos gén, például Ms45- vagy Ms2-gén hatását megszüntetjük [Mark, G. M. és munkatársai, Natúré 363, 715-717 (1993)]. Gén hatásának megszüntetésére szolgáló módszerek szakember számára jól ismertek, például transzpozábilis elemek inszerciója vagy mutáció indukálása.
6. Hímsterilitás helyreállítása az F1-hibridben
A fentebb leírt eljárásokat lehet alkalmazni transzgenikus hímsteril kukoricanövények előállítására nagy mennyiségű F1-hibrid létrehozása céljából, beltenyésztett vonalak közötti irányított keresztezésekben. Ha a transzgenikus hímsteril növények nem mindegyik petesejtje tartalmazza az exogén gént, amely megszünteti a tapétumfunkciót, akkor az F1 -hibridek egy része hímtermékeny fenotípus lesz. Másrészt az F1-hibridek hímsteril fenotípusok lesznek, ha a transzgenikus hímsteril növények minden petesejtjében megtalálható az idegen gén, mivel az idegen gén által indukált sterilitás domináns lehet. Tehát kívánatos hímtermékenységet helyreállító rendszert alkalmazni a hímtermékeny
HU 225 002 Β1
F1-hibridek előállításának biztosítására. Ilyen termékenységet helyreállító rendszernek különös jelentősége van akkor, ha a begyűjtött termék mag, vagy ha a haszonnövények önbeporzók.
Ilyen termékenységet helyreállító rendszer különösen akkor értékes, ha a hímszövet-specifikus szabályozórégió működőképesen van kapcsolva indukálható promoterhez, például a WO 89/103396 számú nemzetközi közzétételi iratban (Mariani és munkatársai, „Plants with Modified Stamen Cells”) leírtak szerint, és az indukálható promoter külső szabályozásokra reszponzív. Ez a kapcsolt hímszövet-specifikus szabályozórégió hímszövet-specifikus szabályozórégióból, indukálható promoterből és exogén génből áll.
Hímtermékenység helyreállítására szolgáló egyik megközelítés lehet transzgenikus hímsteril növények keresztezése olyan transzgenikus hímtermékeny növényekkel, amelyek tartalmazzák a termékenységet helyreállító gént hímszövet-specifikus szabályozórégió kontrollja alatt. Fabijanski („Antisense Gene Systems of Pollination Control Fór Hybrid Seed Production”, 08/288.734 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint) például barnázinhibitort („barstar-nak nevezték) expresszáló hímtermékeny növényeket keresztezett barnázt expresszáló, hímsteril növényekkel. Hartley és munkatársai [J. Mól. Bioi. 202, 913 (1988)] közölték a „barstar” nukleotidszekvenciáját.
Egy másik megközelítésben esszenciális hímtermékenységet okozó gént hatástalanítva tartalmazó hímsteril növényeket keresztezhetünk hímszövet-specifikus szabályozórégiót és ehhez működőképesen kapcsolt, termékenységet okozó gén, például Ms45vagy Ms2-gén zavartalanul működő kópiáját tartalmazó, transzgenikus hímtermékeny növényekkel. Az Ms45-gén teljes szekvenciáját közlik az 5.478.369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, valamint Mark, G. M. és munkatársai [Natúré 363, 715-717(1993)].
Más módszer szerint a hímtermékenységet úgy állíthatjuk helyre, hogy komplementer nukleotidegységeket, például toxin ribozimjait vagy aptamereket expresszálunk hímtermékeny növényekben, a toxin hatásainak semlegesítése céljából hímsteril növényekben, így a hímtermékenység helyreállítható F1-hibridekben olyan transzgenikus hímtermékeny növényt létrehozásával, amely egy adott fajta RNS-molekulát vagy polipeptidet szintetizál, amely ellentétesen hat a hímsteril transzgenikus növényekben expresszálódó adott exogén gén hatásaival szemben.
A hímtermékenység helyreállításának egy alternatív módszere transzgenikus hímsteril növények előállítása, amelyek olyan expressziós vektort tartalmaznak, amely hímszövet-specifikus szabályozórégiót, prokarióta szabáiyozórégiót (prokarióta szabályozórendszerből) és tapétumfunkciót megszüntetni képes exogén gént tartalmaz. Olyan transzgenikus hímtermékeny növényeket állítottunk elő, amelyek prokarióta peptidet expresszálnak hímszövet-specifikus szabályozórégió vezérletével. Az így kapott, hímsteril és hímtermékeny keresztezésből származó F1-hibridekben a prokarióta pepiid prokarióta szabályozószekvenciához kötődik és represszálja a hímtermékenységet megszüntetni képes, exogén gén expresszióját. A termékenység helyreállítását célzó ezen megközelítés előnye, hogy transzgenikus hímtermékeny növény egyik formáját alkalmazhatjuk az F1-termékenység biztosítására, tekintet nélkül az exogén gén típusára, amelyet a tapétumfunkció megszüntetésére alkalmazunk a transzgenikus hímsteril növényben.
Például a találmány szerint a LexA-gén/LexA-operátorrendszert alkalmazhatjuk a génexpresszió szabályozására. Lásd 4.833.080 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást és Wang és munkatársai közleményét [Mól. Cell. Bioi. 13, 1805 (1993)]. Pontosabban, a hímsteril növény expressziós vektora tartalmazza a LexA-operátorszekvenciát, míg a hímtermékeny növény expressziós vektora tartalmazza a LexA-represszort kódoló szekvenciát. Az F1-hibridben a LexA-represszor a LexA-operátorszekvenciához kötődik, és gátolja annak az exogén génnek a transzkripcióját, amely által kódolt termék képes megszüntetni a hímtermékenységet. Ez lehet például avidin, DAM-metiláz, diftériatoxin, RNáz-T, barnáz, rolB vagy kalkon-szintetáz-A.
LexA-operátor DNS-molekulákhoz úgy juthatunk, hogy például szintetizáljuk a jól ismert LexA-operátorszekvenciát tartalmazó DNS-fragmenseket. Lásd például a 4.833.080 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, valamint Garriga és munkatársai közleményét, Mól. Gén. Génét. 236, 125 (1992). A LexA-génhez úgy juthatunk, hogy szintetizáljuk a LexA-represszort kódoló DNS-molekulát. Gén szintézisére alkalmas eljárásokat fentebb tárgyaltunk, és a LexA-gén szekvenciája pedig ismert, lásd például Garriga és munkatársai közleményét, Mól. Gén. Génét. 236, 125 (1992). Más módszer szerint a LexA-represszort kódoló DNS-molekulákhoz pRB500-plazmidból juthatunk, melynek „American Type Culture Collection” nyilvántartási száma 67758. Szakember képes összeállítani más stratégiát is a hímtermékenység helyreállítására prokarióta szabályozórendszerek, például lac-represszor/lac-operon rendszer vagy trp-represszor/trpoperon rendszer alkalmazásával.
7. A szabályozórégió esszenciális részeinek azonosítása
A szabályozórégió esszenciális részeit azonosíthatjuk a szabályozórégióban lévő nukleotidok deletálásával, hozzáadásával és/vagy szubsztituálásával szakember által jól ismert módszerek alkalmazásával. Ilyen variánsokhoz például oligonukleotidirányított mutagenezis, linkerpásztázó mutagenezis vagy polimeráz-láncreakciót felhasználó mutagenezis alkalmazásával [„Directed Mutagenesis: A Practical Approach”, IRL Press (1991)] juthatunk.
A szabályozórégióban egy sorozat 5'-deléciót lehet előállítani a meglévő restrikciós hasítóhelyek felhasználásával. Az eredményül kapott promoterfragmenseket aktivitásra lehet tesztelni, a fentebb leírt ex10
HU 225 002 Β1 pressziós vektor alkalmazásával. További finomításhoz és ábrázoláshoz juthatunk kisebb változtatásokkal, amelyek előnyösen körülbelül 50 vagy 30 nukleotidot érintenek, előnyösebben körülbelül 20 vagy 10 nukleotidot érintenek, és legelőnyösebben körülbelül 5 vagy 1 nukleotidot érintenek, a legkisebb restrikciós fragmensig, amely még a riporterkonstrukció megfelelő expresszióját biztosítja [„Directed Mutagenesis: A Practical Approach”, IRL Press (1991)]. Ezt bevihetjük az expressziós vektorba, beépített vagy természetes restrikciós hasítóhelyek felhasználásával. Egy sorozat 3’-deléciót is elő lehet állítani a fentebb tárgyaltak szerint vagy PCR-rel vagy szakember által jól ismert módszerekkel [„Directed Mutagenesis: A Practical Approach”, IRL Press (1991)]. További finomításhoz és ábrázoláshoz juthatunk kisebb változtatásokkal, amelyek előnyösen körülbelül 50 vagy 30 nukleotidot érintenek, előnyösebben körülbelül 20 vagy 10 nukleotidot érintenek, és legelőnyösebben körülbelül 5 vagy 1 nukleotidot érintenek, a legkisebb restrikciós fragmensig, amely még a riporterkonstrukció megfelelő expresszióját biztosítja [„Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press (1991)].
Ezekkel az 5’- és 3’-végi deléciókkal ennélfogva felvázolhatjuk azt a minimális régiót, amely a hosszabb szabályozórégió megfelelő szövetbeli és időbeli expressziójának modellezéséhez szükséges. Hímszövet-specifikus szabályozórégió ezen minimális régióját kódoló szekvenciák általában ezzel előnyösen 70%, 75% vagy 80%, előnyösebben 85% vagy 90%, és legelőnyösebben 95% vagy 99% szekvenciaazonosságot mutatnak.
Az alábbi példák szemléltetés célját szolgálják, és nem kívánjuk ezzel a találmány igényelt oltalmi körét korlátozni.
1. példa
Ms45-promoter genomi klónozása és szekvenálása
Az Ms45-cDNS Ac-címkézését és azonosítását, valamint a Northern-analízis ismertetését lásd az 5.478.369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.
Az Ms45 részleges cDNS-ét alkalmaztuk kukoricaeredetű B73 jelű genomi könyvtár szkrínelésére. Ezt a könyvtárat SAU3A1-részek klónozásával állítottuk elő BamHI-enzimmel emésztett genomi klónozóvektorban (Lambda Dash II, Stratagene, La Jolla, CA). Körülbelül 1*106 plakkot szkríneltünk, gazdaszervezetként genomi DNS-hez megfelelő E. coli-törzset (ER1647, New England Biolabs, MA) alkalmaztunk. Az AC4.1-kiónt homogenitásig tisztítottuk három ciklus szkrínelés után. Az AC4.1 restrikciós térképezése azt mutatta, hogy a klón körülbelül 13 kb hosszúságú, és két belső BamHI-hasítóhelyet tartalmaz (1. ábra). Ezen hasítóhelyek közül az egyiket megtaláltuk az Ms45 részleges cDNS-ében is. Két BamHI-fragmenst klónozóvektorba (Bluescript SK+, Stratagene, La Jolla, CA) szubklónoztunk. Az 5’-végi klón körülbelül 3,5 kb hosszúságú volt, és megfelelt a belső BamHI-hasítóhelytől szintézis15 iránnyal szemben lévő (5’) szekvenciának. A 3’-végi klón körülbelül 2,5 kb hosszúságú volt, és a belső BamHI-hasítóhelytől szintézisirányban lévő Ms45szekvenciát tartalmazta. Ezzel egyidejűleg egy feltételezett, teljes hosszúságú Ms45-cDNS-t izoláltunk és szekvenáltunk. Az 5’-végi klón és az Ms45-cDNS-szekvencia összehasonlításával azonosítottuk a feltételezett transzlációs starthelyet (1. ábra).
Az Ms45-promoterrégió szekvenálását Sanger és munkatársai által leírt [,,DNA Sequencing with Chain Terminating Inhibitors”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)] didezoxi-láncterminációs módszerrel végeztük. A pac4.1-5’ genomi klón (1. ábra) szekvenálását szakember által jól ismert technikák alkalmazásával, az univerzális oligo és más, szekvenciaspecifikus oligók felhasználásával végeztük.
A hímszövet-specifikus szabályozórégió tartalmazott egy Ncol-hasítóhelyet, melyet bevittünk a starthelyhez, és Ncol-fragmensként klónoztuk egy promoter nélküli, „Luci” expressziós vektorba. Ezt az új riportervektort PHP6045-plazmidként jelöltük (2. ábra), ATCC nyilvántartási száma: 97828 (deponálva 1996. december 12-én; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr„ Rockville, MD 20852).
2. példa
Primer lánchosszabbitásos analízis
Totál RNS-t izoláltunk olyan kukoricacímerekből, amelyek négyes haploidtól korai egysejtmagvas állapotig terjedő stádiumban lévő portokokat tartalmaztak. A totál RNS-t etanollal és magnézium-kloriddal kicsaptuk. Egy milligramm totál RNS-t izoláltunk, és a poliA+mRNS-t oligo-dT-cellulóz alkalmazásával tisztítottuk. PoliA+RNS-t szintén izoláltunk közvetlenül 6 napos kukoricamagoncok leveleiből és kukoricaportokokból szakember által ismert eljárás alkalmazásával.
Szekvenálólétrát preparáltunk egyszálú Ms45-oligonukleotid és 35S-dATP-beépülés felhasználásával standard szekvenálóeljárás szerint, szakember által jól ismert eljárás alkalmazásával.
Primer lánchosszabbítást az alábbi módszer szerint végeztünk:
I. 5’-végi jelölő szintetikus láncindító oligonukleotid
Összekeverünk: 5 pmol N11916 láncindító oligonukleotidot (PHL11916) 1,0 μΙben μΙ (50 μΰί) gamma 32P-ATP (>5000 Ci/mmol)
0,7 μΙ 10X kinázpuffer 0,7 μΙ T4 polinukleotid-kináz °C-on inkubáljuk 45 percig.
Hígítjuk 20 μΙ TE-vel, és 65 °C-ra melegítjük az enzim inaktiválása céljából.
ml 10X kinázpuffer elkészítése:
0,5 M Tris-HCI pH 7,6-8,0 5 mM spermidin 100 mM MgCI2 100 mM DTT
0,1 mg/ml zselatin vagy BSA
0,5 ml 1 M-ból 0,05 ml 0,1 M-ból 0,1 ml 1 M-ból 0,5 ml 0,5 M-ból 50 μΙ 2 mg/ml-ből 0,1 ml víz.
HU 225 002 Β1
II. Összehibridizált láncindító oligonukleotid és RNS
Kinázzal kezelt láncindító oligonukleotidokat kukoricacímerből, 6 napos kukoricamagoncok leveleiből, kukoricaportokokból és 6 napos kukoricalevelekből származó mRNS-hez hibridizáltattunk. Jégen összekevertünk 2 μΙ RNS-t, 1 μΙ kinázzal kezelt oligót, 2 μΙ 5X összehibridizáló puffért (1,25 M KCI, 10 mM Tris, pH 7,9-8,15) és 1 μΙ 30 mM vanadilt. Az össztérfogatot 10 μΙ-re kiegészítettük 10 mM Trisszel, pH 8,15. Ezt a keveréket 65 °C-ra melegítettük, és 55 °C-ra hűtöttük 4 óra alatt ciklizálótermosztát melegítőblokkjában.
III. Primer lánchosszabbítás μΙ primer lánchosszabbító keveréket (receptet lásd lentebb) és 0,4 μΙ reverz transzkriptázt (SuperScript, BRL, MD) adtunk az egyes csövekhez. Ezeket óvatos fel-le pipettázással összekevertük, és azonnal 48 °C-ra helyeztük, és 45 percig inkubáltuk. A primer lánchosszabbító keverék 10 mM MgCI2-ot, 5 mM DTT-t, 0,33 mM dATP-t, dCTP-t, dGTP-t vagy dTTP-t és DEPC vizet tartalmazott.
Hozzáadtunk 300 μΙ etanolt, és -20 °C-on fagyasztottuk egy éjszakán át, azután centrifugáltuk 30 percig mikrocentrifugában. Az üledéket Speed Vacban szárítottuk, és feloldottuk 6 μΙ 0,1 M NaOH/1 mM EDTAban. A csövek tartalmát pipettázással és vortexeléssel kevertük, hogy biztosítsuk az üledék teljes oldódását. Ezt szobahőmérsékleten hagytuk 2,5 óra hosszáig, és hozzáadtunk 6 μΙ szekvenálófestéket (USB szekvenáló reagenskészletből a „Stop oldat), és az oldatot körülbelül 95 °C-on denaturáltuk. A minta felét 6%-os denaturáló poliakrilamid szekvenálógélre vittük a mintagélpufferrel, és 55 watton futtattuk 2 óra hosszáig. A gélt megszárítottuk gélszárítóban, és Kodak X-AR filmre helyeztük. Háromnapos exponálás után transzkripciós terméket figyeltünk meg a kukoricacímerből származó mRNS-sel készült primer lánchosszabbító reakcióban, amely megfelelt dezoxitimidinnel lokalizált 42 nukleotidnak a startkodontól szintézisiránnyal szemben (3. ábra). Ezt a helyzetet +1-nek jelöltük. Egy kisebb transzkripciós starthelyet is azonosítottunk (-3)-nál.
3. példa
Ms45-ből származó hímszövet-specifikus szabályozórégió fejlődési fázis és szövetspecifításának meghatározása
A teljes hosszúságú hímszövet-specifikus szabályozórégiót szentjánosbogárból, Photinus pyralisbói származó luciferáz-riportergénhez [DeWit, T. R. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7870-7873 (1985)] fuzionáltuk burgonyából származó Pinll-3’ nem transzlálódó régióval [An, G. és munkatársai, „Functional Analysis of the 3’ Control Region of the Potato Wound-lnducible Proteinase Inhibitor II Gene”, Plánt Cell. 1, 115-122 (1989)]. Különböző fejlettségi állapotokban lévő kukoricaportokokat szélesztettünk címertenyésztésre alkalmas, agarral (Phytagar®, Sigma, St. Louis) szilárdított táptalajra [Pareddy, D. R. és J. F. Petelino, Crop. Sci. J. 29, 1564-1566 (1989)]. Az egyes virágokból származó három portokból egyet osztályoztunk (fejlettségi állapotra), és a maradék portokokat fejlettségi állapot szerint egyesítettük, mikrorészecskebombázáshoz szélesztettük, tipikusan nyolc portokot tálcánként. A portokokat 1100 Psi alkalmazásával, 1,8 μ méretű volfrámrészecskékkel bombáztuk, amelyekre Ms45 hímszövet-specifikus szabályozórégiónak és luciferáz-riporterkonstrukciónak megfelelő DNS-t csaptunk ki. Egy adott tálcán lévő valamennyi portok ugyanabban a fejlettségi állapotban volt: premeiotikus, meiózis-l, meiózis-ll, négyes haploid, kiszabaduló mikrospóra, korai egysejtmagvas mikrospóra vagy egysejtmagvas mikrospóra középső szakasza. A bombázást háromszor ismételtük az egyes fejlettségi állapotok esetén. A portokokat egy éjszakán át inkubáltuk 26 °C-on, 18 óra hosszáig. Nyers extraktumot preparáltunk az egyes tálcákról származó portokokból, és luciferázaktivitásra, valamint fehérjetartalomra vizsgáltuk azokat. A fehérjekoncentrációra normalizált luciferázaktivitást ábrázoltuk a 4. ábrán, a fejlettségi állapot függvényében. A legnagyobb aktivitás a négyes haploid állapotban és a kiszabaduló mikrospóra fejlettségi állapotban volt, kisebb aktivitás volt a meiózis-l és -ll-ben, és alig detektálható aktivitás volt a korai egysejtmagvas állapotban. Nem detektáltunk háttér feletti szignifikáns aktivitást a portokok premeiotikus szakaszában és az egysejtmagvas állapot középső szakaszában.
Továbbá 2,0 pg/ml 2,4-D-t tartalmazó MS-táptalajon tenyésztett embriogén kalluszt bombáztunk ugyanígy (kivéve azt, hogy 650 Psi-t alkalmaztunk) olyan luciferázriporterrel burkolt részecskékkel, amelyek az Ms45 hímszövet-specifikus szabályozórégióhoz vagy kukoricaeredetű ubiquitinpromoterhez (5.510.474 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) fuzionált luciferázriporterrel és kukoricaeredetű ubiquitinpromoterhez fuzionált uidA (GUS) riporterrel voltak burkolva. A luciferázt p-glükuronidázra normalizáltuk. Az 5. ábrán bemutatottak szerint az Ms45 hímszövet-specifikus szabályozórégió nem volt képes tranziens expressziót vezérelni embriogén kalluszban és sarjakban, még akkor sem, amikor az ubiquitinpromoter expresszálódott. Ehhez hasonlóan, desztillált vízben áztatott, két napig csíráztatott és nedves szűrőkre helyezett kukoricamagokat alávetettünk mikrorészecskebombázásnak, és hipokotilszáraikat vizsgáltuk luciferázra és β-glükuronidázra. Az ubiqutin szabályozórégió (promoter) aktív volt, de az Ms45 hímszövet-specifikus szabályozórégió nem.
Ezek az eredmények párhuzamban vannak az RNS-hibridizációs analízis eredményeivel. Különböző fejlettségi állapotban lévő kukoricaportokokat gyűjtöttünk, és az alábbiak szerint kezeltük azokat. Az egyes virágokból származó három portok egyikét 3:1 arányú etanol-jégecetben fixáltuk egy mikrotitertálca mérőhelyén, és kettőt folyékony nitrogénben lefagyasztottunk egy másik mikrotitertálca megfelelő mérőhelyén. A fixált portokokat osztályoztuk (fejlettségi állapotra): azután a megfelelő fagyasztott portokokat egyesítettük fejlettségi állapotok szerint, és poliA+RNS-t izoláltunk 20 portokból (RNS Micro-Quick Prep kit, Pharmacia, Uppsala, Sweden). Az egyes fejlődési fázisokban lévő,
HU 225 002 Β1 egyesített portokokból származó RNS-ből azonos térfogatokat elektroforézisnek vetettünk alá 1,2%-os agarózban, MOPS-pufferben+formaldehidben. Az RNSmintákat biotolással nejlonmembránra vittük, UV-keresztkötéssel fixáltuk (Stratalinker, Stratagene Inc., La 5 Jolla), és 32P-jelölt próbafragmenshez hibridizáltuk, amely tartalmazta a teljes Ms45-cDNS kódolórégióját és 3’-régióját. Az eredményeket bemutatjuk a 4. ábrán, amelyek igazolják Ms45-transzkriptum „steady-state jelenlétét a négyes haploid állapottól a korai egysejt- 10 magvas állapotig, és valószínűleg a meiózisban, a telofázis-ll-ben, de korábban nem. Az Ms45 hímszövet-specifikus szabályozórégió aktivitásából származó egyik transzkriptum sem halmozódott fel annyira a meiózis alatt, hogy az elegendő legyen RNS-hibridizá- 15 cióval való detektálásra, vagy a tranziens vizsgálati eljárásokban megfigyelt, meiotikus állapotú, hímszövet-specifikus szabályozórégió nem volt aktív növényekben.
Tehát az Ms45 hímszövet-specifikus szabályozóré- 20 giót (1. azonosító számú szekvencia) úgy jellemeztük, hogy hímszövet-specifikus expressziót biztosít a portokfejlődésben legalább a négyes haploid állapottól a négyes haploid kiszabadulási állapotig, és alacsonyabb mértékű expresszió valószínű a meiotikus és ko- 25 rai egysejtmagvas állapotban.
4. példa
TA TA-box-analízis
Az Ms45-eredetű hímszövet-specifikus szabályozó- 30 régiót kódoló, 1388 bp méretű DNS-fragmensben a transzkripció fő starthelyét +1 -nél azonosítottuk, egy kisebb transzkripciós starthelyét —3-nál azonosítottunk a fő transzkripciós starthelyhez viszonyítva, és egy feltételezett TATA-boxot (CATTAAA) -33-nál azonosítót- 35 tünk. Megjegyeztük, hogy -30-nál lévő TAAAGAT-szekvencia szintén szóba jöhet tényleges TATA-boxként. Ezt az 1388 bp méretű fragmenst működőképesen kapcsoltuk szentjánosbogárból származó luciferáz kódolórégióját tartalmazó riportergén-kazettá- 40 hoz [Pareddy és munkatársai, Theoret. Appl. Génét.
77, 521-526 (1989)], majd burgonyaeredetű proteázinhibitor-ll-génből származó 3'-végi nem transzlálódó régióhoz [An, G. és munkatársai, „Functional Analysis of the 3' Control Region of the Potato Wound-lnducible 45
Proteinase Inhibitor II Gene”, Plánt Cell. 1, 115-122 (1989)].
A TATA-box analizálására szolgáló, szakember számára jól ismert egyik módszerben mutációt alkalmaznak. Egy másik megvalósítási mód szerint a feltételezett TATA-box 1-6. nukleotidjait kicseréltük egy adott származékra. Bglll-hasítóhely bevitele a -38. helyzetbe megváltoztatta a feltételezett TATA-boxot CATTAAA-ról TATTAAA-ra, amely még jobban egyezik a TATA-box eredeti szekvenciájával (TATATAA).
Szakember számára nyilvánvaló, hogy bizonyos szubsztitúciók a TATA-boxban befolyásolhatják a promoter expressziójának mértékét anélkül, hogy az a szövetspecifitásra hatással lenne. Ahogyan azt a 7. ábrán bemutatjuk, a TATA-boxban végzett, Bglll-hasítóhelynek a -38. helyre való bevitelével asszociált változtatás drámaian megnövelte a tranziens expresszió mértékét portokokban, továbbá ez alapján feltételezzük, hogy a -33-nál lévő szekvencia az autentikus TATA-box. Bglll-hasítóhely bevitele a -40., -43., -51. vagy -53. helyre nem növelte a promoter aktivitását (az adatokat nem mutatjuk be), ami azt igazolja, hogy a Bglll-hasítóhelynek a -38. helyre való bevitele esetén megfigyelt expresszió fokozódása nem függ össze magával a Bglll-hasítóhellyel.
Más módosításokat is bevittünk a feltételezett TATA-boxba funkciójának további tesztelése céljából. A feltételezett TATA-box szekvenciájának megváltoztatása CATTAAA-ról GATTAAA-ra, CATGGAA-ra vagy GGGCCCA-ra valamennyi esetben csökkentette a tranziens expresszió mértékét portokokban, továbbá ez alapján feltételezzük ezen szekvencia jelentőségét mint TATA-box. Meglepő módon ezen mutációk egyike sem szüntette meg a tranziens aktivitást; azonban más rendszerekre leírtak tranziens aktivitást TATA-szerű szekvencia nélkül, sőt TATA nélküli promoterek nélkül is [Guan, L. és J. G. Scandalios, Plánt J. 3, 527-536 (1993); Close, P. S., „Cloning and Molecular Characterization of Two Nuclear Genes fór Zea mays Mitochondrial Chaperonin 60” (Dissertation), lowa State University, Ames, lowa, 92., 128. old. (1993)].
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány fentebb leírt előnyös megvalósítási módjaiban variációkat és módosításokat lehet létrehozni, amelyeket a találmány igényelt oltalmi körébe tartozónak tekintünk.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1394 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCATGGTGTC TCTATGAAAA AGATGAGTAC AATGTGTCTA TATCCGTTTT CTTAGGGTCC 60
CTTCTTCTGC CTTATTACTG ACTGAATCGG GGTTACAAAA AACTTCCACG GGTGCATGAT 120
CTCCATGTTC CACTTCTCCC ACCTCGCGTT GCACATTTCT TGGATGTCGG TGGTTCCCAT 180
CTGACCGAGG CCCATCAGAC ACCTTTCGGG ACACCCATCA AGGGCCTTTC GGATGGCCCA 240
CGAGACGTAT CGGGTCGTGG TGATCCAGGG GATATATGTC CCCCACAATC GTCACCTATA 300
HU 225 002 Β1
TTATTATTCT TTAGATATTA TTTAATTTTT GGAAAAATAA CAAACTTATA CTTTTGTGTA 360 GGGCCTCAGC ATAGATTTTC GCTTAGGGCC CAGAAATGCG AGGACCAGCC ATGTCTAGTG 420 TCCACTATTG GCACTACCCA GAACAAGATT TAAAAAAATA ACCAAAGTAA CTAATCCACT 480 CGAAAGCTAT CATGTAATGT TTAAAGAAAC ATCTATTAAA ACCACGATCC TCTTAAAAAA 540 CAAGCATATT TCGAAAGAGA GAAATTATGT TACAGTTTAC AAACATCTAA GAGCGACAAA 600 TTATATCGAA AGGTAAGCTA TGACGTTCAG ATTTTTCTTT TTCATTCTTG TTATTTTGTT 660 ATTGTTTTTA TATACATTTT CTTCTCTTAC AATAGAGTGA TTTTCTTCCG ATTTTATAAA 720 ATGACTATTAA AGTCATTTTT ATATAAGAGC ACGCATGTCG TAGATTCTCG TTCAAAAATC 780 TTTCTGATTT TTTTAAGAGC TAGTTTGGCA ACCCTGTTTC TTTCAAAGAA TTTTGATTTT 840 TTCAAAAAAA ATTAGTTTAT TTTCTCTTTA TAAAATAGAA AACACTTAGA AAAATAGAGT 900 TGCCAGACTA GCCCTAGAAT GTTTTCCCAA TAAATTACAA TCACTGTGTA TAATTATTTG 960 GCCAGCCCCA TAAATTATTT AAACCGAAAC TGAAATCGAG CGAAACCAAA TCTGAGCTAT 1020 TTCTCTAGAT TAGTAAAAAG GGAGAGAGAG AGGAAGAAAT CAGTTTTAAG TCATTGTCCC 1080 TGAGATGTGC GGTTTGGCAA CGATAGCCAC CGTAATCATA GCTCATAGGT GCCTACGTCA 1140 GGTTCGGCAG CTCTCGTGTC ATCTCACATG GCATACTACA TGCTTGTTCA ACCGTTCGTC 1200 TTGTTCCATC GTCCAAGCCT TGCCTATTCT GAACCAAGAG GATACCTACT CCCAAACAAT 1260 CCATCTTACT CATGCAACTT CCATGCAAAC ACGCACATAT GTTTCCTGAA CCAATCCATT 1320 AAAGATCACA ACAGCTAGCG TTCTCCCGCT AGCTTCCCTC TCTCCTCTGC CGATCTTTTT 1380 CGTCCACCAC CATG 1394
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1394 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCATGGTGTC TCTATGAAAA AGATGAGTAC AATGTGTCTA TATCCGTTTT CTTAGGGTCC 60 CTTCTTCTGC CTTATTACTG ACTGAATCGG GGTTACAAAA AACTTCCACG GGTGCATGAT 120 CTCCATGTTC CACTTCTCCC ACCTCGCGTT GCACATTTCT TGGATGTCGG TGGTTCCCAT 180 CTGACCGAGG CCCATCAGAC ACCTTTCGGG ACACCCATCA AGGGCCTTTC GGATGGCCCA 240 CGAGACCTAT CGGGTCGTGG TGATCCAGGG GATATATGTC CCCCACAATC GTCACCTATA 300 TTATTATTCT TTAGATATTA TTTAATTTTT GGAAAAATAA CAAACTTATA CTTTTGTGTA 360 GGGCCTCAGC ATAGATTTTC GCTTAGGGCC CAGAAATGCG AGGACCAGCC ATGTCTAGTG 420 TCCACTATTG GCACTACCCA GAACAAGATT TAAAAAAATA ACCAAAGTAA CTAATCCACT 480 CGAAAGCTAT CATGTAATGT TTAAAGAAAC ATCTATTAAA ACCACGATCC TCTTAAAAAA 540 CAAGCATATT TCGAAAGAGA CAAATTATGT TACAGTTTAC AAACATCTAA GAGCGACAAA 600 TTATATCGAA AGGTAAGCTA TGACGTTCAG ATTTTTCTTT TTCATTCTTG TTATTTTGTT 660 ATTGTTTTTA TATACATTTT CTTCTCTTAC AATAGAGTGA TTTTCTTCCG ATTTTATAAA 720 ATGACTATAA AGTCATTTTT ATATAAGAGC ACGCATGTCG TAGATTCTCG TTCAAAAATC 780 TTTCTGATTT TTTTAAGAGC TAGTTTGGCA ACCCTGTTTC TTTCAAAGAA TTTTGATTTT 840 TTCAAAAAAA ATTAGTTTAT TTTCTCTTTA TAAAATAGAA AACACTTAGA AAAATAGAGT 900 TGCCAGACTA GCCCTAGAAT GTTTTCCCAA TAAATTACAA TCACTGTGTA TAATTATTTG 960 GCCAGCCCCA TAAATTATTT AAACCGAAAC TGAAATCGAG CGAAACCAAA TCTGAGCTAT 1020 TTCTCTAGAT TAGTAAAAAG GGAGAGAGAG AGGAAGAAAT CAGTTTTAAG TCATTGTCCC 1080 TGAGATGTGC GGTTTGGCAA CGATAGCCAC CGTAATCATA GCTCATAGGT GCCTACGTCA 1140 GGTTCGGCAG CTCTCGTGTC ATCTCACATG GCATACTACA TGCTTGTTCA ACCGTTCGTC 1200 TTGTTCCATC GTCCAAGCCT TGCCTATTCT GAACCAAGAG GATACCTACT CCCAAACAAT 1260 CCATCTTACT CATGCAACTT CCATGCAAAC ACGCACATAT GTTTCCTGAA CAGATCTATT 1320 AAAGATCACA ACAGCTAGCG TTCTCCCGCT AGCTTCCCTC TCTCCTCTGC CGATCTTTTT 1380 CGTCCACCAC CATG 1394
Claims (32)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Izolált nukleinsav, amely olyan Ms45-eredetű, hímszövet-specifikus szabályozórégiót tartalmaz, mely hímszövetekben fokozottabb transzkripciós szín- 60 tét idéz elő, mint a növény némely más vagy bármely más szövetében, és a következők bármelyikét tartalmazza:(a) az 1. vagy 2. azonosító számú nukleotidszekvencia;HU 225 002 Β1 (b) az 1. vagy 2. azonosító számú szekvenciával legalább 70%-ban azonos nukleotidszekvencia, mely hímszövetekben fokozottabb transzkripciós szintet idéz elő, mint a növény némely más vagy bármely más szövetében;(c) az 1. vagy 2. azonosító számú szekvenciával erősen sztringens körülmények között hibridizálódni képes nukleotidszekvencia, mely körülményeket a következő mosási sztringencia jellemez: 50% formamid, 5X Denhardt-féle oldat, 0,5% SDS, IxSSPE és 42 °C, és a szekvencia hímszövetekben fokozottabb transzkripciós szintet idéz elő, mint a növény némely más vagy bármely más szövetében;(d) az 1. vagy 2. azonosító számú szekvencia olyan fragmense, mely hímszövetekben fokozottabb transzkripciós szintet idéz elő, mint a növény némely más vagy bármely más szövetében; vagy (e) az 1. vagy 2. azonosító számú szekvencia belsejéből származó hímszövet-specifikus szabályozórégió, mely hímszövetekben fokozottabb transzkripciós szintet idéz elő, mint a növény némely más vagy bármely más szövetében, és hozzá van kapcsolva egy „core”-promoterhez.
- 2. Az 1. igénypont szerinti izolált nukleinsav, amelyben az (e) pont szerinti „core”-promoter a CAMV 35S vagy 19S jelű promotere, az IN2-„core”-promoter, az ubiquitinpromoter vagy a görvélyfű-mozaikvírus promotere.
- 3. Rekombináns expressziós vektor, amely 1. vagy2. igénypont szerinti, izolált nukleinsavat tartalmaz exogén gént kódoló nukleotidszekvenciához működőképesen úgy kapcsolva, hogy az exogén gén fokozottabb mértékben expresszálódik egy növény hímszöveteiben, mint a növény némely más vagy bármely más szövetében.
- 4. A 3. igénypont szerinti exogén gén, amely az Ms45-gén.
- 5. Eljárás exogén nukleotidszekvenciát egy növény némely más vagy bármely más szövetéhez képest a növény hímszöveteiben fokozottabb mértékben expresszálni képes, transzformált növény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy növénybe bevisszük az exogén nukleotidszekvenciát 1. vagy 2. igénypont szerinti hímszövet-specifikus szabályozórégióhoz működőképesen kapcsolva.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szekvenciát mikrorészecskebombázás alkalmazásával visszük be a növénybe.
- 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szekvenciát Agrobacterium felhasználásával visszük be a növénybe.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Ti-plazmidot tartalmazó Agrobacteríumot alkalmazunk.
- 9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy növény némely más vagy bármely más szövetéhez képest a pollen, tapétum, portok, címer, pollenanyasejtek és/vagy mikrospórák szöveteiben fokozott mértékű expressziót biztosító szabályozórégiót viszünk be a növénybe.
- 10. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növénybe az exogén nukleotidszekvenciát egy vagy több kópiában jelen lévő, 1. vagy 2. igénypont szerinti hímszövet-specifikus szabályozórégióhoz működőképesen kapcsolva visszük be.
- 11. Eljárás termékenység mediálására növényben, azzal jellemezve, hogy olyan transzformált növényt állítunk elő, amelyben az 1. vagy 2. igénypont szerinti, exogén génhez működőképesen kapcsolt, hímszövet-specifikus szabályozórégió vezérli a termékenységet befolyásoló exogén nukleotidszekvencia expresszióját.
- 12. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokarióta szabályozórendszert kódoló DNS-t tartalmazó, exogén nukleotidszekvenciát viszünk be a növénybe.
- 13. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy citotoxikus gént kódoló, exogén nukleotidszekvenciát viszünk be a növénybe.
- 14. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy avidint kódoló, exogén nukleotidszekvenciát viszünk be a növénybe.
- 15. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DAM-metilázt kódoló, exogén nukleotidszekvenciát viszünk be a növénybe.
- 16. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy komplementer nukleotidegységhez működőképesen kapcsolt, hímszövet-specifikus szabályozórégiót kódoló, exogén nukleotidszekvenciát viszünk be a növénybe.
- 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy komplementer nukleotidegységként kalláz antiszensz RNS-t, barnáz antiszensz RNS-t, kalkon-szintáz antiszensz RNS-t és/vagy Ms45 antiszensz RNS-t alkalmazunk.
- 18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy komplementer nukleotidegységként ribozimot vagy külső vezetőszekvenciát alkalmazunk.
- 19. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy auxint, rolB-t vagy diftériatoxint kódoló exogén nukleotidszekvenciát alkalmazunk.
- 20. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén nukleotidszekvenciaként hímsterilitást biztosító gént alkalmazunk.
- 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hímsterilitást biztosító génként Ms45-gént alkalmazunk.
- 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyszikű növényben mediálunk termékenységet.
- 23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kétszikű növényben mediálunk termékenységet.
- 24. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve továbbá, hogy egy első hímtermékeny növényt és egy második hímterméketlen növényt keresztbeporzást biztosító juxtapozícióban elültetünk, ezáltal lehetővé tesszük a keresztbeporzást, és az eredményül kapott magokat kifogjuk.
- 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként kukoricát alkalmazunk.
- 26. Exogén nukleotidszekvenciát egy növény némely más vagy bármely más szövetéhez képest a növényHU 225 002 Β1 hímszöveteiben fokozottabb mértékben expresszálni képes transzformált növény, amely exogén nukleotidszekvenciát tartalmaz 1. igénypont szerinti hímszövet-specifikus szabályozórégióhoz működőképesen kapcsolva.
- 27. A 20. igénypont szerinti transzformált növény, 5 amelyben az 1. vagy 2. igénypont szerinti hímszövetspecifikus szabályozórégióhoz működőképesen kapcsolt exogén nukleotidszekvencia egy vagy több kópiában van jelen.
- 28. A 26. igénypont szerinti transzformált növény, 10 amely egyszikű vagy kétszikű növény.
- 29. A 26. vagy 28. igénypont szerinti transzformált növény, amely kukorica, napraforgó, szójabab, búza, kanola, rizs vagy cirok.
- 30. A 29. igénypont szerinti transzformált növény transzformált szövete.
- 31. A 30. igénypont szerinti transzformált szövet, amely pollenből, kalászból, magkezdeményből, portokból, címerből, porzólevél termőjéből vagy növényi sejtből származik.
- 32. A 26. igénypont szerinti transzformált növény transzformált sejtje.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/880,499 US6037523A (en) | 1997-06-23 | 1997-06-23 | Male tissue-preferred regulatory region and method of using same |
| PCT/US1998/012895 WO1998059061A1 (en) | 1997-06-23 | 1998-06-19 | Male tissue-preferred regulatory region and method of using same |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0002578A2 HUP0002578A2 (hu) | 2000-12-28 |
| HUP0002578A3 HUP0002578A3 (en) | 2001-11-28 |
| HU225002B1 true HU225002B1 (hu) | 2006-05-29 |
Family
ID=25376411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0002578A HU225002B1 (hu) | 1997-06-23 | 1998-06-19 | Hímszövet-specifikus szabályzórégió és alkalmazására szolgáló eljárás |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6037523A (hu) |
| EP (1) | EP0994956B1 (hu) |
| JP (1) | JP3513157B2 (hu) |
| CN (1) | CN1149293C (hu) |
| AR (1) | AR016280A1 (hu) |
| AT (1) | ATE286538T1 (hu) |
| AU (1) | AU747286B2 (hu) |
| BG (1) | BG104095A (hu) |
| BR (1) | BRPI9810293B1 (hu) |
| CA (1) | CA2293997C (hu) |
| DE (1) | DE69828505T2 (hu) |
| ES (1) | ES2236915T3 (hu) |
| HU (1) | HU225002B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ501954A (hu) |
| PT (1) | PT994956E (hu) |
| RO (1) | RO119957B1 (hu) |
| TR (1) | TR199903234T2 (hu) |
| WO (1) | WO1998059061A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA985408B (hu) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7154024B2 (en) * | 1997-06-23 | 2006-12-26 | Pioneer Hi-Bred, Inc. | Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same |
| WO2001060997A2 (en) * | 2000-02-15 | 2001-08-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Male tissue-specific regulatory region and method of using same |
| AU6406800A (en) * | 1999-03-16 | 2000-10-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | SF3 promoter and methods of use |
| DE10081621D2 (de) * | 1999-06-12 | 2002-05-29 | Thomas Roitsch | Promotorsystem, dessen Herstellung und Verwendung |
| US6465217B1 (en) | 2000-07-05 | 2002-10-15 | Paradigm Genetics, Inc. | Methods and compositions for the modulation of chorismate synthase and chorismate mutase expression or activity in plants |
| WO2002026789A2 (en) * | 2000-09-26 | 2002-04-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| US7517975B2 (en) | 2000-09-26 | 2009-04-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| US7612251B2 (en) | 2000-09-26 | 2009-11-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| US6956118B2 (en) * | 2001-02-08 | 2005-10-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Promoter sequences providing male tissue-preferred expression in plants |
| WO2003003816A2 (en) | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Monsanto Technology Llc | Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof |
| WO2003029492A1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-04-10 | Justin Gallivan | Metabolic genes and related methods and compositions |
| US7230168B2 (en) * | 2001-12-20 | 2007-06-12 | The Curators Of The University Of Missouri | Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase |
| EP1527183B1 (de) * | 2002-07-26 | 2008-08-20 | BASF Plant Science GmbH | Neue selektionsverfahren |
| US7202397B2 (en) * | 2002-08-16 | 2007-04-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Chalcone synthase |
| WO2004085611A2 (en) * | 2003-03-21 | 2004-10-07 | The Research Foundation Of State University Of New York | Model for mutually exclusive domain folding molecular switch |
| US20070169227A1 (en) * | 2003-12-16 | 2007-07-19 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same |
| AU2011265403B2 (en) * | 2003-12-16 | 2012-07-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Dominant gene suppression transgenes and methods of using same |
| CN104313049A (zh) | 2003-12-16 | 2015-01-28 | 先锋高级育种国际公司 | 显性基因抑制性转基因及其使用方法 |
| US20080244765A1 (en) * | 2004-12-16 | 2008-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for pollination disruption |
| AR052164A1 (es) * | 2005-12-15 | 2007-03-07 | Bioceres S A | Una molecul a aislada de adn potenciadora de la expresion de una secuencia codificante, fragmento, variante genetica, casete, vector, celula, planta y semilla que contengan la molecula . |
| US7919676B2 (en) * | 2007-08-03 | 2011-04-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same |
| US7915478B2 (en) | 2007-08-03 | 2011-03-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same |
| US7910802B2 (en) * | 2007-08-03 | 2011-03-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | MSCA1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same |
| EP2173883A1 (en) * | 2007-08-03 | 2010-04-14 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same |
| EP2257076B1 (en) * | 2009-05-28 | 2015-02-25 | Advanced Digital Broadcast S.A. | Video data signal, system and method for controlling shutter glasses |
| WO2013138289A2 (en) * | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
| WO2013138309A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
| CN104703998B (zh) | 2012-03-13 | 2020-08-21 | 先锋国际良种公司 | 植物中雄性育性的遗传减少 |
| US9803214B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Breeding pair of wheat plants comprising an MS45 promoter inverted repeat that confers male sterility and a construct that restores fertility |
| BR112015023304A2 (pt) | 2013-03-14 | 2017-07-18 | Pioneer Hi Bred Int | método para melhorar a tolerância ao estresse abiótico de uma planta, planta e semente |
| BR112015023700A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Pioneer Hi Bred Int | método de aprimoramento da tolerância ao estresse abiótico em uma planta de cultura agrícola , planta de milho transgênica, célula vegetal, semente, método de regulação negativa de um gene de acc oxidase endógeno em uma planta de milho. |
| CA2918909A1 (en) | 2013-07-25 | 2015-01-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method for producing hybrid brassica seed |
| CN103733979B (zh) * | 2013-12-23 | 2015-06-03 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | 一种提高玉米父本单倍体诱导系诱导效率的方法 |
| CN103667277B (zh) * | 2013-12-31 | 2016-02-17 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法 |
| WO2016100309A1 (en) | 2014-12-16 | 2016-06-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Restoration of male fertility in wheat |
| CA2968938A1 (en) | 2017-05-31 | 2018-11-30 | Bayer Cropscience Lp | Canola hybrid variety 5cn0130 |
| CA2968905A1 (en) | 2017-05-31 | 2018-11-30 | Bayer Cropscience Lp | Canola hybrid variety 5cn0125 |
| CA3004115A1 (en) | 2018-05-07 | 2019-11-07 | Bayer Cropscience Lp | Canola hybrid variety 6cn0122 |
| CA3040289A1 (en) | 2019-04-12 | 2020-10-12 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Canola hybrid variety 7cn0298 |
| CA3047768A1 (en) | 2019-06-21 | 2020-12-21 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Canola hybrid variety 7cn0425 |
| US11672218B2 (en) | 2020-04-24 | 2023-06-13 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Canola hybrid variety 7CN0065 |
| CN114480418B (zh) * | 2022-01-24 | 2023-08-25 | 上海交通大学 | 温敏雄性不育基因hsp60-3b及其应用和育性恢复的方法 |
Family Cites Families (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5190931A (en) * | 1983-10-20 | 1993-03-02 | The Research Foundation Of State University Of New York | Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA |
| US5208149A (en) * | 1983-10-20 | 1993-05-04 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures |
| US4732856A (en) * | 1984-04-03 | 1988-03-22 | Carnegie Institution Of Washington | Transposable elements and process for using same |
| US4833080A (en) * | 1985-12-12 | 1989-05-23 | President And Fellows Of Harvard College | Regulation of eucaryotic gene expression |
| GB8901677D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Hybrid seed production |
| US5356799A (en) * | 1988-02-03 | 1994-10-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| NZ227835A (en) * | 1988-02-03 | 1992-09-25 | Paladin Hybrids Inc | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
| GB8810120D0 (en) * | 1988-04-28 | 1988-06-02 | Plant Genetic Systems Nv | Transgenic nuclear male sterile plants |
| GB8901697D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Male flower specific gene sequences |
| KR920701453A (ko) * | 1989-03-17 | 1992-08-11 | 미리엄 디. 멕코나헤이 | 유전자발현의 외부조절 |
| US5168053A (en) * | 1989-03-24 | 1992-12-01 | Yale University | Cleavage of targeted RNA by RNAase P |
| WO1990012107A1 (en) * | 1989-03-31 | 1990-10-18 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Recombinant expression system based on satellite tobacco mosaic virus |
| US5086169A (en) * | 1989-04-20 | 1992-02-04 | The Research Foundation Of State University Of New York | Isolated pollen-specific promoter of corn |
| EP0412911B1 (en) * | 1989-08-10 | 2001-07-18 | Aventis CropScience N.V. | Plants with modified flowers |
| DE3931969A1 (de) * | 1989-09-25 | 1991-04-04 | Max Planck Gesellschaft | Dna-sequenz, wunl-gen mit gestutztem promotor sowie verwendung derselben |
| WO1991009957A1 (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-11 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Site-specific recombination of dna in plant cells |
| US5472841A (en) * | 1990-06-11 | 1995-12-05 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Methods for identifying nucleic acid ligands of human neutrophil elastase |
| CA2042447C (en) * | 1990-06-12 | 1999-09-28 | Marc C. Albertsen | Control of microsporogenesis by externally inducible promoter sequences |
| US5478369A (en) * | 1990-06-12 | 1995-12-26 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| US5824524A (en) * | 1990-06-12 | 1998-10-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating fertility and method of using same |
| US5432068A (en) * | 1990-06-12 | 1995-07-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Control of male fertility using externally inducible promoter sequences |
| CA2087703C (en) * | 1990-07-20 | 1999-09-21 | Steven F. Fabijanski | Binary cryptocytotoxic method of hybrid seed production |
| GB9028060D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| WO1992013957A1 (en) * | 1991-02-07 | 1992-08-20 | Plant Genetic Systems, N.V. | Stamen-specific promoters from corn |
| CZ214593A3 (en) * | 1991-04-16 | 1994-07-13 | Mogen Int | Plants exhibiting male sterility, process of obtaining thereof and recombinant dna for application of such process |
| GB9115909D0 (en) * | 1991-07-23 | 1991-09-04 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| JP3418396B2 (ja) * | 1992-03-09 | 2003-06-23 | ワシントン ステート ユニバーシティ リサーチ ファンデーション | 植物稔性の調節方法 |
| EP0578611B1 (en) * | 1992-07-02 | 2003-11-26 | Syngenta Participations AG | Anther-specific cDNA sequences, genomic DNA sequences and recombinant DNA sequences |
| AU669384B2 (en) * | 1992-07-09 | 1996-06-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize pollen-specific polygalacturonase gene |
| CA2151267A1 (en) * | 1992-12-16 | 1994-06-23 | Robert Bruce Knox | Developmental regulation in anther tissue of plants |
| CA2161515A1 (en) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | Willem Johannes Stiekema | Method for obtaining male-sterile plants |
| US5470359A (en) * | 1994-04-21 | 1995-11-28 | Pioneer Hi-Bred Internation, Inc. | Regulatory element conferring tapetum specificity |
| US5837850A (en) * | 1994-04-21 | 1998-11-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Regulatory element conferring tapetum specificity |
| WO1996013588A1 (en) * | 1994-10-28 | 1996-05-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
| US5633438A (en) * | 1994-11-22 | 1997-05-27 | Pioneer Hi-Bred International | Microspore-specific regulatory element |
| US5763243A (en) * | 1994-12-08 | 1998-06-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
| US5733726A (en) * | 1995-06-07 | 1998-03-31 | Emory University | Cytotoxicity-based genetic selection system (TOXSEL) |
| JP3761628B2 (ja) * | 1995-07-14 | 2006-03-29 | 住友化学株式会社 | 植物プロモーターおよびその利用 |
-
1997
- 1997-06-23 US US08/880,499 patent/US6037523A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-06-19 ES ES98931443T patent/ES2236915T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-19 JP JP50491099A patent/JP3513157B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-19 CA CA002293997A patent/CA2293997C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-19 HU HU0002578A patent/HU225002B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-06-19 RO RO99-01377A patent/RO119957B1/ro unknown
- 1998-06-19 CN CNB988084422A patent/CN1149293C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-19 DE DE69828505T patent/DE69828505T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-19 NZ NZ501954A patent/NZ501954A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-06-19 WO PCT/US1998/012895 patent/WO1998059061A1/en active IP Right Grant
- 1998-06-19 PT PT98931443T patent/PT994956E/pt unknown
- 1998-06-19 EP EP98931443A patent/EP0994956B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-19 TR TR1999/03234T patent/TR199903234T2/xx unknown
- 1998-06-19 BR BRPI9810293A patent/BRPI9810293B1/pt active IP Right Grant
- 1998-06-19 AT AT98931443T patent/ATE286538T1/de active
- 1998-06-19 AU AU81576/98A patent/AU747286B2/en not_active Expired
- 1998-06-22 ZA ZA9805408A patent/ZA985408B/xx unknown
- 1998-06-23 AR ARP980103015A patent/AR016280A1/es active IP Right Grant
-
2000
- 2000-01-20 BG BG104095A patent/BG104095A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0002578A2 (hu) | 2000-12-28 |
| EP0994956B1 (en) | 2005-01-05 |
| BG104095A (en) | 2000-11-30 |
| JP2001520523A (ja) | 2001-10-30 |
| EP0994956A1 (en) | 2000-04-26 |
| NZ501954A (en) | 2001-06-29 |
| JP3513157B2 (ja) | 2004-03-31 |
| CA2293997C (en) | 2007-09-11 |
| AU747286B2 (en) | 2002-05-16 |
| DE69828505T2 (de) | 2006-01-05 |
| CA2293997A1 (en) | 1998-12-30 |
| US6037523A (en) | 2000-03-14 |
| BR9810293A (pt) | 2001-11-20 |
| TR199903234T2 (xx) | 2000-06-21 |
| HUP0002578A3 (en) | 2001-11-28 |
| WO1998059061A9 (en) | 1999-04-15 |
| PT994956E (pt) | 2005-04-29 |
| RO119957B1 (ro) | 2005-06-30 |
| BRPI9810293B1 (pt) | 2016-06-14 |
| AR016280A1 (es) | 2001-07-04 |
| CN1149293C (zh) | 2004-05-12 |
| ATE286538T1 (de) | 2005-01-15 |
| AU8157698A (en) | 1999-01-04 |
| DE69828505D1 (de) | 2005-02-10 |
| CN1268183A (zh) | 2000-09-27 |
| WO1998059061A1 (en) | 1998-12-30 |
| ZA985408B (en) | 2000-04-03 |
| ES2236915T3 (es) | 2005-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU225002B1 (hu) | Hímszövet-specifikus szabályzórégió és alkalmazására szolgáló eljárás | |
| US5750868A (en) | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants | |
| US6281348B1 (en) | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants | |
| CA2423480C (en) | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same | |
| CA2437318A1 (en) | Nucleotide sequence mediating male fertility and method of using same | |
| US7154024B2 (en) | Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same | |
| CA2392722C (en) | Male tissue-preferred regulatory region and method of using same | |
| AU2001238177B2 (en) | Male-tissue Specific Regulatory Region and Method of Using Same | |
| MXPA99012109A (en) | Male tissue-preferred regulatory region and method of using same | |
| AU2001238177A1 (en) | Male-tissue Specific Regulatory Region and Method of Using Same | |
| MXPA96004989A (en) | Regulator element conferring tape specificity | |
| MXPA04011042A (es) | Secuencias nucleotidicas y metodos para la expresion especifica de genes en el gametofito femenino, celulas reproductivas femeninas, grano de polen y/o las celulas reproductivas masculinas de las plantas. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |