CN1501978A - 可诱导的无融合生殖 - Google Patents

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E��³��ŵ��
E·鲁西诺瓦
¸
S·C·德弗里斯
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Abstract

本发明涉及植物无性繁殖，也称为无融合生殖。本发明具体描述了一种种子生产的方法，包括：(a)通过转基因途径在第一亲本植物的胚囊附近表达编码体细胞胚胎发生受体激酶或与这种激酶相互作用的基因，(b)将步骤(a)中的第一亲本植物与具遗传多态性的第二亲本植物杂交，并在开花期前以生长素处理杂交后的植物，(c)从用生长素处理过的植物的种子培育F1后代植物，(d)将步骤c中得到的F1后代植物自交，以获得F2后代植物，以及(e)选择其核基因组标记图谱与在步骤(d)中自交的F1后代植物核基因组标记图谱一致的F2代植物。

Description

可诱导的无融合生殖
技术领域
本发明涉及植物无性繁殖，也称为无融合生殖。具体地，本发明描述了一种增加在植物世代中形成的无融合生殖种子的比率，即通过种子进行无性繁殖的概率的方法步骤。
背景技术
无融合生殖是在某些多倍体非栽培植物物种中发现的一种受遗传控制的植物繁殖方式，通过这种繁殖方式获得的后代植物，其遗传本质上与雌性亲本植物一致。在WO 97/43427和WO 00/24914中，描述了通过在胚囊附近转基因表达而增加无融合生殖种子比率的基因。这些基因编码体细胞胚胎发生受体激酶(SERK)或与此激酶相互作用的蛋白质。
可区分两种类型的无融合生殖，即配子体无融合生殖和非配子体无融合生殖。在配子体无融合生殖中，形成了多个典型缺乏反足核的胚囊，从而使在胚囊中不能进行大孢子发生。在非配子体无融合生殖，也称为不定胚生殖中，体细胞胚直接从胚囊、子房壁或珠被细胞发育而来。来自周围细胞的体细胞胚侵入到有性子房中，其中的一个体细胞胚竞争掉其它体细胞胚和有性胚，并利用已经形成了的胚乳。
无融合生殖使不分离的以种子繁殖的杂种成为可能。因此，将无融合生殖应用到栽培植物品种中，由于可以不需要自交及为稳定理想基因组合而进行的后代检测，从而将会缩短并简化育种程序。由于无融合生殖基因型无论杂合与否都不分离，因此，具有独特基因组合的基因型可被用作栽培种。因而，基因或基因群可被“聚积及固定”在所需的基因型中。每一种来自有性生殖-无融合生殖杂交的优良无融合生殖基因型都有潜力成为栽培品种。将无融合生殖应用于栽培植物中，使植物育种者可培育具有株高、种子和饲料品质及成熟等特定稳定性状的栽培种。在杂交种的商业生产中，育种者将不再受限于：(1)质-核相互作用以产生雄性不育的母本，或(2)授粉者的育性恢复能力。几乎所有杂交亲和的种质都可以是生产无融合生殖杂种的潜在亲本。
无融合生殖也将会简化杂交种子的商业生产。具体来说，(1)不再需要对商业杂交种生产田进行物理上的隔离；(2)所有可利用的土地都可用于增产杂交种子，而不是成为授粉者和雄性不育系间的隔离空间；(3)不再需要保存亲本品系种子原种。
发明内容
本发明公开了一种种子生产中的方法步骤，它能够增加植物世代中形成或发育的无融合生殖种子的比率，在此植物世代中，通过转基因途径在胚囊附近表达了编码体细胞胚胎发生受体激酶或与此种激酶相互作用的基因。根据本发明，在开花前以植物生长素处理上述植物。所增加的无融合生殖可被看作可诱导的无融合生殖，它在停用生长素后，又回复到几乎正常的有性生殖。
按照本发明，生产种子的方法包括：
(a)在第一亲本植物的胚囊附近转基因表达编码体细胞胚胎发生受体激酶或与此激酶相互作用的基因，
(b)将步骤(a)中的第一亲本植物与具遗传多态性的第二亲本植物杂交，并在开花期前给杂交后的植物施加生长素，
(c)从获自以生长素处理后的植物的种子培育F1后代植物，
(d)将步骤c中得到的F1后代植物自交，以获得F2后代植物，
(e)选择其核基因组标记图谱(marker profile)与在步骤(d)中用于自交的F1后代植物核基因组标记图谱一致的F2后代植物，和
(f)任选地，通过一轮以上的自交增殖上述F2后代植物。
为了生产足量的核基因组标记图谱一致的种子，可将通过上述方法获得的无融合生殖植物进行重复多轮自交或杂交来增殖。为了进行后代分析，可在方法步骤(b)中方便地使用自交系。然而，此方法也能应用于有近交衰退的情况。
用在胚囊附近转基因表达的基因的例子有胡萝卜(Daucus carota)SERK基因(GENBANK登录号为U93048)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)SERK基因(GENBANK登录号为A67827)以及编码与SERK基因产物发生物理性相互作用的蛋白质的基因，如GENBANK登录号AX024556、AX024558、AX024560、AX024562、AX024564、AX024566、AX024568及AX024570所描述的拟南芥基因。这些基因所编码的蛋白质的氨基酸序列选自WO 97/43427中的序列3和21及WO 00/24914中的序列2、4、6、8、10、12、14和16。也可利用可获自其它植物种的功能相似、结构相关的基因。
为了实现转基因在胚囊附近表达，必须将该基因可操作地连接到合适的可诱导的或受发育调节的启动子。任选地，基因于极核与雄配子核融合前在雌配子体中表达。其中最有利的是基因在胚囊、子房壁、珠心或珠被的体细胞中表达。合适的启动子的具体例子是胡萝卜几丁质酶DcEP3-1基因启动子、拟南芥属AtChitIV基因启动子、拟南芥属LTP-1基因启动子、拟南芥属bel-1基因启动子、矮牵牛fbp-7基因启动子、拟南芥属ANT基因启动子、拟南芥属AtDMC1启动子、蝴蝶兰属(Phalaenopsis)O126基因启动子或SERK基因启动子。
为了鉴定无融合生殖种子，用于最初杂交的亲本植物的基因组相互间应该具有足够的多态性。如果在最初杂交中使用了遗传相似的植物，尽管也能产生无融合生殖种子，但鉴定由此杂交得到的无融合生殖种子几乎是不可能的。与此相反，亲本植物的遗传多态性则使利用DNA指纹表征后代植物很容易进行，从而鉴定由无融合生殖产生的种子。如果亲本植物包含至少5到10个，优选20个以上，更优选50到60个或更多独立分离的座位，而这些座位在至少一个亲本植物中或两个亲本植物间都表现出遗传变异，那么，可以认为这些亲本植物已具有足够的多态性。
在亲本植物最初杂交后，于开花前1到10天，优选开花前1到2天至少施用一次生长素。在开花前重复施用生长素例如2、3、4或5次同样也是优选的。生长素可以选自2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)及IAA(吲哚乙酸)等。特别合适的生长素是2，4-D。
无融合生殖可产生在遗传上和最初杂交中的母本植物相同的植物。因此，在本发明中，可以认为，F2后代植物的核基因组与在最初杂交中，即上述方法的步骤(b)中所采用的母本植物的核基因组基本上是一致的。
本发明可应用于双子叶植物和单子叶植物。在双子叶植物中，优选拟南芥属、大豆、棉花、甜菜、甘蔗、油菜(oilseed rape)、烟草和向日葵。特别优选的是大豆、棉花、烟草、甜菜和油菜。在单子叶植物中，优选玉米、甜玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、燕麦、草坪草和饲料草、谷子以及稻。特别优选的是玉米、小麦、高粱和稻。
采用具有足够多态性的植物进行最初的杂交允许利用DNA指纹技术去鉴别各种后代植物，从而鉴定那些由无融合生殖得到的植物。在上述方法的一个特定的实施方案中，通过比较F2后代植物基因组指纹与在方法步骤(d)中用于自交产生F2后代植物的F1后代植物的基因组指纹，鉴别其核基因组基本上与以上步骤(d)中自交的F1后代植物核基因组一致的F2后代植物。利用一套分子标记，如限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、单核苷酸多态性(SNPs)、简单序列长度多态性(SSLPs)、切割扩增多态性(CAPs)或扩增片段长度多态性(AFLPs)等，可以方便地进行基因组的指纹分析和比较。一些特定的拟南芥SSLPs的清单可以从例如拟南芥基因组中心URL http：//genome.salk.edu/获取。在URLhttp：//genome.salk.edu/SSLP_info/SSLPsordered.html中可以找到一套拟南芥SSLPs和相应的寡核苷酸。
因此，本发明还包括区分有性生殖后代植物和无融合生殖后代植物的方法，该方法包括在后代和亲本植物中表征至少5到10个，优选20个以上，更优选50到60个或更多独立分离的分子标记座位的标记图谱，并鉴别其标记图谱与雌性亲本植物标记图谱一致的后代植物，其中标记对亲本植物是多态的。
实施例
实施例1：AtLTP∷AtSERK1表达载体的构建
将2.1kb AtSERK1全长cDNA作为SacI-KpnI片段克隆到包含CaMV35S启动子的pRT105载体(Topfer等，Nucleic Acids Res.15：5890，1987)中。然后用HincII-SmaI消化，以从pRT105中除去CaMV35S启动子，并以AtLTP1(Thoma等，Plant Physiol.105：35，1994)启动子片段取代。采用下列对侧翼pRT105质粒DNA特异的、并包含SmaI限制位点的引物，对AtLTP1∷AtSERK1盒进行PCR扩增：
pRTFor：5′-TCC CCCGGGGGAAGCTTGCATGCCTG-3′(SEQ ID NO：1)和
pRTRev：5′-TCC CCCGGGGGACTGGATTTTGGTT-3′(SEQ ID NO：2).
然后将PCR产物片段以SmaI酶切消化后转移至双元载体pMOG800(Mogen)中，用于植物转化。通过使用AtSERK1特异引物SERK1 Rev：5′-TAAGTTTGTCAGATTTCCAAGATTACTAGG-3′(SEQ ID NO：3)测序，验证该构建体，并通过电穿孔转入根癌农杆菌AGL1菌株中(Lazo等，Biotechnology 5：963，1991)。
实施例2：AtLTP∷AtSERK1表达载体转化拟南芥植物
以Bechtold等(C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences de la vie316：1194，1993)所述的真空渗入法转化拟南芥生态型WS植物。在10天内于补充有10％蔗糖和50mg/L卡那霉素的1/2 MS-盐培养基(Murashige和Skoog，Duchefa Biochemie BV)上选择T1种子。将卡那霉素抗性幼苗移栽到土壤中，以用于繁殖种子。
实施例3：无融合生殖种子的生产
a.材料与方法
利用对AtLTP1∷AtSERK1构建体纯合的转基因T3拟南芥生态型WS植物，即转化后的第三代转基因植物作为雄性供体给拟南芥生态型Landsberg erecta(Ler)植物授粉。将开花前约1-2天的11至12期(Smyth等，The Plant Cell 2：755，1990)F1植物花芽浸入到如Vivian-Smith等所述(Plant Physiol.121：437，1999)的补充有0.04％(v/v)Triton X-100作为表面活性剂的2μM 2，4-D水溶液中。在两天的期间内重复该处理2次，并使植物生长以产生F2种子。同时进行野生型Ler雌性植物和野生型WS雄性植物间的杂交作为对照，并获取其F1植物。这些F1植物被称为野生型F1植物，除了不以生长素处理外，用与转基因F1植物同样的方法对其进行分析。
待F2种子生长至幼苗后，从每株植物取一些莲座叶按Ponce等(Mol.Gen.Genet.261：408，1999)所述的方法提取DNA.利用Ponce等(见上)所述的荧光标记引物通过多重PCR同时扩增11个SSLP标记(见表1)，以进行简单序列长度多态性(SSLP)分析。所采用的全部SSLP标记对WS和Ler生态型都具有多态性，这些标记均一分布于基因组中，且不连锁，使得在F2后代能进行孟德尔分离。用三种不同的荧光染料之一标记每条正向引物，以运行于GS 36C-2400模式的ABI PRISMTM 337 DNA测序仪分离PCR产物。然后运用GeneScan3.1和Genotyper软件(Applied Biosystems)分析DNA片段。
表1：所采用的SSLP标记(如Ponce等所述，Mol.Gen.Genet.261：408，1999)
SSLP名称 染色体     Ler(bp)     WS(bp) 引物
AthACS I 276 287* 5′-AGAAGTTTAGACAGGTAC-3′(SEQ ID NO：4)
5′-AAATGTGCAATTGCCTTC-3′(SEQ ID NO：5)
AthGENEA I 419 425 5′-GCTACGCGTTGTCGTCGTG-3′(SEQ ID NO：6)
5′-ACATAACCACAAATAGGGGTG-3′(SEQ ID NO：7)
nga111 I 163* 147* 5′-CTCCAGTTGGAAGCTAAAGGG-3′(SEQ ID NO：8)
5′-TGTTTTTTAGGACAAATGGCG-3′(SEQ ID NO：9)
nga1126 II 460 438 5′-CGCTACGCTTTTCGGTAAAG-3′(SEQ ID NO：10)
5′-TCAGTGCTTGAGGAAGATAT-3′(SEQ ID NO：11)
nga1145 II 220 194 5′-CCTTCACATCCAAAACCCAC-3′(SEQ ID NO：12)
5′-GCACATACCCACAACCAGAA-3′(SEQ ID NO：13)
nga162 III 88* 86* 5′-CATGCAATTTGCATCTGAGG-3′(SEQ ID NO：14)
5′-CTCTGTCACTCTTTTCCTCTGG-3′(SEQ ID NO：15)
nga12 IV 252 262 5′-AATGTTGTCCTCCCCTCCTC-3′(SEQ ID NO：16)
5′-CTTGTAGATCTTCTGATGC-3′(SEQ ID NO：17)
nga1111 IV 157 151 5′-GGGTTCGGTTACAATCGTGT-3′(SEQ ID NO：18)
5′-AGTTCCAGATTGAGCTTTGAGC-3′(SEQ ID NO：19)
AthCTRI V 142* 144* 5′-TATCAACAGAAACGCACCGAG-3′(SEQ ID NO：20)
5′-CCACTTGTTTCTCTCTCTAG-3′(SEQ ID NO：21)
AthPHYC V 226 211 5′-CTCAGAGAATTCCCAGAAAAATCT-3′(SEQ ID NO：22)
5′-AAACTCGAGAGTTTTGTCTAGATC-3′(SEQ ID NO：23)
MBK5 V 362* 368* 5′-CTGTCAGTTGTTGGTGAAG-3′(SEQ ID NO：24)
5′-TGAGCATTTCACAGAGACG-3′(SEQ ID NO：25)
*该PCR产物大小与Ponce等测定的略有不同
b.结果/解释/讨论
我们采用基于遗传学的方法在超量表达AtSERK1的植物的后代中进行无融合生殖的筛选。该方法的基础是利用单一序列长度多态性(SSLP)标记。SSLPs是串联重复的2到5个碱基对的DNA核心序列。重复区域两侧的DNA序列通常是保守的，由此可以选择PCR引物以扩增居间的SSLP。串联重复数目的变化将会导致PCR产物长度的不同。在拟南芥属中已经发表了50条SSLP标记，这些SSLP通常被用作共显性遗传标记进行连锁和基因型分型分析。SSLPs检测的是高水平的等位基因变异，并且很容易利用PCR进行评价(19)。
所有转基因和对照F1植物的SSLP图谱都是一致的，通常扩增得到22个PCR产物。它们对应于Ler生态型中的11个SSLP等位基因及WS生态型中的11个SSLP等位基因，这些等位基因存在于所有杂合F1植物中。以上述同样11个SSLP标记，对每个转基因试验所获得的F2植物和野生型对照试验的F2植物按基因型分类。将每株F2植物的SSLP图谱与其相应的F1母本植物进行比较。结果见表2和表3。
表2：野生型Ler与WS间杂交的SSLP分析
 所评分的SSLP标记数  所分析的F2植物数  对所有SSLP标记均为杂合的植物数  卡方(1df)  P值
 观察值  期望值
 5  458  19  14.3  1.6  0.2
 6  457  8  7.21  0.1  0.8
 7  456  4  3.6  0.04  p＞0.9
 8  457  3  1.8  0.8  0.4＞p＞0.3
 9  459  2  0.9  1.3  p＞0.3
 10  459  1  0.45  0.7  p＞0.4
 11  459  0  0.2  0.2  0.7
表3：以2，4-D处理后野生型Ler与转基因WS的SSLP分析
构建体类型 所分析的F2植物总数  对11个SSLP标记为杂合的植物  卡方(1df)  P值
 观察值  期望值
野生型对照(杂交号1) 459  0  0.2  0.2  0.7
AtLTP∷AtSERK1(杂交号14) 144  0  0.1  0.1  0.8
AtLTP∷AtSERK1(杂交号15) 175  2  0.1  37  ＜0.0001
我们为在每个转基因试验和野生型对照中对11个SSLP标记为杂合的F2植物数目进行评定。在有性生殖群体中，对11个SSLP标记均为杂合的期望植物数为0.00048，这意味着每2048株植物的群体中出现1株植物。对于本试验中评定的野生型植物数(459株)，期望值为0.2。在这个群体中，没有检测到对11个SSLP标记均为杂合的植物。即得到0.2的卡方(x2)值，表明对459株F2群体来说，与期望值的偏离是非显著的。这些数据说明野生型拟南芥植物是通过有性生殖方式进行繁殖的。第15号转基因杂交的结果显示，对所用的超量表达AtLTP1∷AtSERK1的植物，卡方值是极显著的(x2＝37)。在一个175株植物的F2群体中，我们鉴定到了2株对11个SSLP均为杂合的植物。这种情况偶然发生的概率是很低的(p＜0.0001)，由此我们推断，这两株植物起源于母本，它们是无融合生殖的后代。在另一个用与第15号杂交所用的转基因系相比低水平表达SERK1蛋白质(以Western杂交分析检测的)的转基因系进行的转基因杂交(杂交号为14)中，没有检测到对所选用的全部11个SSLP标记都为杂合的植物。
因为在所分析的转基因植物中不存在非减数的配子，我们推断没有发生配子体类型的无融合生殖。这使得单性生殖之后在中心细胞受精(假受精)存在时双单倍体化或者是不定胚生殖成为无融合生殖胚胎发生的可能方式。由于后代对所检测的所有标记都是杂合的，由此可以排除假受精。这使得通常在受精前开始的不定胚生殖成为无融合生殖最可能的方式。
                               序列表
<110>Syngenta Participations AG
<120>可诱导的无融合生殖
<130>S-60006A
<140>
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<151>2001-04-10
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<170>PatentIn Ver.2.1
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<211>26
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<220>
<223>人工序列说明：nga1145标记引物1
<400>12
ccttcacatc caaaacccac                                                 20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：nga1145标记引物2
<400>13
gcacataccc acaaccagaa                                                 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：nga162标记引物1
<400>14
catgcaattt gcatctgagg                                                 20
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：nga162标记引物2
<400>15
ctctgtcact cttttcctct gg                                              22
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：nga12标记引物1
<400>16
aatgttgtcc tcccctcctc                                                 20
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：nga12标记引物2
<400>17
cttgtagatc ttctgatgc                                                  19
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：nga1111标记引物1
<400>18
gggttcggtt acaatcgtgt                                                 20
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：nga1111标记引物2
<400>19
agttccagat tgagctttga gc                                              22
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：AthCTRI标记引物1
<400>20
tatcaacaga aacgcaccga g                                               21
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：AthCTRI标记引物2
<400>21
ccacttgttt ctctctctag                                                 20
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：AthPHYC标记引物1
<400>22
ctcagagaat tcccagaaaa atct                                            24
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：AthPHYC标记引物2
<400>23
aaactcgaga gttttgtcta gatc                                            24
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：MBK5标记引物1
<400>24
ctgtcagttg ttggtgaag                                                  19
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：MBK5标记引物2
<400>25
ctgtcagttg ttggtgaag                                                  19

Claims (16)

1.一种增加在胚囊附近转基因表达编码体细胞胚胎发生受体激酶或与体细胞胚胎发生受体激酶相互作用的基因的植物世代中无融合生殖概率的方法步骤，其中在开花前向植物施用生长素。
2.一种生产种子的方法，包括：
(a)在第一亲本植物的胚囊附近转基因表达编码体细胞胚胎发生受体激酶或与体细胞胚胎发生受体激酶相互作用的基因，
(b)将步骤(a)中的第一亲本植物与具遗传多态性的第二亲本植物杂交，并在开花期前给杂交后的植物施用生长素，
(c)从用生长素处理过的植物的种子培育F1后代植物，
(d)将步骤c中得到的F1后代植物自交，以获得F2后代植物，
(e)选择其核基因组标记图谱与在步骤(d)中自交的F1后代植物核基因组标记图谱一致的F2后代植物，和
(f)任选地，通过一轮以上的自交增殖上述F2后代植物。
3.权利要求1的方法步骤或权利要求2的方法，其中在开花前1至2天的期间内，施用生长素至少一次，优选两次。
4.权利要求1的方法步骤或权利要求2的方法，其中生长素选自2，4-D、NAA及IAA。
5.权利要求4的方法步骤或方法，其中生长素为2，4-D。
6.权利要求1的方法步骤或权利要求2的方法，其中转基因表达的基因编码蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列选自WO 97/43427中的序列3和21及WO 00/24914中的序列2、4、6、8、10、12、14和16。
7.权利要求1的方法步骤或权利要求2的方法，其中基因的表达受可诱导的或发育调节的启动子的控制。
8.权利要求7的方法步骤或方法，其中基因在极核与雄配子核融合之前表达。
9.权利要求7的方法步骤或方法，其中基因在胚囊、子房壁、珠心或珠被的体细胞中表达。
10.权利要求7的方法步骤或方法，其中基因的表达受以下启动子控制：胡萝卜几丁质酶DcEP3-1基因启动子、拟南芥属AtChitIV基因启动子、拟南芥属LTP-1基因启动子、拟南芥属bel-1基因启动子、矮牵牛fbp-7基因启动子、拟南芥属ANT基因启动子、蝴蝶兰属O126基因启动子或SERK基因启动子。
12.权利要求2的方法，其中F2后代植物的标记图谱与步骤(b)中所采用的雌性亲本的标记图谱是一致的。
13.权利要求2的方法，其中，通过比较F2后代植物的基因组指纹和步骤(d)中自交的F1后代植物的基因组指纹，鉴定其核基因组标记图谱与步骤(d)中自交的F1后代植物的核基因组标记图谱相一致的F2后代植物。
14.权利要求13的方法，其中使用一套分子标记对基因组进行DNA指纹分析和比较。
15.一种生产具有一致的核基因组标记图谱的种子的方法，包括对权利要求2中获得的植物或其后代植物进行重复循环的自交或杂交。
16.一种区分无融合生殖后代植物和有性生殖后代植物的方法，包括在后代和亲本植物中表征至少5个分子标记的标记图谱，并鉴定其标记图谱与雌性亲本植物标记图谱一致的后代植物，其中标记对亲本植物是多态的。
17.权利要求16的方法，其中分子标记选自限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA、单核苷酸多态性、简单序列长度多态性、切割扩增多态性或扩增片段长度多态性。
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