CN114544851B - 一种测定邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及杂质的分析方法 - Google Patents
一种测定邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及杂质的分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及杂质的分析方法,主要杂质为苯甘氨酸甲酯、间氯苯甘氨酸甲酯。采用高效液相色法,以酸水溶液和有机溶剂为流动相,对邻氯苯甘氨酸甲酯的样品溶液进行梯度洗脱,该方法快速、简单、准确、重复性好,适合邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及杂质的控制和杂质研究。
Description
技术领域
本发明属药物分析领域,更多涉及一种用HPLC测定邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及杂质的分析方法。
背景技术
硫酸氢氯吡格雷(clopidogrel)是一种新型高效的抗血小板聚集药物。由法国Sanofi公司于1986年研制,临床用其硫酸氢盐,适合于治疗动脉粥样硬化、急性冠脉综合征,预防冠脉内支架植入术后再狭窄和血栓性并发症等。与其他抗血小板药物相比,硫酸氢氯吡格雷具有疗效好、费用低、不良反应小等优点。1998年,硫酸氢氯吡格雷首先在美国上市,随后进入欧洲以及加拿大、澳大利亚、新加坡等国家,在我国该药于2001年上市。可抑制ADP诱导的血小板聚集,作用强度和耐受性均高于同属噻吩并吡啶类衍生物噻氯匹定(ticlopidine),且副作用少。临床用于预防心肌梗塞、中风或有外周动脉疾病史患者的动脉粥样硬化。其CAS号为:135046-48-9,分子式为C16H18ClNO6S2,分子量为:419.9,化学结构为:
硫酸氢氯吡格雷(clopidogrel)的合成方法很多,其原料均包括邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐,经典反应过程如下描述:邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐与噻吩酯发生缩合反应氯吡格雷缩合物,氯吡格雷缩合物在甲醛水溶液中发生环合反应,生成硫酸氢氯吡格雷。
目前关于硫酸氢氯吡格雷质量控制有药典收录,但对于邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐中苯甘氨酸甲酯及间氯苯甘氨酸甲酯的杂质控制尚无已公开的检测方法,且在后续工艺中,上述两个杂质较难去除。
发明内容
本发明旨在提供一种能有效的检测邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐中苯甘氨酸甲酯及间氯苯甘氨酸甲酯的检测方法。
具体技术方案如下:
采用高效液相色谱法对邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及杂质进行检测,以酸水溶液为流动相A,以有机溶剂为流动相B,所述邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及其杂质结构如下:
采用梯度洗脱,程序如下:
其中,0<a≤8分钟,8<b≤14分钟,14<c≤15分钟,15<d≤25分钟。
优选的洗脱梯度为:
洗脱时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 90~70 | 10~30 |
a | 90~70 | 10~30 |
b | 30~10 | 70~90 |
c | 30~10 | 70~90 |
d | 90~70 | 10~30 |
其中,0<a≤8分钟,8<b≤14分钟,14<c≤15分钟,15<d≤25分钟。
更优选的洗脱梯度为:
洗脱时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 75~85 | 15~25 |
a | 75~85 | 15~25 |
b | 15~25 | 75~85 |
其中,0<a≤8分钟,8<b≤14分钟。
更优选的洗脱梯度为:
洗脱时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 75~85 | 15~25 |
a | 75~85 | 15~25 |
b | 15~25 | 75~85 |
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其中,0<a≤8分钟,8<b≤14分钟,14<c≤15分钟,15<d≤25分钟。
更优选的洗脱梯度为:
洗脱时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 80 | 20 |
5 | 80 | 20 |
14 | 20 | 80 |
流动相A酸水溶液为甲酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液中的一种,优选为磷酸水溶液;其中,磷酸水溶液的浓度为0.05%~0.2%之间,优选浓度为0.1%;流动相B有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇中的一种,优选为甲醇。
流动相流速为0.5ml/min~1.2ml/min,优选流速1.0ml/min;柱温25℃~40℃,优选30℃;紫外检测器波长210nm~230nm,优选220nm。
色谱柱为十八烷基键合硅胶柱或五氟苯基键合硅胶柱或苯基键合硅胶柱,优选苯基键合硅胶柱;色谱柱的填料粒径为2.0μm~6.0μm,色谱柱长为100mm~250mm,色谱柱直径为3.0nm~5.0nm;色谱柱粒径优选5.0μm,柱长优选250mm,直径优选为4.6nm。
该分析方法具体包括以下步骤:
(1)制备系统测试液:取邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐、杂质1、杂质2用水溶解并稀释;
(2)采用反相色谱柱,流动相A为酸水溶液,流动相B为有机相,检测器为紫外检测器的检测条件;
(3)依次取空白溶液、上述系统测试液、供试品溶液进行检测。
有益效果:
本发明提供的技术方案,具有能够快速、灵敏度高的对邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及间氯苯甘氨酸甲酯和苯甘氨酸甲酯的检测优势,故本发明可以为邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐中杂质的测定提供了一种准确的、高效的检测方法。本发明选择十八烷基键合硅胶柱、五氟苯基键合硅胶柱或苯基键合硅胶柱的反相色谱柱,本方法专属性强:空白溶液对检测无干扰;邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及间氯苯甘氨酸甲酯和苯甘氨酸甲酯的分离度均大于1.5。RSD值均低于10%,重复性良好。对邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸及杂质的检测限低于0.0324μg/ml。在对色谱条件中的流动相比例、柱温、检测波长、流速发生进行微小改变时,各杂质与主峰分离度均远大于1.5,且变化并不太大,表明该方法耐用性好。
附图说明
图1为实施例1的检测结果示意图,其中,RT=6.1min、RT=8.8min、RT=10.4min分别为系统适用性溶液中杂质1、邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐、杂质2的峰,其它均为未知杂质峰。
图2为实施例2的检测结果示意图,其中,RT=10.2min、RT=11.4min、RT=12.2min分别为系统适用性溶液中杂质1、邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐、杂质2的峰,其它均为未知杂质峰。
图3为实施例3的检测结果示意图,其中,RT=6.9min、RT=10.0min、RT=12.0min分别为系统适用性溶液中杂质1、邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐、杂质2的峰,其它均为未知杂质峰。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细描述,但本发明的实施方式并不限于此。除非另有说明,否则以下实施例中所用的试剂、材料及仪器均可通过常规商业手段获得。
实施例1
高效液相色谱仪:Agilent 1260检测器
流动相:A:0.1%磷酸水溶液
B:乙腈
洗脱梯度:
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 90 | 10 |
5 | 90 | 10 |
10 | 30 | 70 |
13 | 30 | 70 |
15 | 90 | 10 |
20 | 90 | 10 |
色谱柱:Agilent Zorbax Eclipse XDB-phenyl(苯基键合色谱柱),4.6*250mm,5μm检测波长:220nm;流速:1.0ml/min;柱温:30℃;进样量:10μl
稀释液:水
空白溶液:水
对照储备液:称取苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品24.4mg、间氯苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品23.6mg,置入100ml容量瓶中,以稀释液溶解稀释至刻度,摇匀。再精密移取5ml至100ml容量瓶,以稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀。
系统适用性溶液:精密称取邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品25mg至50ml容量瓶中,精密移入2.5ml对照储备液,以稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀。检测结果:进样系统适用性溶液,结果参见附图1,其中,RT=6.1min、RT=8.8min、RT=10.4min分别为杂质1、邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐、杂质2的峰,苯甘氨酸甲酯、间氯苯甘氨酸甲酯与其他杂质的最小分离度分别为1.6、1.1,未达到基线分离。
实施例2
高效液相色谱仪:Agilent 1260检测器
流动相:A:0.1%磷酸水溶液
B:甲醇
洗脱梯度:
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 90 | 10 |
5 | 90 | 10 |
10 | 30 | 70 |
13 | 30 | 70 |
15 | 90 | 10 |
20 | 90 | 10 |
色谱柱:Agilent Zorbax Eclipse XDB-phenyl(苯基键合色谱柱),4.6*250mm,5μm检测波长:220nm;流速:1.0ml/min;柱温:30℃;进样量:10μl
稀释液:水
空白溶液:水
对照储备液:称取苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品24.4mg、间氯苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品23.6mg,置入100ml容量瓶中,以稀释液溶解稀释至刻度,摇匀。再精密移取5ml至100ml容量瓶,以稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀。
系统适用性溶液:精密称取邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品25mg置入50ml容量瓶中,精密移入2.5ml对照储备液,以稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀。检测结果:进样系统适用性溶液,结果参见附图2,其中,RT=10.2min、RT=11.4min、RT=12.2min为杂质1、邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐、杂质2的峰,苯甘氨酸甲酯、间氯苯甘氨酸甲酯与其他杂质的最小分离度分别为2.8、1.1,未达到基线分离。
实施例3
高效液相色谱仪:Agilent 1260检测器
流动相:A:0.1%磷酸水溶液
B:甲醇
洗脱梯度:
时间(min) | A相 | B相 |
0 | 80 | 20 |
5 | 80 | 20 |
14 | 20 | 80 |
15 | 20 | 80 |
15.1 | 80 | 20 |
20 | 80 | 20 |
色谱柱:Agilent Zorbax Eclipse XDB-phenyl(苯基键合色谱柱),4.6*250mm,5μm
检测波长:220nm;流速:1.0ml/min;柱温:30℃;进样量:10μl
稀释液:水
空白溶液:水
对照储备液:称取苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品24.4mg、间氯苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品23.6mg,置于100ml容量瓶中,以稀释液溶解稀释至刻度,摇匀。再精密移取5ml至100ml容量瓶,以稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀。
系统适用性溶液:精密称取邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品25mg置50ml容量瓶中,精密移入2.5ml对照储备液,稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀。
对照品溶液:精密移取对照储备液2.5ml于50ml容量瓶中,以稀释液稀释至刻度,混匀。
检测限溶液:称取苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品40.4mg、间氯苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品15.7mg,置于100ml容量瓶中,以稀释液溶解稀释至刻度,摇匀。精密移取1ml至100ml容量瓶,以稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀。再精密移取上述溶液2ml至100ml容量瓶,以稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀。平行配制三份(苯甘氨酸甲酯、间氯苯甘氨酸甲酯浓度分别为0.065μg/ml、0.026μg/ml)。
供试品溶液:称取邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐供试品约25mg置于50ml容量瓶中,以稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀。
检测结果:进样系统适用性溶液,结果参见附图3,其中,RT=6.9min、RT=10.0min、RT=12.0min为杂质1、邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐、杂质2的峰。苯甘氨酸甲酯、间氯苯甘氨酸甲酯与其他杂质的最小分离度分别为1.7、1.9,分离度较好。进样检测限溶液,每份进样2针,6次进样单位浓度杂质峰面积RSD均小于10%。杂质1、杂质2信噪比分别为11.9、11.4,均大于10。检测限度浓度分别为0.0324μg/ml、0.0129μg/ml,方法的灵敏度高。6次进样,杂质1、杂质2单位浓度杂质峰面积RSD分别为7.9%、8.6%,准确度较高。
在对色谱条件分别进行上述微小改变,如有机相的起始体积分数为75%-85%;柱温为27℃-33℃,甚至是25℃-35℃;检测波长为215nm-225nm,甚至是210nm-230nm;流速为0.5ml/min-1.2ml/min时,苯甘氨酸甲酯、间氯苯甘氨酸甲酯与相邻峰之间分离度均大于1.5,符合要求,因而该方法耐用性良好。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节;而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的。本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (8)
1.一种用高效液相色谱法测定邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及杂质的分析方法,其特征在于,采用反相色谱柱对邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及杂质进行检测,以磷酸水溶液为流动相A,以甲醇为流动相B,进行梯度洗脱,所述邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐及杂质结构如下:
邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐:
;
杂质1:苯甘氨酸甲酯:
;
杂质2:间氯苯甘氨酸甲酯:
;
所述反向色谱柱为苯基键合硅胶柱;梯度洗脱程序如下:
2.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,流动相A为0.1%磷酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,流动相流速为0.5 mL/min~1.2 mL/min;柱温为25℃~40℃;紫外检测器波长为210nm~230nm。
4.根据权利要求3所述的分析方法,其特征在于:流动相流速为1 mL/min;柱温为30℃;紫外检测器波长为220nm。
5.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,梯度洗脱的程序如下:
6.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,梯度洗脱程序如下:
7.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,梯度洗脱程序如下:
8.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备系统测试液:取邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐、杂质1、杂质2用水溶解并稀释;
(2)采用反相色谱柱,流动相A为酸水溶液,流动相B为有机相,检测器为紫外检测器的检测条件;
(3)依次取空白溶液、所述系统测试液、供试品溶液进行检测。
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