CN114113363A - 一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，属于医药化学分析技术领域。本发明公开了一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱法，且以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以纯化水‑三氟乙酸的混合液作为流动相A，以乙腈‑甲醇的混合溶液作为流动相B，进行梯度洗脱。本发明提供了一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，专属性好，重现性好，准确度高，不受空白和其他杂质干扰，能够准确检测度他雄胺胶囊中杂质。
Description
技术领域
本发明涉及医药分析化学技术领域，更具体的说是涉及一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法。
背景技术
度他雄胺(Dutasteride)由美国葛兰素史克公司生产的抗前列腺增生的药物，是一种白色结晶固体的化学品，分子式为C27H30F6N2O2，用于治疗良性前列腺增生，能长久改善BPH症状，本品还能降低前列腺癌的发病率，同时还被用于治疗男性脱发；度他雄胺是唯一一种对I型、II型亚群双重抑制的5α-还原酶的抑制剂。本公司生产的度他雄胺软胶囊(0.5mg)API的供应商为Sterling制药，度他雄胺软胶囊中杂质谱信息见表1所示：
表1度他雄胺软胶囊中杂质谱信息
上述杂质的化学结构如下：
目前，各国药典上均未有度他雄胺软胶囊质量标准，也没有相关的任何文献或者标准报道。按照进口质量标准JX20130056有关物质方法进行检测，现有的检测手段较为复杂，且检测水平不高，精确度不够。现有的杂质检测方法下，2,5-双(三氟甲基)苯胺和2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯相对于度他雄胺的保留时间分别为0.18，0.19，小于0.35，与辅料峰重合，不适用检测度他雄胺软胶囊(0.5mg)中2,5-双(三氟甲基)苯胺及2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯的含量，而且EP杂质E(度他雄胺-17α-异构体)与度他雄胺峰重合。
因此，针对现有技术中存在的缺陷，提供一种准确测定度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，该方法专属性好，重现性好，准确度高，不受空白和其他杂质干扰，且2,5-双(三氟甲基)苯胺峰与相邻杂质峰之间的分离度大于1.5；2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺与相邻杂质峰之间的分离度大于1.2，符合有关物质要求，能够定量检测度他雄胺胶囊中的降解杂质2,5-双(三氟甲基)苯胺及EP杂质E(度他雄胺-17α-异构体)，同时定性检测基因毒性杂质2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，能够支持对度他雄胺软胶囊的质量控制。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱法，且以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以纯化水-三氟乙酸的混合液作为流动相A，以乙腈-甲醇的混合溶液作为流动相B，进行梯度洗脱。
优选地，所述色谱柱为YMC-Pack ODS-AM 250×4.6mml.D S-5μm,12nm或等同色谱柱，柱温为35-45℃，流速为0.8-1.2ml/min。进一步地，柱温为40℃；流速为1.0ml/min。
上述技术方案的技术效果：采用上述色谱柱，提高柱效，进而提高分离度，能够保证基因毒性杂质与相邻杂质的分离效果。在该柱温下，能准确、稳定地控制液相色谱柱的稳定性，有利于提高液相色谱柱的灵敏度，提高基因毒性杂质峰的分辨率，加快分离速度，缩短分析时间，保证分析结果的准确度和再现性。
优选地，所述流动相A中三氟乙酸和纯化水的体积比为(0.48-0.52)ml：1L；所述流动相B中乙腈和甲醇体积比为94-96：4-6。进一步地，所述流动相A中三氟乙酸和纯化水的体积比为0.50ml：1L；所述流动相B中乙腈和甲醇体积比为95：5。
优选地，所述梯度洗脱为：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 52 | 48 |
| 30 | 52 | 48 |
| 50 | 10 | 90 |
| 60 | 10 | 90 |
| 61 | 52 | 48 |
| 70 | 52 | 48 |
。
上述技术方案的技术效果：以三氟乙酸和纯化水为流动相A，乙腈和甲醇为流动相B，采用上述梯度进行洗脱，能够保证各杂质与相邻杂质的分离效果。此外，采用上述不含缓冲盐的流动相，在保证样品溶解度下，能够延长色谱柱寿命；通过调整流动相的pH，增加杂质在固定相的保留，改善峰形。
优选地，所述杂质包括降解杂质2,5-双(三氟甲基)苯胺和EP杂质E(度他雄胺-17α-异构体)中一种或两种的混合。
优选地，所述基因毒性杂质为2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯。
优选地，所述杂质为2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺。
上述技术方案的技术效果：采用本发明检测方法可同时适用于检测度他雄胺软胶囊中5个杂质包括2,5-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺、3,5-双(三氟甲基)苯胺和EP杂质E(度他雄胺-17α-异构体)，进一步提供制剂中各种杂质研究情况，实用性强。
优选地，所述高效液相色谱法中，检测波长为240-242nm。进一步地，检测波长为242nm。
上述技术方案的技术效果：采用该检测波长，能保证检测的灵敏度和响应值最高，一定程度上避免干扰，保证一定的检测限。
优选地，所述高效液相色谱法中，进样量为90-100μL。进一步地，进样量为100μL。
优选地，所述度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，具体包括以下步骤：
S1、对照品溶液配制：称取2,5-双(三氟甲基)苯胺对照品，加入稀释剂并分步稀释，配制成含2,5-双(三氟甲基)苯胺0.25-0.35μg/ml的对照品溶液；
S2、灵敏度溶液配制：分别称取2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺杂质对照品，加入稀释剂并分步稀释，再移取上述溶液混合并稀释，配制成含(2,5-双(三氟甲基)苯胺0.08-0.10μg/mL、,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯0.08-0.10μg/m、2,4-双(三氟甲基)苯胺0.08-0.10μg/m和3,5-双(三氟甲基)苯胺0.08-0.10μg/mL的灵敏度溶液；
S3、样品溶液配制：取度他雄胺软胶囊，挤出内容物，加入乙腈溶解，并加入纯化水稀释，配制含度他雄胺95-105μg/ml的样品溶液；
S4：分别取步骤是步骤S1所述对照品溶液、步骤S2所述灵敏度溶液和S3所述样品溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定度基因毒性杂质的保留时间，按外标法以峰面积计算样品溶液中度他雄胺基因毒性杂质的含量。
优选地，所述步骤S1中，配制成含2,5-双(三氟甲基)苯胺0.3μg/ml的对照品溶液；
所述步骤S2中，配制成含(2,5-双(三氟甲基)苯胺0.09μg/mL、,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯0.09μg/m、2,4-双(三氟甲基)苯胺0.09μg/m和3,5-双(三氟甲基)苯胺0.09μg/mL的灵敏度溶液；
所述步骤S3中，配制成含度他雄胺100μg/ml的样品溶液。
优选地，所述步骤S1和步骤S2中，稀释剂为乙腈水溶液，且体积比为：3:1.5-2.5。
一种上述的度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法用于2,5-双(三氟甲基)苯胺和EP杂质E的定量检测，以及2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺)的定性检测。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果包括以下几点：
(1)该检测方法能保证2,5-双(三氟甲基)苯胺峰与相邻杂质峰之间的分离度不得小于1.5；且2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺与相邻杂质峰之间的分离度不得小于1.2，能够定量检测度他雄胺胶囊中的杂质2,5-双(三氟甲基)苯胺和EP杂质E，同时定性检测基因毒性杂质2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，对于实现度他雄胺软胶囊质量控制具有极其重要的意义。
(2)该方法专属性好，重现性好，准确度高，不受空白和其他杂质干扰，符合有关物质要求，能够支持对度他雄胺软胶囊的质量控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1中稀释剂色谱图。
图2为实施例1中空白安慰剂色谱图。
图3为实施例1中鉴别溶液色谱图。
图4为实施例1中灵敏度溶液色谱图。
图5为实施例1中对照品溶液色谱图。
图6为实施例1中样品溶液色谱图。
图7为实施例1中2,5-双(三氟甲基)苯胺线性图。
图8为实施例1中各杂质紫外图谱。
图9为对比例1中杂质加样混合溶液。
附图4中各峰的名称如下：
其他附图中峰名称同附图4。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中采用的化学试剂见表2所示：
表2使用的化学试剂清单
本发明实施例中使用的仪器见表3所示：
表3使用的仪器清单
实施例1
本实施例提供一种度他雄胺软胶囊中基因杂质的检测方法，包括以下内容：
1、色谱条件
色谱柱：YMC-Pack ODS-AM 250×4.6mml.D S-5μm,12nm或等同
流速：1.0mL/min 柱温：40±2℃ 检测波长：242nm
进样量：100μL 运行时间：70min
检测器：紫外检测器
洗针液：水/乙腈(200：800，v/v)
柱塞杆液：水/异丙醇(900：100，v/v)
流动相梯度洗脱方式：
流动相A：移取0.5mL三氟乙酸加入至1L纯化水中，脱气；
流动相B：乙腈/甲醇＝95/5(v/v)，脱气；
稀释剂：60％乙腈。
2、具体步骤：
2.1对照品溶液的制备
对照储备溶液：准确称取和转移2,5-双(三氟甲基)苯胺对照品30mg到100ml的容量瓶中，加稀释液稀释到刻度，混匀；准确移取该溶液1.0ml到100ml的容量瓶中，加稀释液稀释到刻度，混匀。(2,5-双(三氟甲基)苯胺：3μg/ml)
对照溶液：准确移取对照储备溶液5.0mL到50ml的容量瓶中，加稀释液稀释到刻度，混匀。(2,5-双(三氟甲基)苯胺：0.3μg/m)。
2.2灵敏度溶液制备
限度溶液(0.1％)：准确称取和转移2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺杂质对照品各30mg到100ml的容量瓶中，加稀释液稀释到刻度，混匀；准确移取该溶液1.0ml到100ml的容量瓶中，加稀释液稀释到刻度，混匀。
准确移取上述溶液和对照储备溶液各3.0mL到100ml的容量瓶中，加稀释液稀释到刻度，混匀。(2,5-双(三氟甲基)苯胺：0.09μg/mL；2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯：0.09μg/mL；2,4-双(三氟甲基)苯胺：0.09μg/mL和3,5-双(三氟甲基)苯胺：0.09μg/mL)
备注:对照品的重量可根据稀释体积来调整以达到目标浓度。
2.3样品溶液制备
取度他雄胺软胶囊20粒，挤出内容物，混匀，精密称取的内容物约3.7g(相当于10粒)于50ml的容量瓶中，加入30ml的乙腈溶解，然后加纯化水稀释定容。取该溶液于离心管中，以3500转离心15分钟，取上层清液即得。(含度他雄胺100μg/ml)
2.4分别取步骤是上述对照品溶液、灵敏度溶液和样品溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定度基因毒性杂质的保留时间，按外标法以峰面积计算样品溶液中度他雄胺基因毒性杂质的含量。
其中，平衡与进样序列：平衡色谱系统直到基线稳定；进至少1针稀释液，进一针灵敏度溶液；进6针2,5-双(三氟甲基)苯胺杂质对照溶液；每一份样品溶液进1针；每进12针样品后进一针2,5-双(三氟甲基)苯胺对照品溶液；运行序列的尾端进一针对照溶液；备注：对照品溶液运行时间可以为30分钟。
3、检测方法验证结果
3.1系统适应性
记录2,5-双(三氟甲基)苯胺在灵敏度溶液中的信噪比(S/N)。同时记录第一针对照溶液中2,5-双(三氟甲基)苯胺理论塔板数和拖尾因子。计算前六针对照品溶液中主峰面积的RSD。结果见表4所示：
表4系统适应性结果总结
注：结果出来ID号为本公司处理色谱图中进样标号。
由表4中数据可知，符合系统适用性标准。
3.2专属性
溶液配制：分别制备1.0％水平的各有关物质的杂质鉴别溶液并进样。杂质鉴别溶液包括：碱破坏杂质(1-羟基度他雄胺)、EP杂质E、二氢度他、EP杂质A、2,5-双(三氟甲基)苯胺、2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯、2,4-双(三氟甲基)苯胺、3,5-双(三氟甲基)苯胺、以及度他雄胺(主峰)。制作空白胶囊，得到空白胶囊溶液。
稀释剂中在2,5-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺出峰位置应无任何干扰。鉴别溶液中2,5-双(三氟甲基)苯胺与相邻杂质峰之间的分离度不得小于1.5。2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺与相邻杂质峰之间的分离度不得小于1.0。杂质鉴别溶液中各已知杂质不得干扰2,5-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺峰。专属性结果见表5所示：
表5专属性结果总结
如附图1-6以及表5中数据可知，稀释剂和辅料中的色谱峰不会对2,5-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺产生干扰。
3.3线性和范围
根据样品溶液工作浓度(100ug/ml)配制2,5-双(三氟甲基)苯胺的线性溶液，2,5-双(三氟甲基)苯胺的线性范围为LOQ，20％，50％，80％，100％和120％。计算响应面积并绘制了浓度-峰面积图。使用以下等式进行线性回归分析：y＝mx+c(其中m是斜率，c是y轴截距)。2,5-双(三氟甲基)苯胺相关系数不小于0.990；Y轴截距不超过100％水平标样峰面积的10.0％。线性和范围结果见表6所示：
表6线性和范围结果总结
2,5-双(三氟甲基)苯胺线性图如附图7所示，由于附图7及表6中数据可知，线性方程为：y＝288427x-66.515，R2＝1，即2,5-双(三氟甲基)苯胺的相关系数为1.0000。Y截距与0.30μg/mL标样的响应百分比为0.1％，符合标准。因此，数据的线性回归分析表明，该方法是线性的，并且适用于在规定浓度范围(从0.03μg/mL到0.39μg/mL)内定量分析2,5-双(三氟甲基)苯胺。
3.4精密度
按照准确度中100％加样回收方法，重复配制六份样品溶液并进样。计算每个样品中2,5-双(三氟甲基)苯胺的回收率。4.4.2.1 6份样品溶液中2,5-双(三氟甲基)苯胺测得回收率结果的RSD％不得过5％。精密度结果见表7所示：
表7精密度结果总结
由表中数据可知，6份样品溶液中2,5-双(三氟甲基)苯胺测得回收率结果为2.2％。因此，该方法可以精确定量成品中2,5-双(三氟甲基)苯胺的量。
3.5准确度
通过规定量的度他雄胺内容物中加入相应限度2,5-双(三氟甲基)苯胺对照品来计算其回收率％，2,5-双(三氟甲基)苯胺的回收样品水平分别为80％，100％和120％。同一浓度水平配制三份，检测样品并计算回收率。每个样品的回收率范围为75％至120％；9份样品回收率的相对标准偏差不超过8％。准确度结果见表8所示
表8准确度结果总结
由表8中数据可知，准确度的结果符合接受标准。因此，该方法对于2,5-双(三氟甲基)苯胺的定量是准确的。
3.6中间精密度
实验室中第二名检测员在不同日期，使用不同序列号的色谱柱在不同系统上进行精密度实验(分析重复性)。6份样品溶液中2,5-双(三氟甲基)苯胺测得回收率结果的RSD％不得过5％。12份样品溶液中2,5-双(三氟甲基)苯胺测得回收率结果的RSD％不得过8％。中间精密度结果见表9所示：
表9中间精密度结果统计
由表9中数据可知，分析员1和2之间结果一致，该方法精确且可重复。
3.7定量限和检测限
将标准溶液按体积稀释到检测限(LOD)与定量限(LOQ)浓度。连续进样6针2,5-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺定量限溶液。检测限的信噪比(S/N)不小于3。定量限的信噪比(S/N)不小于10。6针定量限样品的相对标准偏差不高于10.0％。定量限和检测限结果见表10-13所示：
表10 2,5-双(三氟甲基)苯胺检测限/定量限结果
表11 2,4-双(三氟甲基)苯胺检测限/定量限结果
表12 3,5-双(三氟甲基)苯胺检测限/定量限结果
表13 2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯检测限/定量限结果
由表10-13中数据可知，检测限与定量限的信噪比在接受范围内，2,5-双(三氟甲基)苯胺，2,4-双(三氟甲基)苯胺，3,5-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯六针定量限溶液的相对标准偏差分别为0.9％,1.6％,2.0％,3.2％。定量限溶液浓度远小于已知单一杂质的上限(0.1％)，因此灵敏度符合要求。
此外，本发明还针对该方法的耐用性进行测试，更换类型色谱柱，柱温为35-45℃，流速为0.8-1.2ml/min；流动相A中三氟乙酸和纯化水的体积比为(0.48-0.52)ml：1L；流动相B中乙腈和甲醇体积比为94-96：4-6，检测波长为232-252nm，进样量为90-100μL，上述参数范围内都不会影响该方法的性能，符合系统适用性标准。
本发明还针对溶液稳定性进行测试，试品溶液及对照品溶液配制完成后在室温条件下放置48小时内是稳定的。
3.8检测波长的选择
采用成品有关物质分析方法中的色谱条件，注射1％杂质样品溶液进入高效液相中，得到各杂质紫外图谱如图8所示，从上至下，化合物一次为：2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,5-双(三氟甲基)苯胺，2,4-双(三氟甲基)苯胺，3,5-双(三氟甲基)苯胺。
由图8中可以看出3个苯胺在242nm附近有最大吸收，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯和在紫外吸收的首端比较大，但是噪音也相对较大。综合选择该方法的紫外吸收波长为242nm。
注：成品有关物质分析方法中的色谱条件：
梯度程序：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 70 | 30 |
| 10 | 70 | 30 |
| 25 | 90 | 10 |
| 26 | 70 | 30 |
| 30 | 70 | 30 |
。
综上所述，度他雄胺软胶囊中基因杂质的检测方法的验证参数和结果见表14所示：
表14验证参数和结果总结
由表14中数据可知，该分析方法对于2,5-双(三氟甲基)苯胺含量检测的专属性，线性，准确性，重现性，耐用性是良好的。它在浓度范围内呈线性。该方法针对成品中的2,4-双(三氟甲基)苯胺，3,5-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯的检测具有专属性且灵敏度符合要求。样品溶液在48小时内稳定。
实施例2
本实施例提供一种度他雄胺软胶囊中EP杂质E(度他雄胺-17α-异构体)的检测方法，包括以下内容：
1、色谱条件
色谱柱：YMC-Pack ODS-AM 250×4.6mml.D S-5μm,12nm或等同
流速：1.0mL/min柱温：40±2℃检测波长：242nm
进样量：100μL运行时间：70min
检测器：紫外检测器
洗针液：水/乙腈(200：800，v/v)
柱塞杆液：水/异丙醇(900：100，v/v)
流动相梯度洗脱方式：
流动相A：移取0.5mL三氟乙酸加入至1L纯化水中，脱气，即0.05％-三氟乙酸水溶液；
流动相B：乙腈/甲醇＝95/5(v/v)，脱气；
稀释剂：60％乙腈。
2、具体步骤：
2.1对照品溶液的制备
对照储备溶液：准确称取和转移EP杂质E对照品约2mg到50ml的容量瓶中，加稀释液溶解并稀释到刻度，混匀；准确移取该溶液10.0ml到100ml的容量瓶中，加稀释液稀释到刻度，混匀。(EP杂质E：4μg/ml)
对照溶液：准确移取对照储备溶液5.0mL到50ml的容量瓶中，加稀释液稀释到刻度，混匀。(EP杂质E：0.4μg/ml)
2.2灵敏度溶液制备
灵敏度溶液(0.1％)：准确移取对照储备溶液2.5ml到100ml的容量瓶中，加稀释液稀释到刻度，混匀。(EP杂质E：0.1μg/ml)
备注:对照品的重量可根据稀释体积来调整以达到目标浓度。
2.3样品溶液制备
取度他雄胺软胶囊20粒，挤出内容物，混匀，精密称取的内容物约3.7g(相当于10粒)于50ml的容量瓶中，加入30ml的乙腈溶解，然后加纯化水稀释定容。取该溶液于离心管中，以3500转离心15分钟，取上层清液即得。(含度他雄胺100μg/ml)
2.4分别取步骤是上述对照品溶液、灵敏度溶液和样品溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定度基因毒性杂质的保留时间，按外标法以峰面积计算样品溶液中度他雄胺基因毒性杂质的含量。
其中，平衡与进样序列：平衡色谱系统直到基线稳定；进至少1针稀释液，进一针灵敏度溶液；进6针EP杂质E对照溶液；每一份样品溶液进1针；每进12针样品后进一针EP杂质E对照溶液；运行序列的尾端进一针EP杂质E对照溶液。
3、检测方法验证结果
该方法验证参数和结果总结见表15所示：
表15验证参数和结果总结
由表14数据，可知，本发明公开的度他雄胺胶囊EP杂质E检测方法，对于EP杂质E含量检测的专属性，线性，准确性是良好的，且对照品溶液和样品溶液在室温下放置48小时内是稳定的。
对比例1
本对比例提供一种度他雄胺软胶囊杂质的分析方法，具体包括以下内容：
1、色谱条件
梯度程序：
| 时间(min) | 水(％) | 乙腈(％) | 甲醇(％) |
| 0 | 50 | 45 | 5 |
| 30 | 50 | 45 | 5 |
| 50 | 10 | 85 | 5 |
| 60 | 10 | 85 | 5 |
| 61 | 50 | 45 | 5 |
| 70 | 50 | 45 | 5 |
样品溶液：取4粒软胶囊(批号：1000679)内容物于100ml容量瓶中，用60％乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
2,5-双(三氟甲基)苯胺定位溶液：精密称取约20mg该杂质于100ml容量瓶中，用60％乙腈溶液溶解并稀释定容作为储备溶液；精密移取储备溶液5ml于100ml容量瓶中，用60％乙腈溶液溶解并稀释定容作为中间溶液；再精密移取中间溶液1ml于50ml容量瓶中，用60％乙腈溶液溶解并稀释定容作为1％定位溶液。
4个杂质混合样品溶液配制：分别称取2,5-双(三氟甲基)苯胺，3,5-双(三氟甲基)苯胺，2,4-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯各适量于50ml容量瓶中，用样品溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
采用上述色谱条件进行进样。
2、测试结果
如图9所示，在该方法中3,5-双(三氟甲基)苯胺，2,4-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯保留时间分别为18.87min，19.28min，20.59min，22.69min，分离度分别为0.7，2.4，4.3。且辅料峰不干扰4个目标峰，但分离度未达到要求，在此基础上微调柱温，流动相梯度等，使其分离度达到要求。
综上所述，本发明度他雄胺胶囊中基因毒性杂质的检测方法，对于2,5-双(三氟甲基)苯胺含量检测的专属性，线性，准确性，重现性，耐用性是良好的，在浓度范围内呈线性。该方法针对成品中的2,4-双(三氟甲基)苯胺，3,5-双(三氟甲基)苯胺，2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯的检测具有专属性且灵敏度符合要求，且样品溶液在48小时内稳定。
该检测方法能保证2,5-双(三氟甲基)苯胺峰与相邻杂质峰之间的分离度不得小于1.5；且2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺与相邻杂质峰之间的分离度不得小于1.2，能够定量检测度他雄胺胶囊中的降解杂质2,5-双(三氟甲基)苯胺，同时定性检测基因毒性杂质2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，以及杂质2,4-双(三氟甲基)苯胺、3,5-双(三氟甲基)苯胺和，对于实现度他雄胺软胶囊质量控制具有极其重要的意义。该方法专属性好，重现性好，准确度高，不受空白和其他杂质干扰，符合有关物质要求，能够支持对度他雄胺软胶囊的质量控制。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱法，且以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以纯化水-三氟乙酸的混合液作为流动相A，以乙腈-甲醇的混合溶液作为流动相B，进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为YMC-Pack ODS-AM 250×4.6mml.D S-5μm,12nm或等同色谱柱，柱温为35-45℃，流速为0.8-1.2ml/min。
3.根据权利要求1所述的一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，其特征在于，所述流动相A中三氟乙酸和纯化水的体积比为(0.48-0.52)ml：1L；所述流动相B中乙腈和甲醇体积比为94-96：4-6。
4.根据权利要求1所述的一种度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱为：
。
5.根据权利要求1所述的度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，其特征在于，所述杂质包括基因毒性杂质、降解杂质及工艺杂质中一种或多种的混合。
6.根据权利要求5所述的度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，其特征在于，所述基因毒性杂质包括2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯。
7.根据权利要求1所述的度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，检测波长为240-244nm，进样量为90-100μL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、对照品溶液配制：称取2,5-双(三氟甲基)苯胺对照品，加入稀释剂并分步稀释，配制成含2,5-双(三氟甲基)苯胺0.25-0.35μg/ml的对照品溶液；
S2、灵敏度溶液配制：分别称取2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺杂质对照品，加入稀释剂并分步稀释，再移取上述溶液混合并稀释，配制成含(2,5-双(三氟甲基)苯胺0.08-0.10μg/mL,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯0.08-0.10μg/m、2,4-双(三氟甲基)苯胺0.08-0.10μg/m和3,5-双(三氟甲基)苯胺0.08-0.10μg/mL的灵敏度溶液；
S3、样品溶液配制：取度他雄胺软胶囊，挤出内容物，加入乙腈溶解，并加入纯化水稀释，配制含度他雄胺95-105μg/ml的样品溶液；
S4：分别取步骤是步骤S1所述对照品溶液、步骤S2所述灵敏度溶液和S3所述样品溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定度他雄胺杂质的保留时间，按外标法以峰面积计算样品溶液中2,5-双(三氟甲基)苯胺的含量。
9.根据权利要求8所述的度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法，其特征在于，所述步骤S1和步骤S2中，稀释剂为乙腈水溶液，且体积比为：3:1.5-2.5。
10.一种权利要求1-9任一项所述的度他雄胺软胶囊中杂质的检测方法用于2,5-双(三氟甲基)苯胺和杂质E的定量检测，以及2,5-双(三氟甲基)-1-硝基苯，2,4-双(三氟甲基)苯胺和3,5-双(三氟甲基)苯胺)的定性检测。
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| Title |
|---|
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Also Published As
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