CN109270178A - 一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的方法,其特征是采用氰基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以正己烷‑异丙醇‑乙腈‑冰醋酸为流动相进行洗脱，用于分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质。本方法能够有效分离度他雄胺软胶囊中度他雄胺和杂质A和/或E和/或N，可以同时对其中的一种或多种有关物质进行分离测定，与现有技术相比，提高了分离测定的效率，具有重复性好、专属性强和灵敏度高等特点。

Description

一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及 有关物质的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及高效液相色谱法、流动相及高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的方法。

背景技术

度他雄胺(dutasteride)是第2代5α还原酶抑制药,是目前第一种也是唯一一种同时抑制Ⅰ型和Ⅱ型5α还原酶的药物,由葛兰素公司研究开发,2002年10月10日由美国食品与药品管理局(FDA)批准在美国上市。度他雄胺是合成4氮杂类甾醇化合物,为细胞内酶。分子式为C27H3OF6N2O2,分子量为5285。度他雄胺为白色至淡黄色粉末,熔点为242～250℃,不溶于水,溶于乙醇(44mg·mL1),甲醇(64mg·mL1),聚乙二醇400(3mg·mL1)。

度他雄胺软胶囊，治疗良性前列腺增生症(BPH)的中、重度症状。用于中、重度症状的良性前列腺增生症患者，降低急性尿潴留(AUR)和手术的风险。

合成的度他雄胺粗品主要含有少量的度他雄胺杂质,其中,包含杂质A、B、E、M、N。因此,可采用主成分自身对照法计算杂质含量。但现有的高效液相色谱法均无法很好的分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质。

比如，度他雄胺软胶囊进口注册质量标准(JX20130056)中收录了有关物质方法，以氰基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，流动相为正己烷：异丙醇＝90：10，流速为1.0ml/min，柱温为15℃，检测波长为240nm，供试品浓度为20μg/ml，进样体积为50μl。但根据进口注册质量标准的方法，空白辅料会干扰杂质的检测。同样，EP9.4和USP41质量标准中同样收录了有关物质方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，流动相为乙腈-水-三氟乙酸(52:48:0.25)，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为220nm，供试品浓度为500μg/ml，进样体积为20μl。根据EP9.4和USP41的检测方法，空白辅料干扰峰特别多，干扰杂质的检测，并且空白辅料峰在等度条件下无法完全洗脱，会干扰下一针测试。

鉴于现有的质量标准检测方法会导致空白辅料干扰峰特别多，杂质与杂质之间不能很好的分开，空白辅料会干扰杂质A和/或杂质E和/或杂质N的分离测定，无法更好的有效分离测定他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质以及更好的质量研究。因此，寻找一种重复性好、专属性强和灵敏度高的分离测定他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的高效液相色谱法很有必要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的方法，该流动相和方法适用于度他雄胺和相关杂质A，和/或杂质E，和/或杂质N的分离测定，可同时实现度他雄胺软胶囊中度他雄胺和杂质A，和/或杂质E，和/或杂质N的分离测定，提高了分离测定的效率，有利于对度他雄胺胶囊的质量监测。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的方法，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以氰基硅烷键合硅胶为填充剂，以正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸为流动相进行洗脱。

本发明所述的方法适用于度他雄胺相关杂质A，和/或杂质E，和/或杂质N的分离测定，可用于单独检测其中一种物质，也可同时分离测定这4中物质，与现有技术相比，本发明的方法检测结果受干扰少、重复性更好、专属性更强和灵敏度更高。

上述的方法中，所述色谱柱为以氰基硅烷键合硅胶作为填充剂的色谱柱或性能相当的色谱柱，优选为氰基硅烷键合硅胶。

进一步地，所述色谱柱的型号为Ultimate XB-CN 250mm×4.6mm 5um。

上述方法中，所述色谱柱的柱温为13～17℃，优选为15℃。

上述的方法中，所述流动相为正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸。

进一步地，所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的配比为890～910:81.9～100.1：8.1～9.9:0.445～0.455，优选为900～910:90～100.1：8.9～9.9:0.450～0.455，更优选为900:91:9:0.45。

上述方法中，所述流动相进行洗脱的流速为0.95～1.05ml/min，优选为1.0ml/min。

上述的方法中，在进行高效液相色谱法分析之前，度他雄胺软胶囊内容物需要采用正己烷-异丙醇溶剂溶解并稀释，优选地所述溶剂正己烷-异丙醇的配比为90：10。

上述的方法中，所述高效液相色谱法测定的定量方式为加校正因子的主成分自身对照法。

进一步地，研发此发明方法的同时，需要进行此方法相关的系统适用性溶液进样重复性、检测限、线性和准确度实验。

本发明的目的之2，在于提供了一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺的方法，该方法适用于度他雄胺的分离和检测，可实现度他雄胺软胶囊中度他雄胺的分离测定，提高了分离测定的效率，有利于对度他雄胺胶囊的质量监测。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺的方法，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以氰基硅烷键合硅胶为填充剂，以正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸为流动相进行洗脱。本发明所述的方法适用于度他雄胺的分离测定，与现有技术相比，本发明的方法测定结果受干扰少、重复性更好、专属性更强和灵敏度更高。

上述的方法中，所述色谱柱为以氰基硅烷键合硅胶作为填充剂的色谱柱或性能相当的色谱柱，优选为氰基硅烷键合硅胶。

进一步地，所述色谱柱的型号为Ultimate XB-CN 250mm×4.6mm 5um。

上述方法中，所述色谱柱的柱温为13～17℃，优选为15℃。

上述的方法中，所述流动相为正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸。

进一步地，所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的配比为890～910:81.9～100.1：8.1～9.9:0.445～0.455，优选为900～910:90～100.1：8.9～9.9:0.450～0.455，更优选为900:91:9:0.45。

上述方法中，所述流动相进行洗脱的流速为0.95～1.05ml/min，优选为1.0ml/min。

上述的方法中，在进行高效液相色谱法分析之前，度他雄胺软胶囊内容物需要采用正己烷-异丙醇溶剂溶解并稀释，优选地所述溶剂正己烷-异丙醇的配比为90：10。

上述的方法中，所述高效液相色谱法测定的定量方式为加校正因子的主成分自身对照法。

进一步地，研发此发明方法的同时，需要进行此方法相关的系统适用性溶液进样重复性、检测限、线性和准确度实验。

本发明的目的之3，在于提供了一种高效液相色谱法，该方法适用于度他雄胺和相关杂质A，和/或杂质E，和/或杂质N的分离测定，可同时实现度他雄胺软胶囊中度他雄胺和杂质A、E、N的分离和测定，提高了测定检测效率，有利于对度他雄胺胶囊的质量监测。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效液相色谱法，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以氰基硅烷键合硅胶为填充剂，以正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸为流动相进行洗脱。

本发明所述的方法适用于度他雄胺相关杂质A，和/或杂质E，和/或杂质N的分离和测定，可用于单独测定其中一种物质，也可同时分离测定这4中物质，与现有技术相比，本发明的方法检测结果受干扰少、重复性更好、专属性更强和灵敏度更高。

上述的方法中，所述色谱柱为以氰基硅烷键合硅胶作为填充剂的色谱柱或性能相当的色谱柱，优选为氰基硅烷键合硅胶。

进一步地，所述色谱柱的型号为Ultimate XB-CN 250mm×4.6mm 5um。

上述方法中，所述色谱柱的柱温为13～17℃，优选为15℃。

上述的方法中，所述流动相为正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸。

进一步地，所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的配比为890～910:81.9～100.1：8.1～9.9:0.445～0.455，优选为900～910:90～100.1：8.9～9.9:0.450～0.455，更优选为900:91:9:0.45。

上述方法中，所述流动相进行洗脱的流速为0.95～1.05ml/min，优选为1.0ml/min。

上述的方法中，在进行高效液相色谱法分析之前，度他雄胺软胶囊内容物需要采用正己烷-异丙醇溶剂溶解并稀释，优选地所述溶剂正己烷-异丙醇的配比为90：10。

上述的方法中，所述高效液相色谱法测定的定量方式为加校正因子的主成分自身对照法。

进一步地，研发此发明方法的同时，需要进行此方法相关的系统适用性溶液进样重复性、检测限、线性和准确度实验。

本发明的目的之4，在于提供了一种高效液相色谱法中使用的流动相，使用含有此流动相的高效液相色谱法来分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质，能够提高分离测定的效率，并有利于对度他雄胺胶囊的质量监测。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效液相色谱法中使用的流动相，所述流动相以正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸为流动相进行洗脱。

本发明所述流动相适用于度他雄胺相关杂质A，和/或杂质E，和/或杂质N的分离和测定，可用于单独检测其中一种物质，也可同时分离测定这4中物质，与现有技术相比，本发明的方法检测结果受干扰少、重复性更好、专属性更强和灵敏度更高。

上述所述流动相为正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸。

进一步地，所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的配比为890～910:81.9～100.1：8.1～9.9:0.445～0.455，优选为900～910:90～100.1：8.9～9.9:0.450～0.455，更优选为900:91:9:0.45。

上述方法中，所述流动相进行洗脱的流速为0.95～1.05ml/min，优选为1.0ml/min。

本发明所述的方法，在一个具体的实施方式中，按照以下方式实现：

取度他雄胺软胶囊(含2.5mg度他雄胺)，置10ml量瓶中，加溶剂{正己烷-异丙醇(90：10)}溶解并稀释制成每1ml中约含度他雄胺0.25mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。称取度他雄胺系统适用性对照品2.5mg(含度他雄胺、杂质A、杂质E和杂质N)，加溶剂超声使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.25mg的溶液。分别取供试品溶液、对照溶液和取度他雄胺系统适用性对照品溶液50ul，注入色谱仪，记录色谱图，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍，按本发明色谱条件(色谱柱为以氰基硅烷键合硅胶作为填充剂，型号为Ultimate XB-CN 250mm×4.6mm 5um，流动相为正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸，配比为900:91:9:0.45，柱温15℃流动相进行洗脱的流速为1.0ml/min。)测定。

供试品溶液记录的色谱图中如显杂质峰(杂质A以前的色谱峰除外)，按下式计算各杂质的含量，定量方式为加校正因子的主成分自身对照法，各杂质不得过表一中的限度规定，总杂质(包含杂质O)不得过2.0％。供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.1倍的色谱峰可忽略不计(0.1％)。

Ai/As×F×1％

式中：Ai为供试品溶液色谱图中各杂质的峰面积；

As为对照溶液色谱图中度他雄胺峰的峰面积；

F为校正因子。

表一

本发明的有益效果在于：一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的方法,利用本发明提供的方法可以更好的分离度他雄胺软胶囊中度他雄胺和杂质A，和/或杂质E，和/或杂质N，从而能够更加准确的测定其相关含量，避免了干扰从而克服了现有度他雄胺软胶囊进口注册质量标准所提供的检测方法的不足。

本发明提供了一种比现有检测标准重复性更好、专属性更强和灵敏度更高的分离度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的高效液相色谱法。根据现有度他雄胺软胶囊进口注册质量标准所提供的测定方法，空白辅料和工艺杂质会对其他杂质产生干扰，从而很难准确分离测定度他雄胺及有关物质，而本专利研发了一种新的分离测定方法，很好的解决了这一问题。

综上，本发明提供一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的方法，具有重复性好、专属性强和灵敏度高等特点。

附图说明

图1a和图1b分别为实施例1的空白辅料在240nm、220nm波长下测定的色谱图。

图2为实施例1的度他雄胺的色谱图。

图3为实施例1的杂质A的色谱图。

图4为实施例1的杂质E的色谱图。

图5为实施例1的杂质N的色谱图。

图6a和6b分别为实施例3的检测限实验方案中检测限-1在240nm、220nm波长下测定的色谱图。

图7a和7b分别为实施例3的检测限实验方案中检测限-2在240nm、220nm波长下测定的色谱图。

图8a和8b分别为实施例3的检测限实验方案中检测限-3在240nm、220nm波长下测定的色谱图。

图9为实施例4的线性范围实验方案中杂质A的线性图。

图10为实施例4的线性范围实验方案中度他雄胺的线性图。

图11为实施例4的线性范围实验方案中杂质E的线性图。

图12为实施例4的线性范围实验方案中杂质N的线性图。

图13为对比实施例1的度他雄胺软胶囊进口注册质量标准(JX20130056)的空白辅料色谱图。

图14为对比实施例1的度他雄胺软胶囊进口注册质量标准(JX20130056)的杂质A色谱图。

图15为对比实施例1的度他雄胺软胶囊进口注册质量标准(JX20130056)的杂质M色谱图。

图16为对比实施例1的度他雄胺软胶囊进口注册质量标准(JX20130056)的杂质E色谱图。

图17为对比实施例1的度他雄胺软胶囊进口注册质量标准(JX20130056)的杂质B色谱图。

图18为对比实施例2的度他雄胺原料EP9.4和USP41质量标准的空白辅料色谱图。

图19为对比实施例2的度他雄胺原料EP9.4和USP41质量标准的空白辅料后的供试品溶液色谱图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

仪器与条件

实施例1-5均按照表二色谱条件进行。

表二

实施例1度他雄胺软胶囊中相关物质的分离测定

取度他雄胺软胶囊(含2.5mg度他雄胺)，置10ml量瓶中，加溶剂{正己烷-异丙醇(90：10)}溶解并稀释制成每1ml中约含度他雄胺0.25mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。称取度他雄胺系统适用性对照品2.5mg(含度他雄胺、杂质A、杂质E和杂质N)，加溶剂超声使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.25mg的溶液。分别取供试品溶液、对照溶液和取度他雄胺系统适用性对照品溶液50ul，注入色谱仪，记录色谱图，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍，结果显示空白辅料和度他雄胺不干扰杂质A、杂质E和杂质N测定。分离测定结果：空白辅料、度他雄胺、杂质A、杂质E和杂质N各自的色谱图分别如1-5所示。

实施例2系统适用性溶液进样重复性实验

称取度他雄胺系统适用性对照品2.5mg(含度他雄胺、杂质A、杂质E和杂质N)，加溶剂超声使对照品溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.25mg的溶液。取50μl对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为杂质A、度他雄胺、杂质E与杂质N，度他雄胺峰与杂质E峰的分离度应符合要求。如表三所示，包含杂质A、杂质E、杂质N和度他雄胺的系统适用性溶液进样重复性良好。

表三

实施例3检测限测定实验

取杂质A、杂质E、杂质N和度他雄胺对照品适量，用溶剂超声溶解并定量稀释得到浓度约为0.1μg/ml的溶液(相当于供试品浓度的0.04％)，作为检测限溶液，分别进样3针，每针都采用240nm和220nm波长测定，记录色谱图，得到信噪比，结果见表四。这3针的检测限色谱图分别如图6-8所示。

表四

实施例4线性范围测定实验

取杂质A、杂质E、杂质N和度他雄胺对照品适量，配制相当于供试品浓度0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、1.5％、2.5％的系列溶液(供试品溶液浓度为250μg/ml)，作为标准曲线系列溶液，取50μl注入液相色谱仪中，记录色谱图，以浓度X(μg/ml)对峰面积Y做线性回归，计算回归方程及相关系数，杂质A、度他雄胺、杂质E和杂质N的线形范围结果分别如图9-12所示。

实施例5准确度测定实验

取杂质A、杂质E、杂质N和度他雄胺对照品适量，配制成一定浓度的对照品混合贮备溶液；取本品内容物约1.75g，精密称定，置10ml量瓶中，共9份度他雄胺软胶囊内容物；精密量取对照品混合储备液1.5ml、1.0ml、0.5ml，各3份，分别置上述10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为准确度供试品溶液(分别相当于供试品溶液浓度的1.5％、1％、0.5％)；精密量取各准确度供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液，精密量取上述溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按加校正因子的主成分自身对照法计算杂质A、杂质E、杂质N的加入量和回收率，结果见表五。

表五

对比实施例1进口注册质量标准(JX20130056)测定度他雄胺软胶囊度他雄胺和有关物质

进口注册质量标准(JX20130056)的测定度他雄胺软胶囊度他雄胺和有关物质的色谱条件为以氰基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，流动相为正己烷：异丙醇＝90：10，流速为1.0ml/min，柱温为15℃，检测波长为240nm，供试品浓度为20μg/ml，进样体积为50μl。

取度他雄胺软胶囊(含0.2mg度他雄胺)，置10ml量瓶中，加溶剂{正己烷-异丙醇(90：10)}溶解并稀释制成每1ml中约含度他雄胺0.02mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。称取度他雄胺系统适用性对照品0.2mg(含度他雄胺、杂质A、杂质E和杂质N)，加溶剂超声使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.02mg的溶液。分别取供试品溶液、对照溶液和取度他雄胺系统适用性对照品溶液50ul，注入色谱仪，记录色谱图，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍，空白辅料、杂质A、杂质M、杂质E和杂质B的色谱图结果如图13-17所示。

对比实施例2 EP9.4和USP41质量标准度他雄胺软胶囊度他雄胺和有关物质

EP9.4和USP41质量标准测定度他雄胺软胶囊度他雄胺和有关物质的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，流动相为乙腈-水-三氟乙酸(52:48:0.25)，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为220nm，供试品浓度为500μg/ml，进样体积为20μl。

取度他雄胺软胶囊(含5.0mg度他雄胺)，置10ml量瓶中，加溶剂{正己烷-异丙醇(90：10)}溶解并稀释制成每1ml中约含度他雄胺0.5mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。称取度他雄胺系统适用性对照品5.0mg(含度他雄胺、杂质A、杂质E和杂质N)，加溶剂超声使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液。分别取供试品溶液、对照溶液和取度他雄胺系统适用性对照品溶液20ul，注入色谱仪，记录色谱图，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍，空白辅料和供试品溶液的色谱图如图18-19所示。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (26)

1.一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺及有关物质的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以氰基硅烷键合硅胶为填充剂，以正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸为流动相进行洗脱，所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为890～910:81.9～100.1：8.1～9.9:0.445～0.455，所述有关物质为杂质A，和/或杂质E，和或杂质N；杂质A、杂质E、杂质N的结构式如下所示：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为900～910:90～100.1：8.9～9.9:0.450～0.455。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为900:91:9:0.45。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述流动相进行洗脱的流速为0.95～1.05ml/min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述流动相进行洗脱的流速为1.0ml/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在进行高效液相色谱法分析之前，采用正己烷-异丙醇溶剂来溶解并稀释度他雄胺软胶囊内容物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述正己烷-异丙醇溶剂中正己烷-异丙醇的体积比为90：10。

8.一种高效液相色谱法分离测定度他雄胺软胶囊中度他雄胺的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以氰基硅烷键合硅胶为填充剂，以正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸为流动相进行洗脱，所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为890～910:81.9～100.1：8.1～9.9:0.445～0.455。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为900～910:90～100.1：8.9～9.9:0.450～0.455。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为900:91:9:0.45。

11.根据权利要求8或9或10所述的方法，其特征在于所述流动相进行洗脱的流速为0.95～1.05ml/min。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述流动相进行洗脱的流速为1.0ml/min。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于在进行高效液相色谱法分析之前，采用正己烷-异丙醇溶剂来溶解并稀释度他雄胺软胶囊内容物。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述正己烷-异丙醇溶剂中正己烷-异丙醇的体积比为90：10。

15.一种高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以氰基硅烷键合硅胶为填充剂，以正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸为流动相进行洗脱，所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为890～910:81.9～100.1：8.1～9.9:0.445～0.455。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为900～910:90～100.1：8.9～9.9:0.450～0.455。

17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为900:91:9:0.45。

18.根据权利要求15或16或17所述的方法，其特征在于所述流动相进行洗脱的流速为0.95～1.05ml/min。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述流动相进行洗脱的流速为1.0ml/min。

20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于在进行高效液相色谱法分析之前，采用正己烷-异丙醇溶剂来溶解并稀释度他雄胺软胶囊内容物。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述正己烷-异丙醇溶剂中正己烷-异丙醇的体积比为90：10。

22.一种高效液相色谱法中使用的流动相，其特征在于，所述流动相由正己烷、异丙醇、乙腈和冰醋酸组成，所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为890～910:81.9～100.1：8.1～9.9:0.445～0.455。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为900～910:90～100.1：8.9～9.9:0.450～0.455。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于所述流动相正己烷-异丙醇-乙腈-冰醋酸的体积比为900:91:9:0.45。

25.根据权利要求22或23或24所述的方法，其特征在于所述流动相在所述高效液相色谱法中进行洗脱的流速为0.95～1.05ml/min。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于所述流动相在所述高效液相色谱法中进行洗脱的流速为1.0ml/min。