CN1135989C - 母体免疫分泌物及其在治疗和/或预防人体病症中的应用 - Google Patents

Abstract

由具有人唾液或其它粘膜分泌物生物活性特性并被人耐受的母体免疫分泌物制备的药物，可用于治疗和/或预防以正常粘膜分泌物或其正常生物性能缺失为特征的人体病症如口腔病症。适宜分泌物是家养动物的卵流体或乳或它们的复制品。可以将这些分泌物中发现的天然免疫球蛋白浓缩，由此使分泌物具有接近超免疫免疫球蛋白的潜能。药物特别用于治疗和/或预防口腔感染、龋齿、以炎症、口腔干燥和口臭为特征的口腔病症。

Description

母体免疫分泌物及其在治疗 和/或预防人体病症中的应用

技术领域

本发明涉及治疗和预防以正常粘膜分泌物流量或其正常保护特性减少或丧失为特征的人体病症或者对此类粘膜分泌物敏感的人体病症。

这里所说粘膜分泌物尤其是指唾液、泪液、鼻腔分泌物、肠分泌物和生殖器分泌物。

背景技术

粘膜分泌物具有多种性能，包括机械润滑和清洁、免疫保护作用，当分泌物是唾液时的缓冲能力及对牙齿的再-矿物化作用，以及作为神经刺激的溶媒作用。

除外作为粘多糖(粘蛋白)特性之一的水合和润滑性能外，唾液还含有大量特异和非特异的调节微生物菌群的抗微生物物质。

分泌型免疫球蛋白提供特异保护作用，所述分泌型免疫球蛋白由免疫系统产生并以对特定微生物种属应答的细胞表面抗原为靶向。一些生物活性分子，其中一些目前尚不甚了解，提供更广泛的保护作用；这些生物活性分子包括构成天然免疫系统的肽和蛋白质。酶、溶菌酶、涎过氧化物酶和淀粉酶参与唾液非-特异性抗微生物作用，通过凝集蛋白质和薄膜形成蛋白和所有起源于唾液分泌的乳铁蛋白。

乳铁蛋白是铁结合蛋白质，它有效排除口腔微生物菌群的营养供应品中的铁；它也调节铁在胃肠道(GI)的生物利用度并且具有控制该金属过量吸收的治疗功能。

唾液具有维持口腔健康的基本功能。正常唾液量或其正常组分的减少对于个体口腔健康具有显著影响并导致念珠菌感染、牙龈炎、牙周炎、龋齿、溃疡和口臭的发病率增加。唾液保护和预防性能与前述感染之间的关系主要是预防性的。健康个体的正常唾液流量不能完全防止任何感染的发生，但正常唾液的减少或丧失将诱使感染的频率和复发率大大增加。

口腔感染的严重性在很大程度上也受个体唾液的量和质的影响。牙龈炎和龋齿是全球性最常见疾病；它们的普遍存在性致使健康专家将它们划分到卫生保健或美容之列。在唾液功能严重缺失的患病个体中，龋齿可变成迫使重大牙科或医学干预的严重的容颜损毁和衰弱性疾病。

正常唾液腺功能缺失的症状在医学上被描述为口腔干燥或“口腔干燥综合征”。它是由多种因素引起的最普通症状。许多老年人患有常常由其它医药物质如抗-感染、抗-组胺、镇痛药、麻醉药、抗高血压药、利尿剂、治疗精神病的药物、抗精神病药和抗-帕金森氏病药物引起的进展性口腔干燥。口腔干燥也是斯耶格伦氏综合征(Sjogren’s syndrome)的一个特征，斯耶格伦氏综合征是与类风湿性关节炎有关的自身-免疫性疾病。受累最严重个体是那些接受头部和颈部肿瘤放疗治疗的个体，放射线破坏唾液腺功能的结果是不可避免的副作用。

尽管通常描述为“口腔干燥综合征”的口腔干燥也常常影响其它区域粘膜的干燥，特别是当它是斯耶格伦氏综合征的一个症状时。不考虑其病原学。病症严重影响患病个体的生命质量并导致龋齿、牙龈疾病、溃疡和鹅口疮发病率增加。

口腔干燥或其它任何导致粘膜分泌减少的病症可诱发个体由念珠菌属致病性酵母菌引起的口腔鹅口疮的发病率大大增加。这些诱发病症包括免疫抑制、细胞毒和放射治疗、HIV感染、白血病和糖尿病。对于酵母菌感染最不明显和可能最普遍的诱因是由过量使用抗菌药和类固醇而引起的。

口腔鹅口疮，或该感染的其它表现如酵母菌牙龈炎通常称作念珠菌病；最常见菌属是白色念珠菌。Coleman等在AIDS(1997)11，5，557-567中描述了在为防止口腔念珠菌病预先长期预防性使用抗真菌药物治疗的HIV感染个体中出现了新种的念珠菌。

更为普遍存在的口腔健康问题包括下面将要讨论的龋齿、牙龈炎、牙周炎和口臭。大多数个体在其一生中会患有部分或者所有这些病症，病症的严重程度取决于多种因素，包括宿主特异性免疫机制、影响牙釉质和牙龈形成的遗传因素、影响微生物斑数量和类型的饮食与卫生保健因素。尽管在对这些感染的微生物病因学的认识上有一些不同观点，但众所周知特定微生物与这些疾病的进展有关。例如，有三组微生物通常与龋齿有关，它们是链球菌乳酸杆菌和放线菌。

对粘膜分泌物的正常流量或其正常免疫性能减少或缺失引起的病症的治疗有许多疗法。例如，使用多种抗体，包括抗真菌药和抗菌剂。

抗体，无论是否是抗真菌或抗菌剂，由于总是存在受治疗微生物发生抗药性和出现难治性感染的风险，所以给药应当保守。大多数抗体具有限制它们用于急性治疗的副作用；副作用可包括恶心和食欲不振以至肝脏损害以及与其它药物的相互作用。

用于治疗口腔干燥的植物小叶毛果芸香的提取物毛果芸香碱，是目前可利用的最有效的催涎剂，由于它的副作用包括流泪、头晕、出汗、鼻炎、视力模糊，所以该药的使用需要个体化剂量控制。毛果芸香碱对毒蕈碱受体具有胆碱样活性并拟似副交感神经乙酰胆碱的作用。乙酰胆碱刺激水和电解质分泌；另一独立的神经递质肾上腺素通过交感神经起作用并刺激蛋白质和大分子的分泌。理论上毛果芸香碱应当仅仅影响水和电解质的分泌。然而，在细胞水平存在一定量的交叉作用，细胞水平共同的激活剂-环AMP，对液体和蛋白质的分泌也有一定程度的影响。然而，对毛果芸香碱反应而产生的唾液或其它粘膜分泌液的质量中所含的基本大分子，特别是分泌型免疫球蛋白的量有限。唾液中所含分泌型免疫球蛋白和其它免疫成分通过入胞作用和胞裂外排作用而由血清通过上皮细胞转运，并且主要由不直接受神经递质影响的小粘液腺生成。

认识到毛果芸香碱经常被用于减轻因其它原因引起免疫系统受损个体的口腔干燥也是很重要的。在这些患者中液体分泌的刺激不能矫正免疫成分的缺失。

配制钙和钾盐的饱和溶液代替唾液中的离子组分是相对简单的事。此类溶液在抗原制药有限公司(Antigen Pharmaceuticals Limited)已作为“Luborant”(商标)市售，溶液由钾、镁和氯化钙组成，还含有磷酸钾缓冲液、氟化钠和羧甲基纤维素。已经开发的大量类似再-矿物化产品包括”Remodent”(商标)，一种骨钙溶液。所有这些产品的问题是唾液饱和状态的脆弱平衡不能被在龋病变处起作用的适宜结晶抑制剂重现。因此，形成不可控制的小管沉积的可能性是很大的。

多数人可以耐受经常作为食物消耗的卵蛋白，同样，大多数人可以耐受各种反刍动物的乳品。

已知通过事先分别免疫牛或母鸡可以增加乳和蛋的特异抗体含量。由于它们的食物来源，此类抗体为人粘膜的长期被动免疫提供了吸引人的选项。Hatta H等：龋齿研究(Caries Research)，1997：31：268-278描述了超免疫卵免疫球蛋白作为预防龋齿的潜在用途。

EP-A 0 152 270公开了被动免疫哺乳动物对抗由抗原引起的病症的方法，所述方法包括将从用抗原免疫过的家禽或牛中提取的免疫有效量的抗体施予哺乳动物；哺乳动物由于曾经食用过来自家禽蛋或牛乳的含抗体物质，所以能够耐受抗体。

65218号爱尔兰(Irish)专利说明书描述了使用卵和乳的分泌型免疫球蛋白来预防真菌感染，特别是粘膜上皮白色念珠菌感染。该文献已经证明白色念珠菌免疫过的母鸡卵中的免疫球蛋白成分抑制实验培养的白色念珠菌株的生长、颊细胞粘附和菌丝小管形成。

Ikemori等(1992)在美国兽医研究杂志(American Journal of VeterinaryResearch)；53，2005描述了卵免疫球蛋白在被动免疫中的应用。Mastecky等在临床调查研究杂志(J.Clin.Invest.)(1978)61，731-737中证明了分泌型免疫球蛋白的作用和免疫对抗变异链球菌的可能性。

被动免疫过程，是指直接针对特异微生物种属并特意地将之清除，而不影响可能存在的其它种属。如前所述，大多数粘膜特别是口腔被多种微生物种属病理性占据。指出哪个，若有的话，或全部已知病原菌将在某特定时间影响某一个体是困难的，因此，最好将被动免疫技术局限在预防和治疗特定病症上。

粘膜保健中应用被动免疫的合理性是建立在模拟粘膜天然存在的分泌型免疫球蛋白的基础上。众所周知人唾液中存在分泌型免疫球蛋白，Brandtzaeg对此进行了适当综述：人唾液(Human saliva)：临床化学和微生物学(Clinical Chemistry and Microbiology)，第2卷第1-55页，J Tenovuo主编，1989年CRC出版。在同一出版物中，J Tenovuo对人唾液中非-免疫球蛋白性防御因素进行了综述，第55-93页。

非-免疫球蛋白性防御因素包括溶菌酶、乳铁蛋白和唾液过氧化物酶以及其它天然免疫系统成分。天然免疫系统提供广谱抗微生物活性而不象特异适应性反应那样需要事先与抗原接触，特异适应性反应中抗体是主要组分。

已报道人唾液分泌物中存在其它的天然免疫成分(Wolff等，组织化学细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)(1990)，38，1531-1534)。有效的抗微生物活性归因于由许多不同脊椎动物和无脊椎动物粘膜分泌物中分离出的数种多肽(Mahada等，肠(Gut)(1997)，40，161-163)。已鉴定的分子实体是爪蟾抗菌肽、杀菌肽、防御素、collectins和富含脯氨酸和精氨酸的多肽。

抗微生物多肽在牙科保健中的潜在用途是Miyasaki和Lehrer一篇综述的主题：国际抗微生物剂杂志(Int’J.Antimicrobial Agents)9(1998)269-280。作者提供了当前已知抗微生物多肽和其来源的综合清单，其中没有一个是得自乳或卵的。

需要避免传统治疗的副作用的治疗或预防前述人体病症的可选择的和改进的治疗方法

发明公开

本发明提供具有人粘膜分泌物生物活性特征的母体免疫分泌物的应用，所述母体免疫分泌物在制备治疗和/或预防以丧失所述粘膜分泌物或分泌物正常生物性能为特征的或对所述粘膜分泌物敏感的人体病症的药物中能够被人耐受。

这里使用的术语人可以包括遗传上与人近缘的动物，所述人将受益于本文所描述的治疗和预防处理。

这里使用的母体免疫分泌物是指任何由母体为保护或发育胚胎或新生儿的目的而产生的生物分泌物。这些分泌物的实例是母鸡卵的流体基质或牛乳。除外它们的营养功能，这些流体通过它们的分泌型免疫组分，包括但不限于抗体，而参与鸡胚或新生小牛发育的被动免疫。

适宜的粘膜分泌物选自唾液、泪液、鼻腔分泌物、肠道分泌物和生殖器分泌物。

在下面描述中，本发明主要以称为卵流体物质的单个母体免疫分泌物及其在治疗和/或预防口腔病症中的应用来进行描述。

因此，本发明一方面是提供具有人粘膜分泌物生物活性特征的母体免疫分泌物的应用，所述母体免疫分泌物在制备治疗和/或预防以丧失正常唾液或丧失唾液正常生物性能为特征的人口腔病症的药物中能够被人耐受。

当母体免疫分泌物是卵流体时，优选卵流体取自家养母鸡。

在一实施方案中，卵流体取自卵黄。

优选地，卵黄是脱脂的(delipidised)。

在另一供选择的实施方案中，卵流体取自卵白。

卵的天然免疫能力并不限于卵黄的成分，卵白蛋白显示出抑制微生物生长及粘附的抗微生物活性，因此，根据本发明它们在模拟粘膜分泌物特性方面具有很大的实用性。

优选地，卵白是脱去卵白蛋白(de-ovalbuminised)的卵白。

为了利用卵白蛋白的抗微生物性质，优选去除主要结构蛋白卵白蛋白。蛋白质分离方法为本领域技术人员所熟知。只要剩余少量成分按接近其在完整卵白的原始比例的比例回收的话，基于凝胶过滤、离子交换、选择沉淀或其它制备性色谱技术的任何常规方法均能满足。

在另一个实施方案中，卵流体是脱脂卵黄和去卵白蛋白卵白的混合物。

如本文所描述，卵黄提取物和卵白提取物是提供唾液和其它粘膜分泌物样成分的丰富来源，包括但不限于，卵溶菌酶(溶解活性)、卵转铁蛋白(结合铁)、抗生物素蛋白(凝集素和生物素络合物)、类卵粘蛋白(蛋白酶抑制剂)、粘蛋白卵磷脂和过氧化物酶活性，以及特异和非特异免疫球蛋白及天然免疫系统的非特异抗微生物成分。

许多脊椎动物的体外分泌物中存在类似的生物活性实体，特别是哺乳动物的体外腺体分泌物，包括乳腺。体外分泌物是生物性流体，它们增添活力、健壮生命和保护机体与外界环境的接触面。在体外分泌物是乳腺分泌物和鸡卵的成分时，体外分泌物也是将接触面传递给新生儿的母系载体。

根据另一实施方案，分泌物是乳，尤其是山羊乳(caprine milk)。

来源于任何反刍动物的乳汁将同样地含有母体动物表达的分泌型免疫球蛋白。初乳，分娩后的最初乳汁，特别富含免疫球蛋白；在新生儿的隐性免疫系统成熟之前，初乳天然地旨在为新生儿提供被动免疫。卵、乳和特别是初乳含有母体动物曾感染过的任何抗原的特异性分泌型抗体。

选择家禽卵和牛乳或羊乳作为这些成分的可接受来源。由于这些物质通常作为食物消耗，它们不仅不象例如猴乳或鸽卵那样不具有全球的可接受性，而且它们是本发明所用类似物质的十分充足的来源。

正如前面所指出的那样，这些分泌物在本文是指“母体免疫分泌物”。分泌物提取物可用于复制人粘膜分泌物的基本成分，以及根据本发明可用于治疗和/或预防以正常粘膜液流或其正常保护特性减少或缺失为为特征的人体病症。

这里使用的术语预防包括母体免疫分泌物在制备可用于增强或基本代替正常粘膜分泌物的药物中的应用。

本发明所用药物是模拟全部粘膜分泌物作用的天然来源的生物活性组分的组合物，特别是通过替代免疫成分(既替代特异性又替代非-特异性)、润滑和水合粘蛋白以及需要时唾液复制品中的磷酸钙结晶抑制剂。使用其大分子成分的天然存在的复制物，组合物可复制全部粘膜分泌物的已知生物功能，这样，适宜于在本文所描述的保健应用中长期预防性给药。

这里的药物也指特别的饮食制剂。

例如，这里描述的药物可包括治疗或预防胃肠道感染的婴儿乳制品。

优选地，母体免疫分泌物包括它们的天然免疫系统成分。

天然免疫系统与特异或获得性免疫系统的区别是天然免疫系统的成分对于任何一种微生物种属或抗原类型均是非特异性的，同时也不需要任何事先与抗原的接触(使免疫)以引发反应。

另外，优选地，天然免疫系统成分的抗体由非-免疫的天然抗体组成。

还有，优选地，天然免疫系统成分的抗体成分包括多特异抗体。

为了特定应用，可通过在收集分泌物之前先将动物免疫而增强母体免疫分泌物，然而，一般不需要这样。

因此，母体免疫分泌物或其一部分可得自超免疫动物。

优选地，当本发明药物是唾液复制品时，药物将包括分泌型免疫球蛋白作为它的组分，从而模拟人唾液的分泌型IgA和IgG。如果需要，可通过用得自下列口腔病原菌的任何一个或联合抗原接种供体动物而增强免疫性能：

链球菌属；变异链球菌、鼠链球菌、大鼠链球菌、表兄链球菌、野生链球菌、弥猴链球菌、汗毛链球菌或它们的血清型，血链球菌，口腔链球菌，缓症链球菌，唾液链球菌，前庭链球菌。

乳酸杆菌属；鼠李糖乳杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌

放线菌属；衣氏放线菌、内氏放线菌和粘放线菌

二氧化碳嗜纤维菌属；生痰二氧化碳嗜纤维菌，黄褐二氧化碳嗜纤维菌和牙龈二氧化碳嗜纤维菌

具核梭杆菌属

伴放线放线杆菌。

假丝酵母属；白色假丝酵母，dublinensis，glabrata，热带假丝酵母，克鲁斯氏假丝酵母，乳酒假丝酵母和星形假丝酵母。

正如上面所指出的那样，在本发明一个实施方案中，药物是所述人粘膜分泌物的复制品。

为开发预防或治疗粘膜的有效制剂，复制品尽可能接近天然分泌物的所有特性是必要的。最需要的制剂将包括广谱抗微生物活性而不是完全抗菌，从而清除机会病原菌的过度定居，同时促进天然微生物菌群的再-平衡。唾液天然促进口腔正常微生物菌群的生长，同时抑制粘膜的过度定居。参见，唾液和口腔健康(Saliva and Oral Health)；Edgar和O’Mullane编写：大不列颠牙科协会(British Dental Association)出版；第100-101页。天然分泌物的水合和润滑性能是粘膜保健的基础，在唾液，调节钙结晶的独特性能对于保养牙釉质很关键。也需要为长期预防设计没有传统抗生素或抗菌剂副作用的制剂。

优选地，所述分泌物富含天然免疫成分中的一种或多种成分。

因此，本发明提供i)非-免疫的‘天然’或‘初始’抗体；ii) 与任选 地包括非免疫抗体的天然免疫系统成分联合；和iii)天然免疫系统成分与免疫抗体(超免疫抗体)联合；在母体免疫分泌物或其复制品中在预防或治疗前面提到的并将在后面更加详细介绍的病症中的应用。

正如这里所描述的，通过从母体免疫分泌物中提取各种天然免疫成分和接下来将该免疫成分或每一个提取的免疫系统成分加入到含母体免疫分泌物或它们的复制品中，可以增强分泌物或复制品的作用，视情况而定。因此，此过程可能获得具有接近超免疫免疫球蛋白效能的天然或‘背景’免疫球蛋白。

根据本发明，基于蛋白质粘附于微生物细胞表面的生物特性，天然免疫系统的蛋白质通常是从卵黄中提取和浓缩的。由于在食品中使用，在这点上发面酵母菌是适用的。对微生物细胞具有亲和力的天然免疫系统成分，粘附于酵母菌并可通过离心而收集。通过控制pH和离子强度，可将天然免疫系统成分从酵母菌上解吸附。由于天然系统的多特异性，从发面酵母菌上解吸附的破片成分将强烈地粘附于各种微生物种属，结果将抑制这些微生物种属与粘膜上皮细胞的粘附。

将卵黄脱脂并非必要，但是脱脂可提高收率并便于测定蛋白质的含量。当需要时，可使用超临界二氧化碳溶解卵黄脂或者通过用9倍体积的蒸馏水稀释卵黄并于-70℃冷冻24小时而更简单地将卵黄脂去除。融化，离心将脂部分分离。收集经平纹细布(muslin cloth)过滤的上清液而去除仍漂浮着的低密度脂部分。

微生物细胞可被有效地用作天然免疫系统蛋白质的诱饵。这样，利用蛋白质粘附于微生物细胞表面的生物特性的过程，这些蛋白质全部被浓缩；与此同时，使得所有分子实体的提取物和浓缩物分享此特性。

除外使用微生物细胞本身，使用适宜微生物种属的细胞壁成分与内表面键合如聚苯乙烯珠也是可能的。

卵黄是由悬浮于水性蛋白质溶液(浆)中的粒状和球状体构成的复合结构，卵黄通过卵黄膜而与卵白分隔。卵黄的大分子成分由脂、蛋白质、脂蛋白和磷脂蛋白、低聚糖和糖蛋白组成，每一种成分具有不同的水溶解度，彼此之间有不同程度的亲和力，因而一些聚集成球状体。有一篇对卵蛋白的全面综述：卵科学和技术(Egg Science and Technology)，Staedelman和Cotterill编写，Hayworth出版，国际标准书号156022 8555，第105-175页。

卵黄浆的水溶性蛋白质区分为与鸡血清蛋白相对应的α、β、γ和δ卵黄球蛋白。Chang，P.K.等((1977)，食品科学杂志(J.Food Sci.)35，87-88)报道脱脂卵黄提取物中确定有19种独立蛋白质，而卵浆部分α和β中有9种蛋白质；γ部分是单个蛋白质，相当于血清γ球蛋白。1969年Leslie，G.A.和Clem，L.W.(实验医学杂志(J.Exp.Med.)130，1337-1352)确定此γ球蛋白为免疫球蛋白IgY。

使用等电聚焦(IEF)技术显示，从发面酵母菌上解吸附的天然系统成分由高达11条分离蛋白带组成；其中两条是高度磷酰化的或glycosylate的，因为它们只是在硝酸银或酰氨黑染色时才可见到。至少一种IEF带代表γ球蛋白(抗体)，其它是非免疫球蛋白。

如前所述，天然免疫系统能力不限于卵黄成分，也包括卵白的成分。使用本领域任何常规的方法可将天然免疫系统的独立成分分馏以提供呈现分立的生物功能的纯化组分。

纯化成分包括蛋白质、脂蛋白、肽、肽聚糖、脂、烃、低聚糖或任何其它大分子成分或显示类似于粘膜分泌物性能的生物功能成分的联合。

如这里描述的，在为构建人造粘膜或人粘膜其它预防性应用而使用天然免疫成分时，可能希望校准各个成分的相对浓度。通过纯化各个组分的量和将这些成分加回到一批去卵白蛋白的卵白或脱脂卵黄或它们的混合物中而完成校准。

这样，从卵和乳提取、纯化和再配制以提供模拟唾液功能的唾液复制品成分的生物特性，将在下面详细描述，此后也称为唾液复制品。

尽管不希望受任何理论说明的限制，本发明非特异免疫成分如低聚糖可能通过结合个别组分而加强其它成分包括免疫球蛋白的作用，因而，有利于在微生物细胞表面联合作用。

定义的卵天然免疫系统包括下述模拟人唾液类似因子的实体：

溶菌酶：卵白富含溶菌酶，溶菌酶很容易提取和纯化。每升唾液通常含有约100mg溶菌酶。众所周知，该酶的抗微生物功能是水解细菌细胞壁的胞壁质，特别是革兰氏阳性细菌包括变异链球菌，在低渗溶液中引起细胞溶解。溶菌酶也被认为增强分泌型免疫球蛋白的功能。

乳铁蛋白：每升唾液含有10-20mg此种铁结合蛋白，已证实乳铁蛋白是螯合铁，它不是口腔微生物菌群的营养素。卵白含有约13％卵转铁蛋白，现在已知卵转铁蛋白的结构和功能类似于唾液乳铁蛋白和人血清铁蛋白。

生长因子抑制：Tenovuo，J.O.((1989)supra)提出唾液中存在类似于乳铁蛋白的结合因子但功能是没收维生素B12。卵白含有抗生物素蛋白，已知后者与生物素结合到这样的程度以致于可引起大鼠此维生素的营养性缺乏。生物素是念珠菌和其它致病性酵母种属的基本生长因子(F.C.Odds；念珠菌和念珠菌病(Candida和Candidosis.)第13页)。

酶抑制：也已知唾液含有一定量的酶抑制剂。因此，已证实唾液含有抑半胱氨酸蛋白酶蛋白，细菌蛋白酶活性的抑制剂(Saitoh.E.和Isemura S.口腔生物医学的评论性综述(Crit.Rev.Oral Biol.Med.)(1993)4，487-493)。也如抑半胱氨酸蛋白酶蛋白那样，卵白含有称为类卵粘蛋白的胰蛋白酶抑制剂，类卵粘蛋白呈现出不同于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白和其它唾液成分的强的蛋白水解抑制作用。

卵黄蛋白：卵黄的非特异和多特异成分包括γ卵黄蛋白，γ卵黄蛋白作用方式类似于分泌型抗体，通过与微生物细胞表面结合，从而建立分子屏障以阻止微生物细胞与宿主组织粘附。

这里描述的视情况而定的唾液和其它粘膜分泌物的复制性能，包括但不限于：

分泌型免疫球蛋白的特异和非特异/多特异免疫特性；

溶菌酶、涎过氧化物酶、histatins、粘蛋白、粘附素、防卫素、爪蟾抗菌肽、collectin和杀菌肽的天然免疫特性；

卵类粘蛋白和其它因子的蛋白水解抑制作用；

乳铁蛋白、抗生物素蛋白和其它生长因子没收剂的代谢调节作用；

statherins、富含脯氨酸蛋白(PRP)和磷蛋白的钙结晶抑制和表膜形成特性；

粘蛋白和糖蛋白的水合和润滑特性；

碳酸钙的再矿物化特性；

磷酸钙和钾的缓冲特性；和

葡萄糖、尿素和游离氨基酸的微生物营养特性。

根据本发明，为了预防或治疗口腔感染，唾液复制品可被增强。

可制备针对特定微生物的增加个别组分浓度的特定制剂。

从用适宜抗原超免疫过的动物提取的特异免疫球蛋白也可与本文描述的提取的天然系统成分联合。

本发明抗念珠菌制剂通常包括特异抗念珠菌免疫球蛋白与浓度增加了的抗生物素蛋白联合。该制剂中的抗生物素蛋白将与念珠菌基本生长因子-生物素结合。增加制剂中没收铁的卵转铁蛋白的浓度将使酵母菌既丧失铁又丧失生物素，因而导致抗微生物活性大大增加。

应认识到该制剂在治疗普通念珠菌病有效并特异地对鞘鹅口疮有效。

本发明抗口臭制剂通常包括对抗常常与口腔中蛋白水解活性有关的革兰氏阴性厌氧微生物的特异免疫球蛋白与卵类粘蛋白联合，所述革兰氏阴性厌氧微生物包括Treponema denticola，Porphyromonas gingivalis，Prevotellaintermedia、Bacterides fbrsythus和Fusobacterium，所述卵类粘蛋白抑制这些微生物的蛋白水解活性。

增加上述制剂中溶菌酶的浓度将进一步增强抗微生物活性，甚至对革兰氏阴性微生物有效，而溶菌酶本身通常对革兰氏阴性微生物没有影响。

本发明抗斑制剂通常包括对变异链球菌种属特异的免疫球蛋白与增浓的溶菌酶的联合，后者具有强的抗这些革兰氏阳性球菌的溶菌活性。

增加唾液复制品中上述鉴定的每一个独立成分的浓度，是指通过将各成分的纯化提取物加入到一批唾液复制品中，使所述成分的量相对于唾液复制品中已存含量增加。优选地，加入抗生物素蛋白的量不大于1mg/ml，加入的溶菌酶或卵转铁蛋白的量不大于5mg/ml。

尽管不是必需的，但是上述制剂中，组合物在全卵的水性提取物的稀释溶液中制备是优选的。

发现个别成分所显示的生物活性被全卵的稀释性水性提取物增强。尽管不希望受任何理论解释限制，但是提议某些水溶性组分作为凝集因子起作用，促进该个别组分在微生物细胞表面结合。

本发明唾液复制品成分通常是家禽卵的成分，根据打算应用的目的将家禽卵成分提取、纯化、在特定特性的制剂中再集合，并制成最适于应用的剂型。活性组分可以配制成用于牙膏内含物的冷冻-干燥粉末形式，或是打算用作漱口剂而配制成液体形式。也可将活性组分在用作牙线包衣或托牙固定剂的蜡或聚合物中包胶囊或乳化。其它适宜制剂包括托牙分离剂或润喉糖锭。

在本发明使用的任何制剂中，各种组分可与赋形剂联合以增强活性组分与口腔或其它粘膜粘附或在计划起作用的部位提供组分的持续或控制释放。

在一口腔应用的优选实施方案中，活性组分制剂是持续释放的口香糖制剂。

本发明由母体免疫分泌物制备的药物可用于口腔的多种病症和疾病。

本发明使用的唾液复制品制剂可用于常规预防龋齿和牙龈疾病，用于患其它口腔疾病而没有预-处理的个体，或者，更特异地配制以补偿正常唾液流量从而预防其他健康个体的复发感染如鹅口疮。唾液复制品也配制成完全替代免疫损害个体的正常唾液中减弱的免疫成分。唾液复制品还可配制成补充或完全替代口腔干燥症的衰弱的唾液腺体功能。甚至用于细菌性口臭的涉及个别组分如蛋白酶抑制剂(类卵粘蛋白)的更特异制剂也是可能的。

如上面所指出，这里描述的药物可用于治疗和/或预防口腔感染。

例如，药物可用于预防和治疗口腔鹅口疮，鹅口疮可能是口腔干燥引起的复发性感染。

本发明药物可用于预防龋齿。

本发明药物也可用于治疗和/或预防以牙龈炎症为特征的口腔病症。

本发明药物另外一个用途是治疗和/或预防口臭。

用于口腔干燥和口臭时，优选的制剂是上面提到的漱口剂和口香糖。

本发明药物也可用于减轻某些代谢障碍的影响。

因此，本发明药物可用于限制食物中铁的摄取。

唾液是咀嚼润滑剂，由此而浸湿所有咀嚼食物。唾液淀粉酶的作用已被很好地阐明，它通常在口腔中启动淀粉的消化。很少了解其它唾液成分与食物的相互作用，特别是在调节食物成分吸收方面。乳铁蛋白调节铁摄取作用被认为是患血色素沉着个体的显著特征，血色素沉着是缺乏对过量吸收铁控制调节而导致铁的过量吸收。可以特异配制通过增加卵转铁蛋白和卵黄高磷蛋白含量来减少铁从饮食中摄取的药物。

这样，铁与卵转铁蛋白和卵黄高磷蛋白结合的特性可用于没收饮食中的铁，从而就象在治疗血色素沉着时希望的那样限制铁的系统吸收。制剂中加入蛋白水解抑制剂-类卵粘蛋白，将进一步抑制胰蛋白酶消化卵转铁蛋白：铁络合物，从而进一步限制铁的饮食摄取。

类似地，分泌型IgA在调节食物中抗原摄取方面起作用。本发明药物可用于抑制食物中可能引起某些个体过敏的成分的吸收。用特异过敏原将供体动物免疫，免疫球蛋白成分可直接对抗这些致过敏成分，由此将这些过敏原从消化道的吸收减至最少。

所以，使用本发明药物影响食物中特定成分的吸收是可能的。

另外，药物可包括一种或多种唾液特有的无机盐。

本发明唾液复制品的治疗特性可通过掺入已知在口腔保健中具有修复特性的中草药提取物而更进一步地增强。

因此，本发明药物可与增强所述分泌物作用的植物提取物同时、分开或顺次给药。

适宜地，植物提取物可得自欧洲越桔(Vaccinium myrtillis)、玉米、香蜂花(Melissa officinalis)或小叶毛果芸香(Pilocarpus microphylus)。

科学文献和药典参考支持欧洲越桔提取物在口腔保健中的治疗价值：Morazzorni，P和Bombardelli，E.，Fitoterapia(1996)LXVII，1。

发现花色甙(anthocyanin)在其中提供如下特性：

刺激粘多糖生物合成

刺激糖胺聚糖生物合成

抗炎作用，这是由于降低了毛细血管通透性，而降低毛细血管通透性可能是与胶原交联从而增加对胶原酶活性的抵抗力的结果。

标准提取物的总抗收敛性引起口腔中唾液和粘液分泌增加。

由香蜂花(香峰叶(lemon balm))提取的rosmarinic酸已被清楚地证实在治疗单纯性疱疹中具有治疗价值：Wolbling，R.H.和Leonhardt，K.，植物医学(phytomedicine)(1994)1，25-31。

据报道玉米的不可皂化成分通过刺激成骨细胞而刺激牙槽骨生长，所以在修复牙周骨缺损上是有价值的。(Nuova Linnea Sa，Locarno，Switzerland)。

药物毛果芸香碱以胶囊形式常规地给予那些患口腔干燥的患者，5mg每日3次。该药物是胆碱能激动剂，增加液体的产生但对唾液生物功能所必要的大分子成分则很少有改善。该治疗的副作用是频繁的，包括发汗、流泪和恶心。为例将这些副作用减至最少，通常将剂量个体化给药；个体化有效剂量可从1mg到15mg，每日3次。

南美印地安人常常咀嚼称为Joborandi的植物以利用其生涎特性。以与作为烟草替代物而使用尼古丁口香糖的同样方式，将毛果芸香碱掺入口香糖中，促进个体化剂量控制。本发明描述的母体免疫系统分泌物提取物与口香糖中的毛果芸香碱一起将增加液量及替代正常唾液所必需的大分子成分。

另一方面，本发明提供用于治疗和/或预防口腔病症的制剂，制剂包括此前定义的母体免疫分泌物和多元醇，所述病症以缺失正常唾液或丧失的唾液正常生物特性为特征。

优选地，多元醇选自赤藓醇、甘露醇、山梨醇和木糖醇。

已知该多元醇用于牙科保健产品并干扰微生物转化饮食中的糖类，由此而防止牙斑中酸的形成。

还有，制剂是口香糖、润喉糖锭、漱口剂或牙膏形式。

再一方面，本发明提供用于治疗/或预防以正常机体产生的粘液分泌物或粘液分泌物的正常生物特性缺失为特征的或对所述粘膜分泌敏感的人体病症的组合物，所述组合物包括具有所述粘膜分泌物生物活性特征的母体免疫分泌物的天然免疫物质。

本发明使用的药物可以能有效地达到所需治疗或预防作用的任何剂型给药或施用。

上述制剂通常是那些适于口腔治疗的制剂。然而，包括口服给药、非肠道给药和局部应用、鼻腔喷雾、阴道栓剂的其它应用也是可取的。

如果是眼部病症，可使用滴眼剂、软膏、眼睛植入体等等。

对母体免疫分泌物敏感病症包括创伤和擦伤的治疗、烧伤和皮肤感染。

因此，这里描述的药物可掺入调味品中。

根据本发明，可治疗的典型皮肤感染包括唇疱疹、皮炎、痤疮和感染。

附图简述

图1是表示在单独存在浓缩卵黄蛋白时或在卵黄蛋白与去卵白蛋白卵白联合存在时与超免疫抗念珠菌免疫球蛋白和实施例6描述的对照相比，粘附于口腔上皮细胞的白色念珠菌细胞数量的曲线图。

图2是在培养介质中按实施例7描述的那样接种后9小时时600nm处的O.D.对去卵白蛋白的卵白(mg/ml)剂量的曲线图；

图3是在培养介质中按实施例7描述的那样接种后9、12和15小时时600nm处的0.D.对去卵白蛋白的卵白(mg/ml)剂量的曲线图。

图4是显示实施例7描述的在添加了溶菌酶(1mg/ml)、卵转铁蛋白(1mg/ml)或抗生物素蛋白(0.1mg/ml)或它门联合的的2％葡萄糖的酵母菌氮基上生长的白色念珠菌600nm处的O.D.对时间(小时)的曲线图；

图5.是显示实施例7描述在添加了去卵白蛋白的卵(1mg/ml)或者卵转铁蛋白(0.25mg/ml)、溶菌酶(0.1mg/ml)和抗生物素蛋白(0.05mg/ml)联合的2％葡萄糖酵母氮基上生长的白色念珠菌600nm处的O.D.对时间(小时)的曲线图；

图6是表示实施例9描述的在存在唾液、卵天然免疫成分和空白时饱和溶液(饱和溶液的％)中钙的缺失对时间(分)的复合曲线图；

图7表示实施例10描述显示在不同浓度木糖醇和卵天然免疫成分的80％SBNB中生长的变异链球菌600nm处的O.D.对时间(小时)的系列曲线图；

图8是实施例10描述的600nm处O.D.对递增浓度的去卵白蛋白的卵(mg/ml)和在存在木糖醇(0.5％)时的去卵白蛋白卵的系列直方图；

图9表示实施例10描述显示在80％SBNB中，在各种多元醇(0.5％)和卵天然免疫系统提取物(0.075％)存在时变异链球菌的生长的600nm处O.D.对时间(小时)的系列曲线图；和

图10显示实施例12描述的与超免疫抗变异链球菌卵IgY相比，在存在来源于卵和乳的天然免疫系统蛋白质时变异链球菌与羟磷灰石粒相对粘附％。

下述实施例将进一步阐述本发明：

完成本发明的模式

                         实施例1

该实施例描述全卵的水性级分将抑制变异链球菌与唾液饱和的实验性牙釉质(羟磷灰石粒)的结合。这是由于与表膜层竞争性结合还是由于特异性抑制作用尚不知道。

在2小时的期间在冰上从一个体收集大约100ml的唾液；通过咀嚼一片‘Parafilm’来刺激唾液流量(Parafilm是商标)。

卵提取物制备：将一个卵打破倒入1升无菌蒸馏水中，搅拌1分钟，在电冰箱中放置12小时。从不溶性凝结物中轻轻倒出水溶性部分用作流体。将一半唾液样本用生理盐水稀释，另一半用非特异全卵的水性部分稀释。两部分均用0.2微米的滤膜过滤灭菌。

每50ml部分中加入1g灭菌羟磷灰石粒(BDH)并水化12小时。两部分均接种上在充氮(为了刺激细胞外多糖生成)二氧化碳条件下在蔗糖血液琼脂上生长的变异链球菌培养物悬浮液并于30℃孵育12小时。

用等体积无菌生理盐水冲洗两种样本的羟磷灰石粒两次，用标准革兰氏染色法染色。虽然羟磷灰石粒染上一些染料，但是在显微镜下粒上的革兰氏阳性球菌清晰可辨。利用这种目视分析，很显然卵黄提取物抑制变异链球菌的粘附，因为从单纯唾液的羟磷灰石粒上可见到的细胞数量大约大100倍。

在含唾液蛋白的条件下，未免疫卵的水性提取物抑制变异链球菌粘附于羟磷灰石粒的事实需要进一步研究。由于鸡在环境中暴露于链球菌属微生物，所以卵含有链球菌属的背景免疫球蛋白是可能的。或者，下面证实的抑制钙沉淀的卵黄成分也可能与唾液的statherin和PRP成分结合产生位阻而进一步被变异链球菌结合。也可能是卵中的天然免疫成分起到了抑制粘附的作用。

                          实施例2

本实施例证实全卵的水溶性部分具有抑制钙沉积作用。

全卵的水溶性提取物按照实施例1制备。将溶液放置在20℃水浴中而保持卵溶液的温度。将碳酸氢钙加入到卵的粗溶液中直到获得饱和溶液；与烧瓶底部未溶解的碳酸钙结合而形成沉淀。12小时后将清澈的上清液轻轻倒入新的烧瓶中并保持在20℃的水浴中。用蒸馏水和碳酸钙而不使用卵来制备类似的溶液，将上清液以类似方式从未溶解的结晶中倾析出来。两种溶液放置在分别盛有500mg作为结晶启动子的羟磷灰石粒(BDH)的上端开口的500ml烧杯中。溶液在20℃水浴中保持3天，在此期间观察结晶速度。不合有卵的溶液在24小时后出现结晶，而卵溶液直到16小时仍无结晶出现。该实验重复3次，结果相似。

卵为什么具有结晶抑制特性的确切机理尚不知道。推测这可能是一种生物机制，所述机制适用于许多不同功用包括钙在蛋壳的沉积或在鸡胚发育中的作用。无论缘何原因使得该特征存在，它提供自身在制成唾液替代产品中的偶然发现的用途。

                          实施例3

           作为口腔保健常规预防剂的人唾液复制品

取自未免疫母鸡的卵黄用作上述实施例目的的起始物料。通过仅仅去除胆固醇成分而将全部水溶性成分进行纯化。此过程可通过任何一个工业标准技术来完成；液态二氧化碳的使用是得到食品工业认同并且是从卵黄水性溶液中去除脂类和脂溶性成分而不损伤蛋白成分的非常适宜的方法。冷冻干燥该残留的含有免疫球蛋白成分和非特异免疫组分，以及其它活性成分的水溶性部分。

冷冻干燥的粗提物可掺入任何适宜的释放系统包括口香糖并用来提供前述口腔保健的常规预防作用。

                         实施例4

          为在口腔保健中常规预防设计的唾液复制品

使用前面所指出的微生物抗原的任何一种或其联合，或者由于经口吸收引起疾病所暗示的任何抗原而将家养母鸡免疫。当卵抗体效价最大时，收集卵并将免疫成分纯化。

使用工业标准化蛋白分馏技术，包括凝胶过滤色谱，可以将卵白的水溶生成分分离。使用离子交换色谱和分子筛技术可以将包括溶菌酶、卵转铁蛋白、抗生物素蛋白和类卵粘蛋白在内的特异成分进一步纯化。也可将特异性糖蛋白成分分离，这些糖蛋白成分包括粘蛋白和凝集蛋白。

从卵黄和卵白中均已分离出显示钙结晶抑制作用的成分，表明它们是具有相似性能的独立的分子实体，或者它们是卵黄膜的成分。

冷冻干燥每一独立成分并根据蛋白含量和特异活性进行分类。纯化的成分可用于配制标准制剂。

然后在全卵的灭菌的水性提取物中配制下述成分的溶液。

     组分                     大约浓度

     非特异免疫组分           2000mM

     特异免疫球蛋白           200mM

     糖蛋白                   200mM

     脂多糖                   200mM

     粘蛋白                   200mM

     卵类粘蛋白               100mM

     溶菌酶                   100mM

     抗生物素蛋白             100mM

     卵转铁蛋白               100mM

     尿素                     10mM

     必需氨基酸               10mM

     必需脂肪酸               10mM

     钙                       2mM

     镁                       0.2mM

     钠                       20mM

     钾                       20mM

     氨                       5mM

       磷酸氢盐(二价)        20mM

       磷酸二氢盐(单价)      20mM

       碳酸氢盐              20mM

使用0.1摩尔盐酸或0.1摩尔的氢氧化铵溶液将pH滴定到6.7。

将该溶液冷冻干燥并在制备终制剂口香糖、润喉糖锭、牙膏、牙线托牙分离剂和漱口剂中用作活性成分，它也可掺入特异的饮食配方中。

                        实施例5

         取自卵黄天然免疫系统的组分的提取和浓缩

40g新鲜发面酵母菌(酿酒酵母菌)通过悬浮在1升10mM pH 7.0磷酸缓冲液中并加热到60℃1小时而灭活。灭活是必需的以防止提取过程中的蛋白酶活性。由于发面酵母是食物成分，所以它是优选的，并因而无需考虑安全性或毒性问题。灭活酵母菌然后经离心洗涤制备，首先在pH 4.0含0.01％吐温80(吐温是一个商标)的1.0mM磷酸钾缓冲液中离心洗涤，然后在pH 7.0 10mM磷酸钾缓冲液中离心洗涤2次。高离子强度、低pH缓冲液与吐温的作用是去除可能干扰提取过程的任何松散粘附的囊蛋白或细胞表面大分子。

用上述方法制备卵黄的不含脂提取物，用pH 7 10mM磷酸钾缓冲液将蛋白浓度调节到10mg/ml。

按每25mg蛋白质加入1克湿重细胞的量将制备的酵母菌加入到卵黄溶液中。悬浮液在30℃孵育1小时，在此期间天然免疫系统组分结合到酵母细胞表面。用pH 7.0 10mM磷酸钾缓冲液离心洗涤2次来回收酵母菌与结合物质，用含0.01％吐温的pH 4.0 1.0mM磷酸钾缓冲液重新悬浮，并剧烈振荡30分钟以将结合卵成分解吸附。离心除去废酵母菌，用pH 7.0 10mM磷酸钾缓冲液透析上清液。

用Lowry分析法测定蛋白质，牛血清白蛋白做标准品。

蛋白质的收率为卵溶液蛋白含量的48％。使用新鲜酵母菌在同样的卵黄溶液中重复此过程或者在较低pH下解吸附可稍稍提高收率。使用所述方法得到的最大收率是54％，说明40％的卵黄蛋白质没有结合到酵母细胞上。

用4％聚丙烯酰胺凝胶(Pharmacia，Sweden)等电聚焦技术，比较脱脂卵蛋白质与从发面酵母菌上解吸附下来的成分的分布。使用微量吸管(50μg蛋白质/20μl)将样本材料加到凝胶中，凝胶在非-还原条件下使用BioRad(BioRad是一个商标)电源组在100瓦特按常规的方式走电泳。使用考马斯蓝和硝酸银联合染色，在脱脂卵成分中可见19条分离的蛋白带；这与Chang，P.K.等((1970)supra)报道的一致。在解吸附(浓缩的)蛋白成分中见到9条带，另有2条代表酸性磷蛋白的窄带只在用硝酸银染色时可见。注意到蛋白带的数量并不直接与从卵溶液浓缩的蛋白总量相等是重要的，因为一些清晰可见的蛋白带可能是在解吸附过程中分离的个别球蛋白的亚基。

                        实施例6

               浓缩卵黄成分在体外的效力

实施例5制备的浓缩卵蛋白的显著特性是与各种微生物种属的结合能力。为了证明浓缩卵黄蛋白的多特异结合能力，用pH 7.0 10mM磷酸钾缓冲液制备热灭活的下述微生物的悬浮液：酿酒酵母菌、白色念珠菌、变异链球菌、粪链球菌、干酪乳杆菌、狗齿龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、艰难梭菌和绿脓杆菌。微生物的肉汤培养基按下述接种，用高离子强度缓冲液离心洗涤，然后用低强度缓冲液平衡，并稀释到600nm的光密度为1.0。

微生物细胞培养：

白色念珠菌酵母菌接种到购自Oxoid的萨布罗氏葡萄糖琼脂(Sabouraud Dextrose)上。当细胞用于口腔细胞粘附分析或在这里为评价任何天然免疫系统提取物的抗-粘附特性时，则制备萨布罗氏葡萄糖肉汤培养基。用购自Difeo添加了2％葡萄糖的酵母菌氮基评价生长抑制。

细菌，变异链球菌、粪链球菌、狗齿龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和艰难梭菌在购自Oxoid的添加了去纤维马血(购自Oxoid)的哥伦比亚血琼脂基上培养。梭状芽胞杆菌和狗齿龈卟啉单胞菌是专性厌氧菌，于厌氧条件下在使用购自Oxoid的填充厌氧气的“气瓶”中培养。当用变异链球菌进行抗-粘附研究时，该生物体首先在厌氧环境下在气瓶中脑心肉浸汁中培养，以促进细胞表面聚糖形成，所述聚糖被认为与该生物体的粘附有关。

每一热灭活培养物5.0ml加入5.0ml的每毫升含10mg总蛋白的浓缩卵蛋白溶液并于30℃孵育1小时。按照实施例5所描述的方式将培养物热灭活。按照实施例5所述方法离心、洗涤收取微生物细胞并解吸附结合蛋白质。作为测定孵育后在上清液中的残留蛋白质和经过解吸附收取的量的指标，结合到每一细胞上的蛋白质的结果由表1所示。

                                     表1

                 浓缩卵黄蛋白自一系列生物体的吸附和解吸附作用

生物体	总用量	上清液中残留量	洗液	吸附量	解吸量	解吸附+洗涤+上清液中残留量
							酿酒酵母菌	50mg	1.8	2.9	45.3	32.5	37.2
白色念珠菌	50mg	2.1	0.1	47.8	35.6	37.8
							变异链球菌	50mg	3.5	2.4	44.1	26.5	32.4
粪链球菌	50mg	3.3	1.9	44.8	31.6	36.8
							干酪乳杆菌	50mg	3.8	2.3	43.9	32.8	38.9
狗齿龈卟啉单胞菌	50mg	5.3	1.7	43.0	33.6	40.6
							金黄色葡萄球菌	50mg	2.0	1.5	46.5	40.3	43.8
鼠伤寒沙门氏	50mg	2.8	1.5	45.7	34.5	38.8
							艰难梭菌	50mg	6.5	1.9	41.6	31.4	39.8
绿脓杆菌	50mg	2.4	2.1	45.5	30.6	35.1

在每种情况下，均发现大约15％-20％的所用蛋白质消失，最可能的解释是蛋白质仍结合在微生物细胞上。

面颊上皮细胞粘附：

为了证实浓缩卵黄蛋白在体外与面颊细胞粘附的效力，按照下述方式进行了研究。

使用‘Costar’细胞刮刀(或用匙的锋利边沿)由颊的内侧刮取面颊上皮细胞。用pH 7的磷酸盐缓冲液稀释细胞，并通过18微米的滤布洗涤以除去细胞碎片和细菌。在显微镜下使用血细胞计数玻片计数洗涤后的细胞数。细胞与新鲜生长(洗涤的)酵母菌按每个面颊细胞100个酵母菌的比例混合，在含或不含测试物质的情况下在轻轻振荡下于30℃孵育1小时。使用‘Cytospin’(Cytospin是一商标)振荡器时，将转速调至200转/分。

孵育后将细胞混合物经18微米滤布过滤并转移到洁净的显微镜玻片上空气干燥过夜。将干燥的玻片短暂通过本生氏灯焰(Bunsen flame)进行‘热固定’。龙胆紫水溶液(1％w/v)滴到玻片上，1分钟后漂净并干燥。在放大500倍的显微镜下检测粘附到每一颊细胞上的酵母菌细胞数量是相对容易计数的。粘附100颊细胞的平均酵母细胞数量作为测定粘附因素的指标。

浓缩卵黄蛋白与由免疫了热灭活白色念珠菌的母鸡所产卵的超免疫抗-念珠菌免疫球蛋白提取物比较。超免疫抗-念珠菌免疫球蛋白按如下制备。

制备超免疫抗体

用磷酸盐缓冲液将新鲜生长的白色念珠菌稀释到在600nm光密度为1的浓度。通过加热到60℃1小时而将细胞悬浮液减毒，并立即使用。

在8周期间内以2周的间歇期给产卵鸡在两个部位肌内注射在Freund’s完全佐剂中1ml减毒细胞。 使用ELISA技术与过氧化物酶结合的山羊抗- 鸡免疫球蛋白(Sigma，英国)测定抗体滴度(原文第38页)。

按照下述方法将超免疫卵抗体从卵中分离：将卵黄从卵白中分离出来倒在洁净的棉纸上，以从卵黄膜的外表面上吸去任何残留的稀薄卵白。将取得的卵黄在玻璃烧杯中打碎，加入9倍体积的蒸馏水稀释。溶液在-70℃冷冻过夜。离心融化溶液，通过平纹细布倾析上清液以除去仍漂浮着的低密度脂。

以递增方式将12％聚乙二醇(分子量8000)加入到脱脂卵中，在室温下平衡1小时。离心收集沉淀，用冰冷的乙醇补足到起始体积，20分钟后离心溶液并用小量10mM磷酸缓冲液重新悬浮沉淀。用磷酸缓冲液将溶解部分透析过夜。

对照卵是没有浓缩的脱脂卵黄，所有三部分均以1.0mg/ml和10mg/ml的浓度进行检测。结果见图1。

图1表明超免疫卵免疫球蛋白在10mg/ml时使得粘附每100颊细胞的酵母菌数量减少79％。10mg/ml浓缩卵蛋白减少达70％，而如实施例7中所描述的，1.0mg/ml浓缩卵蛋白与1.0mg/ml去-卵白蛋白卵白(DeOEW)联合时，减少达95％。

                        实施例7

去-卵白蛋白(DeOEW)卵制备如下：

制备9份去离子水的新鲜卵白的水性溶液，加入硫酸氨使得终浓度为90％w/v。平衡30分钟后，离心收集蛋白质沉淀，在去离子水中重新悬浮。用pH 5.5 10mM乙酸铵缓冲液透析重新悬浮的沉淀，用同样的缓冲液将浓度调整至10mg蛋白质/ml。

制备的卵白溶液用于Whatman DE-52树脂柱(Whatman是商标)，所述树脂柱预先用10g/ml蛋白的pH 5.5 10mM乙酸铵缓冲液的柱填充物平衡。在此条件下，溶菌酶、抗生物素蛋白和卵转铁蛋白不与树脂结合而以起始洗脱液形式从柱中回收。梯度增加洗脱液的离子强度(10mM到500mM乙酸铵)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂、卵抑制剂、G2和G3球蛋白在洗脱液中洗出。由于等电点相似，后期从柱中洗脱出的洗脱液中含有卵白蛋白中的类卵粘蛋白、卵粘蛋白、卵糖蛋白、卵黄素蛋白和卵巨球蛋白的混合成分。

使用10,000Kda排阻膜超滤将由DE-52柱洗脱出来的后期洗脱液浓缩，然后用于以pH 5.5 10mM乙酸铵作载体的S-100凝胶过滤柱中。基于分子量分离出起始洗脱液中所含的卵粘蛋白和卵巨球蛋白，随后是含卵白蛋白的大的成分，然后在后期洗脱液中的是类卵粘蛋白、卵转铁蛋白和卵糖蛋白。

在卵白蛋白洗脱之前和之后从S-100柱收集的蛋白质与在出现混合卵白蛋白成分之前从DE-52柱洗脱下来的物质结合。通过加入pH 7.0 10mM磷酸钾缓冲液在UF药筒中经超滤和透析法而将结合的溶液浓缩。

该实施例中发现，当向培养基中加入细菌或酵母菌时，去-卵白蛋白卵白显示出独特的剂量反应关系。物料的抑制活性受培养介质的强度、接种物的龄期和剂量影响。不象大多数抑制物质那样，作用不随剂量增加而增加；在浓度大于1.0mg/ml时，存在反向反应，即物料刺激生长。在1.0/ml和0.1mg/ml之间时(取决于介质强度)，抑制生长。此独特的剂量反应可能是去-OEW或者其中个别组分的溶解特性。已知唾液显示出类似的生长刺激和抑制作用，这被认为是维持口腔正常微生物菌群的先决条件：见唾液和口腔健康(Saliva and Oral Health)；Ed’Edgar和O’Mullane；大不列颠牙科协会出版；第100-101页。长期使用抗生素和抗菌剂导致整个口腔抗菌，清除了唾液自然支持的健康微生物菌群，由此提供了支持后来的不适当种属菌群的机会。

研究了去-OEW对变异链球菌的作用，结果见图2和图3。

图2描述去-OEW对接种后9小时时在80％SBNB中变异链球菌生长的抑制作用。80％SBNB是购自Oxoid的营养肉汤在正常强度的80％时添加了2％蔗糖并用pH 6.8 0.5％磷酸二氢钾缓冲。浓度在0.2mg/ml～1.0mg/ml时清楚地证实有抑制作用。如图3所示，正如在分开的试验中所证实的那样，样本在9、12和15小时的时间点时，抑制作用贯穿整个生长周期。

不象抗生素或抗菌素，天然免疫系统不具有杀菌作用。抑制和刺激的二重性是反映人粘液(唾液)性能的独特性，而不期望口腔的整体抗菌。

卵白的一些个别成分较卵黄的更具完整特性，(见Staedelman和Cotterill，卵科学和技术(Egg Science and Technology)第119-137页)。主要组分与它们通常所具有的特性总结在表2中。

                           表2

                         卵白组分

卵白蛋白                54％      磷酸糖蛋白

卵转铁蛋白              12％      结合金属离子

卵类粘蛋白              11％      胰蛋白酶抑制剂

卵粘蛋白                3.5％     粘性涎蛋白

溶菌酶                  3.4％     对一些细菌的溶菌活性

G2球蛋白                4％       未知

G3球蛋白                4％       未知

卵抑制剂                1.5％     抑制丝氨酸蛋白酶

卵糖蛋白                1％       未知

卵黄素蛋白              0.8％     结合核黄素

卵巨球蛋白              0.5％     抗原

半胱氨酸蛋白酶抑制剂    0.05％    抑制巯基蛋白酶

抗生物素蛋白            0.05％    结合生物素

总计                    96％

已知3种成分抑制微生物生长，它们是溶菌酶、卵转铁蛋白和抗生物素蛋白。溶菌酶的抑制特性归因于对特定细菌(非酵母菌)胞壁的酶解作用。已知卵转铁蛋白与包括铁在内的许多金属离子结合，因此剥夺了 离子在介质中的可利用性。抗生物素蛋白结合生物素因而使得以生物素为必需生长因子的生物体(包括酵母菌)不能利用生物素。每种组分对白色念珠菌生长的相对效力由图4显示。溶菌酶和卵转铁蛋白本身均不抑制生长，而抗生物素蛋白则大约使生长减少50％。三者联合时，生长减少80％，故证实它们之间具有协同作用。去-卵白蛋白卵白降低生长达98％。

去-卵白蛋白卵白的已知成分的相对百分浓度列于表3。

                           表3

         去-卵白蛋白卵白已知组分的大约相时百分浓度

     卵转铁蛋白                       24％

     卵类粘蛋白                       24％

     卵粘蛋白                         8％

     溶菌酶                           8％

     G2球蛋白                         8％

     G3球蛋白                         8％

     卵抑制剂                         4％

     卵糖蛋白                         3％

     卵黄素蛋白                       2.5％

     卵巨球蛋白                       2％

     半胱氨酸蛋白酶抑制剂             0.2％

     抗生物素蛋白                     0.2％

     总计                             91.9％

根据表3，1.0mg去-卵白蛋白卵白含有不到0.25mg的卵转铁蛋白、不到0.1mg的溶菌酶和不到0.05mg的抗生物素蛋白.

图5描述卵转铁蛋白(0.25mg/ml)、溶菌酶(0.1mg/ml)和抗生物素蛋白(0.05mg/ml)联合时与1.0mg/ml去-卵白蛋白卵白对白色念珠菌生长的作用相比较，证明去-卵白蛋白卵白更大的抑制作用并不仅仅归因于这三种成分。

                           实施例8

                        合成唾液制剂

去-卵白蛋白卵白(按照实施例7制备)和浓缩的脱-脂卵黄(如实施例5所描述的)等重量结合并溶于具有下述终浓度的有机盐溶液中。

         成分                 每升浓度

         天然免疫系统         10克

         钙                   2mM

         镁                   0.2mM

         钠                   20mM

         钾                   20mM

         氨                   5mM

         磷酸氢盐(二价)       20mM

         磷酸二氢盐(单价)     20mM

         碳酸氢盐             20mM

使用0.1摩尔盐酸或0.1摩尔氢氧化铵将溶液pH值滴定到6.7。

制剂具有与新鲜全唾液相似的粘稠度，具有与唾液可比的流变学和抗干燥性。

                        实施例9

                       抑制钙沉积

钙将从饱和的氯化钙或碳酸钙溶液中出来沉积到任何提供了启动结晶生长的晶种的适宜表面上。

用pH 7.2 50mM HEPES缓冲液配制4mM氯化钙溶液。向溶液中加入等重量的去-卵白蛋白卵白(如在实施例7制备的)和脱-脂浓缩卵黄(如在实施例5制备的)得到终浓度为0.01％w/v(0.1mg/ml)的溶液。取该溶液8ml加入到盛有1.6g BDH羟磷灰石粒的25ml‘Sterilin’通用瓶中。室温下平衡后，加入含有15mM磷酸二氢钾的pH 7.2 50mMHEPES 8.0ml。溶液中磷酸钾的作用是产生钙的饱和溶液。

使用Hanna离子选择性计量器与Hanna试剂测定溶液中钙的损失，根据Van der Reijden，W.A.描述的方法(龋齿研究(Caries Research)1997；31：216-223)进行钙的测定。溶液中钙损失的百分比与不加蛋白质的空白溶液、唾液饱和的羟磷灰石粒的对照溶液进行比较，测试溶液由前述卵的天然成分组成。结果由图6所示。40分钟后，空白溶液中钙浓度下降65％，存在唾液时下降百分比为35％，而卵蛋白显示出出众的溶液维护能力，钙浓度仅下降18％。

                         实施例10

                        掺入多元醇

这里描述的天然免疫成分制剂具有取代氟作为牙膏和其它牙粉或提供广谱抗微生物作用的口腔卫生制剂中活性成分的潜在可能性，在用于龋齿时，与氟具有同等的益处，而在控制牙龈疾病、鹅口疮和口臭时具有更广泛的益处。

该实施例显示卵的天然免疫组分增强木糖醇的作用，木糖醇放宽天然卵蛋白的抑制浓度。因此，二者之间具有协同作用，在卵天然免疫组分制剂中掺入低浓度多元醇，增加有益效果。

在80％蔗糖缓冲的营养肉汤(SBNB)介质中培养(试管培养)变异链球菌。介质是80％SBNB，因为营养肉汤的终浓度时正常的80％。

介质按如下配制：

Oxoid营养肉汤             20.8克

磷酸氢二钾                17.9克

蔗糖                      40克

蒸馏水                    1升

用盐酸将上述溶液的pH值调至6.8。

上述5.0ml的等份溶液分配到25ml试管中，然后用脱脂棉封口并加压灭菌。

测试物料溶液，即卵的天然免疫系统蛋白加或不加不同浓度的多元醇，在pH 6.8 0.1mM磷酸缓冲液中配制，用0.2微米胶囊滤器过滤灭菌。

测试物料以无菌形式加入到灭菌介质试管中，所加入的容量是当每个试管中装有总体积为10ml灭菌的pH 6.8 0.1mM磷酸缓冲液时，使测试物料达到其特定浓度。

制备管接种0.1ml变异链球菌，在不含测试物料的80％SBNB中培养生长12小时。接种管在37℃水浴孵育，用带适宜滤光片的EEL比色计测得600nm处的光密度增加。每一测定系列均有一个由未接种介质组成的空白管和一个由不含测试物料的接种介质组成的对照管。

结果见图7-9。

图7代表80％SBNB掺入木糖醇时对变异链球菌的作用。0.25％w/v～1.0％w/v木糖醇增加生长抑制作用。相同系列显示从0.025％w/v至高达0.075％w/v卵天然免疫系统蛋白质的抑制作用。如图所示，0.5％木糖醇与0.075％卵白提取物的天然免疫系统成分(按照实施例7制备)联合增大抑制作用。应当注意该系列也证实前面所述的天然免疫系统蛋白的反向抑制作用。

图8代表变异链球菌在80％SBNB中在增加实施例7制备的提取物的浓度的条件下9小时生长的结果。相同系列邻管添加0.5％木糖醇。木糖醇提高抑制浓度‘窗’，卵提取物本身时抑制浓度为0.2-1.0mg/ml，加入0.5％木糖醇时抑制浓度为0.2-5.0mg/ml。

图9描述甘露醇、山梨醇、赤藓醇和木糖醇和0.5％w/v与0.075％w/v实施例7制备的提取物对在80％SBNB中生长的变异链球菌的作用。在测试条件下，木糖醇提供最适抑制作用，其它多元醇可能提供类似的抑制作用并且具有不同的抑制浓度。

                          实施例11

               乳天然免疫系统成分的提取和浓缩

乳的蛋白含量与卵不同，天然系统蛋白质在非功能性物质的分散也不同，因而有必要对在卵提取中所使用的提取过程进行变改以虑及这些个别不同之处。

乳的脂成分通过在-70℃冷冻24小时然后冻融后离心并过滤上清液而去除。对卵而言不必要去-脂，但对乳来说天然系统蛋白质的分散需要将脂滴破碎和分离。

用乌头酸将所得上清液的pH降至3.5并用去离子水透析以除去金属离子和与许多乳天然系统蛋白质的功能团结合的低分子量成分。使用排阻膜(“滤掉”分子量不超过10000的成分)经超滤将去离子蛋白溶液浓缩。用10mM磷酸钾缓冲液将蛋白质溶液调整至10mg/ml。然后按照实施例5所描述的方法使用发面酵母菌进行天然系统蛋白质的提取。

                        实施例12 卵和乳的浓缩提取物与卵的超免疫抗体在体外抗变异链球菌的效力比较

进行了卵的浓缩天然系统成分与乳的浓缩天然系统成分以及超免疫卵抗体在体外抗变异链球菌的效力的研究。变异链球菌以与粘附于牙釉质表面同样的方式强烈地粘附到唾液包被的羟磷灰石粒上。首先用新鲜全唾液将羟磷灰石包被是必要的，因为变异链球菌的停泊处是牙齿表面的唾液蛋白质。

0.1克羟磷灰石粒等分试样称重后放入‘Sterilin’(Sterilin是商标)离心管中并与2.0ml新鲜唾液一起在轻轻振荡下于30℃孵育2小时。水合羟磷灰石粒在蒸馏水中洗涤2次以去除残留的唾液。

变异链球菌在添加了2％蔗糖的脑心肉汤汁中培养12小时。肉汤培养基用pH 7.0的磷酸缓冲盐液离心洗涤2次。将收集到的细胞用磷酸缓冲盐液重新悬浮并稀释到在600nm时的光密度为1.0。

按照实施例6描述的方法制备抗变异链球菌超免疫卵抗体。用pH 710mM的磷酸缓冲液将抗体稀释到10g/ml。用10mM磷酸缓冲液将由等重量浓缩卵黄提取物(按照实施例5所述方法制备)和去卵白蛋白卵白(按照实施例7所述方法制备)组成的溶液稀释到10mg/ml。由乳提取的浓缩天然系统蛋白，(按照实施例11所描述的方法制备)稀释到10mg/ml。将1.0ml的每一测试溶液加入到1.0ml制备的变异链球菌细胞中并于30℃孵育1小时。使用磷酸缓冲盐液代替测试蛋白溶液作为空白管进行测定。

孵育后用磷酸缓冲盐液将测试溶液洗涤2次，在1.0ml相同的缓冲液中重新悬浮并加入唾液包被的羟磷灰石粒。羟磷灰石粒与测试溶液一起在30℃孵育2小时，然后用灭菌磷酸缓冲盐液仔细地洗涤5次以除去未粘附于羟磷灰石粒的任何细菌细胞。

用龙胆紫染色羟磷灰石粒并用乙醇洗涤，接着在放大500倍的显微镜下检测可大致估算出来粘附于每个羟磷灰石粒上的细菌数量。标准的格兰氏染色技术也是适宜的。

用Hatta，H.等((1997)supra)报道的方法可更精确地测得粘附于每个羟磷灰石粒的细菌的相对数量；一个超声探针用于分离粘附着的细菌。

在该实施例中，用与在实施例5中为从酵母菌上解吸附浓缩卵蛋白所用缓冲液相同的高离子强度缓冲液来分离细菌。对每一个测试样本，均加入含0.01％吐温pH 41摩尔的磷酸缓冲液1.0ml。剧烈振荡30秒后，立即将上清液进行顺次稀释。使用标准平皿计数技术，将每一稀释液的1ml等份试样铺在新鲜血琼脂平皿的表面。孵育平皿后检查和计数菌落数量；基于稀释的倍增系数用于确定原始样本的可见细胞数量。

表4显示三个试验的平均值。

                     表4

     变异链球菌与羟磷灰石粒粘附的相对抑制

                        粘附到粒上的细菌数量

细胞悬浮液              60×10⁸

空白                    120×10⁶

乳提取物                175×10⁵

超免疫卵抗体            105×10⁴

浓缩卵提取物            80×10⁴

该结果也由图10显示。

Claims (37)

1.母体免疫分泌物提取物在制备治疗和/或预防以所述粘膜分泌物缺失或所述粘膜分泌物的正常生物性能缺失为特征的或者对所述粘膜分泌物敏感的病症的药物中的应用，所述提取物具有人粘膜分泌物抗微生物活性特性并被人耐受，所述提取物包含与微生物细胞表面粘附的母体免疫分泌物的天然免疫成分。

2.根据权利要求1所述的应用，其中粘膜分泌物选自唾液、泪液、鼻腔分泌物、肠分泌物和生殖器分泌物。

3.根据权利要求2所述应用，其中所述提取物具有人唾液抗微生物活性特性，其中所述病症是以正常唾液或其的正常生物性能缺失为特征的或对分泌物敏感的口腔病症。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中母体免疫分泌物是卵流体。

5.根据权利要求4所述的应用，其中卵流体得自家养母鸡。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其中卵流体取自卵黄。

7.根据权利要求6所述的应用，其中卵黄是脱脂的。

8.根据权利要求4或5所述的应用，其中卵流体取自卵白。

9.根据权利要求8所述的应用，其中卵白是去-卵白蛋白卵白。

10.根据权利要求4-9中任一项所述的应用，其中卵流体是脱脂卵黄和去-卵白蛋白卵白的混合物。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中分泌物取自乳。

12.根据任一项前述权利要求所述的应用，其中所述提取物的抗体内容物由非免疫的天然抗体组成。

13.根据权利要求12所述的应用，其中该提取物的抗体内容物包括多特异抗体。

14.根据权利要求1-11任一项所述的应用，其中母体免疫分泌物除了天然免疫成分之外还包含超免疫成分。

15.根据前述任一项权利要求所述的应用，其中药物是所述人粘膜分泌物的复制品。

16.根据任一项前述权利要求所述的应用，其中所述药物包括富集了所述提取物的母体免疫分泌物。

17.根据任一项前述权利要求所述的应用，其中所述提取物包括那些粘附于酿酒酵母菌表面的母体免疫分泌物的天然免疫成分。

18.根据任一项前述权利要求所述的应用，其中药物用于治疗口腔干燥。

19.根据权利要求1-17中任一项所述的应用，其中药物用于局部治疗皮肤感染。

20.根据权利要求1-17中任一项所述的应用，其中药物用于治疗和/或预防口腔感染。

21.根据权利要求3或以权利要求3为基础的任何权利要求所述的应用，其中所述病症是龋齿。

22.根据权利要求3或以权利要求3为基础的任何权利要求所述的应用，其中所述病症是以牙龈感染为特征的口腔病症。

23.根据权利要求3或以权利要求3为基础的任何权利要求所述的应用，其中所述病症是口臭。

24.根据权利要求18和20-23中任一项所述的应用，其中药物以漱口剂的形式使用。

25.根据权利要求1-17或20-24中任一项所述的应用，其中药物用于常规预防不易患其它口腔疾病的个体的龋齿或牙龈疾病。

26.根据权利要求1-17中任一项所述的应用，其中药物用于治疗和/或预防阴道感染。

27.根据权利要求26所述的应用，其中所述阴道感染是酵母性阴道炎。

28.根据权利要求26或27所述的应用，其中药物以阴道栓形式使用。

29.根据前述权利要求任一项所述的应用，其中药物用于限制铁从食物中摄取。

30.根据任一项前述权利要求所述的应用，其中药物包括一种或多种所述人粘膜分泌物特性的无机盐。

31.根据前述权利要求任一项所述的应用，其中药物与增强所述分泌物作用的植物提取物同时、分开或顺次施予。

32.根据权利要求31所述的应用，其中植物提取物选自欧洲越桔、玉米、香蜂花和小叶毛果芸香。

33.用于治疗和/或预防以正常唾液或其正常生物性能缺失为特征的口腔病症的制剂，包括权利要求1定义的提取物和多元醇。

34.根据权利要求33所述制剂，其中多元醇选自赤藓醇、甘露醇、山梨醇和木糖醇。

35.根据权利要求33或34所述制剂，制剂是口香糖形式。

36.根据权利要求33或34所述制剂，制剂是牙膏形式。

37.用于治疗和/或预防人体病症的组合物，所述病症以人机体产生的粘膜分泌物的缺失或所述粘膜分泌物的正常生物性能缺失为特征或者能对所述粘膜分泌物反应，所述组合物包括权利要求1定义的提取物。

Images