CN105418759B - 一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制品制备技术领域，具体涉及一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制备方法。抗内氏放线菌卵黄抗体的制备过程，具体包括：制备灭活的内氏放线菌作为抗原、免疫接种蛋鸡、分离纯化卵黄抗体等步骤。经过实际检验，本发明所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体能显著抑制内氏放线菌的生长，并能有效清除内氏放线菌单菌生物膜的形成，并对其生物膜产酸有明显抑制作用，制备的抗内氏放线菌卵黄抗体对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性。本发明具有容易制备、成本低廉等优点，将其添加到漱口液、牙膏、含片、奶制品、糕点、饮料、保健品等日常洗护用品或食品饮料时，对于内氏放线菌所引起的龋齿、牙龈炎、牙周炎的预防和治疗具有较好地应用效果。

Description

一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制品制备技术领域，具体涉及一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制备方法。
背景技术
内氏放线菌（Actinomyces naeslundii）是口腔中定植的一种主要的放线菌，它通过产生6-去氧太洛糖（6-deoxytalose），将口腔中更多的放线菌和其他细菌黏附在牙釉质上形成菌斑，菌斑中的细菌分解食物中的糖类产酸，酸化和腐蚀牙釉质形成龋齿，并可和其他细菌进一步引起牙龈炎和牙周炎。
卵黄抗体( immunoglobulin yolk，IgY) 是鸟类血液中的免疫球蛋白传递至卵黄，并在卵孵育过程中和孵育后对幼鸟和幼禽起保护作用的免疫球蛋白，IgY的优势在于：可与抗原特异性结合，发挥抗菌、抗病毒等多种生物学效应；制备经济简单，产量高；对实验动物无伤害，满足动物权益保护的要求；稳定性好，具有耐热、耐酸、耐蛋白酶等诸多优点。随着细菌耐药性的不断出现，应用卵黄抗体技术来发挥抗菌作用正逐渐成为研究热点。
发明内容
本发明主要目的在于提供一种抗内氏放线菌卵黄抗体，所提供的抗体用于漱口液、牙膏、含片、奶制品、糕点、饮料、保健品等日常洗护用品或食品饮料时，可以对内氏放线菌所引起的龋齿、牙龈炎、牙周炎等口腔疾病起到一定的预防和治疗作用。
本发明所采取的详细技术方案如下所述。
一种抗内氏放线菌卵黄抗体，通过以下步骤制备而成：
（一）制备灭活的内氏放线菌作为抗原，具体过程为，取内氏放线菌进行培养，获得菌体，对菌体进行灭活处理，用生理盐水重悬菌体，调整菌液浓度为1×107～1×1010CFU/mL备用；
所述内氏放线菌采用血琼脂平板或用脑心浸液（brain heart infusion，BHI）琼脂培养基进行培养，培养条件为37℃、厌氧培养；
所述内氏放线菌具体采用例如美国模式培养物集存库（American Type CultureCollection）的保藏号为ATCC 12104的内氏放线菌（A. naeslundii）；
所述内氏放线菌菌体灭活采用例如质量分数为0.2～0.5%的甲醛进行灭活；
（二）免疫接种蛋鸡，具体过程为：取步骤（一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂按1：1体积比充分混合后，皮下和肌肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2～3mL；
免疫接种完成后2周开始收集鸡蛋，所搜集鸡蛋均于4℃保存；可持续收集鸡蛋60天；
所用蛋鸡具体采用例如22周龄健康产蛋来杭母鸡（1600±230 g）；
所述免疫接种可具体接种4次，具体过程为：第一次免疫接种后两周进行第2次免疫接种，以后每隔9～14天免疫接种一次；第一次免疫接种时使用弗氏完全佐剂，第二次、第三次、第四次免疫接种所用佐剂为弗氏不完全佐剂；
（三）分离纯化卵黄抗体，具体过程为：
首先取步骤（2）中所收集的鸡蛋，对鸡蛋外壳采用75%乙醇消毒清理后，打蛋分离蛋清与卵黄，收集卵黄；对所收集的卵黄，按卵黄：双蒸水=1：9的质量比加入无菌双蒸水，搅拌充分混匀后，调节pH值至5.0~5.3，4℃静置过夜；然后4℃、10000～12000rpm离心20min，收集上清液；
对所收集的上清液采用滴加( NH4) 2 SO4溶液方法获得卵黄抗体，具体过程为：
对所收集的上清液滴加饱和( NH4) 2 SO4溶液，使混合液中( NH4) 2 SO4饱和度为50%， 4℃静置过夜；4 ℃、10000 rpm离心20～30 min，弃上清，对沉淀物用蒸馏水溶解后，滴加饱和( NH4) 2 SO4溶液使饱和度达33%，4℃静置过夜；
过夜后，4 ℃、10000 rpm离心20～30 min，弃上清；对沉淀物（即采用滴加( NH4) 2SO4溶液方法获得卵黄抗体）用蒸馏水溶解后，经100KD超滤膜超滤纯化，收集浓缩液，冷冻干燥后即得到纯化的抗内氏放线菌卵黄抗体，所得抗体-80℃保存。
所述抗内氏放线菌卵黄抗体在口腔疾病预防与治疗中的应用，可对内氏放线菌、黏性放线菌或其所形成的生物膜具有一定的预防和治疗作用，能够抑制生物膜的产酸；具体而言，
抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MIC为25µg/mL，对黏性放线菌的MIC为200µg/mL；
抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MBEC为50µg/mL，对黏性放线菌MBEC为800µg/mL；
为抑制生物膜内细菌产酸，针对内氏放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小于12.5µg/mL，针对黏性放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小于200µg/mL。
经过实际检验，本发明所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体能显著抑制内氏放线菌的生长，并能有效清除内氏放线菌单菌生物膜的形成，并对其生物膜产酸有明显抑制作用，制备的抗内氏放线菌卵黄抗体对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性。
总体而言，本发明所提供的抗内氏放线菌卵黄抗体具有容易制备、成本低廉等优点，将其添加到漱口液、牙膏、含片、奶制品、糕点、饮料、保健品等日常洗护用品或食品饮料时，对于内氏放线菌所引起的龋齿、牙龈炎、牙周炎的预防和治疗具有较好地应用效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例1
本发明所提供的抗内氏放线菌卵黄抗体，其制备方法包括抗原制备、免疫注射产蛋母鸡、收集鸡蛋分离纯化抗体等步骤，详细介绍如下。
（一）制备灭活的内氏放线菌作为抗原
具体过程如下：
取内氏放线菌进行培养，本实施例具体采用购买于美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection）的保藏号为ATCC 12104的内氏放线菌（A.naeslundii）；
培养时采用血琼脂平板（也可采用脑心浸液（brain heart infusion，BHI）琼脂培养基）；
培养条件为：37℃、厌氧培养4～6天；
培养结束后，在平板上加入适量无菌生理盐水，用涂布器刮下菌苔和菌落，然后吸入离心管中，混匀；
将离心管5000～6000rpm、4℃，离心15～20min，弃上清，用0.2～0.5%甲醛（质量分数）灭活18～24h，然后5000～6000rpm，4℃，离心15～20min，弃上清；
用生理盐水洗涤，具体过程为：在上述去除甲醛的离心管中加入生理盐水，混匀后，5000～6000rpm、4℃、离心15～20min，弃上清；重复此过程不少于3次以确保完全将甲醛洗去；
在上述生理盐水洗涤后的离心管中再次加入适量生理盐水，用麦氏比浊法测定并调整细菌悬液浓度为1×107～1×1010CFU/mL备用。
（二）免疫接种蛋鸡
取步骤（一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂按1：1体积比充分混合后，皮下和肌肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2～3 mL；
本实施例中所用佐剂均为美国Sigma公司产品，所用蛋鸡为22周龄健康产蛋来杭母鸡（1600±230 g），购自吉林农业大学养鸡场。
本实施例中免疫接种时共接种4次，具体过程为：第一次免疫接种后两周进行第2次免疫接种，以后每隔9～14天免疫接种一次；
第一次免疫接种时使用弗氏完全佐剂，第二次、第三次、第四次免疫接种所用佐剂为弗氏不完全佐剂。
本实施例中共免疫接种10只蛋鸡。4次免疫接种完成后2周开始收集鸡蛋，所搜集鸡蛋均于4℃保存；持续收集鸡蛋60天。本实施例中共收集鸡蛋436枚。
上述免疫接种过程中，采用相同方法、相同步骤对相同数量的蛋鸡接种生理盐水，按照相同程序收集鸡蛋并保存作为阴性对照。
（三）分离纯化卵黄抗体
具体包括以下步骤：
首先取步骤（2）中所收集的鸡蛋，对鸡蛋外壳采用75%乙醇消毒清理后，打蛋分离蛋清与卵黄，本实施例中所采用了10枚鸡蛋；
其次，将所收集的卵黄打散后，按卵黄：双蒸水=1：9的质量比加入无菌双蒸水，搅拌充分混匀后，用0.1 mol.L-1 HCL调节pH值至5.0~5.3，4℃静置过夜；
第三，将上述过夜后卵黄-双蒸水混合液4℃、10000～12000rpm离心20min，收集上清液，本实施例中共收集到上清液1200mL；
第四，对第三步中所收集的含有卵黄抗水溶性成分（water soluble fraction，WSF）体的上清液滴加饱和( NH4) 2 SO4溶液，滴加量于上清液体积相同（即1200mL），滴加后混合液中( NH4) 2 SO4饱和度为50%，然后4℃静置过夜；
第五，对第四步中静置过夜后混合液离心，4 ℃、10000 rpm离心20～30 min，弃上清；对沉淀物用等体积（1200mL）的蒸馏水溶解后，滴加饱和( NH4) 2 SO4溶液使饱和度达33%，4℃静置过夜；
第六，对第五步中静置过夜后混合液离心，4 ℃、10000 rpm离心20～30 min，弃上清；对沉淀物用适量蒸馏水溶解（本次使用1500mL），然后使用截留分子量为100KD超滤膜的默克密理博Labscale小型切向流超滤仪（德国Merck公司）进行超滤纯化，收集浓缩液，冷冻干燥后即得到纯化的抗内氏放线菌卵黄抗体，所得抗体-20℃保存。本实施例中共制得抗内氏放线菌卵黄抗体653.8mg。
实施例2
对于实施例1所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体，发明人对其抗抗菌活性进行了进一步测定，相关过程简要介绍如下。
对于实施例1中所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体，为检测及使用方便，需制备成一定浓度的水溶液，具体为：取实施例1中所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体10mg，溶于10mL无菌生理盐水中，制成1mg/ mL的母液，经0.22µm无菌滤器过滤，备用；母液根据需要添加生理盐水后稀释成相应浓度后再具体使用。
最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）的测定
本发明所提供的抗内氏放线菌卵黄抗体主要是对内氏放线菌、黏性放线菌等感染菌种具有一定的抑制作用，相关抑菌浓度测定过程如下。
首先制备相应感染菌的细菌悬液，具体为：
分别取内氏放线菌、黏性放线菌、变异链球菌的菌株分别接种于血琼脂平板，37℃厌氧培养4天，然后挑取菌苔或菌落混匀于脑心浸液（brain heart infusion，BHI）液体培养基中进行培养，采用麦氏比浊法测定细菌悬液浓度至5.0×106 CFU/mL时，备用；
所用内氏放线菌（A. naeslundii ，ATCC 12104）、黏性放线菌（A. viscosus ，ATCC 19246）、变异链球菌（Streptococcus mutans， ATCC 25175）均购于美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection）；
然后采用试管二倍稀释法进行具体的最低抑菌浓度（MIC）的测定，具体过程为：
取9支灭菌试管并编号，分别加入BHI液体培养基1mL，在第1号试管中加入含800µg/mL的抗内氏放线菌卵黄抗体的BHI液体培养基1mL，混匀后吸取1mL加入第2号试管，依此类推，直至第7号试管，第7号试管吸取1mL弃去，使1~7号试管内抗内氏放线菌卵黄抗体浓度分别为：400µg/mL、200µg/mL、100µg/mL、50µg/mL、25µg/mL、12.5µg/mL、6.25µg/mL；
分别向1~8号试管中加入100µL感染菌的细菌悬液，混匀，第8号试管为阳性对照，以观察细菌生长情况，第9号试管不加菌液，为阴性对照， 37℃厌氧培养24 h，观察结果，重复实验3次。
结果判断：与对照管进行浊度对比，以肉眼观察无细菌生长现象的试管内抗内氏放线菌卵黄抗体的最低浓度为MIC。
结果显示，抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MIC为25µg/mL，对黏性放线菌的MIC为200µg/mL，对变异链球菌无抑制作用。这一结果表明，本发明所提供的抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌有较好的抑菌效果，而对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性，但对菌种的抗菌作用相对较弱，而且对变异链球菌无抑制作用。
抗内氏放线菌卵黄抗体的单菌最小生物膜清除浓度（minimum biofilmeradication concentration，MBEC）的测定
首先，同上述最低抑菌浓度测定过程，分别制备内氏放线菌、黏性放线菌的菌悬液，调整细菌悬液浓度为4×106 CFU/mL备用；
然后，进行最小生物膜清除浓度（MBEC）的测定，具体过程为：
取96孔板，每孔加入150µL含1%蔗糖的BHI液体培养基和50µL的细菌悬液，37 ℃、厌氧培养24 h使形成生物膜；
PBS洗板，然后每孔分别加入200µL的含抗内氏放线菌卵黄抗体 (浓度分别为12.5µg/mL、25µg/mL、50µg/mL、100µg/mL、200µg/mL、400µg/mL、800µg/mL )的BHI液体培养基，每一浓度做3复孔，37 ℃、厌氧培养24 h；
培养结束后弃上清，PBS洗板2次，室温干燥30min，然后每孔加入200µL的0.1%结晶紫，振荡培养20min后，吸出结晶紫，PBS洗板3次，室温干燥，每孔加200µL的95%乙醇，振荡培养1 h，将每孔中的乙醇转移至另一96孔板中，酶标仪测OD570值，实验重复3次，取平均值作为测定结果。
结果判断：MBEC值为OD570值突然升高前的临界值。
结果显示，抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MBEC为50µg/mL，对黏性放线菌MBEC为800µg/mL。需要解释的是，菌斑生物膜是龋齿发生的起始因素，与游离的细菌相比，菌斑生物膜内细菌的耐药性、毒力和抵抗宿主免疫防御能力更强。上述生物膜MBEC的实验结果表明，抗内氏放线菌卵黄抗体能渗透单菌生物膜并抑制和杀死膜内内氏放线菌，在较高浓度下对黏性放线菌也有一定作用。
抗内氏放线菌卵黄抗体对单菌生物膜产酸水平的影响
首先，同上述最低抑菌浓度测定过程，分别制备内氏放线菌、黏性放线菌的菌悬液，调整细菌悬液浓度为4×106 CFU/mL备用；
然后，进行抗内氏放线菌卵黄抗体对单菌生物膜产酸水平评价，具体过程为：
取96孔板，每孔加入pH=7.0的含1%蔗糖的4mL的BHI液体培养液和1mL细菌悬液，37℃、厌氧培养24 h，使形成生物膜；
然后吸出每孔中液体，再分别加入含MBEC（对于内氏放线菌为50µg/mL，对于黏性放线菌为800µg/mL）、1/2MBEC、1/4MBEC和1/8MBEC浓度的含抗内氏放线菌卵黄抗体的BHI液体培养液5 mL，并设阴性对照孔，37℃、厌氧培养24 h；
培养结束后把培养液吸入离心管内，4℃、9000 rpm、离心20 min，测上清pH值，并计算ΔpH值，ΔpH值=初始pH值－终末pH值；
每菌株做6孔，实验重复3次，实验结果采用SPSS19.0统计软件处理。
产酸水平变化结果如下表所示：
表中“*”表示ΔpH值显著低于阴性对照组，P<0.05。
细菌对牙齿的致龋性与其产酸性相关。从上表数据可以看出，抗内氏放线菌卵黄抗体在MBEC、1/2 MBEC和1/4 MBEC三个浓度时均可抑制生物膜内细菌的产酸能力，而且抗体的浓度越高，其抑制生物膜内细菌的产酸能力就越强。
综上所述，本发明所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体能显著抑制内氏放线菌的生长，并能有效清除内氏放线菌单菌生物膜的形成，并对其生物膜产酸有明显抑制作用，制备的抗内氏放线菌卵黄抗体对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性。

Claims (6)

1.一种抗内氏放线菌卵黄抗体，其特征在于，包括如下步骤制备获得：
（一）制备灭活的内氏放线菌作为抗原，具体过程为，取内氏放线菌进行培养，获得菌体，对菌体进行灭活处理，用生理盐水重悬菌体，调整菌液浓度为1×107～1×1010CFU/mL备用；
所述内氏放线菌采用美国模式培养物集存库保藏号为ATCC 12104的内氏放线菌；
（二）免疫接种蛋鸡，具体过程为：取步骤（一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂按1：1体积比充分混合后，皮下和肌肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2～3 mL；
所述蛋鸡为22周龄健康产蛋来杭母鸡；
免疫接种完成后2周开始收集鸡蛋，所收集鸡蛋均于4℃保存；
所述免疫接种具体接种4次，具体过程为：第一次免疫接种后两周进行第2次免疫接种，以后每隔9～14天免疫接种一次；第一次免疫接种时使用弗氏完全佐剂，第二次、第三次、第四次免疫接种所用佐剂为弗氏不完全佐剂；
（三）分离纯化卵黄抗体，具体过程为：
取步骤（2）中所收集的鸡蛋，对鸡蛋外壳消毒清理后，打蛋收集卵黄，加入无菌双蒸水搅拌充分混匀后，调节pH值至5.0~5.3，4℃静置过夜；然后4℃、10000～12000rpm离心20min，收集上清液；
对所收集的上清液采用滴加(NH4)2SO4溶液方法获得卵黄抗体；具体过程为：
对所收集的上清液滴加饱和(NH4)2SO4溶液，使混合液中(NH4)2SO4饱和度为50%，4℃静置过夜；
4℃、10000 rpm离心20~30 min，弃上清，对沉淀物用蒸馏水溶解后，滴加饱和(NH4)2SO4溶液使饱和度达33%，4℃静置过夜；
过夜后，4℃、10000 rpm离心20~30 min，弃上清；
对沉淀物用蒸馏水溶解后，经100KD超滤膜超滤纯化，收集浓缩液，冷冻干燥后即得到纯化的抗内氏放线菌卵黄抗体。
2.权利要求1所述抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（一）制备灭活的内氏放线菌作为抗原，具体过程为，取内氏放线菌进行培养，获得菌体，对菌体进行灭活处理，用生理盐水重悬菌体，调整菌液浓度为1×107～1×1010CFU/mL备用；
所述内氏放线菌采用美国模式培养物集存库保藏号为ATCC 12104的内氏放线菌；
（二）免疫接种蛋鸡，具体过程为：取步骤（一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂按1：1体积比充分混合后，皮下和肌肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2～3 mL；
所述蛋鸡为22周龄健康产蛋来杭母鸡；
免疫接种完成后2周开始收集鸡蛋，所收集鸡蛋均于4℃保存；
所述免疫接种具体接种4次，具体过程为：第一次免疫接种后两周进行第2次免疫接种，以后每隔9～14天免疫接种一次；第一次免疫接种时使用弗氏完全佐剂，第二次、第三次、第四次免疫接种所用佐剂为弗氏不完全佐剂；
（三）分离纯化卵黄抗体，具体过程为：
取步骤（2）中所收集的鸡蛋，对鸡蛋外壳消毒清理后，打蛋收集卵黄，加入无菌双蒸水搅拌充分混匀后，调节pH值至5.0~5.3，4℃静置过夜；然后4℃、10000～12000rpm离心20min，收集上清液；
对所收集的上清液采用滴加(NH4)2SO4溶液方法获得卵黄抗体；具体过程为：
对所收集的上清液滴加饱和(NH4)2SO4溶液，使混合液中(NH4)2SO4饱和度为50%，4℃静置过夜；
4℃、10000 rpm离心20~30 min，弃上清，对沉淀物用蒸馏水溶解后，滴加饱和(NH4)2SO4溶液使饱和度达33%，4℃静置过夜；
过夜后，4℃、10000 rpm离心20~30 min，弃上清；
对沉淀物用蒸馏水溶解后，经100KD超滤膜超滤纯化，收集浓缩液，冷冻干燥后即得到纯化的抗内氏放线菌卵黄抗体。
3.如权利要求2所述抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤（一）中所述内氏放线菌采用血琼脂平板或用脑心浸液琼脂培养基进行培养，培养条件为37℃、厌氧培养。
4.如权利要求2所述抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤（一）中所述内氏放线菌菌体采用质量分数为0.2～0.5%的甲醛进行灭活。
5.权利要求1所述抗内氏放线菌卵黄抗体在制备治疗口腔疾病药物中的应用，其特征在于，针对内氏放线菌、黏性放线菌或其所形成的生物膜具有作用。
6.如权利要求5所述抗内氏放线菌卵黄抗体在制备治疗口腔疾病药物中的应用，其特征在于，
抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MIC为25µg/mL，对黏性放线菌的MIC为200µg/mL；
抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MBEC为50µg/mL，对黏性放线菌MBEC为800µg/mL；
为抑制生物膜内细菌产酸，针对内氏放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小于12.5µg/mL；针对黏性放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小于200µg/mL。
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