CN113194932A - 氧化铈的纳米粒子、核酸的分解方法、多肽的分解方法、氧化铈的纳米粒子的制造方法、氧化剂、抗氧化剂、抗霉剂及抗病毒剂 - Google Patents
氧化铈的纳米粒子、核酸的分解方法、多肽的分解方法、氧化铈的纳米粒子的制造方法、氧化剂、抗氧化剂、抗霉剂及抗病毒剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明以提供新的氧化铈的纳米粒子、和发现该纳米粒子的新用途作为课题。本发明提供表面被具有哌嗪、吡啶、咪唑或咔唑等杂环式胺骨架的乙烯基系聚合物或聚酰胺被覆了的氧化铈的纳米粒子和使用该氧化铈的纳米粒子的将核酸或多肽分解的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用聚合物被覆其表面的氧化铈的纳米粒子、使用了该纳米粒子的核酸或多肽的分解方法、氧化铈的纳米粒子的制造方法、氧化剂、抗氧化剂、抗霉剂以及抗病毒剂。
背景技术
近年来，在对安全、卫生管理的意识提高中，将有害物质、微生物分解的抗菌技术受到关注。例如，氧化钛具有通过光催化特性而使活性氧种产生、而将有机物氧化分解的特性，除了用作抗菌剂以外，向将乙醛、氨等低分子、变应原、病毒等各种有害物质分解的用途的利用也值得期待。
另一方面，也已知氧化铈的纳米粒子(纳米二氧化铈)具有氧化作用、抗氧化作用、抗菌作用等各种特性，并具有与过氧化氢酶、氧化酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、磷酸酶等酶同样的催化活性。此外，氧化铈的纳米粒子可以期待向与具有光催化特性的氧化钛不同的用途的利用。
然而，一般而言，纳米粒子具有易于凝集的性质。由于氧化铈的纳米粒子也易于凝集，因此有时用聚合物等涂布粒子表面而使粒子的分散性提高，用于氧化剂、抗菌剂等。
在非专利文献1、2中记载了表面被聚丙烯酸、葡聚糖被覆了的氧化铈的纳米粒子，并研究了氧化活性、抗菌活性等。
此外，在非专利文献3中记载了代替聚合物而用磺基琥珀酸-双(2-乙基己基)钠被覆了表面的氧化铈的纳米粒子，并对磷酸酶活性进行了研究。进一步，在非专利文献3中公开了虽然氧化铈的纳米粒子具有将磷酸酯水解的磷酸酶活性，但对核酸不能分解。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：A.Asati，Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，2308-2312.
非专利文献2：M.H.Kuchma，Nanomedicine：Nanotechnology，Biology，andMedicine 2010，6，738-744.
非专利文献3：Q.Wang，International Journal of Nanomedicine 2013，8，3395-3399.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明人等进行了使用用聚合物被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的新用途的研究。然而，如后述核酸和多肽的分解试验那样，使用非专利文献1所记载的用聚丙烯酸被覆其表面的氧化铈的纳米粒子，尝试质粒、多肽的分解，结果关于质粒，与在非专利文献3中报导的结果同样地，不能确认分解。此外，关于多肽，已知分解率非常低。
根据这些结果，以发现可以将核酸、多肽以高分解率分解的新的氧化铈的纳米粒子作为课题，进行了研究。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题，对被覆氧化铈的纳米粒子的表面的聚合物进行了研究。其结果发现，用具有哌嗪、吡啶、咪唑或咔唑的骨架的乙烯基系聚合物或聚酰胺被覆表面的氧化铈的纳米粒子能够将核酸、多肽以高分解率分解，从而完成了本发明。
本发明如下所述。
(1)一种氧化铈的纳米粒子，其表面被具有杂环式胺骨架的乙烯基系聚合物或聚酰胺被覆。
(2)根据(1)所述的氧化铈的纳米粒子，上述杂环式胺骨架通过哌嗪、吡啶、咪唑和咔唑中的任一者构成。
(3)根据(1)所述的氧化铈的纳米粒子，其特征在于，上述乙烯基系聚合物为侧链具有上述杂环式胺骨架的聚合物。
(4)根据(1)所述的氧化铈的纳米粒子，其特征在于，上述聚酰胺为主链具有上述杂环式胺骨架的聚合物。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的氧化铈的纳米粒子，其特征在于，通过X射线吸收精细结构光谱测定而获得的Ce L3端XANES光谱在5726.0～5729.0eV和5735.0～5739.0eV之间具有极大吸收。
(6)一种核酸的分解方法，其特征在于，使包含核酸的试样与(1)～(5)中任一项所述的氧化铈的纳米粒子接触。
(7)一种多肽的分解方法，其特征在于，使包含多肽的试样与(1)～(5)中任一项所述的氧化铈的纳米粒子接触。
(8)一种氧化铈的纳米粒子的制造方法，是其表面被聚合物被覆了的氧化铈的纳米粒子的制造方法，其包含下述工序：
工序a：将具有杂环式胺骨架的聚合物的溶液、与包含铈(III)离子的溶液或铈(III)盐混合，获得混合溶液的工序；以及
工序b：向工序a中获得的混合溶液中添加氧化剂的工序。
(9)一种氧化剂，其包含(1)～(5)中任一项所述的氧化铈的纳米粒子。
(10)一种抗氧化剂，其包含(1)～(5)中任一项所述的氧化铈的纳米粒子。
(11)一种抗霉剂，其包含(1)～(5)中任一项所述的氧化铈的纳米粒子。
(12)一种抗病毒剂，其包含(1)～(5)中任一项所述的氧化铈的纳米粒子。
发明的效果
如果使用本发明的氧化铈的纳米粒子，则与以往的纳米粒子相比，能够将核酸、多肽以更高分解率分解。
附图说明
图1为说明在本发明中使用的聚合物的结构的图。
图2为说明在本发明中使用的具有哌嗪骨架的聚合物的结构的图。
图3为说明本发明的实施例15的抗霉试验的图。
图4为说明本发明的实施例15的抗霉试验的结果的图。
图5为显示在实施例2中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子的CeL3端XANES光谱的图。
图6为显示在比较例1中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子的CeL3端XANES光谱的图。
具体实施方式
本发明的用具有杂环式胺骨架的乙烯基系聚合物或聚酰胺被覆表面的氧化铈的纳米粒子在本说明书中有时记载为本发明的氧化铈的纳米粒子。
在本发明中使用的乙烯基系聚合物或聚酰胺如图1所示那样，在主链(图1(a))或侧链(图1(b)和(c))具有哌嗪、吡啶、咪唑或咔唑等杂环式胺骨架R。本发明涉及的乙烯基系聚合物或聚酰胺可以在主链、侧链的任意位置具有取代基，也可以在哌嗪、吡啶、咪唑或咔唑等杂环式胺骨架的任意位置具有取代基。对于图1(a)所示的聚合物，在主链中具有杂环式胺骨架，在侧链中具有取代基R1和R2。对于图1(b)所示的聚合物，在侧链中具有杂环式胺骨架，作为杂环式胺骨架的取代基，具有取代基R2。对于图1(c)所示的聚合物，在侧链中具有杂环式胺骨架，杂环式胺骨架为侧链的取代基R1的取代基，并且具有取代基R3作为杂环式胺骨架的取代基。图1(a)～(c)所示的结构为在本发明中使用的乙烯基系聚合物或聚酰胺的例示，不限定于此。另外，在本说明书中只要没有特别指明，取代基为烷基、乙酰基、羟基、氨基、氰基、羧基、酯基、醛基、酰胺基、醚基、酮基、卤基、磺酸基或磷酸基。取代基的数目可以为一个也可以为多个。
在本发明中使用的乙烯基系聚合物为主链具有亚甲基的聚合物。作为例子，将主链或侧链具有哌嗪骨架的乙烯基系聚合物的结构示于图2(a)、(b)中。如图2(a)所示那样，在主链具有哌嗪骨架的情况下，在主链的亚甲基与亚甲基之间具有哌嗪骨架。在主链具有吡啶、咪唑或咔唑骨架等其它杂环式胺骨架的情况下也与图2(a)同样地，在亚甲基与亚甲基之间具有杂环式胺骨架。
在本发明中使用的乙烯基系聚合物的侧链具有哌嗪骨架的情况下，可以如图2(b)所示那样，哌嗪骨架直接结合于亚甲基的碳，哌嗪骨架也可以经由烷基、氨基而结合。在具有吡啶、咪唑或咔唑骨架等其它杂环式胺骨架的情况下，与图2(b)同样地，吡啶、咪唑或咔唑骨架等杂环式胺骨架可以直接结合于亚甲基的碳，也可以经由烷基、氨基而结合于亚甲基的碳。
在本发明中使用的乙烯基系聚合物优选为侧链具有哌嗪、吡啶、咪唑或咔唑骨架的乙烯基系聚合物。侧链具有哌嗪、吡啶、咪唑或咔唑骨架的乙烯基系聚合物通过具有乙烯基的乙烯基系单体的聚合反应而获得。
作为乙烯基系单体的具体例，可举出1-乙烯基哌嗪、(4-乙烯基哌嗪-1-基)甲烷胺、2-(4-乙烯基哌嗪-1-基)乙烷-1-胺、2-乙烯基哌嗪、(3-乙烯基哌嗪-1-基)甲烷胺、2-(3-乙烯基哌嗪-1-基)乙烷-1-胺、(2-乙烯基哌嗪-1-基)甲烷胺、2-(2-乙烯基哌嗪-1-基)乙烷-1-胺、2-乙烯基吡啶、3-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基咪唑、4-乙烯基咪唑、9-乙烯基咔唑等。此外，上述乙烯基系单体可以在除乙烯基以外的任意位置具有取代基，也可以在乙烯基上具有甲基、氰基作为取代基。
在本发明中使用的乙烯基系聚合物可以为均聚物，也可以为以2种以上乙烯基系单体作为原料的共聚物。
在本发明中使用的乙烯基系聚合物的优选的具体例为聚(1-乙烯基哌嗪)、聚((4-乙烯基哌嗪-1-基)甲烷胺)、聚(2-(4-乙烯基哌嗪-1-基)乙烷-1-胺)、聚(2-乙烯基吡啶)、聚(3-乙烯基吡啶)、聚(4-乙烯基吡啶)、聚(1-乙烯基咪唑)、聚(2-乙烯基咪唑)、聚(4-乙烯基咪唑)、聚(9-乙烯基咔唑)。
在本发明中使用的聚酰胺为主链具有酰胺键的聚合物。如图2(c)所示那样，在主链具有哌嗪骨架的情况下，在主链的羰基与羰基之间具有哌嗪骨架，哌嗪骨架的杂环中的氮与羰基构成酰胺键。在主链具有吡啶、咪唑或咔唑骨架等具有2个以上伯氨基或仲氨基的其它杂环式胺骨架的情况下，也与图2(c)同样地，在羰基与羰基之间具有杂环式胺骨架。
在本发明中使用的聚酰胺具有哌嗪骨架的情况下，可以如图2(d)所示那样，哌嗪骨架直接结合于连接酰胺基的碳，哌嗪骨架也可以经由烷基、氨基而结合。在具有吡啶、咪唑或咔唑骨架等其它杂环式胺骨架的情况下，与图2(d)同样地，吡啶、咪唑或咔唑骨架等杂环式胺骨架可以直接结合于连接酰胺基的碳，也可以经由烷基、氨基而结合。
在本发明中使用的聚酰胺优选为主链或侧链具有哌嗪骨架的聚合物，更优选为图2(c)所示的、主链具有哌嗪骨架的聚合物。
在本发明中使用的主链具有哌嗪骨架的聚酰胺通过具有哌嗪骨架的胺、与二羧酸的缩聚反应而获得。
作为具有哌嗪骨架的胺的优选例，可举出哌嗪、(氨基甲基)哌嗪、(氨基乙基)哌嗪、(氨基丙基)哌嗪、(氨基丁基)哌嗪、1,4-双(氨基甲基)哌嗪、1,4-双(2-氨基乙基)哌嗪、1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪、1,4-双(4-氨基丁基)哌嗪等。它们之中，更优选为(氨基乙基)哌嗪、1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪。此外，这些胺可以在除能够形成酰胺键的氮以外的任意位置具有取代基。
作为二羧酸的优选例，可举出1H-咪唑-2,4-二甲酸、1H-咪唑-2,5-二甲酸、1H-咪唑-4,5-二甲酸、吡啶-2,3-二甲酸、吡啶-2,4-二甲酸、吡啶-2,5-二甲酸、吡啶-2,6-二甲酸、吡啶-3,4-二甲酸、吡啶-3,5-二甲酸、己二酸、癸二酸、十二烷二甲酸(dodecanedicarboxylic acid)、对苯二甲酸、间苯二甲酸等。此外，这些二羧酸可以在除能够形成酰胺键的羧基以外的任意位置具有取代基。
在本发明中使用的聚酰胺只要是通过上述胺与二羧酸的组合而获得的聚酰胺，就可以优选使用，特别优选为通过(氨基乙基)哌嗪与己二酸的组合而获得的聚酰胺。
此外，在本发明中使用的聚酰胺可以在主链上具有聚亚烷基二醇的结构。具体而言，可举出具有(氨基乙基)哌嗪、己二酸、和双(氨基丙基)聚乙二醇的骨架的聚酰胺。
此外，在本发明中使用的聚酰胺可以为具有哌嗪、吡啶、咪唑或咔唑等杂环式胺骨架的聚酰胺、与其它聚合物的混合物、共聚物。在该情况下，作为其它聚合物的具体例，可举出聚己酰胺(尼龙6)、聚己二酰己二胺(尼龙66)、聚己二酰丁二胺(尼龙46)、聚己二酰戊二胺(尼龙56)、聚癸二酰戊二胺(尼龙510)、聚癸二酰己二胺(尼龙610)、聚十二烷二酰己二胺(尼龙612)、聚己二酰己二胺/聚对苯二甲酰己二胺共聚物(尼龙66/6T)、聚己二酰己二胺/聚对苯二甲酰己二胺/聚间苯二甲酰己二胺共聚物(尼龙66/6T/6I)、聚对苯二甲酰己二胺/聚间苯二甲酰己二胺共聚物(尼龙6T/6I)、聚己二酰苯二甲胺(尼龙XD6)等。
在本发明中使用的乙烯基系聚合物、聚酰胺的分子量只要为3000以上且1000000以下即可，优选为10000以上且50000以下。
本发明的氧化铈的纳米粒子具有以由Ce2O3和CeO2的混合物构成的氧化铈粒子(在本说明书中有时记载为中心核)作为中心、其表面被上述聚合物被覆而成的结构。中心核的粒径只要为1nm以上且100nm以下左右即可。该粒径使用透射型电子显微镜，测定长轴径、短轴径、定方向径之中的2种以上的长度，将其平均值作为粒径而算出。
中心核的Ce2O3与CeO2的比率可以以铈(III)与铈(IV)的比的形式而算出。在计算比时，只要使本发明的氧化铈的纳米粒子干燥，通过X射线光电子分光法(XPS)算出即可。Ce2O3和CeO2中的铈(III)与铈(IV)的能量状态可以通过X射线吸收精细结构光谱测定(X-ray Absorption Fine Structure；XAFS)来观察。在XAFS光谱中，距吸收端约20eV的结构被称为XANES(X射线吸收近边结构，X-ray Absorption Near Edge Structure)，在距吸收端约100eV以上高能量侧出现的广域X射线吸收精细结构被称为EXAFS(延伸X射线吸收精细结构，Extended X-ray Absorption Fine Structure)。由XANES获得与着眼原子的价数、结构有关的信息，对于EXAFS解析，通过实际光谱的傅里叶变换(相当于FT-EXAFS/径向分布函数)，获得与试样的局部结构、着眼原子周围的原子种类、价数、距离有关的信息。与氧化铈的氧化还原反应有关的铈(III)与铈(IV)的能量状态反映于XANES光谱的极大吸收的峰位置、峰强度比。
通过X射线吸收精细结构光谱测定而获得的Ce L3端XANES光谱优选在5726.0～5729.0eV和5735.0～5739.0eV之间具有极大吸收。
本发明的氧化铈的纳米粒子的优选的粒径包含表面的聚合物层在内，作为流体力学直径，优选为200nm以下。关于流体力学直径，将本发明的氧化铈的纳米粒子溶解于水、乙醇、吡啶等任意溶剂，测定动态光散射而导出自相关函数，通过玛夸特法(Marquadt法)进行解析，由个数转换直方图作为平均粒径而算出。动态光散射的测定中使用大塚电子株式会社的ELS-Z。
本发明的氧化铈的纳米粒子可以通过下述氧化铈的纳米粒子的制造方法来制造，上述制造方法包含下述工序a和工序b，工序a：将具有哌嗪、吡啶、咪唑或咔唑等杂环式胺骨架的聚合物的溶液、与包含铈(III)离子的溶液或铈(III)盐混合，获得混合溶液的工序；工序b：向工序a中获得的混合溶液中添加氧化剂的工序。以下，对本发明的氧化铈的纳米粒子的制造方法按工序分开说明。
工序a为将具有哌嗪、吡啶、咪唑或咔唑等杂环式胺骨架的聚合物的溶液、与包含铈(III)离子的溶液或铈(III)盐混合，获得混合溶液的工序。在工序a中使用的聚合物的溶液可以将上述聚合物溶解于任意溶剂而调制。溶剂优选为水或与水具有相容性的溶剂。作为与水具有相容性的溶剂的具体例，可举出例如，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、四氢呋喃、甘油、乙二醇、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、三乙胺、吡啶等。如果为聚酰胺、聚乙烯基咪唑则优选溶解于水，如果为聚(4-乙烯基吡啶)、聚(2-乙烯基吡啶)则优选溶解于80％乙醇水溶液，如果为聚乙烯基咔唑则优选溶解于吡啶。在聚合物不易溶解的情况下，可以进行加温、超声波处理来溶解。
聚合物的溶液的浓度以质量浓度计优选为0.01％以上且5％以下，更优选为0.1％以上且2％以下。
聚合物的溶液、与包含铈(III)离子的溶液或铈(III)盐的混合方法可以分别调制聚合物的溶液、和包含铈(III)离子的溶液进行混合，在聚合物的溶液的溶剂为水、或与水具有相容性的溶剂的情况下，可以在聚合物的溶液中添加铈(III)盐进行混合。包含铈(III)离子的溶液只要将铈(III)盐溶解于任意溶剂而调制即可。铈(III)盐只要使用例如硝酸铈(III)·六水合物即可。
作为铈(III)盐，在使用硝酸铈(III)·六水合物的情况下，优选以硝酸铈(III)·六水合物相对于聚合物的质量比成为0.1以上且5.0以下的方式混合。混合溶液优选混合5分钟以上直到溶液变得均匀。
工序b为向工序a中获得的混合溶液中添加氧化剂的工序。在工序b中使用的氧化剂可举出硝酸、硝酸钾、次氯酸、亚氯酸、氯酸、高氯酸、卤素、卤化氢、高锰酸盐、铬酸、重铬酸、草酸、硫化氢、二氧化硫、硫代硫酸钠、硫酸、过氧化氢等。它们之中特别优选为过氧化氢。添加量相对于铈(III)离子，作为摩尔当量，只要是0.1当量以上且10当量以下即可，优选为1当量以上且2当量以下。
如果向工序a中获得的混合溶液中添加氧化剂，则铈(III)离子被氧化成铈(IV)，以由Ce2O3和CeO2的混合物构成的氧化铈粒子作为中心，其表面被上述聚合物被覆了的粒子的形成反应开始。如果向聚合物与铈(III)离子的混合溶液中添加氧化剂，则本发明的氧化铈的纳米粒子的形成反应开始。此外，在该反应时，溶液着色为黄色、橙色、红色、褐色等。其是由铈(III)离子变化为铈(IV)引起的显色，着色程度由在氧化铈的纳米粒子的表面存在的铈(III)与铈(IV)之比决定。反应结束可以由颜色的变化消失的点判断。通常在30分钟～1小时左右反应结束。
例如，相对于0.1质量％的聚乙烯基咪唑水溶液5ml，添加10质量％的硝酸铈(III)六水合物水溶液100μl进行混合，然后，添加1.2质量％的过氧化氢水溶液100μl，并加温到40℃，则溶液最初变化为黄色，然后黄色逐渐变深，最终变为橙色而反应结束。
本发明的氧化铈的纳米粒子的大小可以根据聚合物的溶液的浓度来调整。如果使用高浓度的聚合物的溶液，则获得大粒径的粒子，如果使用低浓度的聚合物的溶液，则获得小粒径的粒子。
除此以外，本发明的氧化铈的纳米粒子的大小也可以通过反应温度调整。如果使反应温度为聚合物的玻璃化转变温度(Tg)以上，则获得大粒径的粒子，如果使反应温度小于Tg，则获得小粒径的粒子。反应温度可以在4～95℃之间任意设定。
本发明的氧化铈的纳米粒子可以在反应结束后的溶液中保存，也可以将本发明的氧化铈的纳米粒子从反应结束后的溶液中取出，在进行了干燥的状态下保存。在溶液中保存的情况下，优选为冷藏保存。在使本发明的氧化铈的纳米粒子干燥的情况下，只要首先将反应结束后的溶液用超滤膜进行过滤，或用半透明膜进行透析，而将在反应结束后的溶液中残存的未反应的氧化剂和铈(III)离子以及多余的聚合物除去，使用蒸发器、冷冻干燥机等进行干燥即可。
如果使用本发明的氧化铈的纳米粒子，则可以将核酸、多肽分解。例如，具有可以将以核酸和多肽作为主成分的、病毒分解的可能性。此外，具有可以将以多肽作为主成分的、变应原分解的可能性。
在本说明书中，所谓将核酸分解，是指构成核酸的核苷酸链发生切断。如果核酸被分解，则核酸的立体结构变化，或核酸发生片段化。例如，在质粒那样的环状双链核酸的情况下，在核酸未被切断的状态下，变为闭环结构，如果双链之中的1条被切断则变为开环结构，如果双链两者被切断则变为线性结构。
在本说明书中，所谓将多肽分解，是指多肽链发生切断，多肽的立体结构变化，或多肽发生片段化。
在使用本发明的氧化铈的纳米粒子将核酸、多肽分解的情况下，可以在进行了干燥的状态下，使其与包含核酸、多肽的试样接触，也可以作为包含本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液，使上述反应结束后的溶液直接与包含核酸、多肽的试样接触。作为接触的方法，在包含核酸、多肽的试样为液体的情况下，只要添加本发明的氧化铈的纳米粒子、或包含本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液进行混合即可。此外，如果使包含本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液为雾状而散布于空间，则可以使其与病毒等在空气中存在的包含核酸、多肽的试样接触。此外，也可以将本发明的氧化铈的纳米粒子作为添加剂而掺入到纤维、管、珠、橡胶、膜、塑料等中，或涂布于它们的表面，使其与包含核酸、多肽的试样接触。在调制包含本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液的情况下，只要与水、任意溶液混合即可。
能够被本发明的氧化铈的纳米粒子分解的核酸只要是核苷酸直链状或环状地聚合而成的核酸，就没有特别限定，可以为人工核酸。在核酸中，可举出例如，RNA、DNA、RNA/DNA(嵌合体)等。在DNA中，可举出cDNA、微DNA(miDNA)、质粒DNA、基因组DNA、和合成DNA、细胞游离DNA(cfDNA)、ctDNA、线粒体DNA(mtDNA)等。此外，在RNA中，可举出total RNA、mRNA、rRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、snRNA或non-coding RNA、它们的前体或合成RNA等。合成DNA和合成RNA是基于规定的碱基序列(可以为天然型序列和非天然型序列中的任一者)，使用例如自动核酸合成机人工地调制的。在人工核酸中，可举出例如LNA、BNA。在分解时，可以使用包含这些核酸的任意试样。
能够通过本发明的氧化铈的纳米粒子分解的多肽可举出基于蛋白质、规定的氨基酸序列(可以为天然型序列和非天然型序列中的任一者)，人工地合成的多肽等。
此外，具有主链保持了多肽结构的核酸样的结构的多肽核酸(PNA)、以蛋白质和核酸为主成分的病毒等也可以作为包含核酸或多肽的试样而使用。
在确认核酸被分解了的方法中，可举出使用丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳等电泳、尺寸排阻色谱、质谱分析等对核酸进行分析的方法。在核酸被分解了的情况下，可以确认到与分解前相比对象的谱带浓度、峰强度减少、谱带、峰的消失等。此外，也可以通过与分解前相比显示小片段存在的新的谱带、峰出现来确认。具体而言，在环状双链核酸分解了的情况下，闭环结构、开环结构、线性结构可以通过电泳而作为分开的谱带而确认到。此外，如果核酸通过分解而立体结构变化，则电泳的结果，也有时与分解前相比谱带的位置变化。
多肽被分解了可以通过与上述核酸的分解的确认同样的方法来确认。
核酸、多肽的分解率可以通过以下方法算出分解率。首先，调制使包含核酸、多肽的试样与本发明的氧化铈的纳米粒子接触了的样品(以下在本说明书中，有时简单记载为样品。)。在对照的谱带中，使用与本发明的氧化铈的纳米粒子未接触的包含核酸、多肽的试样。将上述与本发明的氧化铈的纳米粒子接触了的样品、和对照通过上述电泳、尺寸排阻色谱等进行分析。在使用电泳的情况下，将对照和样品进行电泳，确认相同位置的谱带浓度，分别将谱带的浓度数值化，将对照的谱带浓度值设为(X)，将样品的谱带浓度值设为(Y)，取(X)与(Y)之差，将该值相对于(X)的比例设为分解率。在使本发明的氧化铈的纳米粒子与包含核酸、多肽的试样接触时，在核酸、多肽吸附于本发明的氧化铈的纳米粒子的情况下，只要使用任意溶出液使核酸、多肽溶出而回收即可。溶出液可以使用包含柠檬酸和柠檬酸钠的柠檬酸缓冲液、包含磷酸和磷酸钠的磷酸缓冲液、在包含三羟基氨基甲烷和盐酸的Tris-盐酸缓冲液中添加了EDTA的Tris-EDTA缓冲液等。
本发明的氧化铈的纳米粒子可以作为氧化剂而使用。例如，可以利用本发明的氧化铈的纳米粒子的氧化作用，用于有机合成反应、高分子聚合、半导体的湿蚀刻。此外，可以利用氧化作用，作为代替氧化酶的物质而使用。具体而言，可以作为氧化酶、过氧化物酶的替代而用于抗体-抗原反应、使用核酸的杂交的检测反应、组织染色，或通过向电极固定化而用于电化学的检测反应。作为这样的氧化剂的性能可以通过测定后述氧化酶活性的方法、测定过氧化物酶活性的方法等来评价。除此以外，可以利用氧化作用，作为漂白剂/消毒剂而用于污垢、臭味、变应原的分解/除去。具体而言，可以作为漂白剂而使用于衣类、餐具、厨房、厕所、洗脸室、浴室、医疗器具等的洗涤。此外，可以作为消毒剂而添加于游泳池、浴槽、温泉，或作为美体皂、洗手剂、消毒药、含漱剂、漱口水等而使用。作为这样的氧化剂的性能可以通过后述有机色素的褪色反应等来评价。
有机色素的褪色反应也使用于氧化钛中的光催化性能的评价，所得的色素的分解率作为将有机物氧化分解的特性的指标而使用。具体而言，色素的分解率如以下那样算出。首先将本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液、和酸性橙7(AO7)等有机色素进行混合、静置规定的时间。作为对照，对不包含氧化铈的纳米粒子的AO7的溶液也进行同样的处理。反应后，测定全部溶液的吸收光谱。解析中使用作为AO7的极大吸收波长的485nm的吸光度。取对照的吸光度(Ic)和包含氧化铈的纳米粒子的溶液的吸光度(I)之差，算出相对于对照的吸光度(Ic)的比例作为分解率。
氧化酶活性可以通过A.Asati，Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，2308-2312.所示那样的方法而求出值。具体而言，使用TMBZ等通过氧化而显色的试剂来制作稀释系列，分别加入相同浓度的本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液而进行3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)(TMBZ)的显色反应。对该反应适用米-曼式方程(Michaelis–Menten equation)而算出氧化酶活性。由各TMBZ浓度下的吸光度的经时变化算出反应速度，相对于相当于底物的TMBZ浓度的倒数而绘制反应速度的倒数。每个底物浓度都进行绘制而获得直线，由y截距的倒数算出最大反应速度Vmax，对该值乘以直线的斜率而算出米-曼常数Km。作为显示氧化酶活性的值，将最大反应速度Vmax进行比较。氧化酶活性也可以使用2,2’-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid))(AzBTS)、多巴胺这样的化合物代替TMBZ来测定。
本发明的氧化铈的纳米粒子可以作为抗氧化剂而使用。在本发明中所谓抗氧化剂，是指具有还原性，抑制脂质的过氧化，或与活性氧(超氧化物离子、羟基自由基、过氧化氢等)反应而抑制其作用的物质(标准化学用语辞典(標準化学用語辞典)第2版，丸善出版)。例如，可以利用本发明的氧化铈的纳米粒子的抗氧化作用，作为有机化学反应中的还原剂、高分子聚合中的自由基终止剂而使用。此外，可以利用抗氧化作用，作为化妆品而用于保护皮肤不受过氧化脂质、活性氧影响。除此以外，可以利用抗氧化作用，作为代替抗氧化酶的物质而使用。具体而言，可以作为过氧化氢酶的替代而用于过氧化氢的检测反应、通过向电极固定化从而用于电化学的检测反应。此外，可以用于将在食品、半导体、纤维、纸浆粕制造、公共浴池的杀菌、配管内的泥浆除去等中被产业利用的过氧化氢进行中和。这样的性能可以通过后述过氧化氢酶活性等来评价。进一步，可以利用抗氧化作用，作为抗氧化剂而使用。具体而言，为了防止橡胶、塑料、燃料、洗剂、食品、动物饲料的劣化，可以添加在它们中。作为这样的抗氧化剂的性能可以通过后述活性种的清除反应等来评价。
进一步，本发明的氧化铈的纳米粒子可以以抗氧化剂的形式作为与氧化应激、炎症有关的人或动物用的药品而使用。一般认为具有过氧化氢酶活性的氧化铈的纳米粒子通过注射、点滴或移植等局部的、经肠的或非经口的方法而被施与到被检体，从而可以用于预防和治疗脑中风、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、缺血再灌注损伤等氧化应激相关的疾病。此外，一般认为具有过氧化氢酶活性的氧化铈的纳米粒子通过保持在插管、导管或支架那样的医疗器具、以透析膜为代表的人工器官的表面，从而可以局部或全身地使炎症减少。
活性种的清除反应可以通过Y.Xue，J.Phys.Chem.C 2011，115，4433-4438.所示那样的方法而作为色素保持率测定。具体而言，将氯化铁(II)水溶液与过氧化氢水溶液混合，通过芬顿反应使羟基自由基产生。向其中加入本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液进行自由基清除反应。将该混合液和亚甲基蓝等的有机色素进行混合、静置规定的时间。作为对照，对不包含氧化铈的纳米粒子的溶液也进行同样的处理。进一步，调制与反应液相同浓度的亚甲基蓝溶液作为基准液，测定上述溶液的吸收光谱。解析中使用作为亚甲基蓝的极大吸收波长的664nm的吸光度。算出基准液的吸光度(I0)与对照的吸光度(Ic)之差(ΔI0)、和包含本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液的吸光度(I)与对照的吸光度(Ic)之差(ΔI)。算出后者(ΔI)相对于前者(ΔI0)的比例作为分解率，设为色素保持率。该值成为显示自由基清除性能的值。色素保持率也可以使用甲基紫代替亚甲基蓝来求出。
过氧化氢酶活性可以如日本特表2018-508568号公报所示那样使用サーモフィッシャーサイエンティフィック社的Amplex Red过氧化氢酶检测试剂盒(Amplex Red CatalaseAssay Kit，A22180)，按照试验方案来求出值。将试剂盒所包含的反应缓冲液和本发明的氧化铈的纳米粒子、过氧化氢水溶液混合，静置30分钟进行过氧化氢的分解反应。使反应液通过30kD的超滤膜，将流通溶液与试剂盒所包含的工作液混合，在37℃下反应30分钟。将通过反应而生成的试卤灵(Resorufin)以544nm激发，测定590nm的荧光强度。与通过试剂盒所包含的活性值已知的过氧化氢酶的标准品制作的标准曲线比较，算出氧化铈的纳米粒子的过氧化氢酶活性。在过氧化氢酶活性的测定中，除此以外，也可以使用BioAssay System社的EnzyChrom过氧化氢酶检测试剂盒(EnzyChrom Catalase Assay Kit)等。
本发明的氧化铈的纳米粒子可以作为抗霉剂而使用。作为对作为抗霉剂的性能进行评价的方法，可举出例如：将霉菌孢子悬浮液与试验液混合，用无机盐琼脂培养基、含有葡萄糖的无机盐琼脂培养基进行培养，观察发长状态的方法；在琼脂培养基中添加试验液而观察生长的抑制的方法、测定生长抑制圈的方法。在本发明中，抗霉性能优选使用在琼脂培养基中添加试验液而观察生育的抑制的方法、测定生长抑制圈的方法。
在本发明的氧化铈的纳米粒子中可以灭活的霉类可举出例如，青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、链格孢霉(Alternaria)、枝孢霉(Cladosporium)、木霉(Trichoderma)、毛壳菌(Chaetomium)等。
在作为抗霉剂而使用的情况下，将本发明的氧化铈的纳米粒子作为添加剂而掺入到纤维、管、珠、橡胶、膜、塑料等中、或涂布于它们的表面而得的加工品可以作为厨房水槽用的排水口地漏盖、排水口塞、窗玻璃固定用衬垫(packing)、镜固定用的衬垫、浴室、盥洗池、厨房的防水衬垫、冰箱的门衬里衬垫、浴垫、洗脸盆、椅子的防滑橡胶、软管、淋浴头、净水器所使用的衬垫、净水器的塑料制品、洗衣机所使用的衬垫、洗衣机的塑料制品、空调器用过滤器、空气净化机用过滤器、吸尘器用过滤器、换气扇用过滤器、车辆用过滤器、空调用过滤器、空调器的散热片、空调器吹出口的百叶窗等塑料部件以及鼓风扇等、汽车空调器的散热片、汽车空调器吹出口的百叶窗等塑料部件以及鼓风扇、衣类、寝具、纱窗用网、鸡棚用网、蚊帐等网类、壁纸、窗、遮光帘、医院内等的大厦用内装材料、火车、汽车等的内装材料、车辆用座椅、遮光帘、椅子、沙发、处理病毒的设备、门、天花板、地板、窗等建筑材料而利用于各种领域。
本发明的氧化铈的纳米粒子可以作为抗病毒剂而使用。作为对作为抗病毒剂的性能进行评价的方法，使本发明的氧化铈的纳米粒子与病毒接触，将接触后的病毒量定量。作为将病毒定量的方法，可举出通过ELISA法测定病毒抗原量的方法、通过PCR将病毒核酸定量的方法、通过噬斑法测定感染滴度的方法、通过50％感染量测定法测定感染滴度的方法等。在本发明中抗病毒性能优选使用噬斑法、通过50％感染量测定法测定感染滴度的方法。病毒感染滴度的单位在50％感染量测定法中，在将培养细胞作为对象进行了试验的情况下由TCID50(组织培养感染剂量50，Tissue culture infectious dose 50)表述，在使用了孵化鸡卵的情况下由EID50(卵感染剂量50，Egg infectious dose 50)表述，对于动物由LD50(致死剂量50，Lethal dose50)表述。此外，作为由在50％感染量测定法中获得的数据算出感染滴度的方法，有Reed-Muench法、Behrens-Kaeber法、Spearman-Karber法等，但在本发明中使用Reed-Muench法。抗病毒性能的判定基准一般如果相对于使本发明的氧化铈的纳米粒子作用前的感染滴度、不包含本发明的纳米粒子的对照，感染滴度的对数减少值为2.0以上，则抗病毒性能被判定为有效。
在本发明的氧化铈的纳米粒子中可以灭活的病毒可举出例如，鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒、轮状病毒、诺如病毒、肠道病毒、肝病毒(hepatovirus)、星状病毒、沙波病毒、E型肝炎病毒、A型、B型、C型流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒(腮腺炎)、麻疹病毒、人类偏肺病毒、RS病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、B型、C型肝炎病毒、东部和西部马脑炎病毒、阿尼昂尼昂病毒(Onyongnyongvirus)、风疹病毒、拉沙病毒、胡宁病毒(Junin virus)、马秋博病毒(Machupovirus)、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)、沙比亚病毒、克里米亚刚果出血热病毒、白蛉热、汉坦病毒、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒(Marburg virus)、蝙蝠丽沙病毒(bat lyssavirus)、人类T细胞白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、人类冠状病毒、SARS冠状病毒、人类微小病毒、多瘤病毒、人类乳头瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus，爱泼斯坦-巴尔病毒)、巨细胞病毒、天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、软疣痘病毒(molluscipoxvirus virus)、副痘病毒等。
在作为抗病毒剂而使用的情况下，将本发明的氧化铈的纳米粒子作为添加剂而掺入到纤维、管、珠、橡胶、膜、塑料等、或涂布于它们的表面而得的加工品可以作为口罩、医疗用帽、医疗用鞋套、空调器用过滤器、空气净化机用过滤器、吸尘器用过滤器、换气扇用过滤器、车辆用过滤器、空调用过滤器、空调器的散热片、空调器吹出口的百叶窗等塑料部件以及鼓风扇等、汽车空调器的散热片、汽车空调器吹出口的百叶窗等塑料部件以及鼓风扇、衣类、寝具、纱窗用网、鸡棚用网、蚊帐等网类、壁纸、窗、遮光帘、医院内等的大厦用内装材料、火车、汽车等的内装材料、车辆用座椅、遮光帘、椅子、沙发、处理病毒的设备、门、天花板、地板、窗等建筑材料而利用于各种领域。
实施例
通过以下实施例进一步具体地说明本发明。
＜材料和方法＞
聚丙烯酸钠、聚(4-乙烯基吡啶)、聚(2-乙烯基吡啶)由メルク株式会社获得，聚(1-乙烯基咪唑)和聚(9-乙烯基咔唑)由丸善石油化学株式会社获得，硝酸铈(III)六水合物和30质量％过氧化氢水由富士フイルム和光純薬株式会社获得。
关于其它试剂，由富士フイルム和光純薬株式会社、东京化成株式会社、シグマーアルドリッチジャパン合同会社购入，不特别精制而直接使用。
在以下实施例中，将具有(氨基乙基)哌嗪和己二酸作为结构单元的聚合物记载为聚酰胺(1)，将具有(氨基乙基)哌嗪和双(氨基丙基)聚乙二醇和己二酸作为结构单元的聚合物记载为聚酰胺(2)，这些聚合物以日本特开平11-166121号公报作为参考而调制。
电热板使用了IKAジャパン株式会社的IKA C-MAG HP4。
在用聚合物被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的流体力学直径的测定中，使用大塚电子株式会社的ζ电位·粒子测定系统ELS-Z，铈(III)与铈(IV)的比使用了PHI社的Quantera SXM。
QM9414株由NBRC(NITE Biological Resource Center)获得而使用。
(实施例1)用聚酰胺(1)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的调制
作为具有哌嗪骨架的聚合物的水溶液，使用了0.1质量％的聚酰胺(1)水溶液。相对于0.1质量％的聚酰胺(1)水溶液5ml，添加10质量％的硝酸铈(III)六水合物水溶液100μl，在室温下搅拌5分钟。然后，添加1.2质量％的过氧化氢水溶液100μl，加温到40℃使其反应1小时，获得了用聚酰胺(1)被覆表面的氧化铈的纳米粒子的黄色水溶液。将该水溶液用30kD的超滤膜精制，作为溶液而获得用聚酰胺(1)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子。
(实施例2)用聚酰胺(2)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的调制
作为具有哌嗪骨架的聚合物的水溶液，使用了0.1质量％的聚酰胺(2)水溶液，除此以外，在与实施例1同样的条件下进行反应，获得了用聚酰胺(2)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的黄色水溶液。将该水溶液用30kD的超滤膜精制，作为溶液而获得用聚酰胺(2)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子。
(实施例3)用聚(1-乙烯基咪唑)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的调制
作为具有咪唑骨架的聚合物的水溶液，使用了0.1质量％的聚(1-乙烯基咪唑)水溶液，除此以外，在与实施例1同样的条件下进行反应，获得了用聚(1-乙烯基咪唑)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的橙色水溶液。将该水溶液用30kD的超滤膜精制，作为溶液而获得用聚(1-乙烯基咪唑)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子。
(实施例4)用聚(4-乙烯基吡啶)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的调制
作为具有吡啶骨架的聚合物的水溶液，使用了溶剂中使用了80体积％乙醇水溶液的、0.1质量％的聚(4-乙烯基吡啶)的乙醇水溶液5ml，除此以外，在与实施例1同样的条件下进行反应，获得了用聚(4-乙烯基吡啶)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的红褐色溶液。在该乙醇水溶液中添加水而稀释为70体积％，用30kD的超滤膜精制，用离心蒸发器除去溶剂而再溶解于二甲亚砜，作为溶液而获得用聚(4-乙烯基吡啶)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子。
(实施例5)用聚(2-乙烯基吡啶)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的调制
作为具有吡啶骨架的聚合物的水溶液，使用了溶剂使用了80体积％乙醇水溶液的、0.1质量％的聚(2-乙烯基吡啶)的乙醇水溶液，除此以外，在与实施例1同样的条件下进行反应，获得了用聚(2-乙烯基吡啶)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的褐色溶液。在该溶液中添加水而稀释为70体积％，用30kD的超滤膜精制，用离心蒸发器除去溶剂而再溶解于二甲亚砜，作为溶液而获得用聚(2-乙烯基吡啶)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子。
(实施例6)用聚(9-乙烯基咔唑)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的调制
作为具有咔唑骨架的聚合物的水溶液，使用了0.1质量％的聚(9-乙烯基咔唑)的吡啶溶液，除此以外，在与实施例1同样的条件下进行反应，获得了用聚(9-乙烯基咔唑)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的橙色溶液。将该水溶液以10000G离心1小时而除去上清液，再溶解于二甲亚砜(DMSO)，作为溶液而获得用聚(9-乙烯基咔唑)被覆其表面的氧化铈的纳米粒子。
(比较例1)用聚丙烯酸被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的调制
作为聚合物水溶液，使用了1质量％的聚丙烯酸钠水溶液，除此以外，在与实施例1同样的条件下进行反应，获得了用聚丙烯酸钠被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的黄色水溶液。将该水溶液用30kD的超滤膜精制，作为溶液而获得用聚丙烯酸被覆其表面的氧化铈的纳米粒子。
(比较例2)
以日本特表2018-508568号公报作为参考，制作出以柠檬酸(CA)/乙二胺二琥珀酸三钠盐(EDDS)作为稳定剂的氧化铈的纳米粒子。
(表面被聚合物被覆了的氧化铈的纳米粒子的流体力学直径的测定)
通过动态光散射(DLS)测定了在实施例1～6中调制的用聚合物被覆其表面的氧化铈的纳米粒子的流体力学直径。测定时的溶剂在聚合物为聚酰胺(1)、聚酰胺(2)和聚(1-乙烯基咪唑)的情况下使用了水，在聚(4-乙烯基吡啶)或聚(2-乙烯基吡啶)的情况下使用了乙醇，在聚(9-乙烯基咔唑)的情况下使用了吡啶。通过个数换算而获得了流体力学直径。将所得的值示于表1中。
[表1]
(表1)
(表面被聚合物被覆了的氧化铈的纳米粒子的Ce4+/Ce3+比的测定)
通过X射线光电子分光法(XPS)测定了在实施例1～6中获得的氧化铈的纳米粒子的Ce4+相对于Ce3+的比。在测定中，使激发X射线为monocheomatic AlKα1,2射线(1486.6eV)，将X射线直径设为200μm，将光电子出射角度设为45°。在测定时，在实施例1～3中调制的氧化铈的纳米粒子使用了在精制后用水进行了冷冻干燥的物质，在实施例4～6中调制的氧化铈的纳米粒子使用了在精制后用离心蒸发器进行了干燥的物质。将所得的值示于表1中。
(核酸的分解试验)
将在实施例1～6、和比较例1中调制的纳米粒子的溶液分别以成为2mg/ml的方式调整浓度。最初，如下那样算出在实施例1～6中调制的纳米粒子的溶液中包含的本发明的氧化铈的纳米粒子的浓度。向测定了质量的覆盖玻璃上滴加在实施例1～6中调制的纳米粒子的溶液，用电热板进行了加热。在空气冷却后，再次测定覆盖玻璃的质量，取与加热前的质量之差，从而求出本发明的氧化铈的纳米粒子的质量。将该质量除以滴加的溶液量，作为本发明的氧化铈的纳米粒子溶液的浓度。基于该浓度的值，分别调整本发明的氧化铈的纳米粒子的浓度，用于以下实验。
加入在实施例1～3中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子、和在比较例1中调制的氧化铈的纳米粒子的水溶液2μl、作为包含核酸的试样的100ng/μl的pUC19的溶液0.5μl、和50mM乙酸缓冲液(pH5)2.5μl，在室温下静置1小时，进行了核酸的分解反应。
加入在实施例4～6中调制的2mg/ml的本发明的氧化铈的纳米粒子的二甲亚砜溶液2μl、作为包含核酸的试样的100ng/μl的pUC19的溶液0.5μl、和150mM乙酸缓冲液(pH5)0.5μl，在室温下静置1小时，进行了核酸的分解反应。
作为对照，加入水2μl、100ng/μl的pUC19 0.5μl、和50mM乙酸缓冲液(pH5)2.5μl，在室温下静置1小时。
在各个反应后的溶液中，加入10％SDS(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺，Sodiumdodecylsulfate polyacrylamide)2μl和0.5M的磷酸缓冲液(pH7)3μl并用琼脂糖凝胶进行了电泳。
将进行了电泳的琼脂糖凝胶用溴化乙锭进行染色，检测了pUC19的谱带。如果使包含核酸的试样与实施例1～6和比较例1所记载的氧化铈的纳米粒子接触，则pUC19被切断，可以确认pUC19的闭环结构的谱带、和开环结构的新的谱带。另一方面，对于对照，未确认到开环结构的谱带，仅确认到闭环结构的谱带。
算出各个闭环结构的谱带浓度(Y)，取对照的闭环结构的谱带浓度与(X)之差，算出该值相对于(X)的比例作为分解率。将结果示于表2中。
由这些结果，可以确认如果使用本发明的氧化铈的纳米粒子，则可以以高分解率将核酸分解。
另一方面，对于比较例1的氧化铈的纳米粒子，未观察到pUC19切断。
[表2]
(表2)
(多肽的分解试验)
加入以成为0.2mg/ml的方式调整的在实施例2中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子的水溶液3μl、作为包含多肽的试样的1mg/ml的卵清蛋白(OVA)3μl、和50mM乙酸缓冲液(pH5)6μl，在40℃下静置1小时，进行了多肽的分解反应。
作为对照，加入灭菌蒸馏水3μl、1mg/ml的OVA3μl、和50mM乙酸缓冲液(pH5)6μl，在40℃下静置1小时，进行了多肽的分解反应。
在各个反应后的溶液中，加入NuPAGE LDS Sample Buffer(ThermoFisher社)4μl，在95℃下加热10分钟，用丙烯酰胺凝胶进行了电泳。
将进行了电泳的丙烯酰胺凝胶用Oriole(Bio-RAD社)染色，检测了OVA的谱带。如果使包含多肽的试样与实施例2所记载的氧化铈的纳米粒子接触，则OVA被分解而谱带浓度降低，可以确认到拖尾(smear)的新的谱带。另一方面，对于对照，未确认到显示分解的拖尾的谱带。
分别算出对照的谱带的浓度(X)、和与对照相同分子量的位置的本实施例10的谱带的浓度(Y)，取(X)与(Y)之差，算出该值相对于(X)的比例作为分解率。将结果示于表3中。
关于在比较例1中调制的氧化铈的纳米粒子，也在同样的操作和条件下进行多肽的分解反应，算出分解率。
由本结果可以确认，如果使用本发明的氧化铈的纳米粒子，则能够以高分解率将多肽分解。
另一方面，对于比较例1的氧化铈的纳米粒子，几乎不能确认到多肽的分解。
[表3]
(表3)
(色素的分解试验)
加入以成为2mg/ml的方式调制的在实施例1～3中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子的水溶液30μl、作为包含有机色素的试样的0.5mg/ml的酸性橙7(AO7)60μl、和蒸馏水1.41ml，在40℃下静置3小时，进行了色素的分解反应。作为对照，对不包含氧化铈的纳米粒子的AO7的溶液也进行了同样的处理。取反应后的水溶液100μl并用1.9ml的蒸馏水稀释，测定了吸收光谱。对照的样品在加热前后在吸收光谱中未见变化。
解析使用了作为AO7的极大吸收波长的485nm的吸光度。取对照的吸光度与本实施例11的吸光度之差，算出相对于对照的485nm的吸光度的比例作为分解率。将结果示于表4中。
关于在比较例1中调制的氧化铈的纳米粒子，也在同样的操作和条件下进行色素的分解试验，算出分解率。
由本结果可以确认，如果使用本发明的氧化铈的纳米粒子，则可以以高分解率将色素分解。通过这样的特性，本发明的氧化铈的纳米粒子可以作为氧化剂而使用。
另一方面，对于比较例1的氧化铈的纳米粒子，几乎不能确认到色素的分解。
[表4]
(表4)
(氧化酶活性测定)
TMBZ溶解于90％DMSO水溶液，制作10、5、2.5、1.25、0.625mM的稀释系列。将50mM的柠檬酸缓冲液(pH4)160μl与各浓度的TMBZ溶液20μl混合，加入到96孔板中。向其中加入以成为2mg/ml的方式调制的在实施例1～3中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子的水溶液20μl，立即设置于酶标仪，测定了伴随TMBZ的蓝色显色的652nm的吸光度的经时变化。测定间隔设为30秒，测定期间设为10分钟。
氧化酶活性的计算应用了米-曼式方程。在本氧化酶活性测定中，由于没有纳米二氧化铈的浓度变化因此进行稳定状态近似，求出米-曼常数Km和最大反应速度Vmax。米-曼式方程的解析使用了Lineweaver作图(双倒数作图)。所得的结果之中，将作为显示氧化酶活性的值的最大反应速度Vmax示于表5中。
关于在比较例1中调制的氧化铈的纳米粒子，也在同样的操作和条件下进行氧化酶活性测定，算出最大反应速度Vmax。
由本结果可以确认，本发明的氧化铈的纳米粒子具有高的氧化酶活性。通过这样的特性，本发明的氧化铈的纳米粒子可以作为氧化剂而使用。
另一方面，对于比较例1的氧化铈的纳米粒子，与实施例1～3的氧化铈的纳米粒子相比，氧化酶活性成为低值。
[表5]
(表5)
(过氧化氢酶活性测定)
过氧化氢酶活性使用サーモフィッシャーサイエンティフィック社的Amplex Red过氧化氢酶检测试剂盒(Amplex Red Catalase Assay Kit，A22180)，按照试验方案测定。简单来说，将反应缓冲液50μl、16μg/ml的在实施例1～3中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子25μl、40μM的过氧化氢水溶液25μl混合，静置30分钟，进行了过氧化氢的分解反应。使反应液通过30kD的超滤膜，将流通溶液100μl与工作液50μl混合，在37℃下反应30分钟。将通过反应而生成的试卤灵(Resorufin)以544nm激发，测定了590nm的荧光强度。与通过活性值已知的过氧化氢酶的标准品制作的标准曲线相比，算出氧化铈的纳米粒子的过氧化氢酶活性。将结果示于表6中。
关于在比较例2中调制的氧化铈的纳米粒子，也在同样的操作和条件下进行过氧化氢酶活性测定，算出过氧化氢酶活性。
由本结果可以确认，本发明的氧化铈的纳米粒子具有高的过氧化氢酶活性。通过这样的特性，本发明的氧化铈的纳米粒子可以作为抗氧化剂而使用。
另一方面，对于比较例2的氧化铈的纳米粒子，与实施例1～3的氧化铈的纳米粒子相比，过氧化氢酶活性成为低值。
[表6]
(表6)
(基于自由基清除的色素保持试验)
将1mM的氯化铁(II)水溶液100μl和1mM的过氧化氢水溶液100μl混合，向其中加入以成为0.4mg/ml的方式调制的在实施例1～3中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液10μl，在室温下静置5分钟。相对于该混合液，添加100μМ的亚甲基蓝水溶液90μl，在室温下静置25分钟。作为对照，对不包含氧化铈的纳米粒子的溶液也进行同样的处理。此外，调制出将100μМ亚甲基蓝水溶液90μl与蒸馏水210μl混合而得的基准液。测定了上述溶液的吸收光谱。
解析使用了作为亚甲基蓝的极大吸收波长的664nm的吸光度。算出基准液的吸光度(I0)与对照的吸光度(Ic)之差(ΔI0)、和实施例1～3的吸光度(I)与对照的吸光度(Ic)之差(ΔI)。算出后者(ΔI)相对于前者(ΔI0)的比例作为分解率，设为色素保持率。将结果示于表7中。
关于在比较例1中调制的0.4mg/ml的氧化铈的纳米粒子，也在同样的操作和条件下进行色素保持试验，算出色素保持率。
由本结果可以确认，如果使用本发明的氧化铈的纳米粒子，则可以清除自由基。通过这样的特性，本发明的氧化铈的纳米粒子可以作为抗氧化剂而使用。
另一方面，对于比较例1的氧化铈的纳米粒子，与实施例1～3的氧化铈的纳米粒子相比，色素保持率成为低值。
[表7]
(表7)
(抗霉试验)
使以成为2mg/ml的方式在实施例2中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液通过0.45μm的灭菌过滤器。如图3所示那样，将马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)分割成3份，在其中的1份培养基与另外被分割的培养基的区分区域涂布氧化铈的纳米粒子的溶液，在洁净台内风干30分钟。将绿色木霉(作为属于Trichoderma的公知的突变株的QM9414株(NBRC31329))接种于另一份被分割的培养基并在28℃下培养，评价了霉的培育在本发明的纳米粒子的涂布面是否被抑制。
将结果示于图4中。在培养开始42小时后确认到霉的养成，在311小时后观察到霉的培育在本发明的纳米粒子的涂布面停止了。
由本结果可以确认，本发明的氧化铈的纳米粒子具有抗霉性能。
(病毒灭活试验)
本试验在一般财团法人北里环境科学中心实施。在以成为10mg/ml的方式调制的在实施例2中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液0.9ml中混合病毒液(猫杯状病毒，Feline calicivirus，F-9，ATCC，VR-782，诺如病毒代替品)0.1ml，作用1小时。然后，将PBS作为作用停止液而加入，使对病毒的作用停止。将该溶液作为病毒滴度测定用试样的原液通过TCID50法测定了感染滴度。
将感染滴度相对于使本发明的氧化铈的纳米粒子作用前的感染滴度的的对数减少值示于表8中。
此外，关于在比较例1中调制的氧化铈的纳米粒子的溶液，在同样的操作和条件下进行病毒灭活试验，算出感染滴度的对数减少值，将结果示于表8中。
由本结果可以确认，由于对数减少值为4.0，因此本发明的氧化铈的纳米粒子具有99.99％的抗病毒活性。
另一方面，对于比较例1的氧化铈的纳米粒子，由于对数减少值为-0.4，因此病毒灭活性能成为低值。
[表8]
(表8)
(XAFS观察)
向以成为10mg/ml的方式在实施例2中调制的本发明的氧化铈的纳米粒子的溶液照射X射线，计测其吸收量，从而测定了X射线吸收精细结构(X-ray Absorption FineStructure)光谱。测定条件是，实验设备设为高能加速器研究机构(高エネルギー加速器研究機構)放射光科学研究设备(Photon Factory)BL12C，分光器设为Si(111)2结晶分光器，吸收端设为Ce L3吸收端，检测法设为透射法，检测器设为电离室。
将CeL3端XANES光谱示于图5中。纵轴如下那样设定：通过将光谱的5724.4eV设为吸收端(E0)，将距E0为-150～-30eV的范围的吸收的平均值设为0，将距E0为+150～+400eV的范围的吸收的平均值设为1而取比值。
此外，关于在比较例1中调制的氧化铈的纳米粒子的溶液，也在同样的操作和条件下进行XAFS观察，将所得的CeL3端XANES光谱示于图5中。
由本结果可知，本发明的氧化铈的纳米粒子在作为5726.0～5729.0eV之间的5728.003eV、和作为5735.0～5739.0eV之间的5736.582eV具有极大吸收。
另一方面可知，比较例1的氧化铈的纳米粒子虽然在5725.631eV、5736.582eV具有极大吸收，在5735.0～5739.0eV之间具有极大吸收，但是在5726.0～5729.0eV之间不具有极大吸收。
(参考例1)XAFS观察
使用了不是纳米粒子的氧化铈的结晶、作为铈盐的碳酸铈(III)、硝酸铈(III)、硝酸铈(IV)铵，除此以外，在与在上述实施例1～3中进行的XAFS观察同样的操作和条件下进行XAFS观察，将所得的CeL3端XANES光谱示于图6中。可知氧化铈的结晶在5729.751eV、5736.582eV具有极大吸收，碳酸铈(III)在5725.161eV具有极大吸收，硝酸铈(III)在5725.316eV具有极大吸收，硝酸铈(IV)铵在5725.796eV、5736.105eV具有极大吸收，对于任一公知的铈盐、铈化合物，在5726.0～5729.0eV和5735.0～5739.0eV之间没有极大吸收。
Claims (12)
1.一种氧化铈的纳米粒子，其表面被具有杂环式胺骨架的乙烯基系聚合物或聚酰胺被覆。
2.根据权利要求1所述的氧化铈的纳米粒子，所述杂环式胺骨架由哌嗪、吡啶、咪唑和咔唑中的任一者构成。
3.根据权利要求1所述的氧化铈的纳米粒子，所述乙烯基系聚合物为侧链具有所述杂环式胺骨架的聚合物。
4.根据权利要求1所述的氧化铈的纳米粒子，所述聚酰胺为主链具有所述杂环式胺骨架的聚合物。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的氧化铈的纳米粒子，其通过X射线吸收精细结构光谱测定而获得的Ce L3端XANES光谱在5726.0～5729.0eV和5735.0～5739.0eV之间具有极大吸收。
6.一种核酸的分解方法，其中，使包含核酸的试样与权利要求1～5中任一项所述的氧化铈的纳米粒子接触。
7.一种多肽的分解方法，其中，使包含多肽的试样与权利要求1～5中任一项所述的氧化铈的纳米粒子接触。
8.一种氧化铈的纳米粒子的制造方法，是其表面被聚合物被覆了的氧化铈的纳米粒子的制造方法，其包含下述工序：
工序a：将具有杂环式胺骨架的聚合物的溶液、与包含铈(III)离子的溶液或铈(III)盐混合，从而获得混合溶液的工序；以及
工序b：向工序a中获得的混合溶液中添加氧化剂的工序。
9.一种氧化剂，其包含权利要求1～5中任一项所述的氧化铈的纳米粒子。
10.一种抗氧化剂，其包含权利要求1～5中任一项所述的氧化铈的纳米粒子。
11.一种抗霉剂，其包含权利要求1～5中任一项所述的氧化铈的纳米粒子。
12.一种抗病毒剂，其包含权利要求1～5中任一项所述的氧化铈的纳米粒子。
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