RU2799427C1 - Способ устранения контаминации помещений нуклеиновыми кислотами путем окислительной деструкции примесных соединений на поверхности материалов с фотоактивным покрытием - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к разработке методов борьбы с нежелательной контаминацией лабораторных помещений примесными нуклеиновыми кислотами. Предложен способ устранения контаминации помещений примесными нуклеиновыми кислотами и их фрагментами, включающий покрытие доступных поверхностей раствором. Проводят функционализацию поверхности материалов коллоидным раствором, содержащим полярный органический растворитель, этилсиликат, фотоактивный компонент, неорганическую кислоту и воду. Фотоактивный компонент представляет собой нанокристаллический диоксид титана или нанокристаллический диоксида титана, содержащий примесь азота или примеси азота, железа и меди. После испарения растворителя формируется фотоактивное кремний-титановое оксидное покрытие, прочно закрепленное на внешней поверхности пористых и непористых материалов. Покрытие обладает эффектом самоочистки под действием солнечного света и света комнатных источников освещения и обеспечивает окислительную деструкцию нуклеиновых кислот и их фрагментов до продуктов, для которых не обнаруживается сигнал при проведении ПЦР-анализа. 4 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 24 пр.

Description

Изобретение относится к области разработки методов борьбы с нежелательной контаминацией лабораторных помещений примесными нуклеиновыми кислотами (НК) и их фрагментами, которые могут приводить к возникновению ложноположительных результатов при проведении исследований с использованием высокочувствительных методов, в первую очередь, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и высокопроизводительного секвенирования.

Развитие современных методов детекции и анализа структуры нуклеиновых кислот достигло высокого уровня чувствительности, при котором могут быть выявлены и изучены даже единичные молекулы. Методы амплификации нуклеиновых кислот позволяют в течение пару часов наработать из нескольких молекул ДНК или РНК 10⁹-10¹² их копий. Методы генной инженерии демонстрируют необходимость повышенной чистоты при создании рекомбинантных молекул ДНК, так как свободно циркулирующая ДНК в окружающем пространстве способна стать матрицей или субстратом для ферментативных реакций. Активное развитие методов высокопроизводительного секвенирования нуклеиновых кислот, с одной стороны, обеспечило прорыв в изучении полных геномов организмов, в том числе человека, и уже достигло уровня чувствительности единичных клеток, с другой - продемонстрировало необходимость защиты от загрязнения примесными нуклеиновыми кислотами для обеспечения достоверного результата проводимых исследований (M. Thoendel, P. Jeraldo, K. E. Greenwood-Quaintance, J. Yao, N. Chia, A. D. Hanssen, M. P. Abdel, R. Patel, Impact of Contaminating DNA in Whole-Genome Amplification Kits Used for Metagenomic Shotgun Sequencing for Infection Diagnosis, Journal of Clinical Microbiology. 55 (2017) 1789-1801). Значительной проблемой для диагностических и исследовательских лабораторий, использующих в работе метод ПЦР, является перекрестная контаминация (кросс-контаминация), в результате которой наработанный фрагмент ДНК может повлиять на результат последующих экспериментов за счет попадания в реакционные смеси, что в итоге может приводить к появлению дополнительных сигналов и риску получения ложноположительных результатов лабораторного исследования. Контаминация геномной ДНК помещений, поверхностей и растворов также затрудняет этапы производства лекарственных форм белков и вирусных препаратов, так как одним из параметров для обязательной оценки качества является уровень остаточной ДНК клеток-продуцентов (M. André, S. Reghin, E. Boussard, L. Lempereur, S. Maisonneuve, Universal real-time PCR assay for quantitation and size evaluation of residual cell DNA in human viral vaccines, Biologicals. 44 (2016) 139-49).

Известно несколько способов устранения ДНК(РНК)-контаминации поверхности материалов и помещений, которые основаны на принципах деструкции, модификации, денатурации и изоляции нуклеиновых кислот (M. Nilsson, H. De Maeyer; M. Allen, Evaluation of Different Cleaning Strategies for Removal of Contaminating DNA Molecules, Genes. 13, 162 (2022) 1-9). Как правило, эффективнее всего оказывается механизм деструкции, так как он приводит к разрушению молекулярной структуры нуклеиновой кислоты на короткие фрагменты без возможности восстановления их матричных свойств и участия в ферментативных реакциях.

Одним из простых способов снижения содержания примесных нуклеиновых кислот, свободно циркулирующих в помещении, является периодическое облучение пространства с использованием жесткого УФ-излучения с длиной волны 254 нм. Такой тип излучения приводит к возникновению пиримидиновых димеров в молекулах нуклеиновых кислот, которые препятствуют продвижению ДНК-полимераз по матрицам РНК или ДНК (R.P. Rastogi, Richa, A. Kumar, M.B. Tyagi, R.P. Sinha, Molecular mechanisms of ultraviolet radiation-induced DNA damage and repair, Journal of Nucleic Acids. 16 (2010) 592980). Основным недостатком этого способа является необходимость использования специальных источников освещения, способных генерировать УФ-излучение с длиной волны 254 нм. Другим недостатком является негативное влияние жесткого УФ-излучения на здоровье человека, так как оно вызывает поражение кожи и органов зрения, что требует соблюдения специальных процедур его использования. УФ-излучение с длиной волны 254 нм приводит к образованию озона из кислорода воздуха, который также опасен для здоровья человека. Еще одним недостатком является то, что под действием излучения данного типа наблюдается быстрая деградация полимерных материалов и ухудшение эксплуатационных характеристик изделий, изготовленных из них.

Простым способом удаления нуклеиновых кислот с поверхности материалов является их обработка концентрированными водными растворами органических спиртов - этилового или изопропилового (M.-L. Kampmann, C. Børsting, N. Morling, Decrease DNA contamination in the laboratories, Forensic Science International: Genetics Supplement Series, 6 (2017) 577-578). Механизм действия данного способа основан на денатурации нуклеиновых кислот и их смыве с поверхности материалов. Основным недостатком данного способа является его низкая эффективность из-за того, что большое количество молекул нуклеиновых кислот оказывается закрепленным на поверхности материалов и не смывается указанными составами, оставаясь в исходном состоянии.

Другим способом удаления нуклеиновых кислот с поверхности материалов является их обработка водным раствором ПАВ, преимущественно неионогенного типа, который дополнительно содержит активный компонент, способствующий деструкции молекул нуклеиновой кислоты. Механизм действия таких составов включает обволакивание молекул нуклеиновой кислоты молекулами ПАВ с последующим их разрушением активным компонентом. Например, специальный состав DNA Remover® PCR Clean™ от компании Minerva Biolabs GmbH (Берлин, Германия, https://minerva-biolabs.com/de/dna-dekontaminationsreagenzien/pcr-clean) содержит очищенную воду с добавлением этоксилированных спиртов (< 0,2%) и фосфорной кислоты (< 2%). В данном случае этоксилированные спирты выступают в качестве неионогенного ПАВ, а активным компонентом, обеспечивающим кислотный гидролиз эфирных связей, является ортофосфорная кислота. Основным недостатком данного способа является низкая скорость деструкции молекул нуклеиновых кислот, что приводит к низкой эффективности данного способа для снижения контаминации, особенно на поверхности пористых материалов (M. Nilsson, H. De Maeyer; M. Allen, Evaluation of Different Cleaning Strategies for Removal of Contaminating DNA Molecules, Genes. 13, 162 (2022) 1-9). Недостатком также является необходимость периодического повторения процедуры нанесения состава для обеспечения перманентного снижения уровня загрязненности.

Описан способ инактивации нуклеотидных последовательностей за счет использования растворов хелатных комплексов металлов в сочетании с окислительным и восстановительным агентами (US 585865, C12Q1/68, 12.01.1999) для разрушения структуры нуклеиновых кислот и препятствия их участия в полимеразной или лигазной цепных реакциях. В качестве хелатных комплексов предложены комплексы производных пиридина или фенантролина с переходными металлами, включающими никель, медь, железо, цинк, рутений, родий, кобальт. Окислительным агентом, в основном, является перекись водорода в виде разбавленного водного раствора, которая активно разлагается при взаимодействии с комплексами переходных металлов с образованием высоко реакционноспособных радикалов, обеспечивающих разрушение молекулярной структуры нуклеиновых кислот и способствующих нарушению их матричных свойств в цепных реакциях. Основным недостатком указанного способа является необходимость последовательной обработки поверхности материалов двумя растворами, один из которых содержит хелатные комплексы металлов, а второй - окислительный и восстановительный агенты, с последующей выдержкой в смоченном состоянии в течение достаточно длительного периода времени (до одного часа) для протекания процессов окислительной деструкции нуклеиновых кислот. Недостатком также является необходимость использования в некоторых случаях дополнительных стабилизирующих добавок, например, дитиотреитола.

Одним из эффективных методом борьбы с ДНК(РНК)-контаминацией в помещениях лабораторий является обработка пола, рабочих поверхностей и посуды раствором высоко реакционноспособного химического агента, например, хлорной извести или перекиси водорода с концентрацией до 30% (US 2007/0289605 A1, A61L 2/00, 20.12.2007). Указанные агенты являются сильными окислителями и обеспечивают деструкцию не только нуклеиновых кислот, но и других биополимеров и органических соединений. Главным недостатком данного метода является необходимость использования едких и агрессивных веществ, которые опасны для здоровья человека, так как приводят к поражениям кожи, слизистых оболочек органов дыхания и зрения, что требует применения средств индивидуальной защиты. Указанные вещества вызывают коррозию металлов, а также могут обесцвечивать окрашенные материалы, что требует аккуратности при их использовании и ограничивает область применения.

Наиболее близким к представленному изобретению является способ для снижения контаминации нуклеиновыми кислотами с использованием катионных композиций (US 2010/0216680 A1, С11В 3/37, 26.08.2010). Принцип описанного в изобретении способа заключается в связывании отрицательно заряженных нуклеиновых кислот положительно заряженными соединениями в диапазоне молекулярной массы от 500 Да до 500 кДа, в число которых входят поликатионные гомопептиды (например, поли-L-лизин), катионные полисахариды, аминосахар хитозан (производное линейного полисахарида, макромолекулы которого состоят из случайно связанных β-(1-4) D-глюкозаминовых звеньев и N-ацетил-D-глюкозамин). Молекулярным механизмом действия указанного прототипа является нарушение межмолекулярного взаимодействия нуклеиновой кислоты с другими кислотами, а также с белками, и, как следствие, нарушение субстратных свойств, необходимых для проявления контаминации в ферментативных реакциях. Предложенные оставы для данного способа не вызывают коррозию металлов и безопасны для человека. Главным недостатком прототипа является необходимость периодического повторения процедуры нанесения состава для обеспечения перманентного снижения уровня загрязненности поверхностей нуклеиновыми кислотами в помещениях лабораторий.

Заявляемое изобретение ставит своей задачей обеспечить перманентное снижение уровня загрязненности пространства лабораторий нуклеиновыми кислотами без необходимости проведения периодических обработок.

Технический результат заключается в формировании на внешней поверхности пористых и непористых материалов, использующихся в лабораториях в качестве элементов отделки, предметов интерьера и других изделий, достаточно прочно закрепленного фотоактивного кремний-титанового оксидного покрытия, обладающего эффектом самоочистки под действием солнечного света и света комнатных источников освещения и обеспечивающего окислительную деструкцию нуклеиновых кислот и их фрагментов до продуктов, для которых не обнаруживается сигнал при проведении ПЦР-анализа, что приводит к устранению контаминации помещений нуклеиновыми кислотами.

Сущность изобретения заключается в функционализации элементов отделки, предметов интерьера, а также других пористых и непористых материалов, присутствующих в лаборатории, коллоидным раствором с фотокаталитически активным компонентом - нанокристаллическим диоксидом титана или нанокристаллическим диоксид титана, содержащим примесь азота, или примеси азота, железа и меди, путем нанесения и формирования фотоактивного покрытия на поверхности материалов, которое под действием солнечного света и света комнатных источников освещения осуществляет окислительную деструкцию химических веществ и биомакромолекул, в том числе нуклеиновых кислот, обеспечивая тем самым очистку поверхностей и окружающего пространства на молекулярном уровне и препятствуя контаминации. Это приводит к перманентному снижению уровня загрязненности поверхностей и пространства помещений нуклеиновыми кислотами.

Спектральные характеристики применяемых фотокатализаторов, фотографии получаемых материалов с нанесенным фотопокрытием, данные о влиянии состава композиции на их фотокаталитическую активность и возможность устранения контаминации нуклеиновыми кислотами и их фрагментами представлены на фиг. 1-12.

Фиг. 1. Спектры диффузного отражения, иллюстрирующие области поглощения диоксида титана и диоксида титана, содержащего примеси азота.

Фиг. 2. Фотографии разных материалов с нанесенным фотопокрытием.

Фиг. 3. Влияние типа кислоты и отмывки водой на активность фотопокрытия.

Фиг. 4. Влияние содержания кремнийорганического связующего в растворе на активность фотопокрытия.

Фиг. 5. Зависимость активности покрытия на поверхности стекла от концентрации фотокатализатора в композиции.

Фиг. 6. Зависимость активности покрытия на поверхности стеклоткани от концентрации фотокатализатора в композиции.

Фиг. 7. Деструкция ДНК на поверхности тканевого материала с фотопокрытием под действием излучения УФ-А диапазона.

Фиг. 8. Иллюстрация разрушения ДНК-фрагментов разной длины на поверхности тканевого материала с фотопокрытием при облучении видимым светом.

Фиг. 9. Иллюстрация разрушения ДНК-фрагментов разной длины на поверхности тканевого материала с фотопокрытием под действием излучения УФ-А диапазона.

Фиг. 10. Иллюстрация разрушения ДНК-фрагментов разной длины на поверхности стекла с фотопокрытием под действием излучения УФ-А диапазона.

Фиг. 11. Иллюстрация удаления разных РНК с поверхности материалов с фотопокрытием под действием излучения УФ-А диапазона.

Фиг. 12. Иллюстрация удаления РНК биологических объектов на примере вируса гриппа.

Для нанесения покрытия используют специальный состав на основе полярного органического растворителя с добавками фотокатализатора, кремнийорганического связующего, неорганической кислоты и очищенной воды.

В качестве полярного органического растворителя, который позволяет получать стабильную дисперсию с гомогенным распределением частиц фотокатализатора по всему объёму, преимущественно используют изопропиловый спирт, этиловый спирт или этилацетата.

В качестве фотокатализатора используют нанокристаллический диоксид титана в анатазной модификации с удельной поверхностью более 50 м²/г или кристаллический диоксид титана в анатазной модификации, содержащий примеси азота для возможности поглощения видимого света и примеси железа и меди для улучшения разделения фотогенерированных зарядов. Синтез фотокатализатора осуществляют с использованием описанной методики (N. Kovalevskiy, D. Selishchev, D. Svintsitskiy, S. Selishcheva, A. Berezin, D. Kozlov, Synergistic Effect of Polychromatic Radiation on Visible Light Activity of N-Doped TiO ₂ Photocatalyst, Catalysis Communications 134 (2020) 105841), позволяющей получать диоксид титана, допированный азотом, который способен поглощать не только УФ-излучение, но и видимый свет, что расширяет спектр его действия. Спектры диффузного отражения, иллюстрирующие наличие поглощения в видимой области спектра для диоксида титана, содержащего примеси азота, по сравнению с обычным диоксидом титана, представлены на Фиг. 1. Содержание примесей азота в диоксиде титана может достигать 1 мас. %. После синтеза фотокатализатор измельчают в вибрационной мельнице до достижения коллоидного состояния. Для улучшения разделения фотогенерированных носителей зарядов и повышения активности фотокатализатора осуществляют его поверхностную модификацию соединениями железа и меди. В качестве соединений железа и меди используют их водорастворимые соли, которые добавляют в состав в количестве преимущественно до 1 мас. % по отношению к диоксиду титана.

В качестве кремнийорганического связующего используют этилсиликат, который представляет собой смесь тетраэтоксисилана и частично гидролизованных олигоэтоксисилоксанов. Общее содержание кремния в этилсиликате в пересчете на SiO₂ составляет 32-40 мас. %.

В качестве неорганической кислоты преимущественно используют серную, азотную или соляную кислоту.

Объемное соотношение этилсиликата и органического растворителя в предлагаемой композиции составляет не менее 1:19, но не более 1:1, при этом объемная доля кислоты находится в диапазоне 0,1-10 %, а доля воды - в интервале от 5 до 25 %. Концентрация фотокатализатора преимущественно составляет 1-150 г/л. Перед использованием состав интенсивно перемешивают для равномерного распределения частиц фотокатализатора по всему объему.

В качестве основы для нанесения фотопокрытия используют поверхность пористых и непористых материалов, изготовленных из текстильных тканей, стеклоткани, стекла и пластика, а также элементов отделки, преимущественно окрашенных поверхностей. Перед нанесением поверхность материалов очищают от видимых загрязнений, протирают бумажным полотенцем или тканевой салфеткой, смоченными в этиловом или изопропиловом спирте, и дожидаются полного испарения спирта. Подготовленный коллоидный раствор с фотоактивным компонентом наносят на поверхность тонким слоем кистью, валиком или губкой или распыляют с помощью аэрографа, пульверизатора или краскопульта. После полного испарения растворителя покрытие выдерживают при комнатной температуре ещё в течение одного часа и далее протирают его тканевой салфеткой, смоченной в очищенной воде, для удаления плохо закрепившихся частиц и окончательно вытирают бумажным полотенцем. Фотографии покрытий на поверхности разных материалов представлены на Фиг. 2.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

В примерах в качестве материалов для нанесения фотоактивного покрытия используют стекло, стеклоткань и хлопковую ткань, образцы которых представляют кусочки определенного размера. Образцы из стекла представляют собой покровные стекла размером 2,4 × 2,4 см (площадь 5,76 см²). В качестве стеклотканевой основы используют стеклоткань ПП-300-1 (AO "Valmieras stikla skiedra", ТУ 4854-001-63453197-2009) с поверхностной плотностью 420 г/м², из которой вырезают кусочки 5 × 5 см (площадь 25 см²). В качестве тканевой основы используют 100 % хлопковую ткань «Премьер-Cotton-350» с поверхностной плотностью 350 г/м² (арт. 10409, ГК «Чайковский текстиль»), смешанную хлопкополиэфирную ткань «Панацея-Cotton rich-150» (60 % хлопок, 40 % полиэстр) с поверхностной плотностью 155 г/м² (арт. 18012, ГК «Чайковский текстиль»). Перед нанесением фотопокрытия покровные стекла протирают изопропиловым спиртом и высушивают на воздухе. В случае тканевых материалов используют отмывку путем полоскания в большом количестве изопропилового спирта с последующей сушкой в сушильном шкафу при температуре 60-80°С в течение 2 часов.

В качестве полярного органического растворителя используют изопропиловый спирт (C₃H₈O, ОСЧ, 99,8 %, АО «ЭКОС-1»), этиловый спирт (C₂H₅OH, > 99,9 %, J.T. Baker) или этилацетат (C₄H₈O₂, ХЧ, 99.7 %, АО «База №1 Химреактивов»).

В качестве кислоты используют концентрированную кислоту: серную (H₂SO₄, ОСЧ, ООО «СИГМАТЕК»), соляную (HCl, ОСЧ, ООО «АО РЕАХИМ»), азотную (HNO₃, ХЧ, 65 %, ООО «ТК АНТ»), ортофосфорную (H₃PO₄, ЧДА, ОАО «ТК СПЕКТР-ХИМ») или уксусную (CH₃COOH, ХЧ, АО «База №1 Химреактивов»).

В качестве фотокатализатора используют нанокристаллический диоксид титана TiO₂ Hombikat UV100 (Sachtleben Chemie GmbH), являющийся 100% анатазом с удельной поверхностью 350 м²/г и размером кристаллитов 10-15 нм, или кристаллический диоксид титана анатазной модификации со средним размером кристаллитов 18-20 нм, содержащий примеси азота (TiO₂-N), который синтезируют по методике, описанной в работе (N. Kovalevskiy, D. Selishchev, D. Svintsitskiy, S. Selishcheva, A. Berezin, D. Kozlov, Synergistic effect of polychromatic radiation on visible light activity of N-doped TiO ₂ photocatalyst, Catal. Commun. 134 (2020) 105841), путём осаждения TiO₂ из водного раствора сульфата титанила водным раствором аммиака с последующим прокаливанием при температуре 400-450 °С и измельчают в вибрационной мельнице MM500 (Retsch) до наноразмерного состояния. По данным элементного анализа содержание примесей азота в синтезированном фотокатализаторе TiO₂-N находится в диапазоне 0,36-0,40 мас. %.

В качестве кремнийорганического связующего используют «Этилсиликат-32» (ПАО «Химпром»), представляющий собой смесь, содержащую тетраэтоксисилан и олигоэтоксисилоксаны с общей формулой Si_mO_m-1(OC₂H₅)_2m+2, где m = 4-7.

Для нанесения фотоактивного покрытия готовят смесь этилсиликата и изопропилового спирта в соотношении от 1:19 до 1:1 по объему добавляют к ней кислоту и воду в количестве 0,1-10 и 5-25 об. % соответственно. Далее смесь интенсивно перемешивают и добавляют подготовленный фотокатализатор в количестве 1-150 г/л. Полученную суспензию обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 10 минут, а затем еще перемешивают в течение 10-12 часов. Полученный состав наносят тонким слоем на поверхность подготовленного материала с помощью кисти, валика, аэрографа или путем пропитки. После полного испарения растворителя полученный образец выдерживают при комнатной температуре в течение еще одного часа, далее промывают водой или протирают тканевой салфеткой, смоченной водой, для удаления плохо закрепившихся частиц фотокатализатора с поверхности и вновь высушивают.

Пример 1

К 0,750 г диоксида титана TiO₂ Hombikat UV 100 добавляют 0,750 мл этилсиликата, 1,4 мл дистиллированной воды, 0,1 мл концентрированной серной кислоты и 12,75 мл изопропилового спирта. Состав обрабатывают ультразвуком, а затем еще перемешивают в течение 10-12 часов. Концентрация фотокатализатора в приготовленной дисперсии составляет 50 г/л, а количество связующего - 5 об. %.

Далее 100 мкл состава наносят тонким слоем на поверхность покровного стекла и высушивают при комнатной температуре.

Образец помечают как С-50Т-5Э-Се.

Пример 2

Аналогичен примеру 1 с тем исключением, что полученное покрытие дополнительно промывают дистиллированной водой в течение 10 секунд и сушат при 80°С в течение 1 часа.

Образец помечают как С-50Т-5Э-Се-О.

Пример 3

Аналогичен примеру 1 с тем исключением, что в состав добавляют соляную кислоту в количестве 100 мкл.

Образец помечают как С-50Т-5Э-Со.

Пример 4

Аналогичен примеру 3 с тем исключением, что полученное покрытие дополнительно промывают дистиллированной водой в течение 10 секунд и сушат при 80°С в течение 1 часа.

Образец помечают как С-50Т-5Э-Со-О.

Пример 5

Аналогичен примеру 1 с тем исключением, что в состав добавляют концентрированную азотную кислоту в количестве 100 мкл.

Образец помечают как С-50Т-5Э-А.

Пример 6

Аналогичен примеру 5 с тем исключением, что полученное покрытие дополнительно промывают дистиллированной водой в течение 10 секунд и сушат при 80°С в течение 1 часа.

Образец помечают как С-50Т-5Э-А-О.

Пример 7 (сравнительный)

Аналогичен примеру 1 с тем исключением, что в состав добавляют фосфорную кислоту в количестве 100 мкл.

Образец помечают как С-50Т-5Э-Ф.

Пример 8 (сравнительный)

Аналогичен примеру 1 с тем исключением, что в состав добавляют ледяную уксусную кислоту в количестве 100 мкл.

Образец помечают как С-50Т-5Э-У.

Пример 9

К 0,750 г диоксида титана TiO₂ Hombikat UV 100 добавляют 1,4 мл дистиллированной воды, 0,1 мл концентрированной азотной кислоты, этиловый спирт и этилсиликат. Количество этилсиликата составляет 0,75; 1,5; 3; 4,5; 7,5 и 9 мл для достижения объемной доли связующего в приготовленной дисперсии 5; 10; 20; 30; 50 и 60% соответственно. Этиловый спирт добавляют до общего объема жидкости 15 мл. Концентрация диоксида титана составляет 50 г/л.

Полученный состав наносят тонким слоем на поверхность покровного стекла с помощью пневматического аэрографа (FPS-20, «Hammer Werkzeug GmbH», Германия) и высушивают при комнатной температуре.

Образцы помечают как С-50Т-хЭ, где x - объемная доля этилсиликата.

Пример 10

К навеске диоксида титана TiO₂ Hombikat UV 100 добавляют 1,5 мл этилсиликата; 1,4 мл дистиллированной воды; 0,1 мл концентрированной азотной кислоты и 12 мл этилацетата. Масса фотокатализатора составляет 0; 0,015; 0,15; 0,45; 0,75; 1,05; 1,5 и 2,25 г, что соответствует его концентрации 0; 1; 10; 30; 50; 70; 100 и 150 г/л в подготовленной смеси. Количество связующего составляет 10 об. %.

Далее 100 мкл состава наносят тонким слоем на поверхность покровного стекла и высушивают при комнатной температуре.

Образцы помечают как С-хТ-10Э, где x - концентрация диоксида титана (г/л).

Пример 11

Аналогичен примеру 10 с тем исключением, что в качестве кислоты используют концентрированную серную кислоту, а в качестве растворителя - изопропиловый спирт. Покрытие наносят на поверхность стеклоткани методом пропитки. После испарения растворителя кусочки ткани выдерживают при комнатной температуре в течение часа. Далее образцы прополаскивают в дистиллированной воде и сушат при 80°С в течение 1 часа.

Образцы помечают как СТ-хТ-10Э, где x - концентрация диоксида титана (г/л).

Пример 12

Аналогичен примеру 11 с тем исключением, что при приготовлении состава вместо TiO₂ Hombikat UV100 используют синтезированный нанокристаллический диоксид титана, содержащий примеси азота (TiO₂-N), который способен поглощать излучение в видимом диапазоне спектра (Фиг. 1).

При осаждении диоксида титана из водного раствора сульфата титанила водным раствором аммиака с последующим прокаливанием на воздухе получается TiO₂, содержащий примеси азота (TiO₂-N), которые обеспечивают поглощение в видимой области спектра. При этом условия синтеза (pH осаждения, время старения, температура прокаливания) влияют на содержание азота в структуре TiO₂, которое может достигать 1 мас. %. Для примеров был выбран фотокатализатор с содержанием азота 0,36-0,40 мас. %, так как он проявляет большую активностью под действием видимого света по сравнению с фотокатализаторами с другим содержанием азота, которые были синтезированы при других условиях.

Пример 13

Готовят состав с концентрацией фотокатализатора 100 г/л и количеством связующего 30 об. %. Для этого к 6 г диоксида титана TiO₂ Hombikat UV 100 добавляют 36 мл изопропилового спирта, 400 мкл концентрированной азотной кислоты, 5,6 мл дистиллированной воды и 18 мл этилсиликата.

Покрытие наносят на поверхность кусочков стеклоткани методом пропитки. После испарения растворителя кусочки ткани выдерживают при комнатной температуре в течение часа.

Образец помечают как СТ-100Т-30Э.

Пример 14

Аналогичен примеру 13 с тем исключением, что образец стеклоткани с фотопокрытием дополнительно прополаскивают в дистиллированной воде и сушат при 80°С в течение 1 часа.

Образец помечают как СТ-100Т-30Э-О.

Пример 15

Аналогичен примеру 13 с тем исключением, что вместо стеклоткани используют смешанную хлопкополиэфирную ткань «Панацея-Cotton rich-150».

Образец помечают как Т-100Т-30Э.

Пример 16

Аналогичен примеру 15 с тем исключением, что образец ткани с фотопокрытием дополнительно прополаскивают в дистиллированной воде и сушат при 80 °С в течение 1 часа.

Образец помечают как Т-100Т-30Э-О.

Пример 17

Аналогичен примеру 16 с тем исключением, что при приготовлении состава вместо TiO₂ Hombikat UV100 используют синтезированный нанокристаллический диоксид титана, содержащий примеси азота (TiO₂-N).

Образец помечают как Т-100TN-30Э-О.

Пример 18

Аналогичен примеру 17 с тем исключением, что в состав дополнительно добавляют навеску нонагидрата нитрата железа (III) (Fe(NO₃)₃9H₂O) в количестве, соответствующем 0,1 % Fe от массы добавленного диоксида титана, и тригидрата нитрата меди (II) (Cu(NO₃)₂3H₂O в количестве, соответствующем 0,5 % Cu от массы добавленного диоксида титана.

В диапазоне содержаний до 1 мас. % поверхностное модифицирование фотокатализатора TiO₂-N железом приводит к увеличению его активности под действием видимого света. При этом активность имеет экстремальную зависимость от содержания железа с максимумом при значении 0,1 мас. %. С целью демонстрации наибольшего эффекта для данного примера было выбрано значение содержания железа, соответствующее максимуму активности (т.е., 0,1 мас. %).

В диапазоне содержаний до 1 мас. % поверхностное модифицирование фотокатализатора TiO₂-N медью приводит к увеличение его активности под действием видимого света. При этом активность имеет экстремальную зависимость от содержания меди с максимумом при значении 0,5 мас. %. С целью демонстрации наибольшего эффекта для данного примера было выбрано значение содержания меди, соответствующее максимуму активности (т.е. 0,5 мас. %).

Образец помечают как Т-100TNFC-30Э-О.

Пример 19 (сравнительный)

Аналогичен примеру 16 с тем исключением, что в состав не добавляют фотокатализатор.

Образец помечают как Т-0TN-30Э-О.

Для иллюстрации способности получаемых материалов к фотокаталической деструкции химических веществ под действием ультрафиолетового или видимого излучения проводят испытание их фотокаталитической активности в тестовой реакции окисления паров ацетона. Испытания проводят в проточно-циркуляционной установке «ИСОФА» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ 2015660118, ИСОФА/ Козлов Д.В., Селищев Д.С., Коровин Е.Ю, 20.10.2015) при температуре 40°С и значении объемной скорости потока 65±1 см³/мин. Источником излучения УФ-А диапазона является 10 Вт светодиод с оптической мощностью в диапазоне длин волн 320-400 нм, равной 9,7 мВт/см². Источником видимого света является 100 Вт светодиод с оптической мощностью в диапазоне длин волн 400-500 нм, равной 160 мВт/см².

Концентрацию реагентов и продуктов анализируют по изменению площадей полос поглощения, соответствующих определенному веществу, на ИК спектрах, записанных с помощью ИК-Фурье спектрометра ФТ-801 (ООО НПФ «Симэкс», Россия), оснащённого длиннопроходной кюветой (Infrared Analysis, США) с длиной оптического пути, равной 2,4 м. Концентрация ацетона в конечной реакционной смеси составляет 15-25 мкмоль/л. Мерой фотокаталитической активности материалов является скорость образования CO₂ при окислении ацетона, которую рассчитывают по следующей формуле:

, где:

- разность концентраций СО₂ в конечной и исходной реакционных смесях (мкмоль/л), U - объемная скорость (л/мин).

Результаты испытаний по определению фотокаталитической активности полученных материалов, а также данные об устойчивости нанесенного фотопокрытия к смыву под струей воды представлены в таблице 1.

Таблица 1
№ примера	Наименование образца	Устойчивость к смыву	Фотокаталитическая активность, мкмоль/мин
			УФ-излучение	Видимый свет
1	С-50Т-5Э-Се	Да	0,32	--
2	С-50Т-5Э-Се-О	Да	1,66	--
3	С-50Т-5Э-Со	Да	0,85	--
4	С-50Т-5Э-Со-О	Да	1,37	--
5	С-50Т-5Э-А	Да	0,99	--
6	С-50Т-5Э-А-О	Да	1,27	--
7	С-50Т-5Э-Ф	Нет	0,12	--
8	С-50Т-5Э-У	Нет	0,40	--
9	С-50Т-хЭ	Да	0-0,18	--
10	С-хТ-10Э	Да	0 - 1,29	--
11	СТ-хТ-10Э	Да	0 -1,23	--
12	СТ-xTN-10Э	Да	0 -1,11	0 - 0,36
13	СТ-100Т-30Э	Да	0,90	--
14	СТ-100Т-30Э-О	Да	1,40	--
15	Т-100Т-30Э	Да	1,73	--
16	Т-100Т-30Э-О	Да	2,23	--
17	Т-100TN-30Э-О	Да	1,54	0,47
18	Т-100TNFC-30Э-О	Да	1,64	0,79
19	Т-0TN-30Э-О	Да	0	0

Согласно данным испытаний все материалы с фотопокрытием, нанесенным с использованием предлагаемого состава коллоидного раствора, обладают фотокаталитической активностью и способны под действием света осуществлять полное окисление паров ацетона до углекислого газа и воды, что подтверждает возможность очистки на молекулярном уровне. Материалы, полученные с использованием нанокристаллического диоксида титана анатазной модификации TiO₂ Hombikat UV100 (примеры 1-11, 13-16) проявляют активность под действием ультрафиолетового излучения ближнего диапазона (УФ-А). Излучение УФ-А входит в состав солнечного света и не оказывает сильного негативного влияния на человека. Таким образом, материалы, полученные с использованием предложенной композиции, будут активны как под действием солнечного света, так и под действием излучения комнатных люминесцентных источников освещения, в спектрах излучения которых присутствуют полосы с длиной волны меньше 400 нм. В тоже время материалы, полученные с использованием нанокристаллического диоксида титана, содержащего примеси азота (примеры 12, 17 и 18), проявляют активность как под действием УФ-излучения, так и под действием видимого света, что соответствует большей эффективности преобразования солнечного света и возможности использования комнатных светодиодных источников освещения.

Примеры 1-8 иллюстрируют то, что для формирования устойчивого фотопокрытия на поверхности материалов с использованием коллоидного раствора с предлагаемой композицией необходимо наличие в ее составе сильных кислот, таких как азотная, серная и соляная (примеры 1-6), поскольку для гидролиза кремнийорганического связующего и надежной фиксации частиц фотокатализатора на поверхности материала необходимо присутствие достаточного количества протонов в растворе. В случае средних и слабых кислот, таких как фосфорная или уксусная кислоты (примеры 7-8), не удается получить устойчивое покрытие, которое не будет смываться с поверхности материала струей воды. Помимо влияния на устойчивость получаемого покрытия, тип добавляемой кислоты также влияет и на его активность (Таблица 1, Фиг. 3).

Сравнение примеров 1 и 2, 3 и 4, 5 и 6 показывает, что дополнительная обработка покрытия водой не только позволяет удалить незакрепленные частицы фотокатализатора, но и способствует повышению фотоактивности покрытия за счёт удаления кислотных групп с его поверхности, которые остаются после нанесения и выступают в роли центров рекомбинации фотогенерированных носителей зарядов, обеспечивая снижение активности. Влияние отмывки для каждого типа кислоты наглядно показано на Фиг 3. Предпочтительными являются азотная и серная кислоты, но также возможно использование соляной кислоты.

Пример 9 иллюстрирует влияние содержания кремнийорганического связующего в растворе на активность получаемого покрытия. При низком содержании связующего наблюдается низкая устойчивость покрытия к потере фотокатализатора при трении или при обработке водой. Увеличение содержания этилсиликата приводит к закреплению большего количества фотокатализатора и постепенному увеличению активности (Фиг. 4). С другой стороны, при большом содержании этилсиликата происходит экранирование фотокатализатора, что снижает активность фотопокрытия вплоть до 0. Таким образом, объемное соотношение этилсиликата и органического растворителя в предлагаемой композиции составляет не менее 1:19, но не более 1:1.

Примеры 10 и 11 иллюстрируют то, что увеличение концентрации диоксида титана в составе приводит к увеличению активности покрытия. Тип материала, на поверхность которого наносится покрытие, влияет на значение оптимальной концентрации фотокатализатора. На Фиг. 5 показано, что для примера 10 при увеличении концентрации фотокатализатора до 30 г/л наблюдается рост активности покрытия на поверхности непористого материала (т.е., стекла), но дальнейшее увеличение концентрации до 150 г/л слабо влияет на активность покрытия. Это обусловлено ограничением количества закрепляемого фотокатализатора на единице поверхности стекла, которое будет доступно для освещения. На Фиг. 6 показано, что в случае стеклоткани (пример 11) с увеличением содержания диоксида титана в наносимом составе наблюдается монотонный рост активности, что обусловлено высокой пористостью структуры стеклотканевого материала по сравнению со стеклом. Следует отметить, что в обоих случаях без добавления диоксида титана (т.е. для концентрации 0 г/л) наблюдается нулевая активность и такое покрытие не обладает функцией самоочистки под действием света. Таким образом, составы, содержащие диоксид титана с концентрацией 1-150 г/л, позволяют наносить фотоактивные покрытия на поверхности как пористых, так и непористых материалов. При этом, при использовании в качестве фотокатализатора нанокристаллического диоксида титана, содержащего примеси азота (TiO₂-N), который за счет этих примесей способен поглощать излучение видимого диапазона (Фиг. 1), получаемые материалы (пример 12) обладают фотокаталитической активностью не только под действием УФ-излучения, но и под действием видимого света, так как наблюдается окисление паров ацетона с высокой скоростью (Таблица 1). Аналогично примеру 11 увеличение концентрации TiO₂-N в диапазоне 1-150 г/л приводит к монотонному увеличению активности материалов в обоих спектральных диапазонах.

Следует отметить, что примеры 1, 9 и 10 иллюстрируют возможность использования изопропилового спирта, этилового спирта или этилацетата в качестве полярного органического растворителя при приготовлении композиции для нанесения фотопокрытия.

Помимо тканевых материалов на основе неорганических волокон (пример 13) предложенный состав позволяет модифицировать ткани на основе природных и синтетических волокон (пример 15) с получением самоочищающихся текстильных материалов. Как и в случае со стеклом (примеры 1-6), для тканевых материалов дополнительная обработка водой приводит к увеличению фотоактивности покрытия (примеры 14 и 16 соответственно) за счет удаления кислотных остатков.

Аналогично примеру 12 при использовании в качестве фотокатализатора нанокристаллического диоксида титана, содержащего примеси азота (TiO₂-N), получаемое покрытие (пример 17) обладает фотокаталитической активностью не только под действием УФ-излучения, но и под действием видимого света, так как наблюдается окисление паров ацетона с высокой скоростью (Таблица 1). Дополнительное введение в состав для нанесения фотопокрытия переходных металлов, например ионов железа и меди (пример 18), приводит к поверхностному модифицированию фотокатализатора и обеспечивает значительное увеличение активности материала под действием видимого света за счет пространственного разделения фотогенерированных носителей зарядов и снижения их рекомбинации.

Сравнение примеров 16 и 19 подчеркивает ключевую роль фотокатализатора в составе наносимого покрытия на поверхности ткани для придания свойств самоочищения, поскольку при отсутствии фотокатализатора активность полученных покрытий равна нулю (Таблица 1). Такой же эффект наблюдается и в случае отсутствия диоксида титана в составе фотопокрытий на стекле (пример 10) и стеклоткани (пример 11).

Таким образом, предложенный состав коллоидного раствора, состоящий из кремнийорганического связующего и нанокристаллического диоксида титана, который может дополнительно содержать примеси азота в объеме и металла на поверхности, позволяет наносить фотопокрытие на поверхность разных типов материалов и обеспечивать окислительную деструкцию химических веществ вплоть до продуктов их полного окисления под действием света широкого спектрального диапазона.

Для иллюстрации способности получаемых материалов к фотокаталитической деструкции нуклеиновых кислот под действием излучения УФ-А диапазона или видимого света проводят испытание их НК-антиконтаминационной активности с использованием метода ПЦР.

Испытания проводят в соответствии со следующей методикой. Раствор объекта НК для исследований наносят в объеме 100 мкл на фрагмент площадью 1 см² исходного материала и материала с фотопокрытием, выдерживают при комнатной температуре до полного высушивания и подвергают обработке излучением УФ-А диапазона (365 нм, 5.0 мВт/см²) или видимым светом (450 нм, 80 мВт/см²) в течение 0-48 ч. Нуклеиновые кислоты смывают путем инкубации исследуемого образца в 1,5 мл TE буфера (10 мМ Tris HCl pH 7.5, 1 мМ ЭДТА).

Количественную оценку содержания НК в смывных растворах проводят с использованием специфических олигонуклеотидов в качестве праймеров в реакционной смеси БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (2×) (ООО «Биолабмикс», г. Новосибирк, Россия). Реакцию ПЦР проводят на приборе Light Cycler 96 (Roche Diagnostics, Швейцария) с предварительным нагревом до 95°С в течение 5 мин, с последующими 45 циклами амплификации, включающими денатурацию при 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров при 58°С в течение 10 с, элонгацию при 72°С в течение 20 с. Съемку сигнала флуоресценции проводят при 81°С. Для каждой реакции определяют значение порогового цикла (Cq) в сопутствующем программном обеспечении версии 1.1.0.1320 (K.J. Livak, T.D. Schmittgen, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method, Methods. 25 (2001) 402-408; M.W. Pfaffl, Relative quantification, in: Tevfik Dorak (Ed.), Real-Time PCR, Taylor & Francis, 2006: pp. 63-82). Кривую плавления ПЦР-продуктов для оценки специфичности реакции амплификации строят для промежутка температур от 67 до 97°С. В качестве внутреннего контроля ПЦР используют ПЦР-фрагмент 28-2.1 (имитирующий фрагмент гена 28S рРНК 4502-4548 н.), который добавляют при подготовке реакционной смеси для ПЦР непосредственно перед постановкой реакции для оценки присутствия ингибиторов. Оценку результатов по удалению следов НК проводят с использованием формулы ΔΔCq=(2^(ΔCq(образецX_свет+)-ΔCq(образецX_свет-)), где ΔCq=Cq(специфический_ПЦР-продукт)-Cq(внутренний_контроль).

Для иллюстрации приведено несколько примеров для разных материалов с использованием разных нуклеиновых кислот.

Пример 20

Исследование антиконтаминационной активности фотопокрытия под действием излучения УФ-А диапазона проводят по вышеописанной методике путем нанесения на поверхность 100 % хлопковой ткани «Премьер-Cotton-350» и материала, синтезированного аналогично примеру 16 с использованием ткани «Премьер-Cotton-350», раствора ПЦР-продукта, который является фрагментом ДНК с длиной 71 п.н и обозначен как «1702».

Пример 21

Аналогичен примеру 20 с тем исключением, что исследование антиконтаминационной активности фотопокрытия под действием излучения УФ-А диапазона и видимого света проводят с использованием ПЦР-продуктов разной длины: 71, 126 и 226 п.н., которые обозначены как «18-1702», «28-2.2» и «GAPDH» соответственно.

Пример 22

Аналогичен примеру 21 с тем исключением, что исследование антиконтаминационной активности фотопокрытия под действием излучения УФ-А диапазона проводят на поверхности материала, синтезированного аналогично примеру 10 с использованием стекла при концентрации нанокристаллического диоксида титана, равной 10 г/л.

Пример 23

Аналогичен примеру 20 с тем исключением, что на тканевые материалы наносят смесь предварительно интактной суммарной РНК с концентрацией 100 нг/мл, состоящей преимущественно из рибосомных РНК (рРНК) и мажорных коротких РНК (транспортных РНК (тРНК) и малых ядерных РНК (мяРНК)). Смыв нуклеиновых кислот проводят путем инкубации фрагмента материала в 1,5 мл деионизованной воды и используют праймеры, специфичные для анализа уровня 18S рРНК и U1 мяРНК. Также протокол реакции обратной транскрипции с последующей амплификацией для оценки уровня РНК содержит стадию предварительной инкубации при 45°С в течение 30 мин (стадия элонгации праймера обратной транскриптазой).

Пример 24

Аналогичен примеру 20 с тем исключением, что на образцы исходной хлопковой ткани и материала с фотопокрытием размером 4 см² наносят 150 мкл суспензии вируса гриппа A / PR / 8/34 (H1N1) в культуральной среде и накрывают стеклом. Затем половину подготовленных образцов облучают излучением УФ-А диапазона в течение 30, 60, 180 или 360 минут, а оставшуюся половину используют для оценки влияния фотоактивного покрытия на деградацию вируса без облучения. По истечению времени все образцы погружают в 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS, Биолот) и встряхивают для смыва вирусных частиц. Для определения исходного количества вируса 150 мкл суспензии сразу помещают в 2 мл буфера. С помощью вышеописанной методики определяют значения порогового цикла.

Фиг. 7 иллюстрирует тот факт, что ДНК остается стабильной на поверхности исходного тканевого материала (без фотопокрытия) под действием излучения УФ-А диапазона, поскольку значение порогового цикла C_q не изменяется значительно даже при длительном освещении. С другой стороны, пример 20 подтверждает принципиальную возможность разрушения ДНК на освещенной поверхности тканевого материала с фотопокрытием, поскольку значение Cq постепенно повышается до фонового уровня (Фиг. 7), что свидетельствует о деструкции ДНК и снижении ее концентрации вплоть до предела обнаружения.

Пример 21 иллюстрирует возможность разрушения ДНК-фрагментов разной длины на поверхности материала с фотопокрытием при облучении как в видимом (Фиг. 8), так и в УФ-А диапазоне (Фиг. 9). В обоих спектральных диапазонах наблюдается одинаковая закономерность: чем длиннее исходная ДНК, тем эффективнее и быстрее происходит разрушение структуры НК на поверхности материала с фотоактивным покрытием, о чем свидетельствует увеличение значения порогового цикла при увеличении длины фрагмента.

Пример 22 подтверждает возможность эффективного удаления ДНК-фрагментов разной длины фрагментов с поверхности непористого материала (стекла) с нанесенным фотопокрытием при освещении излучением УФ-А диапазона (Фиг. 10). Как в случае с пористыми материалами (пример 21), длина фрагмента ПЦР продуктов влияет на скорость очистки поверхности.

Пример 23 иллюстрирует принципиальную возможность удаления разных РНК с поверхности материалов с фотопокрытием (Фиг. 11), а также вместе с примером 21 указывает на возможность применения разрабатываемых материалов для снижения вероятности кросс-контаминации в лабораториях молекулярно-биологического и диагностического профиля.

Пример 24 иллюстрирует возможность удаления РНК даже биологических объектов, например вируса гриппа (Фиг. 12). Как и в случае фрагментов ДНК (Фиг. 7), пороговый цикл C_q постепенно снижается вплоть до фонового уровня, что свидетельствует о деструкции вирусной РНК и снижении ее концентрации вплоть до предела обнаружения. Данный эффект позволит обеспечить отсутствие ложноположительных результатов от биологических объектов, таких как вирусы.

Таким образом, предложенный способ, заключающийся в формировании на внешней поверхности пористых и непористых материалов кремний-титанового оксидного покрытия, которое обладает за счет фотоактивного компонента на основе нанокристаллического диоксида титана, эффектом самоочистки под действием солнечного света и света комнатных источников освещения, позволяет разрушать фрагменты нуклеиновых кислот в составе ДНК, РНК и других НК-содержащих биологических объектов, например вирусов, обеспечивая тем самым перманентное снижение уровня контаминации в помещениях лабораторий.

Claims (12)

1. Способ устранения контаминации помещений примесными нуклеиновыми кислотами и их фрагментами, включающий покрытие доступных поверхностей раствором, отличающийся тем, что проводят функционализацию поверхности материалов коллоидным раствором с фотоактивным компонентом, содержащим:

- полярный органический растворитель из ряда, включающего изопропиловый или этиловый спирт, или этилацетат,

- этилсиликат,

- фотоактивный компонент - нанокристаллический диоксид титана или нанокристаллический диоксида титана, содержащий примесь азота или примеси азота, железа и меди,

- неорганическую кислоту из ряда, включающего серную или азотную, или соляную кислоту,

- воду,

причём объёмное соотношение этилсиликат : полярный органический растворитель составляет от 1 : 19 до 1 : 1 соответственно, объёмная доля неорганической кислоты составляет от 0,1 до 10%, концентрация фотоактивного компонента составляет 1–150 г/л, а объёмная доля воды составляет от 5 до 25%,

с формированием, после испарения полярного органического растворителя, фотоактивного кремний-титанового оксидного покрытия, обеспечивающего окислительную деструкцию химических веществ и биомакромолекул.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предварительно поверхность материалов обрабатывают этиловым или изопропиловым спиртом с дальнейшим полным их испарением.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что содержание примеси азота составляет до 1% от массы нанокристаллического диоксида титана.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют водорастворимые соли железа и меди, каждую из которых добавляют в количестве до 1% от массы нанокристаллического диоксида титана.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коллоидный раствор с фотоактивным компонентом наносят на поверхность тонким слоем кистью, валиком или губкой, или распыляют с помощью аэрографа, пульверизатора.

Images