BR112021009208A2 - nanopartícula de óxido de cério, métodos de decomposição de um ácido nucleico e de decomposição de um polipeptídeo, método para produzir uma nanopartícula de óxido de cério, agentes oxidante, antifúngico e antivírus e antioxidante - Google Patents

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Kazuhiro Matsuda
Takahiro Motoshiromizu
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Abstract

NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO, MÉTODOS DE DECOMPOSIÇÃO DE UM ÁCIDO NUCLEICO E DE DECOMPOSIÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO, AGENTES OXIDANTE, ANTIFÚNGICO E ANTIVÍRUS E ANTIOXIDANTE. A presente invenção tem como objetivo fornecer uma nova nanopartícula de óxido de cério e encontrar novos usos para esta nanopartícula de óxido de cério. A presente invenção fornece: uma nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta com um polímero de vinila tendo um esqueleto de amina heterocíclico, como piperazina, piridina, imidazol ou carbazol ou com uma poliamida tendo um esqueleto de amina heterocíclico, como piperazina, piridina, imidazol ou carbazol; e um método de decomposição de um ácido nucleico ou um polipeptídeo usando a nanopartícula de óxido de cério.

Description

“NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO, MÉTODOS DE DECOMPOSIÇÃO DE UM ÁCIDO NUCLEICO E DE DECOMPOSIÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO, AGENTES OXIDANTE, ANTIFÚNGICO E ANTIVÍRUS E ANTIOXIDANTE” CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a uma nanopartícula de óxido de cério, cuja superfície é coberta com um polímero, um método de decomposição de um ácido nucleico ou um polipeptídeo, utilizando a nanopartícula, um método para a produção de uma nanopartícula de óxido de cério, um agente oxidante, um antioxidante, um agente antifúngico e um agente antivírus.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Diante das circunstâncias de aumento das preocupações com o gerenciamento de segurança e higiene nos últimos anos, uma tecnologia antibacteriana para decompor uma substância nociva e um microrganismo está recebendo atenção. Por exemplo, o óxido de titânio gera uma espécie de oxigênio ativo devido à propriedade fotocatalítica do mesmo; portanto, tem a característica de decompor oxidativamente uma substância orgânica. Portanto, espera-se que o óxido de titânio seja utilizado, além do uso como agente antibacteriano, também para decomposição de substâncias de baixo peso molecular, como acetaldeído e amônia, além de diversas substâncias nocivas, como alergênicos e vírus.
[003] Por outro lado, uma nanopartícula de óxido de cério (nanoceria) possui várias características como ação oxidativa, ação antioxidante e ação antimicrobiana. E também se sabe que tem uma atividade catalítica semelhante a enzimas como uma catalase, uma oxidase, uma peroxidase, uma superóxido dismutase e uma fosfatase. Além disso, espera-se que a nanopartícula de óxido de cério possa ser utilizada de forma diferente do óxido de titânio que possui características fotocatalíticas.
[004] Por outro lado, em geral, as nanopartículas tendem a se agregar rapidamente. Uma vez que a nanopartícula de óxido de cério, também, pode prontamente se agregar, esta é por vezes usada para revestimento da superfície das partículas do mesmo por um polímero ou similar, para reforçar a capacidade de dispersão da partícula; então, isso é ocasionalmente usado como um agente oxidante, um agente antibacteriano e semelhantes.
[005] Nas Literaturas Não Patentárias 1 e 2, a nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta com ácido poliacrílico ou dextrano é descrita; e a atividade de oxidação e atividade antibacteriana dos mesmos, entre outras, são estudadas.
[006] Na Literatura Não Patentária 3, a nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta com, no lugar de um polímero, bis (2-etilhexil) sulfossuccinato de sódio é descrita; e, além disso, nesta literatura, é estudada a sua atividade de fosfatase. Na Literatura Não Patentária 3, é divulgado que a nanopartícula de óxido de cério tinha a atividade de fosfatase para hidrolisar um éster de fosfato, mas não conseguiu decompor um ácido nucleico.
LISTA DE CITAÇÕES LITERATURA NÃO PATENTÁRIA
[007] Literatura Não Patentária 1: A. Asati, Angew. Chem. Int. Ed.
2009, 48, 2308-2312.
[008] Literatura Não Patentária 2: M. H. Kuchma, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2010, 6, 738-744.
[009] Literatura Não Patentária 3: Q. Wang, International Journal of Nanomedicine 2013, 8, 3395-3399.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[0010] Os inventores da presente invenção estudaram um novo uso de uma nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta com um polímero. Como pode ser visto nos testes de decomposição de um ácido nucleico e um polipeptídeo, que será discutido mais tarde, o estudo foi realizado em relação à decomposição de um plasmídeo e um polipeptídeo usando a nanopartícula de óxido de cério, cuja superfície é coberta com o ácido poliacrílico que é descrito na Literatura Não Patentária 1; mas a decomposição do plasmídeo foi não capaz de ser reconhecida, nomeadamente o mesmo resultado como relatado na Literatura Não Patentária 3 foi obtido. Também foi descoberto que a taxa de decomposição do polipeptídeo era muito baixa.
[0011] Com base nesses resultados, o presente estudo foi realizado com o objetivo de encontrar uma nova nanopartícula de óxido de cério que pode decompor um ácido nucléico e um polipeptídeo com altas taxas de decomposição.
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA
[0012] A fim de resolver o problema acima mencionado, os inventores da presente invenção estudaram o polímero para cobrir a superfície das nanopartículas de óxido de cério. Como um resultado, foi encontrado que a nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta com um polímero de vinila que tem um esqueleto de piperazina, piridina, imidazol, ou carbazol ou com uma poliamida tendo um esqueleto de piperazina, piridina, imidazol ou carbazol é capaz de decompor um ácido nucleico e um polipeptídeo com altas taxas de decomposição. Com base em tal conclusão, a presente invenção foi realizada.
[0013] A presente invenção é a seguinte: (1) Uma nanopartícula de óxido de cério, uma superfície da nanopartícula de óxido de cério a ser coberta com um polímero de vinila que tem um esqueleto de amina heterocíclico ou com uma poliamida tendo um esqueleto de amina heterocíclico; (2) A nanopartícula de óxido de cério, de acordo com (1), em que o esqueleto de amina heterocíclico é formado por qualquer um de piperazina, piridina, imidazol ou carbazol;
(3) A nanopartícula de óxido de cério de acordo com (1), em que o polímero de vinila é um polímero que tem o esqueleto de amina heterocíclico de uma cadeia lateral do polímero de vinila;
(4) A nanopartícula de óxido de cério de acordo com (1), em que a poliamida é um polímero que tem o esqueleto de amina heterocíclico em uma cadeia principal da poliamida;
(5) A nanopartícula de óxido de cério de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que um espectro XANES de borda Ce L3 obtido por uma medição de espectrometria de estrutura fina de absorção de raios-X tem uma absorção máxima em um intervalo de 5726,0 eV a 5729,0 eV e em uma faixa de
5735,0 eV a 5739,0 eV;
(6) Um método de decomposição de um ácido nucleico,
incluindo fazer com que uma amostra incluindo o ácido nucleico entre em contato com a nanopartícula de óxido de cério de acordo com qualquer um de (1) a (5);
(7) Um método de decomposição de um polipeptídeo, incluindo fazer com que uma amostra incluindo o polipeptídeo entre em contato com a nanopartícula de óxido de cério de acordo com qualquer um de (1) a (5);
(8) Um método para produzir uma nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta com um polímero, o método incluindo:
- processo a: misturar uma solução de um polímero possuindo um esqueleto de amina heterocíclico com uma solução incluindo um íon cério (III) ou com um sal de cério (III) para obter uma solução misturada; e
- processo b: adicionar um agente oxidante para a solução misturada obtida no processo a;
(9) Um agente oxidante compreendendo a nanopartícula de óxido de cério de acordo com qualquer um de (1) a (5); (10) Um antioxidante compreendendo a nanopartícula de óxido de cério de acordo com qualquer um de (1) a (5);
(11) Um agente antifúngico compreendendo a nanopartícula de óxido de cério de acordo com qualquer um de (1) a (5); e (12) Um agente antivírus compreendendo a nanopartícula de óxido de cério de acordo com qualquer um de (1) a (5).
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[0014] A nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode decompor um ácido nucleico e um polipeptídeo com taxas de decomposição muito mais altas do que as nanopartículas convencionais.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0015] A Figura 1 é o desenho para explicar as estruturas dos polímeros usados na presente invenção.
[0016] A Figura 2 é o desenho que explica as estruturas dos polímeros com o esqueleto de piperazina.
[0017] A Figura 3 é o desenho para explicar o teste antifúngico no Exemplo 2 da presente invenção.
[0018] A Figura 4 é o desenho para explicar o resultado do teste antifúngico no Exemplo 2 da presente invenção.
[0019] A Figura 5 é o espectros XANES da borda Ce L3 da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção preparada no Exemplo 2 e a nanopartícula de óxido de cério preparada no Exemplo Comparativo 1.
[0020] A Figura 6 são os espectros XANES da borda Ce L3 do cristal de óxido de cério, carbonato de cério (III), nitrato de cério (III) e nitrato de amônio e cério (IV) preparados no Exemplo de Referência 1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0021] A nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta com um polímero de vinila tendo um esqueleto de amina heterocíclico ou com uma poliamida tendo um esqueleto de amina heterocíclico de acordo com a presente invenção é algumas vezes descrita neste relatório descritivo como a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção.
[0022] Conforme ilustrado na Figura 1, o polímero de vinila ou a poliamida a ser usado na presente invenção tem um esqueleto de amina heterocíclico R, como piperazina, piridina, imidazol ou um carbazol em uma cadeia principal do mesmo (Figura 1(a)) ou em uma cadeia lateral do mesmo (Figura 1(b) e Figura 1(c)). O polímero de vinila ou a poliamida de acordo com a presente invenção pode ter um grupo substituinte em uma posição arbitrária na cadeia principal ou na cadeia lateral, ou em uma posição arbitrária no esqueleto de amina heterocíclico, como piperazina, piridina, imidazol ou carbazol. O polímero ilustrado na Figura 1(a) tem o esqueleto de amina heterocíclico na cadeia principal e tem os grupos substituintes R1 e R2 na cadeia lateral. O polímero ilustrado na Figura 1(b) tem o esqueleto de amina heterocíclico na cadeia lateral e tem o grupo substituinte R2 como o grupo substituinte do esqueleto de amina heterocíclico. O polímero ilustrado na Figura 1(c) tem o esqueleto de amina heterocíclico na cadeia lateral, em que o esqueleto de amina heterocíclico é o grupo substituinte do grupo substituinte R1 na cadeia lateral, e tem o grupo substituinte R3 como o grupo substituinte do esqueleto de amina heterocíclico. As estruturas ilustradas na Figura 1(a) à Figura 1(c) são meros exemplos do polímero de vinila ou da poliamida a ser utilizada na presente invenção; eles não se limitam a essas estruturas. Neste relatório descritivo, a menos que especificamente mencionado de outra forma, os grupos substituintes são um grupo alquila, um grupo acetila, um grupo hidroxi, um grupo amino, um grupo ciano, um grupo carboxi, um grupo éster, um grupo aldeído, um grupo amida, um grupo éter, um grupo cetona, um grupo halogênio, um grupo sulfonato ou um grupo fosfato. O grupo substituinte pode ser único ou plural.
[0023] O polímero de vinila a ser usado na presente invenção tem um grupo metileno na sua cadeia principal. Exemplos da estrutura do polímero de vinila com um esqueleto de piperazina na cadeia principal ou na cadeia lateral incluem a Figura 2(a) e Figura 2(b). Conforme ilustrado na Figura 2(a), quando o esqueleto da piperazina está presente na cadeia principal, o esqueleto da piperazina está presente entre o grupo metileno e o grupo metileno na cadeia principal. Quando a cadeia principal tem outro esqueleto de amina heterocíclico, como um esqueleto de piridina, imidazol ou carbazol, o esqueleto de amina heterocíclico está presente entre o grupo metileno e o grupo metileno, de forma semelhante à Figura 2(a).
[0024] Quando o polímero de vinila a ser usado na presente invenção tem o esqueleto de piperazina na sua cadeia lateral do mesmo, o esqueleto de piperazina pode ser ligado diretamente ao átomo de carbono no grupo metileno como ilustrado na Figura 2(b), ou o esqueleto da piperazina pode ser ligado por meio de um grupo alquila ou um grupo amino. Quando o polímero de vinila tem outro esqueleto de amina heterocíclico, como um esqueleto de piridina, imidazol ou carbazol, o esqueleto de amina heterocíclico, como o esqueleto de piridina, imidazol ou carbazol pode ser ligado diretamente ao átomo de carbono do grupo metileno de forma semelhante a Figura 2(b), ou pode estar ligado por meio do grupo alquila ou do grupo amino.
[0025] O polímero de vinila a ser usado na presente invenção é preferencialmente o polímero de vinila tendo o esqueleto de piperazina, piridina, imidazol ou carbazol na cadeia lateral do mesmo. O polímero de vinila tendo o esqueleto de piperazina, piridina, imidazol ou carbazol na cadeia lateral do mesmo pode ser obtido por uma reação de polimerização de um monômero de vinila tendo um grupo vinila.
[0026] Exemplos ilustrativos do monômero de vinila incluem especificamente 1-vinil piperazina, (4-vinilpiperazin-1-il)metano amina, 2-(4- vinilpiperazin-1-il)etano-1-amina, 2-vinil piperazina, (3-vinilpiperazin-1-il)metano amina, 2-(3-vinilpiperazin-1-il)etano-1-amina, (2-vinilpiperazin-1-il)metano amina, 2-(2-vinilpiperazin-1-il)etano-1-amina, 2-vinil piridina, 3-vinil piridina, 4- vinil piridina, 1-vinil imidazol, 2-vinil imidazol, 4-vinil imidazol e 9-vinil carbazol. O monômero de vinila pode ter um grupo substituinte em uma posição arbitrária diferente do grupo de vinila; o grupo vinila pode ter um grupo metila ou um grupo ciano como o grupo substituinte.
[0027] O polímero de vinila a ser usado na presente invenção pode ser um homopolímero ou um copolímero produzido a partir de matérias-primas de dois ou mais monômeros de vinila.
[0028] Exemplos do polímero de vinila que podem ser preferencialmente usados na presente invenção são especificamente poli(1- vinilpiperazina), poli((4-vinilpiperazin-1-il)metanamina), poli(2-(4-vinilpiperazin-1- il)etano-1-amina), poli(2-vinilpiridina), poli(3-vinilpiridina), poli(4-vinilpiridina), poli(1-vinilimidazol), poli(2-vinilimidazol), poli(4-vinilimidazol), e poli(9- vinilcarbazol).
[0029] A poliamida a ser utilizada na presente invenção é o polímero possuindo uma ligação amida na sua cadeia principal. Conforme ilustrado na Figura 2c, quando a cadeia principal tem o esqueleto de piperazina, o esqueleto de piperazina existe entre o grupo carbonila e o grupo carbonila na cadeia principal, e os átomos de nitrogênio no anel heterocíclico do esqueleto de piperazina formam as ligações amida com os grupos carbonila. Quando a cadeia principal tem outro esqueleto de amina heterocíclico, como o esqueleto de piridina, imidazol ou carbazol com dois ou mais grupos amino primários ou secundários, o esqueleto de amina heterocíclico existe entre o grupo carbonila e o grupo carbonila, de forma semelhante à Figura 2c.
[0030] Quando a poliamida a ser utilizada na presente invenção tem o esqueleto de piperazina, o esqueleto de piperazina pode ser ligado diretamente ao átomo de carbono que conecta as ligações amida, tal como ilustrado na Figura 2d, ou o esqueleto da piperazina pode ser ligado por meio de um grupo alquila ou um grupo amino. Quando a poliamida tem outro esqueleto de amina heterocíclico, como o esqueleto de piridina, imidazol ou carbazol, o esqueleto de amina heterocíclico, como o esqueleto de piridina, imidazol ou carbazol, pode ser ligado diretamente ao átomo de carbono que conecta os grupos amida de forma semelhante a Figura 2d, ou pode estar ligado por meio do grupo alquila ou do grupo amino.
[0031] A poliamida a ser utilizada na presente invenção é preferencialmente o polímero tendo o esqueleto da piperazina na cadeia principal ou na sua cadeia lateral, enquanto mais preferencialmente o polímero com o esqueleto da piperazina na cadeia principal, como ilustrado na Figura 2c.
[0032] A poliamida possuindo o esqueleto de piperazina na cadeia principal a ser usada na presente invenção pode ser obtida por uma reação de policondensação entre uma amina possuindo o esqueleto de piperazina e um ácido dicarboxílico.
[0033] Exemplos ilustrativos da amina preferida com o esqueleto de piperazina incluem piperazina, (aminometil) piperazina, (aminoetil) piperazina, (aminopropil) piperazina, (aminobutil) piperazina, 1,4-bis(aminometil) piperazina, 1,4-bis(2-aminoetil) piperazina, 1,4-bis(3-aminopropil) piperazina e 1,4-bis(4-aminobutil) piperazina. Entre estes, (aminoetil) piperazina e 1,4-bis(3- aminopropil) piperazina são mais preferidos. Estas aminas podem ter um grupo substituinte em uma posição arbitrária diferente da posição do átomo de nitrogênio capaz de formar a ligação amida.
[0034] Exemplo ilustrativo do ácido dicarboxílico preferido inclui ácido 1H-imidazol-2,4-dicarboxílico, ácido 1H-imidazol-2,5-dicarboxílico, ácido 1H-imidazol-4,5-dicarboxílico, ácido piridina-2,3-dicarboxílico, ácido piridina-2,4- dicarboxílico, ácido piridina-2,5-dicarboxílico, ácido piridina-2,6-dicarboxílico, ácido piridina-3,4-dicarboxílico, ácido piridina-3,5-dicarboxílico, ácido adípico, ácido sebácico, ácido dodecadicarboxílico, ácido tereftálico e ácido isoftálico.
Estes ácidos dicarboxílicos pode ter um grupo substituinte em uma posição arbitrária diferente do grupo carboxi que pode formar a ligação amida.
[0035] A poliamida a ser utilizada na presente invenção é, de preferência aquelas obtidas a partir das aminas e ácidos dicarboxílicos descritos acima em quaisquer combinações dos mesmos, e especialmente de preferência, a poliamida obtida a partir de uma combinação de (aminoetil) piperazina e ácido adípico.
[0036] A poliamida a ser usada na presente invenção pode ter uma estrutura de polialquileno glicol na sua cadeia principal. Exemplos de tal poliamida incluem especificamente a poliamida possuindo os esqueletos de (aminoetil) piperazina, ácido adípico e bis(aminopropil) polietileno glicol.
[0037] A poliamida a ser usada na presente invenção pode ser uma mistura da poliamida tendo o esqueleto de amina heterocíclico, como piperazina, piridina, imidazol ou carbazol com outro polímero, ou um copolímero da poliamida com outro polímero. Neste caso, exemplos ilustrativos de outro polímero incluem especificamente policaproamida (nylon 6), polihexametileno adipamida (nylon 66), politetrametileno adipamida (nylon 46), polipentametileno adipamida (nylon 56), polipentametileno sebacamida (nylon 510), polihexametileno sebacamida (nylon 610), polihexametileno dodecamida (nylon 612), um copolímero de polihexametileno adipamida/ polihexametileno tereftalamida (nylon 66/6T), um copolímero de polihexametileno adipamida/ polihexametileno tereftalamida/ polihexametileno isoftalamida (nylon 66/6T/6I), um copolímero de polihexametileno tereftalamida/ polihexametileno isoftalamida (nylon 6T/6I) e polioxileno adipamida (nylon XD6).
[0038] O peso molecular do polímero de vinila ou da poliamida a ser utilizado na presente invenção pode estar na faixa de 3000 a 1000000, e este está, de preferência no intervalo de 10000 a 50000.
[0039] A nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção tem a estrutura que tem no centro da mesma, a partícula de óxido de cério formada por uma mistura de Ce2O3 e CeO2 (isto é por vezes descrito como um núcleo central no presente relatório descritivo), e tem a superfície da mesma coberta com o polímero mencionado anteriormente. O diâmetro da partícula do núcleo central pode ser de cerca de 1 nm ou mais e 100 nm ou menos. O diâmetro de partícula é obtido de tal forma que pelo menos dois ou mais diâmetros de eixo longo, diâmetro de eixo curto e diâmetro unidirecional são medidos usando um microscópio eletrônico de transmissão seguido do cálculo do valor médio dos mesmos.
[0040] A razão de Ce2O3 para CeO2 no núcleo central pode ser calculado como a razão de cério (III) para o cério (IV). A razão pode ser calculada usando um método de espectrometria de fotoelétrons de raios X (XPS) após a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção ser seca.
Os estados de energia do cério (III) e cério (IV) em Ce 2O3 e CeO2 podem ser observados pela medição do espectro de estrutura fina de absorção de raios-X (XAFS). No espectro XAFS, a estrutura a cerca de 20 eV da borda de absorção é chamada de XANES (absorção de raios-X perto da estrutura da borda), e a estrutura fina de absorção de raios-X estendida aparecendo em mais de cerca de 100 eV em um lado de alta energia da borda de absorção é chamado EXAFS (estrutura fina de absorção de raios-X estendida). No XANES, informações relacionadas à valência e estrutura do átomo em foco podem ser obtidas; na análise EXAFS, informações relativas ao local de estrutura da amostra, bem como as espécies atômicas, valência, e distância ao redor do átomo em questão podem ser obtidas pela transformada de Fourier do espectro real (correspondente à FT-EXAFS/ função de distribuição radial). O estado de energia de cério (III) e de cério (IV), na reação de redução de oxidação de óxido de cério é refletida na posição do pico e razão de intensidade de picos da absorção máxima no espectro de XANES.
[0041] De preferência, o espectro XANES da borda Ce L3 obtido pela medição do espectro de estrutura fina de absorção de raios X tem as absorções máximas na faixa de 5726,0 a 5729,0 eV e na faixa de 5735,0 a 5739,0 eV.
[0042] Na nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção, o diâmetro da partícula incluindo a camada de polímero na superfície da mesma é de preferência 200 nm ou menos, como o diâmetro hidrodinâmico. O diâmetro hidrodinâmico é calculado como se segue. As nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção são dissolvidas em um solvente arbitrário, como água, etanol ou piridina; em seguida, a dispersão dinâmica da luz é medida para obter a função de autocorrelação; esta é estão analisada pelo método Marquadt para calcular a partir do histograma de conversão, o número do diâmetro médio de partícula como o diâmetro hidrodinâmico. A medição da dispersão de luz dinâmica é feita usando ELS-Z fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.
[0043] A nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser produzida pelo método para produzir a nanopartícula de óxido de cério que inclui: o processo (a) no qual uma solução do polímero tendo o esqueleto de amina heterocíclico, como piperazina, piridina, imidazol, ou carbazol é misturado com uma solução incluindo um íon cério (III) ou com um sal de cério (III) para obter uma solução misturada; e o processo (b) no qual um agente oxidante é adicionado à solução misturada obtida no processo (a). Daqui em diante, o método para produzir a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção será explicado ao longo desses processos separadamente.
[0044] No processo (a), uma solução do polímero tendo o esqueleto de amina heterocíclico, como piperazina, piridina, imidazol ou carbazol é misturada com uma solução incluindo um íon cério (III) ou com um sal de cério
(III) para obter uma solução misturada. A solução de polímero a ser usada no processo (a) pode ser preparada dissolvendo o polímero em um solvente arbitrário. O solvente é de preferência água ou um solvente que é solúvel em água é preferível. Exemplos ilustrativos do solvente solúvel em água incluem especificamente metanol, etanol, propanol, butanol, tetrahidrofurano, glicerol, etileno glicol, acetona, dimetilformamida (DMF), dimetil sulfóxido (DMSO), trietilamina e piridina. A poliamida e o polivinil imidazol são preferencialmente solúveis em água; poli(4-vinilpiridina) e poli(2-vinilpiridina) são preferencialmente solúveis em uma solução aquosa de etanol a 80%; e o polivinil carbazol é de preferência solúvel em piridina. Quando esses polímeros não são dissolvidos prontamente, eles podem ser dissolvidos por aquecimento ou por um tratamento ultrassônico.
[0045] A concentração da solução de polímero é de um modo preferido 0,01% ou mais e 5% ou menos, enquanto que mais preferencialmente 0,1% ou mais e 2% ou menos, em termos de concentração em massa.
[0046] A mistura da solução de polímero com a solução incluindo o íon cério (III) ou com o sal de cério (III) pode ser efetuada misturando a solução de polímero com a solução incluindo o íon cério (III) após essas soluções terem sido preparadas separadamente com antecedência; ou alternativamente, quando o solvente da solução de polímero é água ou um solvente solúvel em água, o sal de cério (III) pode ser adicionado à solução de polímero para mistura.
A solução incluindo o íon cério (III) pode ser preparada dissolvendo o sal de cério (III) em um solvente arbitrário. Exemplos do sal de cério (III) incluem nitrato de cério (III) hexahidratado.
[0047] Quando o nitrato de cério (III) hexahidratado é usado como o sal de cério (III), a razão em massa do nitrato de cério (III) hexahidratado para o polímero após a mistura é de preferência 0,1 ou mais e 5,0 ou menos. A solução de mistura resultante é preferencialmente misturada por 5 minutos ou mais até que a solução se torne uniforme.
[0048] No processo (b), um agente oxidante é adicionado à solução misturada obtida no processo (a). Exemplos ilustrativos do agente oxidante a ser usado no processo (b) incluem ácido nítrico, nitrato de potássio, ácido hipocloroso, ácido cloroso, ácido clórico, ácido perclórico, halogênios, halogenetos de hidrogênio, sais de permanganato, ácido crômico, ácido dicrômico, ácido oxálico, sulfeto de hidrogênio, dióxido de enxofre, tiossulfato de sódio, ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio. Entre estes, o peróxido de hidrogênio é especialmente preferido. A quantidade de adição do mesmo pode ser 0,1 equivalente ou mais e 10 equivalentes ou menos em relação ao íon cério (III) como equivalente molar; a quantidade de adição é de preferência 1 equivalente ou mais e 2 equivalentes ou menos.
[0049] Quando o agente oxidante é adicionado à solução misturada obtida no processo (a), o íon cério (III) é oxidado a cério (IV); então, a reação de formação de partículas começa a dar a partícula de óxido de cério que é formada por uma mistura de Ce2O3 e CeO2 no centro da mesma, cuja superfície é recoberta com o polímero. Após a adição do agente oxidante na solução misturada do polímero com o íon cério (III), a reação de formação para produzir a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção começa.
Durante esta reação, a solução é colorida para amarelo, laranja, vermelho, marrom ou semelhante. Esta coloração ocorre porque o íon cério (III) muda para cério (IV), em que o grau de coloração é determinado pela razão de cério (III) para o cério (IV) que estão presentes na superfície das nanopartículas de óxido de cério. O término da reação pode ser julgado no momento em que a cor não mudar mais. A reação geralmente termina em cerca de 30 minutos a 1 hora.
[0050] Por exemplo, 100 μl da solução aquosa de 10% em peso de hexahidrato de nitrato de cério (III) é misturado com 5 ml da solução aquosa de 0,1% em peso de polivinil imidazol, que é então seguido pela adição de 100 μl de solução aquosa de 1,2% em peso de peróxido de hidrogênio; então, ao aquecer a solução resultante a 40 °C, a cor da solução muda primeiro para amarelo; então, a cor amarela se aprofunda gradualmente, resultando finalmente em uma cor laranja, indicando o término da reação.
[0051] O tamanho da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser controlado pela concentração da solução de polímero. A solução de polímero com uma concentração mais alta resulta em uma partícula tendo um diâmetro de partícula maior; a solução de polímero com uma concentração mais baixa resulta em uma partícula com um diâmetro de partícula menor.
[0052] Além disso, o tamanho das nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser controlada pela temperatura de reação assim. Quando a temperatura da reação é igual ou superior à temperatura de transição vítrea (Tg) do polímero, a partícula com um grande diâmetro de partícula pode ser obtida; quando a temperatura da reação é mais baixa do que a Tg, a partícula com um pequeno diâmetro de partícula pode ser obtida. A temperatura da reação pode ser arbitrariamente definida na faixa de 4 a 95 °C.
[0053] A nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser armazenada na solução após o término da reação; ou ela pode ser armazenada no estado seco após a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção ser retirada da solução após o término da reação. Quando armazenada na solução, é armazenada preferencialmente em estado refrigerado. No caso de a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção ser seca, isto pode ser feito como se segue. Por exemplo, a solução após o término da reação é filtrada por uma membrana de ultrafiltração ou dialisada por uma membrana semitransparente para remover o agente oxidante não reagido, o íon cério (III) e o polímero em excesso, estes permanecendo na solução após o término da reação; em seguida, é seco usando um evaporador, um liofilizador ou semelhante.
[0054] Quando a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção é usada, um ácido nucleico e um polipeptídeo podem ser decompostos. Por exemplo, existe a possibilidade de decompor um vírus, que inclui o ácido nucleico e o polipeptídeo como seus principais componentes. Além disso, existe a possibilidade de decompor um alergênico, que inclui o polipeptídeo como seu principal componente.
[0055] Neste relatório descritivo, decompor o ácido nucleico significa que uma cadeia de nucleotídeos que constitui o ácido nucleico é clivada.
Quando o ácido nucleico é decomposto, uma estrutura estérica do ácido nucleico muda ou o ácido nucleico é fragmentado. Por exemplo, no caso de um ácido nucleico de cadeia dupla cíclico, como um plasmídeo, quando o ácido nucleico está no estado não clivado, este tem uma estrutura circular fechada; quando uma das duas cadeias é clivada, ela tem uma estrutura circular aberta; e quando ambas as cadeias são clivadas, ela tem uma estrutura linear.
[0056] No presente relatório descritivo, decompor o polipeptídeo significa que uma cadeia polipeptídica é clivada, desse modo resultando na alteração da estrutura estérica do polipeptídeo ou em fragmentação do polipeptídeo.
[0057] A decomposição do ácido nucleico ou do polipeptídeo usando a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser efetuada por contato sob o seu estado seco com uma amostra que inclui o ácido nucleico ou o polipeptídeo; ou por contato, como a solução que inclui a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção, a solução após o término da reação como ela é com a amostra que inclui o ácido nucleico ou o polipeptídeo. No que diz respeito ao método de contato, quando a amostra que inclui o ácido nucleico e o polipeptídeo é um líquido, o contato pode ser efetuado adicionando e misturando esta amostra com a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção ou com a solução que inclui a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção. Além disso, o contato da solução que inclui a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção com a amostra, tal como um vírus que inclui o ácido nucleico ou o polipeptídeo e que fica no ar pode ser efetuado espalhando esta solução no ar como uma névoa. Alternativamente, a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção é incluída como um aditivo em um têxtil, um tubo, uma conta, uma borracha, um filme, um plástico ou semelhante, ou é aplicada na superfície desses materiais; então, ela pode ser colocada em contato com a amostra que inclui o ácido nucleico ou o polipeptídeo. A solução que inclui a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser preparada misturando esta nanopartícula com água ou uma solução arbitrária.
[0058] Não existe nenhuma restrição em particular no ácido nucleico que pode ser decomposto pela nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção na medida em que o ácido nucleico é aquele que têm os nucleotídeos polimerizados de forma linear ou circular; assim, este também pode ser um ácido nucleico artificial. Exemplos ilustrativos do ácido nucleico incluem RNA, DNA e RNA/DNA (quimera). Exemplos ilustrativos do DNA incluem cDNA, micro DNA (miDNA), DNA plasmídico, DNA de genoma, DNA sintético, DNA livre de células (cfDNA), ctDNA, e DNA mitocondrial (mtDNA). Exemplos ilustrativos do RNA incluem RNA total, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, RNA não codificante, precursores desses RNAs e RNAs sintéticos. DNA sintético e RNA sintético são aqueles preparados artificialmente, por exemplo, usando um aparelho de síntese automática de ácido nucleico com base em uma sequência de nucleotídeos prescrita (qualquer uma de uma sequência natural e uma sequência não natural pode ser usada).
Exemplos ilustrativos do ácido nucleico artificial incluem LNA e BNA. Para decomposição, uma amostra arbitrária incluindo esses ácidos nucleicos pode ser usada.
[0059] Exemplos ilustrativos do polipeptídeo que pode ser decomposto pelas nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção incluem uma proteína e um polipeptídeo que é sintetizado artificialmente com base em uma sequência prescrita de aminoácidos (qualquer um de uma sequência natural e uma sequência não-natural pode ser usada).
[0060] Um ácido nucleico polipeptídico (PNA) com uma estrutura semelhante ao ácido nucleico que retém uma estrutura polipeptídica na sua cadeia principal, um vírus cujos componentes principais são uma proteína e um ácido nucleico e semelhantes também podem ser usados como a amostra que inclui o ácido nucleico ou o polipeptídeo.
[0061] Exemplos ilustrativos do método para confirmar a decomposição do ácido nucleico incluem: eletroforese, como uma eletroforese em gel de acrilamida, uma eletroforese em gel de agarose e uma eletroforese capilar; e métodos de análise de ácido nucleico usando uma cromatografia de exclusão de tamanho, uma análise de espectrometria de massa e semelhantes.
Quando a nucleico ácido é decomposto, a diminuição na concentração de banda de alvo ou a intensidade de pico alvo, em comparação com aquelas antes da decomposição, ou o desaparecimento da banda ou do pico, ou semelhante podem ser confirmados. Além disso, a decomposição pode ser confirmada pelo surgimento de uma nova banda ou pico que indica a presença de um pequeno fragmento em comparação com aqueles antes da decomposição.
Especificamente, quando o ácido nucleico de cadeia dupla cíclico é decomposto, a estrutura circular fechada, a estrutura circular aberta e a estrutura linear podem ser confirmadas como as bandas independentes pela eletroforese. Além disso, quando a estrutura estérica do ácido nucleico é alterada por decomposição, após a eletroforese, há um caso em que a posição da banda muda da posição antes da decomposição.
[0062] A decomposição do polipeptídeo pode ser confirmada pelo método semelhante ao usado para a confirmação da decomposição do ácido nucleico como descrito acima.
[0063] A taxa de decomposição do ácido nucleico ou do polipeptídeo pode ser calculado pelo método descrito abaixo. Primeiramente, a “amostra” que é obtida por contato da amostra que inclui o ácido nucleico ou o polipeptídeo com a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção é preparada (no presente relatório descritivo, a amostra que é obtida por este contato é por vezes chamada simplesmente “Amostra”). Para as bandas de controle, é usada a amostra que inclui o ácido nucleico ou o polipeptídeo não contatado com a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção. A Amostra que foi posta em contato com a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção e o controle são analisados por eletroforese, cromatografia de exclusão de tamanho ou semelhantes como descritos antes. No caso de utilização da eletroforese, o controle e a amostra são submetidos à eletroforese; em seguida, após as concentrações de banda na mesma posição serem confirmadas, cada concentração de banda é expressa pelo valor numérico correspondente. A concentração de banda do controle é expressa por (X), a concentração da banda da amostra é expressa por (Y); e então, a razão da diferença entre (X) e (Y) para (X) é definida como a taxa de decomposição. Quando a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção é colocada em contato com a amostra que inclui o ácido nucleico ou o polipeptídeo, se o ácido nucleico ou o polipeptídeo são adsorvidos à nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico ou o polipeptídeo pode ser recuperado por eluição destes usando uma solução de eluição arbitrária. Exemplos ilustrativos da solução de eluição utilizáveis incluem o tampão citrato incluindo ácido cítrico e citrato de sódio, o tampão fosfato incluindo ácido fosfórico e fosfato de sódio e o tampão Tris-EDTA que é obtido pela adição de EDTA ao tampão Tris-ácido clorídrico, que inclui trishidroxi amino metano e ácido clorídrico.
[0064] A nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser usada como um agente oxidante. Por exemplo, utilizando a ação oxidativa da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção, esta pode ser usada em uma reação de síntese orgânica, uma polimerização de polímero, e gravação úmida de um semicondutor. Ao utilizar a ação oxidativa, ela pode ser usada como uma substância substituta de uma enzima oxidativa. Especificamente, ela pode ser usada como um substituto de uma oxidase ou peroxidase, em uma reação de detecção ou em uma coloração de tecido usando uma reação anticorpo-antígeno ou uma hibridização de ácido nucleico, ou em uma reação de detecção eletroquímica por imobilização deste em um eletrodo. O desempenho deste como o agente de oxidação descrito acima pode ser avaliada pelo método de medição da atividade de oxidase, o método de medição da atividade de peroxidase, ou semelhante, que será descrito mais adiante. Além desses, ao utilizar a ação oxidativa dos mesmos, pode ser usada para decomposição e remoção de sujeira, cheiro e um alergênico como agente de branqueamento ou desinfetante. Especificamente, como o agente de branqueamento, esta pode ser utilizada para a limpeza de tecidos, talheres, uma cozinha, um toalete, um lavatório, um banheiro, equipamentos médicos, e assim por diante. Além disso, pode ser adicionado como desinfetante em uma piscina, banheira e fonte termal; e, além disso, pode ser usado como sabonete, material para limpar as mãos, remédio desinfetante, gargarejo, enxaguante bucal e assim por diante. O desempenho desta como o agente de oxidação descrito acima pode ser avaliada pela reação desbotamento da cor de um corante orgânico ou semelhante, que será descrito mais adiante.
[0065] A reação de desbotamento da cor do corante orgânico também pode ser usada para avaliação do desempenho fotocatalítico do óxido de titânio. A taxa de decomposição do corante assim obtido pode ser usada como o indicador da característica no que diz respeito à decomposição oxidativa de uma substância orgânica. Especificamente, a taxa de decomposição do corante é calculada como segue. Em primeiro lugar, a solução da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção é misturada com um corante orgânico, como Laranja Ácida 7 (AO7); então, a solução misturada resultante pode sair estaticamente por um período determinado. Como um controle, a solução AO7 não incluindo a nanopartícula de óxido de cério é tratada de forma semelhante. Após a reação, os espectros de absorção de todas as soluções são medidos. Para a análise, a absorbância em 485 nm, o comprimento de onda de absorção máximo de AO7, é usada. A razão entre o valor da diferença entre a absorbância do controle (Ic) e a absorbância da solução, incluindo a de nanopartículas de óxido de cério (I), com a absorbância do controlo (Ic) é calculada como a taxa de decomposição.
[0066] O valor da atividade da oxidase pode ser obtido pelo método como o descrito em A. Asati, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 2308-2312.
Especificamente, uma série de diluições é preparada usando o reagente como TMBZ que é capaz de ser colorido por oxidação; a cada um deles, a solução da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção com a concentração idêntica é adicionada para realizar a reação de coloração de 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina (TMBZ). A equação de Michaelis Menten é aplicada a essa reação para calcular a atividade da oxidase. A partir da alteração temporal da absorbância em cada concentração de TMBZ, a velocidade da reação é calculada; então, o recíproco da taxa de reação é plotado contra o recíproco da concentração do substrato TMBZ. Uma linha reta é obtida plotando em cada concentração; a taxa de reação máxima Vmax é obtida a partir do recíproco da interceptação com y; e a constante de Michaelis Menten Km é calculada multiplicando este valor pela inclinação da linha reta. A taxa de reação máxima Vmax é comparada com o valor que indica a atividade da oxidase. A atividade da oxidase também pode ser medida usando um composto como 2,2’- azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (AzBTS) ou dopamina no lugar de TMBZ.
[0067] A nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser usada como um antioxidante. Na presente invenção, antioxidantes significa a substância tendo uma propriedade redutiva, suprimindo desse modo a oxidação excessiva de um lipídeo ou reagindo com um oxigênio ativo (íon superóxido, radical hidroxila, o peróxido de hidrogênio, etc.) para suprimir a ação de oxigênio ativo (Standard Dictionary of Chemical Terms; segunda edição, Maruzen Publishing Co., Ltd.). Por exemplo, por utilização da ação anti-oxidativa das nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção, esta pode ser usada como um agente redutor em uma reação orgânica ou como um agente de terminação radical de polimerização do polímero. Além disso, ao utilizar a ação antioxidante da mesma, pode ser usada como um cosmético para proteger a pele da peroxidação lipídica e de um oxigênio ativo. Além disso, ao utilizar a ação antioxidante da mesma, esta pode ser usada como o substituto de uma enzima antioxidante. Especificamente, como um substituto de uma catalase, esta pode ser usada em uma reação de detecção de peróxido de hidrogênio ou em uma reação de detecção eletroquímica por imobilização desta a um eletrodo. Além disso, pode ser usada para neutralizar o peróxido de hidrogênio que é usado em uma indústria como a de alimentos, semicondutores, têxteis, celulose e papel, bem como usada para esterilizar um banheiro público e para remover lodo em uma tubulação. Estes desempenhos podem ser avaliados pela atividade da catalase que será descrita mais tarde. Além disso, utilizando a ação anti-oxidativa das mesmas, ela pode ser usada como um antioxidante. Especificamente, a fim de evitar que uma borracha, plásticos, um combustível, um detergente, um alimento, uma ração animal se deteriorem, ela pode ser adicionada a estes. O desempenho como anti-oxidante, tal como descrito acima pode ser avaliada por uma reação de eliminação ou como de uma espécie ativa, que irá ser descrito mais tarde.
[0068] Além disso, a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser usada como um antioxidante em um medicamento para tratar um estresse oxidativo ou uma inflamação de um ser humano ou de um animal. Em geral, considera-se que a nanopartícula de óxido de cério com uma atividade de catalase pode ser usada para prevenção e tratamento de uma doença que se relaciona ao estresse oxidativo, como um acidente vascular cerebral apoplético, esclerose disseminada, esclerose lateral amiotrófica e danos de reperfusão de isquemia por administração a um objeto de teste por meio de um método tópico, enteral ou parenteral, como injeção, infusão gota a gota ou transplante. Além disso, considera-se que a nanopartícula de óxido de cério tendo atividade de catalase pode reduzir uma inflamação topicamente ou sistemicamente quando esta é mantida na superfície de um órgão artificial representado por uma membrana de diálise e equipamento medicinal, como uma cânula, um cateter e um stent.
[0069] A reação de eliminação de uma espécie ativa pode ser medida como uma taxa de retenção de corante pelo método tal como o descrito por Y. Xue, J. Phys. Chem. C, 2011, 115, 4433-4438. Especificamente, um radical hidroxi é gerado por uma reação de Fenton misturando uma solução aquosa de cloreto de ferro (II) com uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio. Em seguida, a esta solução é adicionada a solução da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção para realizar a reação de eliminação de radicais. Esta solução de mistura é misturada com um corante orgânico, como azul de metileno; então, a mistura resultante é permitida sair estaticamente por um período determinado. Como um controle, o mesmo tratamento é realizado para a solução não incluindo a nanopartícula de óxido de cério. Além disso, a solução de azul de metileno com a mesma concentração que a solução de reação é preparada como a solução padrão. Em seguida, os espectros de absorção dessas soluções são medidos. Para a análise, utiliza-se a absorbância a 664 nm, o comprimento de onda de absorção máxima do azul de metileno. A diferença (ΔI0) entre a absorbância (I0) da solução padrão e a absorbância (Ic) do controle, e a diferença (ΔI) entre a absorbância (I) da solução incluindo a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção e a absorbância (Ic) do controle são calculadas. A razão do último (ΔI) para o primeiro (ΔI0) é calculada como a taxa de decomposição; e isso é considerado a taxa de retenção do corante. Este valor indica o desempenho de eliminação de radical. A taxa de retenção do corante pode ser obtida usando um violeta de metila no lugar do azul de metileno.
[0070] O valor da atividade da catalase pode ser obtida em conformidade com o protocolo usando Amplex Red catalase Assay Kit (A22180) (fabricado pela Thermo Fisher Scientific Inc.) tal como descrito na Publicação Aberta do Pedido de Patente Japonês No. 2018-508568. O tampão de reação incluído no kit, a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção e a solução aquosa de peróxido de hidrogênio são misturados; em seguida, a mistura resultante é deixada em repouso estaticamente por 30 minutos para realizar a reação de decomposição do peróxido de hidrogênio. A solução de reação é passada através da membrana de ultrafiltração de 30 kD; em seguida, a solução de fluxo contínuo é misturada com a solução de trabalho incluída no kit para realizar a reação a 37 °C por 30 minutos. O resorufina gerada pela reação é excitada a 544 nm, e a intensidade de fluorescência a 590 nm é medida. Por comparação com a curva de calibração do padrão de catalase cujo valor ativo já é conhecido, no qual esse padrão está incluído no kit, é calculada a atividade da catalase da nanopartícula de óxido de cério. Para a medição da atividade da catalase, outros kits como o EnzyChrom Catalase Assay Kit fabricado pela BioAssay Systems, LLC também podem ser usados.
[0071] A nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser usada como um agente antifúngico. Exemplos ilustrativos do método para avaliar o desempenho antifúngico incluem: o método no qual uma solução de suspensão de esporos de mofo é misturada com a solução de teste, seguido por cultura em um meio de sal inorgânico com ágar ou um meio de sal inorgânico com ágar, incluindo glicose para observar o seu estado de crescimento; o método pelo qual a solução de teste é adicionada a um meio de ágar para observar a supressão do crescimento; e o método no qual a solução de teste é adicionada a um meio de ágar para medir o círculo de supressão de crescimento. Na presente invenção, o método no qual a solução de teste é adicionada a um meio de ágar para observar a supressão de crescimento e o método no qual a solução de teste é adicionada a um meio de ágar para medir o círculo de supressão de crescimento são preferencialmente usados.
[0072] Exemplos ilustrativos do mofo que pode ser inativado pela nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção incluem Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Trichoderma e Chaetomium.
[0073] No caso em que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção é usada como o agente antifúngico, esta é adicionada como um aditivo em um têxtil, um tubo, uma conta, uma borracha, um filme, um plástico ou semelhante, ou é aplicada na superfície desses materiais. Exemplos ilustrativos dos produtos processados como estes incluem uma tampa em forma de crisântemo do orifício de drenagem em uma pia de cozinha, um tampão de drenagem, um material de embalagem de fixação de uma janela, um material de embalagem de fixação de um espelho, um material de embalagem à prova de água em um banheiro, em um lavatório e em uma cozinha, um material de embalagem interno de uma porta de geladeira, um tapete de banheiro, uma borracha antideslizante de uma banheira e uma cadeira, uma mangueira, um chuveiro, um material de embalagem usado em um purificador de água, um produto plástico de um purificador de água, um material de embalagem usado em uma máquina de lavar roupa, um produto plástico usado em uma máquina de lavar roupa, um filtro de ar condicionado, um filtro de equipamento de purificação de ar, um filtro para um aspirador, um filtro para uma ventoinha de ventilação, um filtro para um veículo, um filtro para um ar condicionado, uma aba de um ar condicionado, componentes de plástico tais como em uma grelha de saída de um ar condicionado e um ventilador, uma aba de um ar condicionado de carro, peças de plástico como uma grelha de saída de um ar condicionado e um ventilador de um carro, um tecido, um lençol de cama, uma rede em uma porta com tela, uma rede para um galinheiro, redes, tais como uma rede de mosquito, um papel de parede e uma janela, uma cortina, um material interno de um edifício como um hospital, um material interno de um trem e um carro, um assento para um veículo, uma cortina, uma cadeira, um sofá, equipamento de tratamento de vírus e um material de construção em vários campos como uma porta, um teto, um piso e uma janela.
[0074] A nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser usada como um agente antivírus. No método para avaliar o seu desempenho como o agente antivírus, a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção é colocada em contato com um vírus; então, a quantidade de vírus após o contato é quantificada.
[0075] Exemplos ilustrativos do método de quantificação do vírus incluem: o método em que a quantidade de antígeno do vírus é medida pelo método ELISA; o método em que o ácido nucleico do vírus é quantificado por PCR; o método em que um título de infecciosidade é medido pelo método de placa; e o método no qual um título de infecciosidade é medido pelo método de medição da quantidade de infecção a 50%. Na presente invenção, o desempenho antivírus é medido de preferência pelo método em que um título de infecciosidade é medido pelo método de placa ou pelo método de medição da quantidade de infecção a 50%. A unidade do título de infecciosidade do vírus no método de medição da quantidade de infecção a 50% é expressa por: TCID50 (dose infecciosa de cultura de tecidos 50) quando o objeto do teste é uma célula em cultura; EID 50 (dose infecciosa de ovo 50) quando um ovo embrionado é usado; e LD 50 (dose letal 50) em um animal. No método de medição da quantidade de infecção a 50%, os exemplos ilustrativos do método para calcular o título de infecciosidade a partir dos dados obtidos incluem o método de Reed-Muench, o método de Behrens-Karber, e o método de Spearman-Karber. Na presente invenção, é usado o método de Reed-Muench.
No que diz respeito ao padrão de julgamento do desempenho antivírus, em geral, quando o valor de redução logarítmica do título de infecciosidade em relação ao título de infecciosidade antes da ação da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção, ou para o controle não incluindo a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção é 2,0 ou superior, isto é considerado eficaz no desempenho antivírus.
[0076] Exemplos ilustrativos dos vírus que podem ser inativados pela nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção incluem rinovírus, vírus da poliomielite, vírus da febre aftosa, rotavírus, norovírus, enterovírus, hepatovírus, astrovírus, sapovírus, vírus da hepatite E, vírus da influenza A, vírus da influenza B, vírus da influenza C, vírus da parainfluenza, vírus da papeira (epidemia parotidite), vírus do sarampo, metapneumovírus humano, vírus de RS, vírus Nipah, vírus hendra, vírus de febre amarela, vírus da dengue, vírus da encefalite japonesa B, vírus da encefalite do Nilo do Oeste, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus da encefalite equina oriental, vírus da encefalite equina ocidental, vírus o’nyong’nyong, vírus da rubéola, vírus Lassa, vírus Junin, vírus Machupo, vírus Guanarito, vírus Sabia, vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, vírus da mosca-da-areia, hantavírus, vírus Sin Nombre, vírus da raiva, vírus Ebola, vírus de Marburg, lissavírus transmitido por morcego, vírus da leucemia de células T humanas, vírus da imunodeficiência humana, vírus corona humano, vírus corona SARS, parvovírus humano, vírus polioma, vírus do papiloma humano, adenovírus, vírus da herpes, vírus da varicela zoster, vírus EB, citomegalovírus, vírus da varíola, vírus da varíola de macaco, vírus da varíola bovina, Moluscipoxvírus e parapoxvírus.
[0077] No caso em que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção é usada como o agente antivírus, esta é incluída como um aditivo em um têxtil, um tubo, uma conta, uma borracha, um filme, um plástico ou semelhante, ou é aplicado na superfície desses materiais.
[0078] Exemplos ilustrativos dos produtos processados como estes incluem uma máscara, um boné médico, uma capa de calçado médico, um filtro para um ar condicionado, um filtro para um purificador de ar, um filtro para um aspirador de pó, um filtro para um ventilador, um filtro para um veículo, um filtro para um ar condicionado, uma aba de um ar condicionado, componentes de plástico tais como uma grelha de saída de um ar condicionado e um ventilador, uma aba de um ar condicionado de carro, as peças de plástico, tais como uma grelha de saída de ar condicionado de carro e um ventilador, um tecido, um lençol de cama, uma rede em uma porta de tela, uma rede para um galinheiro, redes, tais como uma rede de mosquito, um papel de parede e uma janela, uma cortina, um material interno de um edifício como um hospital, um material interno de um trem e um carro, um assento para um veículo, uma cortina, uma cadeira, um sofá, equipamento de tratamento de vírus e um material de construção em vários campos, como uma porta, um teto, um piso e uma janela.
EXEMPLOS
[0079] A presente invenção será explicada mais especificamente pelos seguintes Exemplos.
<MATERIAIS E MÉTODOS>
[0080] O poliacrilato de sódio, poli(4-vinilpiridina) e poli(2- vinilpirida) foram adquiridos da Merck KGaA; poli(1-vinilimidazol) e poli(9- vinilcarbazol) foram adquiridos da Maruzen Petrochemical Co., Ltd.; e hexahidrato de nitrato de cério (III) e uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 30% em peso foram adquiridos da Fuji Film Wako Pure Chemical Corp.
[0081] Outros reagentes foram adquiridos da Fuji Film Wako Pure Chemical Corp., Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. e Sigma-Aldrich Co., LLC; eles foram usados como estavam, sem qualquer purificação adicional.
[0082] Nos exemplos seguintes, o polímero possuindo as unidades estruturais de (aminoetil) piperazina e ácido adípico é descrito como poliamida (1); o polímero possuindo as unidades estruturais de (aminoetil) piperazina, bis(aminopropil) polietileno glicol e ácido adípico é descrito como poliamida (2); e estes polímeros foram preparados por referência ao Pedido de Patente Japonesa disponível ao público n° H11-166121.
[0083] Foi utilizada uma placa quente IKA C-MAG HP4 fabricada pela IKA Japan K.K.
[0084] O diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de óxido de cério cobertas com o polímero foi medido usando o sistema de medição de partículas de potencial zeta ELS-Z fabricado por Otsuka Electronic Co., Ltd.; e a razão de cério (III) para cério (IV) foi medida usando Quantera SXM fabricado por PHI Inc.
[0085] A cepa QM9414 foi obtida do NBRC (NITE Biological Resource Center).
EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE CÉRIO CUJA SUPERFÍCIE É COBERTA COM POLIAMIDA (1)
[0086] A solução aquosa de 0,1% em peso de poliamida (1) foi usada como a solução aquosa do polímero com o esqueleto de piperazina. A 5 ml de solução aquosa de 0,1% em peso de poliamida (1) adicionou-se 100 μl da solução aquosa de 10% em peso de cério (III), nitrato hexahidratado; a seguir, foram agitados à temperatura ambiente durante 5 minutos. A esta adicionaram- se 100 μl da solução aquosa de 1,2% em peso de peróxido de hidrogênio; em seguida, a reação foi realizada a 40 °C por 1 hora para obter uma solução aquosa amarela da nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poliamida (1). Esta solução aquosa foi purificada pela membrana de ultrafiltração de 30 kD para obter como solução a nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poliamida (1).
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE CÉRIO CUJA SUPERFÍCIE É COBERTA COM POLIAMIDA (2)
[0087] A reação foi realizada nas mesmas condições do Exemplo 1, exceto que a solução aquosa de 0,1% em peso de poliamida (2) foi usada como a solução aquosa do polímero com o esqueleto de piperazina, para obter uma solução aquosa amarela de nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poliamida (2). Esta solução aquosa foi purificada pela membrana de ultrafiltração de 30 kD para obter como solução a nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poliamida (2).
EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE CÉRIO CUJA SUPERFÍCIE É COBERTA COM POLI(1-VINILIMIDAZOL)
[0088] A reação foi realizada nas mesmas condições do Exemplo 1, exceto que a solução aquosa de 0,1% em peso de poli(1-vinilimidazol) foi usada como a solução aquosa do polímero com o esqueleto de imidazol, para obter uma solução aquosa laranja da nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poli(1-vinilimidazol). Esta solução aquosa foi purificada pela membrana de ultrafiltração de 30 kD para obter como solução a nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poli(1- vinilimidazol).
EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE CÉRIO CUJA SUPERFÍCIE É COBERTA COM POLI(4-VINILPIRIDINA)
[0089] A reação foi realizada nas mesmas condições que no Exemplo 1, exceto que 5 ml da solução aquosa de etanol de 0,1% em peso de poli(4-vinilpiridina) foram usados como a solução aquosa do polímero com um esqueleto de piridina, usando a solução aquosa a 80% em volume de solução de etanol, para obter uma solução marrom-avermelhada da nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poli(4-vinilpiridina). Depois que esta solução aquosa de etanol foi diluída em água a 70% em volume, esta foi purificada pela membrana de ultrafiltração de 30 kD, que foi seguida pela remoção do solvente por um evaporador centrífugo, seguido por uma nova dissolução em dimetil sulfóxido para obter como solução a nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poli(4-vinilpiridina).
EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE CÉRIO CUJA SUPERFÍCIE É COBERTA COM POLI(2-VINILPIRIDINA)
[0090] A reação foi realizada nas mesmas condições do Exemplo 1, exceto que a solução aquosa de etanol de 0,1% em peso de poli(2-vinilpiridina) foi usada como a solução aquosa do polímero com um esqueleto de piridina, usando a solução aquosa de 80% em volume de solução de etanol, para obter uma solução marrom da nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poli(2-vinilpiridina). Depois que esta solução foi diluída em água a 70% em volume, esta foi purificada pela membrana de ultrafiltração de 30 kD, que foi então seguida pela remoção do solvente por um evaporador centrífugo, então ainda seguido por re-dissolução em dimetil sulfóxido para obter como solução a nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poli(2-vinilpiridina).
E XEMPLO 6: PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE CÉRIO CUJA SUPERFÍCIE É COBERTA COM POLI (9-VINILCARBAZOL )
[0091] A reação foi realizada nas mesmas condições do Exemplo 1, exceto que a solução de piridina de 0,1% em peso de poli(9- vinilcarbazol) foi usada como a solução aquosa do polímero com o esqueleto de carbazol, para obter uma solução laranja da nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com poli(9-vinilcarbazol). Esta solução aquosa foi centrifugada a 10000 G durante 1 hora para remover o sobrenadante da mesma, a qual foi, em seguida, seguidos por re-dissolução em dimetil sulfóxido (DMSO) para se obter como solução a nanopartícula de óxido de cério, cuja superfície foi coberta com poli(9-vinilcarbazol).
E XEMPLO COMPARATIVO 1: P REPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE
CÉRIO CUJA SUPERFÍCIE É COBERTA COM ÁCIDO POLIACRÍLICO
[0092] A reação foi realizada nas mesmas condições do Exemplo 1, exceto que a solução aquosa de 1% em peso de poliacrilato de sódio foi usada como a solução aquosa de polímero, para obter uma solução aquosa amarela da nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi coberta com poliacrilato de sódio. Esta solução aquosa foi purificada pela membrana de ultrafiltração de 30 kD para obter como solução a nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com ácido poliacrílico.
E XEMPLO COMPARATIVO 2
[0093] Com referência à publicação pública do pedido de patente japonês No. 2018-508568, a nanopartícula de óxido de cério usando ácido cítrico (CA)/ sal tri-sódico de etilenodiamina di-succinato (EDDS) como um estabilizador foi preparada.
(MEDIÇÃO DO DIÂMETRO HIDRODINÂMICO DA NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO CUJA SUPERFÍCIE É COBERTA COM POLÍMERO)
[0094] O diâmetro hidrodinâmico da nanopartícula de óxido de cério cuja superfície foi recoberta com o polímero preparado em cada um dos Exemplos 1 a 6 foi medido pelo método de espalhamento dinâmico de luz (DLS).
Os solventes usados para medição foram: água quando poliamida (1), poliamida (2) ou poli(1-vinilimidazol) foi usada como polímero; etanol quando poli(4- vinilpiridina) ou poli(2-vinilpiridina) foi usada como polímero; e piridina quando poli(9-vinilcabazol) foi usado como polímero. O diâmetro hidrodinâmico foi obtido em termos de conversão numérica. Os resultados obtidos estão listados na Tabela 1. Tabela 1 Nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é Diâmetro Ce4+/Ce3+ coberta com polímero hidrodinâmico [nm] Poliamida (1) Exemplo 1 12,6 ± 2,9 1,92 Poliamida (2) Exemplo 2 9,8 ± 2,1 1,88 Poli(1-vinilimidazol) Exemplo 3 12,4 ± 2,9 1,75 Poli(4-vinilpiridina) Exemplo 4 9,4 ± 1,8 1,24 Poli(2-vinilpiridina) Exemplo 5 10,9 ± 4,0 1,42 Poli(9-vinilcarbazol) Exemplo 6 24,8 ± 3,6 4,00 (MEDIÇÃO DA RELAÇÃO CE4+/CE3+ EM NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE CÉRIO CUJA SUPERFÍCIE É COBERTA COM POLÍMERO)
[0095] A razão de Ce4+ para Ce3+ na nanopartícula de óxido de cério obtida em cada um dos Exemplos 1 a 6 foi medida pelo método de espectrometria de fotoelétrons de raios-X (XPS). Na medição, o raio-X de excitação da linha monocromática AlKα1,2 (1486,6 eV), o diâmetro de raios-X de 200 μm, e o ângulo de fuga de fotoelétrons de 45° foram usadas. Antes da medição, as nanopartículas de óxido de cério obtidas nos Exemplos 1 o 3 foram liofilizadas em água após a purificação e as nanopartículas de óxido de cério obtidas nos Exemplos 4 a 6 foram secas por um evaporador centrífugo após purificação. Os valores obtidos estão listados na Tabela 1.
(TESTE DE DECOMPOSIÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO)
[0096] A concentração de cada solução das nanopartículas preparadas nos Exemplos 1 a 6 e Exemplos Comparativos 1 foi ajustada para 2 mg/ml. Em primeiro lugar, a concentração da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção incluída em cada solução das nanopartículas preparadas nos Exemplos 1 a 6 foi calculada como segue. Cada solução das nanopartículas preparadas nos Exemplos 1 a 6 foi colocada em uma lamínula cuja massa havia sido medida previamente e, a seguir, foi aquecida em uma placa quente. Depois de resfriado ao ar, a massa da lamínula foi medida novamente. Obtendo a diferença da massa antes do aquecimento, foi obtida a massa da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção.
Esta massa foi dividida pela quantidade da solução gota a gota para determinar a concentração da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção na solução. Com base neste valor de concentração, cada uma das concentrações das nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção foi ajustada de modo a ser usada nos experimentos descritos abaixo.
[0097] A solução aquosa (2 μl) de cada uma das nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção preparada nos Exemplos 1 a 3 e da nanopartícula de óxido de cério preparada no Exemplo Comparativo 1, 0,5 μl da solução de 100 ng/μl de pUC19 como a amostra, incluindo o ácido nucleico, e 2,5 μl de tampão de acetato a 50 mM (pH 5) foram adicionados; em seguida, esta mistura foi deixada em repouso estaticamente à temperatura ambiente durante 1 hora para realizar a reação de decomposição do ácido nucleico.
[0098] A solução de 2 mg/ml de sulfóxido de dimetila (2 μl) de cada uma das nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção preparada nos Exemplos 4 a 6, 0,5 μl da solução de 100 ng/μl de pUC19 como a amostra, incluindo o ácido nucleico e 0,5 μl do tampão de acetato a 150 mM
(pH 5) foram adicionados e, em seguida, esta mistura foi deixada em repouso estaticamente em temperatura ambiente por 1 hora para realizar a reação de decomposição do ácido nucleico.
[0099] Como controle, 2 μl de água, 0,5 μl de 100 ng/μl de pUC19 e 2,5 μl do tampão de acetato a 50 mM (pH 5) foram adicionados; em seguida, esta mistura foi deixada em repouso estaticamente à temperatura ambiente durante 1 hora.
[00100] A cada uma das soluções após a reação foram adicionados 2 μl de SDS a 10% (dodecilsulfato de sódio poliacrilamida) e 3 μl de tampão fosfato a 0,5 M (pH 7) para realizar a eletroforese com um gel de agarose.
[00101] O gel de agarose após a eletroforese foi corado com brometo de etídio para detectar as bandas de pUC19. Quando a amostra, incluindo o ácido nucleico foi colocado em contato com a nanopartícula de óxido de cério descrita em cada um dos Exemplos 1 a 6 e Exemplo Comparativo 1, o pUC19 foi clivado, dessa forma a banda da estrutura circular fechada de pUC19 e a nova banda da sua estrutura circular aberta pôde ser reconhecida. Por outro lado, no controle, a banda da estrutura circular aberta não foi reconhecida, mas apenas a faixa da estrutura circular fechada foi reconhecida.
[00102] A concentração da banda (Y) da estrutura circular fechada em cada solução foi calculada, e a diferença com a concentração da banda (X) da estrutura circular fechada no controle foi calculada; então, a razão desse valor de diferença para (X) foi calculada como a taxa de decomposição.
Os resultados são listados na Tabela 2.
[00103] A partir desses resultados, foi confirmado que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode decompor o ácido nucleico a uma alta taxa de decomposição.
[00104] Por outro lado, a clivagem de pUC19 não foi capaz de ser observada com a nanopartícula de óxido de cério do Exemplo Comparativo 1. Tabela 2 Taxa de Nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é decomposição do coberta com polímero ácido nucleico [%] Poliamida (1) Exemplo 1 78,3 Poliamida (2) Exemplo 2 73,7 Poli(1-vinilimidazol) Exemplo 3 82,2 Poli(4-vinilpiridina) Exemplo 4 39,4 Poli(2-vinilpiridina) Exemplo 5 58,1 Poli(9-vinilcarbazol) Exemplo 6 51,6 Ácido poliacrílico Exemplo Comparativo 1 7,4 (TESTE DE DECOMPOSIÇÃO DO POLIPEPTÍDEO)
[00105] 3 μl da solução aquosa da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção que foi preparada no Exemplo 2 e a concentração da qual foi ajustada para 0,2 mg/ml, 3 μl de 1 mg/ml de ovalbumina (OVA) como a amostra incluindo o polipeptídeo, e 6 μl de tampão de acetato a 50 mM (pH 5) foram adicionados; em seguida, esta mistura foi deixada em repouso estaticamente a 40 °C durante 1 hora para realizar a reação de decomposição do polipeptídeo.
[00106] Como um controle, 3 μl de água destilada esterilizada, 3 μl de 1 mg/ml de OVA, e 6 μl de tampão de acetato a 50 mM (pH 5) foram adicionados; em seguida, esta mistura foi deixada em repouso estaticamente a 40 °C durante 1 hora para realizar a reação de decomposição do polipeptídeo.
[00107] A cada uma das soluções após a reação foi adicionado 4 μl de NuPAGE LDS Sample Buffer (fabricado pela Thermo Fisher Scientific Inc.); em seguida, aqueceu-se a 95 °C durante 10 minutos e realizou-se a eletroforese em um gel de acrilamida.
[00108] O gel de acrilamida após eletroforese foi tingido com Oriole (fabricado pela Bio-Rad Laboratories, Inc.) para detectar a banda de OVA.
Quando a amostra incluindo o polipeptídeo foi posta em contato com a nanopartícula de óxido de cério descrita no Exemplo 2, o OVA foi decomposto desse modo resultando em diminuição da concentração de banda, e uma nova banda manchada foi reconhecida. Por outro lado, no controle, a banda manchada sugerindo decomposição não foi reconhecida.
[00109] A concentração da banda (X) do controle e a concentração da banda (Y) deste Exemplo na mesma posição de peso molecular que o controle foram calculadas, respectivamente; em seguida, o valor da diferença entre (X) e (Y) foi calculado. A razão desse valor de diferença para (X) foi calculada como a taxa de decomposição. O resultado disso é listado na Tabela
3.
[00110] A reação de decomposição do polipeptídeo pela nanopartícula de óxido de cério preparada no Exemplo Comparativo 1 também foi realizada com a mesma operação nas mesmas condições descritas acima para calcular a taxa de decomposição.
[00111] A partir deste resultado, foi confirmado que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode decompor o polipeptídeo a uma alta taxa de decomposição.
[00112] Por outro lado, na nanopartícula de óxido de cério do Exemplo Comparativo 1, a decomposição do polipeptídeo dificilmente foi reconhecida. Tabela 3 Nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta Taxa de decomposição do com polímero polipeptídeo [%] Poliamida (2) Exemplo 2 82,7 Ácido poliacrílico Exemplo Comparativo 1 17,2 (TESTE DE DECOMPOSIÇÃO DE CORANTE)
[00113] 30 μl da solução aquosa de cada uma das nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção que foram preparadas nos Exemplos 1 a 3 e cuja concentração foi ajustada para 2 mg/ml, 60 μl de 0,5 mg/ml de ácido laranja 7 (AO7) como amostra incluindo o corante orgânico e 1,41 ml de água destilada foram adicionados; em seguida, esta mistura foi deixada em repouso estaticamente a 40 °C durante 3 horas para realizar a reação de decomposição do corante. Como controle, a solução AO7 não incluindo a nanopartícula de óxido de cério foi tratada da mesma forma que acima. Depois da reação, 100 μl da solução foi tomada e diluiu-se com 1,9 ml de água destilada; então, o espectro de absorção foi medido. No que diz respeito à amostra do controle, não houve alteração encontrada no espectro de absorção antes e após o aquecimento.
[00114] Na análise, foi utilizada a absorbância em 485 nm, o comprimento de onda na absorção máxima de AO7. O valor da diferença na absorbância entre o controle e este Exemplo foi calculado; então, a razão desse valor de diferença para a absorbância em 485 nm do controle foi calculada como a taxa de decomposição. Os resultados estão listados na Tabela 4.
[00115] O teste de decomposição do corante pela nanopartícula de óxido de cério preparada no Exemplo Comparativo 1 também foi realizado com a mesma operação nas mesmas condições descritas acima para calcular a taxa de decomposição.
[00116] A partir deste resultado, foi confirmado que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode decompor o corante a uma alta taxa de decomposição. Devido a tais características, a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser usada como o agente oxidante.
[00117] Por outro lado, na nanopartícula de óxido de cério do Exemplo Comparativo 1, a decomposição do corante foi dificilmente reconhecida. Tabela 4 Nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta Taxa de decomposição da com polímero matéria corante [%] Poliamida (1) Exemplo 1 60 Poliamida (2) Exemplo 2 62 Poli(1-vinilimidazol) Exemplo 3 54 Ácido poliacrílico Exemplo Comparativo 6 1
(MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DA OXIDASE)
[00118] TMBZ foi dissolvido em uma solução aquosa de DMSO a 90%; em seguida, a série de diluições de 10, 5, 2,5, 1,25 e 0,625 mM foi preparada. Cento e 60 μl do tampão citrato a 50 mM (pH 4) e 20 μl da solução TMBZ com cada concentração foram misturados; em seguida, a mistura resultante foi adicionada à placa de 96 poços. A esta adicionou-se 20 μl de cada uma das soluções aquosas de nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção que foram preparados nos Exemplos 1 a 3 e a concentração da qual foi ajustada para 2 mg/ml; então, imediatamente depois disso, foi colocado no leitor de placas para medir a mudança temporal da absorbância em 652 nm devido à coloração de TMBZ para uma cor azul com o intervalo de medição de 30 segundos e o período de medição de 10 minutos.
[00119] Para o cálculo da atividade da oxidase, foi utilizada a equação de Michaelis Menten. Uma vez que não houve nenhuma alteração na concentração de nanoceria, a aproximação do estado estacionário foi realizada nesta medição da atividade de oxidase para obter a constante de Michaelis Menten Km e a velocidade máxima de reação Vmax. Na análise da equação de Michaelis Menten, foi utilizado o gráfico Lineweaver (gráfico recíproco duplo).
Entre os resultados obtidos, a velocidade de reação máxima Vmax, o valor que indica a atividade de oxidase, é listada na Tabela 5.
[00120] A medição da atividade de oxidase da nanopartícula de óxido de cério preparado no Exemplo Comparativo 1 foi também realizada com a mesma operação sob as mesmas condições como as descritas acima, para calcular a velocidade de reação máxima Vmax.
[00121] A partir deste resultado, foi confirmado que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção possui uma alta atividade de oxidase. Devido a tais características, a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser usada como o agente de oxidação.
[00122] Por outro lado, na nanopartícula de óxido de cério do Exemplo Comparativo 1, a atividade da oxidase foi inferior aos valores das nanopartículas de óxido de cério dos Exemplos 1 a 3. Tabela 5 Nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta Atividade de oxidase Vmax com polímero [μM/seg] Poliamida (1) Exemplo 1 5,4 Poliamida (2) Exemplo 2 1,3 Poli(1-vinilimidazol) Exemplo 3 1,2 Exemplo Comparativo Ácido poliacrílico 0,7 1 (MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DA CATALASE)
[00123] A atividade da catalase foi medida usando o kit Amplex Red Catalase Assay (A22180) fabricado pela Thermo Fisher Scientific Inc. de acordo com o protocolo. Para descrever de forma simples, 50 μl de Tampão de Reação, 25 μl de cada uma das nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção que foram preparadas nos Exemplos 1 a 3 e cuja concentração foi ajustada para 16 μ g/ml, e 25 μl da solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 40 μM foram misturados; em seguida, a mistura resultante foi deixada em repouso estaticamente por 30 minutos para realizar a reação de decomposição do peróxido de hidrogênio. A solução de reação foi passada através da membrana de ultrafiltração de 30 kD; em seguida, 100 μl da solução de fluxo direto foram misturados com 50 μl de Solução de Trabalho para realizar a reação a 37 °C por 30 minutos. A resorufina gerada pela reação foi excitada a 544 nm, e a intensidade de fluorescência a 590 nm foi medida. Por comparação com a curva de calibração preparada pelo padrão de catalase, cujo valor ativo já era conhecido, foi calculada a atividade da catalase da nanopartícula de óxido de cério. Os resultados são listados na Tabela 6.
[00124] A medição da atividade da catalase da nanopartícula de óxido de cério preparada no Exemplo Comparativo 2 também foi realizada com a mesma operação nas mesmas condições descritas acima para calcular a atividade da catalase.
[00125] A partir deste resultado, foi confirmado que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção possui uma elevada atividade de catalase. Devido a tais características, a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser usada como antioxidante.
[00126] Por outro lado, na nanopartícula de óxido de cério do Exemplo Comparativo 2, a atividade da catalase foi inferior aos valores das nanopartículas de óxido de cério dos Exemplos 1 a 3. Tabela 6 Nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta Atividade catalase com polímero [U/ml] Poliamida (1) Exemplo 1 0,7 Poliamida (2) Exemplo 2 1,0 Poli(1-vinilimidazol) Exemplo 3 0,6 Exemplo CA/EDDS 0,3 Comparativo 2 (TESTE DE RETENÇÃO DE CORANTE POR ELIMINAÇÃO RADICAL)
[00127] 100 μl de solução aquosa de cloreto de ferro a 1 mM (II) e 100 μl da solução aquosa de solução de peróxido hidrogênio a 1 mM foram misturados e, em seguida, a esta solução misturada foram adicionados 10 μl da solução da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção que foi preparada em cada um dos Exemplos 1 a 3 e cuja concentração foi ajustada para 0,4 mg/ml; em seguida, a mistura resultante foi deixada em repouso estaticamente à temperatura ambiente durante 5 minutos. A esta solução misturada foram adicionados 90 μl da solução aquosa de azul de metileno a 100 μM; em seguida, este foi deixado estaticamente em temperatura ambiente por 25 minutos. Como um controle, o mesmo tratamento foi realizado para que a solução não incluindo a nanopartícula de óxido de cério. A solução padrão foi preparada pela mistura de 90 μl da solução aquosa de azul de metileno a 100 μM com 210 μl de água destilada. Em seguida, os espectros de absorção dessas soluções foram medidos.
[00128] Para a análise, foi utilizada a absorbância a 664 nm, o comprimento de onda de máxima absorção do azul de metileno. A diferença (ΔI0) entre a absorbância (I0) da solução padrão e a absorbância (Ic) do controle, e a diferença (ΔI) entre a absorbância (I) de cada um dos Exemplos 1 a 3 e foram calculadas as absorbâncias (Ic) do controle. A razão do último (ΔI) para o primeiro (ΔI0) foi calculada como a taxa de decomposição; e esta foi considerada a taxa de retenção do corante. Os resultados são listados na Tabela 7.
[00129] No que diz respeito à nanopartícula de óxido de cério de 0,4 mg/ml preparada no Exemplo Comparativo 1, o teste de retenção do corante também foi realizado com a mesma operação nas mesmas condições descritas acima para calcular a taxa de retenção do corante.
[00130] A partir deste resultado, foi confirmado que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode eliminar o radical. Devido a tais características, a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode ser usada como antioxidante.
[00131] Por outro lado, nas nanopartículas de óxido de cério do Exemplo Comparativo 1, a taxa de retenção de corante foi menor do que as nanopartículas de óxido de cério dos Exemplos 1 a 3. Tabela 7 Nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é coberta Taxa de retenção de matéria com polímero corante [%] Poliamida (1) Exemplo 1 62 Poliamida (2) Exemplo 2 90 Poli(1-vinilimidazol) Exemplo 3 63 Ácido poliacrílico Exemplo Comparativo 1 23 (TESTE ANTIFÚNGICO)
[00132] A solução das nanopartículas de óxido de cério de acordo com a presente invenção que tinha sido preparada no Exemplo 2 e a concentração da que tinha sido ajustada a 2 mg/ml foi passada através do filtro esterilizante com 0,45 μm. Conforme ilustrado na Figura 3, o meio de ágar de dextrose de batata (meio PDA) foi dividido em 3 compartimentos; em seguida, após a solução de nanopartículas de óxido de cério ter sido aplicada na área limite de um compartimento a outros compartimentos, esta foi seca com ar em uma bancada limpa por 30 minutos. Trichoderma (cepa QM9414 (NBRC 31329); até agora conhecido mutante pertencente a Trichoderma) foi inoculado no meio em um compartimento diferente do compartimento revestido, que foi então seguido por cultura a 28 °C para avaliar se o crescimento do mofo era capaz de ser suprimido devido à superfície revestida da nanopartícula de acordo com a presente invenção.
[00133] O resultado é ilustrado na Figura 4. O crescimento do mofo foi reconhecido após 42 horas do início da cultura. Após 311 horas, observou-se que o crescimento do mofo parou na superfície que tinha sido revestida com a nanopartícula de acordo com a presente invenção.
[00134] A partir deste resultado, foi confirmado que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção pode exibir o desempenho antifúngico.
(TESTE DE INATIVAÇÃO DE VÍRUS)
[00135] Este teste foi realizado no Kitasato Research Center for Environmental Science. Com 0,1 ml da solução de vírus (calicivírus felino F- 9, ATCC VR-782, substituto de norovírus), 0,9 ml da solução de nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção que tinha sido preparada no Exemplo 2 e cuja concentração havia sido ajustada para 10 mg/ml foi misturada e o vírus agiu por 1 hora. Em seguida, a PBS foi adicionado como a solução de interrupção da ação, para que a ação do vírus fosse interrompida. O título de infectividade foi medido com o método TCID50 usando esta solução como a solução original da amostra para medir o valor do vírus.
[00136] O valor de redução logarítmica do título de infectividade para o título de infectividade antes de aplicar a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente ação é listado na Tabela 8.
[00137] No que diz respeito à solução da nanopartícula de óxido de cério preparada no Exemplo Comparativo 1, o teste de inativação do vírus também foi realizado com a mesma operação nas mesmas condições descritas acima para calcular o valor de redução logarítmica do título de infectividade. Este resultado está listado na Tabela 8.
[00138] Uma vez que o valor de redução logarítmica foi de 4,0 neste resultado, foi confirmado que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção tem 99,99% da atividade antivírus.
[00139] Por outro lado, na nanopartícula de óxido de cério do Exemplo Comparativo 1, o valor de redução logarítmica foi 0,4, indicando que este tem um baixo desempenho de inativação de vírus. Tabela 8 Valor de redução logarítmica do Nanopartícula de óxido de cério cuja superfície é título de infectividade [%] coberta com polímero Poliamida (2) Exemplo 2 4,0 Exemplo Ácido poliacrílico -0,5 Comparativo 1 (OBSERVAÇÃO XAFS)
[00140] Um raio-X foi irradiado na solução da nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção que foi preparada no Exemplo 2 e a concentração da qual foi ajustada para 10 mg/ml para medir a quantidade de absorção da mesma, medindo assim o espectro de estrutura fina de absorção de raios X (XAFS). A medição foi realizada no High Energy Accelerator Research Organization Synchrotron Radiation Research Center (Photon Factory) BL12C usando o espectrômetro de cristal duplo Si (111) com a borda de absorção Ce L3, pelo método de detecção de transmissão, e com o detector de câmara de ionização.
[00141] O espectro XANES de borda Ce L3 é ilustrado na Figura 5. No espectro, a borda de absorção (E0) foi definida em 5724,4 eV, em que o eixo vertical era a razão baseada em 0 como a absorção média na faixa de 150 eV para 30 eV de E0, e 1 como a absorção média na faixa de +150 eV a +400 eV de E0.
[00142] No que diz respeito à solução da nanopartícula de óxido de cério preparada no Exemplo Comparativo 1, a observação XAFS foi também realizada com a mesma operação sob as mesmas condições como as descritas acima. O espectro XANES da borda Ce L3 assim obtido é exibido na Figura 5.
[00143] A partir deste resultado, pode ser visto que a nanopartícula de óxido de cério de acordo com a presente invenção tem as absorções máximas a 5728,003 eV no intervalo de 5726,0 eV a 5729,0 eV, e a 5736,582 eV no intervalo de 5735,0 eV a 5739,0 eV.
[00144] Por outro lado, pode ser visto que a nanopartícula de óxido de cério do Exemplo Comparativo 1 tem as absorções máximas a 5725,631 eV e 5736,582 eV; assim, esta tem a absorção máxima na faixa de 5735,0 eV a 5739,0 eV, mas não tem a absorção máxima na faixa de 5726,0 eV a 5729,0 eV.
(EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1) OBSERVAÇÃO XAFS
[00145] A observação XAFS foi realizada com a mesma operação sob as mesmas condições como as das observações XAFS nos Exemplos 1 a 3 como descritas acima, exceto que o cristal de óxido de cério, o qual não é a nanopartícula, carbonato de cério (III), nitrato de cério (III), ou nitrato de amônio e cério (IV), que são sais de cério, foram usados. Os espectros de XANES de borda Ce L3 deles são exibidos na Figura 6. Verificou-se que o cristal de óxido de cério teve as absorções máximas a 5729,751 eV e 5736,582 eV, o carbonato de cério (III) teve a absorção máxima a 5725,161 eV, o nitrato de cério (III) teve a absorção máxima a 5725,316 eV e nitrato de amônio e cério (IV) tiveram a absorção máxima a 5725,796 eV e 5736,105 eV; mas que nenhum dos sais de cério, até agora conhecidos e os compostos de cério tinha as absorções máximas na faixa de 5726,0 eV a 5729,0 eV e, na faixa de 5735,0 eV a 5739,0 eV.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES
1. NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO, caracterizada por uma superfície da nanopartícula de óxido de cério ser coberta com um polímero de vinila que tem um esqueleto de amina heterocíclico ou com uma poliamida tendo um esqueleto de amina heterocíclico.
2. NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo esqueleto de amina heterocíclico ser formado por qualquer um de piperazina, piridina, imidazol ou carbazol.
3. NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo polímero de vinila ser um polímero que tem o esqueleto de amina heterocíclico em uma cadeia lateral do polímero de vinila.
4. NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela poliamida ser um polímero que tem o esqueleto de amina heterocíclico em uma cadeia principal da poliamida.
5. NANOPARTÍCULA DE ÓXIDO DE CÉRIO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por um espectro XANES de borda Ce L3 obtido por uma medição de espectrometria de estrutura fina de absorção de raios-X ter uma absorção máxima em uma faixa de 5726,0 eV a 5729,0 eV e em um faixa de 5735,0 eV a 5739,0 eV.
6. MÉTODO DE DECOMPOSIÇÃO DE UM ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por compreende fazer com que uma amostra incluindo o ácido nucleico entre em contato com a nanopartícula de óxido de cério, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. MÉTODO DE DECOMPOSIÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, caracterizado por compreender fazer com que uma amostra incluindo o polipeptídeo entre em contato com a nanopartícula de óxido de cério, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
8. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA NANOPARTÍCULA DE
ÓXIDO DE CÉRIO, cuja superfície é coberta com um polímero, caracterizado pelo método compreender: processo a: misturar uma solução de um polímero possuindo um esqueleto de amina heterocíclico com uma solução incluindo um íon cério (III) ou com um sal de cério (III) para obter uma solução misturada; e processo b: adicionar um agente oxidante à solução misturada obtida no processo a.
9. AGENTE OXIDANTE, caracterizado por compreender a nanopartícula de óxido de cério, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
10. ANTIOXIDANTE, caracterizado por compreender a nanopartícula de óxido de cério, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
11. AGENTE ANTIFÚNGICO, caracterizado por compreender a nanopartícula de óxido de cério, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
12. AGENTE ANTIVÍRUS, caracterizado por compreender a nanopartícula de óxido de cério, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
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