CN108779455A - 核酸的回收方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供核酸的回收方法，其特征在于，是从生物学试样回收核酸的方法，其包含以下工序：工序a)，将水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体和包含核酸的溶液进行混合，使核酸吸附于载体的工序；工序b)，从在工序a)中混合后的溶液中分离出吸附有上述核酸的载体的工序；以及工序c)，在工序b)中分离出的吸附有上述核酸的载体中加入洗脱液来回收核酸的工序。

Description

核酸的回收方法
技术领域
本发明涉及回收核酸的方法、水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体以及核酸回收用的试剂盒。
背景技术
随着使用了核酸的实验技术的发展，新基因探索、其解析成为可能。为了弄清癌症等疾病而解析人的基因组，为了弄清病原体的感染而解析它们的基因组等，即使在医疗现场也进行着利用了基因解析的筛选检查、临床检查等。
此外，作为基因解析的目标，不仅是基因组那样的长链核酸，而且短链核酸也备受关注。近年来发现的miRNA是18个碱基长度以上且25个碱基长度以下的单链RNA，由60个碱基长度以上且90个碱基长度以下的pre-miRNA来生物合成。由于它们具有调节蛋白质的合成、基因的表达的功能，因此被认为与疾病有关系，作为基因解析的目标而备受关注。此外，还有如宏基因组(metagenomic)诊断法那样将临床检体中的病原体来源的数百碱基长度的核酸片段用新一代测序仪包罗地解析的方法，作为新的基因解析法而备受关注。可以说现在的基因解析的目标随着基因探索的发展而多样化了。因此，伴随着基因解析的目标的多样化，核酸的回收方法也需求能够回收从miRNA那样的数十碱基长度的核酸直至基因组那样的长链的核酸的方法。
在进行基因解析方面，首先需要的是从生物学试样回收核酸的工序。如果能够高纯度、高收率地回收核酸，则在之后的检测反应中进行高灵敏度的基因检测、以及基因解析成为可能。作为核酸的回收方法，可举出苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀和核酸向二氧化硅的吸附等作为代表性的方法。
其中最通用的方法是专利文献1所记载的、使核酸吸附于包含二氧化硅的金属氧化物、使其洗脱而回收的Boom法。该方法具有下述特征：能够通过离心操作从吸附有核酸的二氧化硅回收核酸，与此同时进行核酸的浓缩。然而，专利文献2中记载了，在使用了Boom法的情况下，具有300碱基长度以上且1000碱基长度以下的长度的核酸对二氧化硅的吸附性与具有比其更长长度的核酸的吸附性相比差。由此预想，回收具有100碱基长度以下的长度的pre-miRNA、miRNA是困难的。由于基因解析在医疗现场也被利用，因此优选不使用复杂的操作、有机溶剂就能够回收核酸的方法。
作为不使用有机溶剂的方法，专利文献3中记载了使用氧化铁等具有磁性的无机成分作为载体，使核酸吸附而回收的方法。然而，该方法中，存在无机成分洗脱于核酸的回收液，回收的核酸的纯度降低的课题，因此一并记载了用聚合物、金属氧化物涂布于无机成分的载体的方法。
此外，作为不使用有机溶剂的其它方法，有使用了硅胶的离子交换柱的方法。专利文献4中记载了，使离子交换柱所使用的硅胶的载体含有二氧化钛、二氧化铈、氧化锆、氧化铪等比重大的粒子，提高柱的密度，使核酸的回收量提高的方法。然而，专利文献4的方法中，虽然能够提高质粒的回收效率，但段落[0134]中记载了小片段的核酸不能吸附于载体，预想回收作为非常短的核酸的pre-miRNA、miRNA是困难的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5234809号说明书
专利文献2：日本特表2011-522529号公报
专利文献3：日本特开2007-6728号公报
专利文献4：日本特表2002-510787号公报
发明内容
发明所要解决的课题
如上述那样，研究了各种核酸的回收方法，但如上述那样专利文献4所记载的方法中，预想回收作为非常短的核酸的pre-miRNA、miRNA是困难的。此外，关于专利文献3的将氧化铁作为载体的回收方法，由于实际上并未公开回收核酸的结果，因此并不明确能够以何种程度的效率回收何种程度的长度的核酸。作为专利文献3的补充试验实验，在后述的比较例1中，进行了以氧化铁作为载体来回收核酸的实验，但可知氧化铁对核酸的吸附性非常低，不适于核酸的回收。此外，比较例2中，假定用金属氧化物被覆氧化铁的载体，以表面未吸附聚合物的氧化铈作为载体来进行回收核酸的实验。然而，不能有效率地洗脱吸附于氧化铈的核酸。
本发明人等认为，为了高效率地回收从pre-miRNA、miRNA那样的非常短的核酸到基因组那样的长的核酸，需要找出以高的吸附率吸附核酸的载体、和能够高效率地洗脱所吸附的核酸的方法。
用于解决课题的方法
作为核酸吸附率高的载体，本发明人等新发现了氧化铈载体。进一步明确了：通过使水溶性的中性聚合物吸附于表面，能够不使核酸的吸附率降低，并且改善核酸的洗脱率，从而完成了本发明。
本发明如下所述。
(1)一种核酸的回收方法，其特征在于，是从生物学试样回收核酸的方法，其包含以下工序：
工序a)，将水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体和包含核酸的溶液进行混合，使核酸吸附于载体的工序，
工序b)，从在工序a)中混合后的溶液中分离出吸附有上述核酸的载体的工序，以及
工序c)，向工序b)中分离出的吸附有上述核酸的载体中加入洗脱液来回收核酸的工序。
(2)根据(1)所述的核酸的回收方法，其特征在于，上述水溶性的中性聚合物是在pH值为7的溶液中具有-10mV以上且+10mV以下的ζ电位的聚合物。
(3)根据(1)或(2)所述的核酸的回收方法，其特征在于，上述聚合物为聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-唑啉)、聚丙二醇、聚丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺或羟基丙基甲基纤维素。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，上述洗脱液为缓冲液。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，上述生物学试样为血液、尿、唾液、粘膜、汗、培养细胞、培养细胞的培养液、组织试样、标本、微生物、微生物的培养液或病毒。
(6)一种载体，是水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体。
(7)根据(6)所述的载体，其特征在于，上述水溶性的中性聚合物是在pH值为7的溶液中具有-10mV以上且+10mV以下的ζ电位的聚合物。
(8)根据(6)或(7)所述的载体，其特征在于，上述水溶性的中性聚合物为聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-唑啉)、聚丙二醇、聚丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺或羟基丙基甲基纤维素。
(9)一种核酸回收用的试剂盒，其特征在于，具备(6)～(8)中任一项所述的载体、和缓冲液。
发明的效果
通过本发明，如果使用水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体，则能够通过简便的方法高收率地回收核酸，进一步也能够以高收率回收迄今为止难以有效率回收的pre-miRNA、miRNA等非常短的核酸。
具体实施方式
本发明中使用的生物学试样可以使用包含核酸的任意试样。核酸中，可举出例如，RNA、DNA、RNA/DNA(嵌合体)和人工核酸等。DNA中，可举出cDNA、微DNA、游离DNA(cell-freeDNA)、基因组DNA和合成DNA等。此外，RNA中，可举出总RNA、mRNA、rRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、snRNA或non-coding RNA、它们的前体或合成RNA等。合成DNA和合成RNA可以基于规定的碱基序列(可以为天然型序列或非天然型序列中的任一种)，使用例如自动核酸合成机，人工地制作。
此外，作为生物学试样，可以利用例如，培养细胞、培养细胞的培养液、组织试样、标本等细胞来源的试样、细菌、真菌、原生生物、病毒等微生物来源的试样、血液、尿、唾液、粘膜、汗、痰、精液等体液、大小便等包含人的动物来源的试样、除了核酸以外还有包含蛋白质、糖、脂质等具有生物学功能的化合物的溶液等，不限定于此。上述生物学试样优选为培养细胞、体液，进一步优选为血液。血液包括全血、血浆、血清、血细胞等。
在这些生物学试样为体液等液体试样的情况下，可以在采集后直接适用本发明，也可以在采集后添加溶液进行稀释。在生物学试样为细胞团块、组织切片等固体试样的情况下，可以在采集后用水、缓冲液进行稀释后用于本发明。
生物学试样可以根据需要进行以下那样的处理。这是因为通常核酸在生物学试样中内包于细胞膜、细胞壁、小泡(vesicle)、脂质体、微团(micelle)、核糖体、组蛋白、核膜、线粒体、病毒的衣壳、包膜(envelope)、核内体或外来体那样的化合物，或它们之间发生相互作用。为了更高收率地回收核酸，可以进行以使核酸从它们之中游离出来为目的的处理。
具体而言，为了提高从包含大肠杆菌的生物学试样回收核酸的回收效率，可以进行以下那样的处理。例如，可以对包含大肠杆菌的生物学试样添加0.2M的氢氧化钠和1％的SDS的混合液(碱变性法)，此外，还可以添加10％的十二烷基肌氨酸钠溶液(利用十二烷基肌氨酸钠进行的非变性法)。此外，可以向这些溶液中添加溶菌酶。此外，还可以利用蛋白酶K在37℃进行1小时处理。作为其它方法，还可以进行超声波处理。
对于生物学试样，为了提高从包含酵母的生物学试样回收核酸的回收效率，可以进行以下那样的处理。例如，也可以用从生化学工业株式会社、ナカライテスク株式会社市售的酵母裂解酶(Zymolyase)进行了处理后加入10％的SDS。
对于生物学试样，为了提高从包含细胞的生物学试样回收核酸的回收效率，可以进行以下那样的处理。例如，可以加入1％的SDS。作为其它方法，可以加入4M以上的盐酸胍、硫氰酸胍和尿素等。也可以对该溶液，以成为0.5％以上的方式加入十二烷基肌氨酸钠。此外，也可以以成为50mM以上的浓度的方式加入巯基乙醇。
在上述操作中，为了抑制生物学试样所包含的核酸的分解，可以添加核酸的分解酶的抑制剂。作为DNA分解酶的抑制剂，可以以1mM以下的浓度添加EDTA。此外，可以使用作为RNA分解酶的抑制剂被市售的RNasin Plus Ribonuclease Inhibitor(プロメガ株式会社)、Ribonuclease Inhibitor(タカラバイオ株式会社)、RNase inhibitor(东洋纺株式会社)等。
在生物学试样中混合存在有DNA和RNA的情况下，也可以通过苯酚/氯仿提取来进行分离。例如，如果在酸性条件下进行苯酚/氯仿提取，则RNA分离至水相，DNA分离至氯仿相；如果在中性条件下进行苯酚/氯仿提取，则RNA和DNA分配于水相。可以利用该性质，根据要取得的核酸的种类来选择条件。上述氯仿还可以置换成对溴茴香醚。
苯酚/氯仿提取还可以利用作为市售试剂的ISOGEN(注册商标：株式会社ニッポンジーン)、TRIzol(注册商标：ライフテクノロジーズジャパン株式会社)、RNAiso(タカラバイオ株式会社)、3D-Gene(注册商标)RNA extraction reagent from liquid sample kit(東レ株式会社)。以上的处理可以仅进行其一个工序，还可以与其它操作中的工序进行组合。此外，它们所使用的溶液的浓度也可以根据需要进行改变。
在本发明中，作为包含核酸的溶液，可以使用溶解有核酸、人工核酸、实施了色素、磷酸基等修饰的核酸的溶液；在使用生物体试样的情况下，可以使用体液等液体试样、其稀释液、细胞团块、组织切片等固体试样的稀释液。此外，可以直接使用对包含液体试样、固体试样的生物学试样进行上述任一处理之后获得的溶液，可以根据需要进行稀释。稀释的溶液不受特别限定，优选使用水、Tris-盐酸缓冲液等包含核酸的溶液所通用的溶液。包含核酸的溶液优选为例如，添加了4M以上的盐酸胍、硫氰酸胍、尿素的生物学试样。
在本发明中，回收的核酸的长度没有特别限定，能够以高收率回收从数十碱基长度的短核酸到如基因组那样的长核酸。特别是，也能够以高收率回收依靠现有技术难以回收的1000碱基长度以下的短链核酸，此外，也能够以高收率回收100碱基长度以下的pre-miRNA、miRNA。
本发明通过使用水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体，来实现高收率的核酸的回收。本发明的载体，本发明的载体为水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体。以下记载为本发明的载体。
利用了本发明的载体的核酸回收中，首先以使核酸吸附于本发明的载体作为特征，本发明的载体具有优异的核酸吸附能力。本发明的载体的核酸吸附能力可以通过吸附于本发明的载体的核酸的吸附率来评价，可以如下算出。首先，算出包含核酸的溶液中的核酸量。接下来将本发明的载体和包含核酸的溶液进行混合，算出核酸吸附于本发明的载体后的混合液中的核酸量，求出与包含核酸的溶液中的核酸量之差。将所得的值作为吸附于本发明的载体的核酸量，将吸附于本发明的载体的核酸量除以包含核酸的溶液中的核酸量，从而可以算出核酸的吸附率。作为核酸量的定量的方法，可举出吸光度测定、荧光测定、发光测定、电泳、PCR、RT-PCR、使用了微阵列的解析、使用了测序仪的解析等。如果是非修饰的核酸，则可以通过测定260nm下的吸光度来定量核酸量。此外，如果是被荧光色素修饰了的核酸，则可以通过将该荧光色素来源的荧光强度与浓度已知的溶液的荧光强度进行比较来定量核酸量。此外，可以通过电泳来进行。利用电泳进行的回收率的计算方法可以通过将浓度已知的样品与进行了回收操作的样品同时泳动，将凝胶染色，通过图像解析来比较谱带的浓度从而确定。
另一方面，利用了本发明的载体的核酸回收中，由于是通过洗脱液使吸附于本发明的载体的核酸从载体洗脱的核酸回收，因此本发明的载体具有对洗脱液的优异的核酸洗脱能力。本发明的载体的核酸洗脱能力可以通过核酸从本发明的载体向洗脱液的洗脱率来评价，可以如下求出。对吸附有核酸的本发明的载体中加入洗脱液，算出洗脱后的溶液中的核酸量，算出核酸的洗脱量。可以将该核酸的洗脱量除以上述算出的吸附于本发明的载体的核酸量，算出洗脱率。
因此，本发明的核酸的回收方法中的核酸回收能力可以如下评价：由通过上述方法算出的核酸的吸附率与洗脱率之积算出核酸的回收率，由此来评价。
此外，不定量核酸的收量，而将通过本发明的方法回收的核酸的收量、与通过本发明的方法以外的方法回收的核酸的收量进行比较，可以评价本发明的核酸的回收方法的核酸回收能力。作为本发明的方法以外的核酸的回收方法，可举出例如，采用市售的试剂盒进行的回收方法等。作为具体的核酸的回收量的比较方法，首先，对相同量的生物学试样使用本发明的载体和本发明的载体以外的载体将核酸吸附、洗脱并回收核酸。洗脱液的体积可以不同也可以相同，但优选为相同。在不同的情况下，将回收的核酸稀释或浓缩，制成相同体积。将两样品进行电泳，将凝胶染色并用荧光扫描仪等取得图像，在通过图像解析将对应于目标的核酸组分的谱带浓度进行比较，从而能够将通过本发明的方法回收的核酸的收量、与通过本发明的方法以外的方法回收的核酸的收量进行比较。
在本发明中，聚合物是多个作为基本单元的被称为单体(単量体)、单体(モノマー)的重复单元连接了而成的化合物的总称。本发明的载体所使用的聚合物中包含由1种单体形成的均聚物和由2种以上单体形成的共聚物的任一种，还包含任意聚合度的聚合物。此外，天然聚合物和合成聚合物中的任一种都包含于本发明的载体所使用的聚合物。
本发明的载体所使用的水溶性的中性聚合物是具有能够溶解于水的性质，在水中的溶解度为至少0.0001wt％以上、优选为0.001wt％以上、更优选为0.01wt％以上、进一步优选为0.1wt％以上的聚合物。
本发明中使用的水溶性的中性聚合物优选为在pH值为7的溶液中的ζ电位为-10mV以上且+10mV以下的聚合物。更优选为-8mV以上且+8mV以下，进一步优选为-7mV以上且+7mV以下，特别优选为-4.0mV以上且+6.5mV以下的聚合物。
所谓ζ电位，是表示溶液中的胶体的界面的电性质的值之一。如果带电的胶体分散于溶液中，则在胶体的表面，通过相对于胶体的表面电荷的抗衡离子而形成双电层。将此时的胶体表面的电位称为表面电位。双电层通过胶体的表面电荷的静电相互作用而形成，因此离子牢固地固定于胶体侧附近。将在双电层中通过静电相互作用而抗衡离子牢固地固定于胶体表面的层称为固定层，将固定层的电位称为固定电位。如果使胶体相对于溶液进行移动，则固定层与胶体一起移动。此时，从胶体来看在与固定层相比靠外侧，由于溶液所具有的粘性，因此具有与胶体一起移动的边界面。将其称为滑动面、或滑面。将充分远离胶体的地点的电位设为零点时的、该滑动面的电位定义为ζ电位。这样，ζ电位依赖于胶体的表面电荷而发生变化，表面电荷根据依赖于pH的质子的附着和分离而发生变化，因此在本发明中，将pH值为7的溶液中的值设为基准。此外，一般而言，与胶体的尺寸相比，直至滑动面的距离小，因此还可以将胶体的表面近似地表示为滑动面。本发明所使用的水溶性的中性聚合物的情况也同样地，可以将分散于溶液中的胶体的表面电位看作ζ电位。
本发明的ζ电位使用通过激光-多普勒电泳法测定的值。ζ电位的测定可以通过使用ζ电位测定装置来进行。ζ电位测定装置由大塚电子株式会社、Malvern InstrumentsLtd.、Ranku Brother Ltd.、PenKem Inc.等市售。
在测定聚合物的ζ电位的情况下，可以调制聚合物溶液作为胶体分散溶液，测定ζ电位。使聚合物溶解于例如磷酸缓冲液、氯化钠溶液、柠檬酸缓冲液等电解质中来调制聚合物溶液，检测分散于溶液中的聚合物的散射光、反射光来进行测定。胶体的尺寸越大，则能够以越低浓度检测散射光、反射光。
通过激光-多普勒法测定聚合物的ζ电位的条件是，以使聚合物的浓度成为0.1wt％以上且10wt％以下的方式将其溶解于磷酸缓冲液(10mM，pH值为7)，将该溶液加入到测定用单元(cell)中，设置于以激光-多普勒电泳法作为原理的ζ电位测定装置，在室温下进行测定。本发明的ζ电位可以利用例如大塚电子株式会社的ζ电位测定装置ELS-Z等。
作为本发明的载体所使用的水溶性的中性聚合物，具体而言，可举出以下物质。可以使用例如，聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮等聚乙烯基系聚合物、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或聚(N-(羟基甲基)丙烯酰胺等聚丙烯酰胺系聚合物、聚乙二醇、聚丙二醇或聚四亚甲基醚二醇等聚亚烷基二醇系的聚合物、聚(2-乙基-2-唑啉)、(羟基丙基)甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、2-羟基乙基纤维素或羟基丙基纤维素等的纤维素等。此外，还可以使用包含上述聚合物的共聚物。
此外，聚蔗糖(日文原文：フィコール)、琼脂糖、壳多糖和葡聚糖等多糖或多糖类似物、以及白蛋白等蛋白质、肽也包含于本发明的水溶性的中性聚合物中。
可以使水溶性的中性聚合物的官能团的一部分离子化，或置换成显示阳性、阴性的官能团，或在侧链导入乙酰基等表现水溶性的官能团。
作为水溶性的中性聚合物的分子量，可以优选使用例如，0.4kDa以上且1000kDa以下的聚合物，更优选为2kDa以上且500kDa以下，更优选为4kDa以上且150kDa以下，进一步优选为6kDa以上且150kDa以下，最优选为6kDa以上且10kDa以下。
本说明书中，使用通过凝胶渗透色谱(GPC)测定的值作为分子量。GPC的装置可以使用例如東ソー社的EcoSEC HLC-8320GPC等装置，使用東ソー社的TSK-gelα柱等来测定。
本发明的载体所使用的氧化铈为由CeO2的组成式表示的两性氧化物，也称为二氧化铈。
氧化铈可以使用天然产出的氧化铈，也可以使用工业制作的氧化铈。作为制作氧化铈的方法，可举出例如，将氧化铈的草酸盐、碳酸盐进行热分解的方法、将氧化铈的硝酸盐的水溶液进行中和而获得的氢氧化氧化铈的沉淀物进行烧成的方法等。工业上制作的氧化铈可以由试剂制造商、催化剂化学制造商、一般社团法人催化剂学会的参照催化剂部门等获得。
本发明的载体所使用的氧化铈为粒状的为好。粒径可以一致，也可以混合利用不同的粒径。粒径只要为在将水与氧化铈粒子的混合物以6000G进行1分钟离心分离时，氧化铈的粒子发生沉淀的大小即可，例如，可以优选使用100μm以下的氧化铈，可以使用优选为50μm以下的氧化铈，可以使用更优选为10μm以下的氧化铈。
在本发明中，粒径可以如下算出：由使用基于激光衍射-散射法的粒度分布测定装置测定的结果而获得的等效球直径的频率分布，以50％径(D50，中值粒径)的值的形式而算出。
本发明所使用的洗脱液只要能够使吸附于本发明的载体的核酸洗脱，就不受特别限定，优选为缓冲液，缓冲液中可以包含螯合剂。具体而言，可举出包含柠檬酸和柠檬酸钠的柠檬酸缓冲液、包含磷酸和磷酸钠的磷酸缓冲液、在包含三羟基氨基甲烷和盐酸的Tris-盐酸缓冲液中添加有EDTA的Tris-EDTA缓冲液等。
缓冲液的pH优选为pH4以上且pH9以下，更优选为pH5以上且pH8以下。
缓冲液所包含的螯合剂可以使用具有带有多个配位座的配位体、且对金属离子结合、形成配位化合物的物质。
作为具体的螯合剂，可举出乙二胺四乙酸(EDTA)、次氮基三乙酸(NTA)、二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、多磷酸、偏磷酸和/或它们的盐等。螯合剂的终浓度不受特别限定，只要为50mM以上即可，优选为100mM以上，进一步优选为500mM以上。
此外，作为成为上述以外的螯合剂的化合物，可举出阴离子性的聚合物。侧链具有羧酸的聚合物由于将金属离子进行配位，因此它们也可以包含于缓冲液中。作为具有这样的功能的聚合物，可举出聚乙烯基磺酸和/或它们的盐。其终浓度不受特别限定，只要为1wt％以上即可，优选为10wt％以上。
本发明是从生物学试样回收核酸的方法，其包括下述工序：工序a)，将氧化铈表面吸附了水溶性的中性聚合物而得的载体和包含核酸的溶液进行混合，使核酸吸附于载体的工序；工序b)，从在工序a)中混合后的溶液中分离出吸附有上述核酸的载体的工序；工序c)，向工序b)中吸附有上述核酸的载体中添加洗脱液来回收核酸的工序。以下，对各个工序进行详细地说明。
本发明的载体通过使水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面来制作。聚合物可以不以均匀的厚度吸附于氧化铈表面。
作为使水溶性的中性聚合物吸附的前阶段，可以预先将氧化铈用水、乙醇等溶液洗涤，除去吸附于表面的杂质，也可以省略本洗涤操作。
使水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面的方法，可举出例如，使水溶性的中性聚合物溶解而调制水溶性的中性聚合物溶液，使其与氧化铈接触的方法。具体而言，可以使氧化铈浸渍于水溶性的中性聚合物溶液，或将水溶性的中性聚合物溶液滴加于氧化铈，或将水溶性的聚合物溶液涂布于氧化铈，或使水溶性的聚合物溶液成为雾状而喷射于氧化铈。
使氧化铈浸渍于水溶性的中性聚合物溶液的方法没有特别限定。例如，在氧化铈中添加水溶性的中性聚合物溶液后，可以进行静置，也可以进行搅拌。在进行搅拌的情况下，可举出冲吸(pipetting)、颠倒混合、用搅拌器、混合机、涡旋混合机、磨机等分散机、超声波处理装置等进行搅拌的方法。
水溶性的中性聚合物浓度没有特别限定，优选为0.01wt％以上，更优选为0.1wt％以上。
在进行静置的情况下的浸渍时间没有特别限定，优选为5分钟以上。此外，关于进行搅拌时的搅拌时间，只要水溶性的中性聚合物与氧化铈被均匀地混合，就没有特别限定，在涡旋的情况下优选搅拌1分钟以上，更优选为5分钟以上。
此外，也可以使用筛子、笊篱等将水溶性的中性聚合物浸渍涂布在氧化铈表面。关于浸没于溶液时的混合时间，只要为0.1wt％以上的聚合物浓度，则优选为5分钟以上，优选为30分钟以上。
在滴加水溶性的中性聚合物溶液的情况下，可以使用滴管、滴液漏斗等。在滴加聚合物溶液时，可以使氧化铈振动，或使其旋转，可以使用旋转涂布机等。
在涂布水溶性的中性聚合物溶液的情况下，可以使用毛刷、辊、线棒。
在使水溶性的中性聚合物溶液成为雾状来进行喷射的情况下，可以使用空气喷涂、气刷等。
采用上述所例示的方法使水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈之后，可以进行离心分离操作，来除去成为上清液的聚合物溶液，也可以不进行离心分离操作而直接用于核酸的回收。此外，在使水溶性的中性聚合物溶液溶解于溶剂的情况下，在使水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈，并除去溶剂之后，可以使其干燥，也可以不使其干燥而用于核酸的回收。
所得的本发明的载体可以使用预先制作而保存的载体，也可以用时调制来使用。
关于水溶性的中性聚合物溶液，如果获得的水溶性的中性聚合物为固体，则可以通过溶解于水、有机溶剂来调制，如果为溶液，则可以通过进行稀释来调制。在聚合物难以溶解的情况下、在溶液的粘度高而难以混合的情况下，可以进行加热处理、超声波处理。有机溶剂优选使用例如，乙醇、乙腈、甲醇、丙醇、叔丁醇、DMF、DMSO、丙酮、乙二醇、甘油等与水具有双溶性的有机溶剂。此外，在水中难以溶解的情况下，可以添加上述有机溶剂。
此外，使氧化铈与水溶性的中性聚合物通过连接分子等来使其共价结合而制作的载体并不相当于本发明的载体。作为具体的连接分子，可举出硅烷偶联剂等。
工序a)是将通过上述制作方法制作的本发明的载体和包含核酸的溶液进行混合，使核酸吸附于本发明的载体的工序。本发明的载体和包含核酸的溶液的混合方法不受特别限定，可以通过例如冲吸、颠倒混合来进行，可以使用混合机、涡旋混合机等装置。混合时间不受特别限定，只要为5分钟左右即可，可以混合5分钟以上的时间。此外，可以将本发明的载体填充至柱，使包含核酸的溶液通过。
工序b)是从在工序a)中混合后的溶液中分离出吸附有上述核酸的本发明的载体的工序。作为分离的方法，可举出将在工序a)中混合后的溶液离心分离，使吸附有核酸的本发明的载体沉淀，除去上清液的方法。由于吸附有核酸的本发明的载体的比重比水重，因此可以通过离心操作使其容易地沉淀。离心分离的条件只要以6000G处理1分钟即可，更优选以10000G处理1分钟。作为其它分离方法，可举出使用超滤膜的方法。使在工序a)中混合后的溶液通过具有比吸附有核酸的载体的粒径小的孔径的超滤膜，将吸附有核酸的载体进行分离。这样的超滤膜被试剂盒化，可以获得以メルク株式会社的ウルトラフリー(注册商标)、Pall Corporation的ナノセップ(注册商标)为代表的离心过滤试剂盒来利用。
此外，可以在工序b)的操作之后，根据需要进行以下那样的处理。这是因为在工序a)之后，目标核酸以外的生物学试样来源物有可能吸附于本发明的载体的表面。例如，为了更高纯度地离析核酸，可以进行洗涤、分解的处理。具体而言，可以进行下述各种处理：为了除去非特异性地吸附的化合物而用水进行洗涤；为了除去非特异性地吸附的蛋白质而用表面活性剂进行洗涤；为了除去离子、低分子化合物而用包含表面活性剂的溶液进行洗涤；为了除去非特异性地吸附的疏水性化合物而用有机溶剂进行洗涤；为了分解非特异性地吸附的蛋白质而添加蛋白质分解酶；为了仅离析DNA而添加RNA分解酶以及为了仅离析RNA而添加DNA分解酶；等。
工序c)是在工序b)中分离出的吸附有上述核酸的本发明的载体中添加洗脱液来回收核酸的工序。
在回收添加上述洗脱液而洗脱出的核酸时，在要将本发明的载体与使核酸洗脱的溶液进行分离的情况下，可举出在工序c)中，将向吸附有核酸的载体中添加洗脱液而获得的混合物进行离心分离，使本发明的载体沉淀，取得核酸洗脱了的上清液的方法。由于本发明的载体的比重比水重，因此能够通过离心操作使其容易地沉淀。离心分离的条件是只要以6000G处理1分钟即可，优选以10000G处理1分钟。
作为其它分离方法，可举出使用超滤膜的方法。使工序c)中获得的混合物通过具有比本发明的载体的粒径小的孔径的超滤膜，将本发明的载体进行分离。这样的超滤膜被试剂盒化，可以获得以メルク株式会社的ウルトラフリー(注册商标)、Pall Corporation的ナノセップ(注册商标)为代表的离心过滤试剂盒来利用。
回收的核酸可以根据需要进行化学修饰。化学修饰中可举出对核酸的末端的荧光色素修饰、消光剂修饰、生物素修饰、氨基化、羧基化、马来酰亚胺化、琥珀酰亚胺化、磷酸化和脱磷酸化等，此外可举出利用嵌入剂进行的染色。这些修饰可以通过化学反应被导入，可以通过酶反应被导入。可以在上述定量之前导入这些修饰基团，不是将回收的核酸本身进行定量，而是将经过化学修饰而导入的修饰基团进行定量，从而间接地定量核酸。由于通过本发明来回收核酸，特别是即使是短链核酸也能够高收率地回收，因此在上述定量时能够高灵敏度地定量。
本发明的核酸回收用试剂盒可以用于从生物学试样有效率地回收核酸。
本发明的核酸回收用试剂盒包含本发明的载体和缓冲液作为其构成成分。此外，除了这些以外，还可以包含说明书等。
本发明的核酸回收用的试剂盒所包含的本发明的载体可以为干燥了的状态，也可以为浸渍于水溶性的中性聚合物的溶液中的状态。
本发明的核酸回收用的试剂盒所包含的缓冲液可以利用能够用于上述工序c)的洗脱液的缓冲液。
实施例
通过以下的实施例来进一步具体地说明本发明。
＜材料和方法＞
聚乙二醇由メルク株式会社获得，聚(2-乙基-2-唑啉)由Alfa Aesar，AJohnson Matthey Company获得，氧化铈(粒径4.4μm)由第一稀元素化学工业株式会社获得。实施例中使用的聚合物水溶液以各自的浓度溶解于水或水与乙醇的混合溶剂。此外，只要没有特别指明，氧化铈不进行筛分等而以购入状态用于实验。
此外，质粒DNA(2.7kbp)的pUC19和大肠杆菌的E.coli DH5α Competent Cells由タカラバイオ株式会社购入，溴化乙锭(Ethidium Bromide)、LB培养基的LB Miller、RPMI培养基的RPMI 1640(含有L-谷氨酰胺)、酵母裂解酶(Zymolyase)由ナカライテスク株式会社购入，Buffer RLT、Buffer RLT Plus、DNeasy Blood&Tissue Kit由キアゲン社购入，MagMax cell-FreeDNA Isolation kit和TrypLE Express由サーモフィッシャー株式会社购入，胎牛血清的Fetal Bovine Serum Sterile Filtered由Equitech-Bio社购入，四氧化三铁由关东化学株式会社购入。YPD培养基将1％Yeast extract(酵母提取物，ベクトン·ディッキンソン株式会社)、2％Polypeptone(聚蛋白胨，ベクトン·ディッキンソン株式会社)和2％D-葡萄糖(和光纯药株式会社)混合而调制。作为非常短的核酸，由ユーロフィンジェノミクス株式会社购入将作为miRNA的let7a序列已知的22碱基长度的核酸转变为DNA序列而合成的物质、以及作为RNA序列而合成的物质。以下关于RNA序列的合成核酸，记载为RNA22，关于DNA序列的合成核酸，记载为DNA22。这些核酸不特别纯化而直接使用。此外，实施例中使用的566bp的DNA序列通过PCR反应扩增而取得。以下，记载为DNA566。具有10kbp以上的长度的大肠杆菌的基因组片段从大肠杆菌DH5α取得。关于其它试剂，由和光纯药株式会社、东京化成株式会社、シグマーアルドリッチジャパン合同会社购入，不特别纯化而直接使用。
混合机使用东京理化器械株式会社的CUTE MIXER CM-1000，荧光计使用ThermoFisher Scientific株式会社的Nanodrop3300和株式会社堀场制作所的FLUOROMAX-3，ζ电位的测定使用大塚电子株式会社的ELS-Z，琼脂糖凝胶电泳使用株式会社アドバンス的Mupid-eXU，丙烯酰胺凝胶电泳使用アズワン株式会社的迷你凝胶斯拉夫电泳装置。染色了的琼脂糖凝胶使用作为荧光扫描仪的GEヘルスケア·ジャパン株式会社的Typhoon9410来解析，染色了的丙烯酰胺凝胶使用作为荧光扫描仪的GEヘルスケア·ジャパン株式会社的Typhoon FLA 9500来解析。琼脂糖凝胶的图像解析使用了Molecular Dynamics社的ImageQuant(注册商标)，丙烯酰胺凝胶的图像解析使用了Molecular Dynamics社的ImageQuant TL(注册商标)。
＜比较例1＞仅使用了氧化铁作为载体的核酸的回收方法
研究了专利文献3的实施例所记载的使用了氧化铁作为载体的核酸的回收方法。作为氧化铁，使用了和光纯药社制的α-氧化铁。其它为与专利文献3的实施例同样的条件，因此作为核酸溶解液，使用了6M硫氰酸胍水溶液，作为洗脱液，使用了TE缓冲液或水。
最初在1.5ml管中量取0.5mg的氧化铁。分别加入200μl的乙醇，涡旋后，用离心机离心1分钟而除去上清液。将该操作进一步进行2次，进行洗涤，作为载体使用。
接着，对洗涤了的氧化铁加入溶解了100pmol的DNA22的6M硫氰酸胍水溶液100μl，用混合机搅拌5分钟，离心(10000G，1min)而舍弃上清液。对剩下的载体加入0.05％Tween水100μl，进行涡旋。将该操作进一步进行2次。然后，分别加入50μl的水或TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8)缓冲液并用混合机搅拌5分钟。用离心机离心(10000G，1min)，将上清液作为核酸溶液而回收。
核酸对核酸载体的吸附率通过Cy3的荧光测定如下那样算出。首先，测定加入氧化铈前的溶解了100pmol的DNA22的6M硫氰酸胍水溶液100μl的荧光强度，接下来测定加入氧化铈进行混合后的荧光强度。将加入氧化铈后的荧光强度除以加入前的荧光强度，取与加入前的核酸量(100pmol)的积而算出溶液中的核酸量。取加入前的核酸量(100pmol)与该值的差，算出吸附的核酸量。将吸附的核酸量除以加入氧化铈前的核酸量(100pmol)，算出吸附率。
洗脱率通过Cy3的荧光测定如下那样算出。向吸附有核酸的氧化铈分别加入50μl的TE缓冲液，对洗脱后的洗脱液进行荧光测定。接下来，调制溶解了100pmol的DNA22的水和TE缓冲液，对该溶液分别进行荧光测定。将洗脱液的荧光强度除以该溶液的荧光强度，算出洗脱出的核酸量。将洗脱出的核酸量除以吸附的核酸量，算出洗脱率。回收率取算出的吸附率与洗脱率之积而算出。将结果示于表1中。
根据这些结果，在使用了氧化铁作为载体的情况下，核酸的吸附率非常低，此外几乎不能确认到核酸的洗脱。可知氧化铁不适于核酸的回收。此外，引用文献3中，虽然记载有能够将无机成分的表面用聚合物被覆了而得的物质利用于核酸的回收，但可以预想：即使将氧化铁的表面用聚合物被覆，对核酸的吸附性也不变化。即，可以预想：即使使用将表面用聚合物被覆了的氧化铁作为载体，也与本比较例1的结果同样地，成为低的核酸回收率。
[表1]
＜比较例2＞使用了表面未吸附水溶性中性聚合物的氧化铈作为载体的核酸的回收方法。
研究了：使用表面未吸附水溶性中性聚合物的氧化铈作为载体，是否能够有效率地回收核酸。载体使用了氧化铈，除此以外，在与比较例1同样的条件下，进行操作。将结果示于表2中。
由这些结果可知，在使用了表面未吸附水溶性中性聚合物的氧化铈作为载体的情况下，核酸对氧化铈的载体的吸附率非常高，但可知核酸的洗脱率低，不能有效率地回收核酸。
此外，专利文献3中，记载了将具有磁性的无机成分进一步用金属氧化物被覆的方法，但在使用了用氧化铈被覆了表面的金属氧化物作为载体的情况下，与比较例2的结果同样地，预想到成为低的回收率。
[表2]
＜比较例3＞水溶性的中性聚合物以外的水溶性的聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体的制作
在1.5ml管中各量取0.5mg的氧化铈。作为聚合物溶液，分别向其中加入聚丙烯酸(PAcA，5.1kDa，10wt％)、聚苯乙烯磺酸(PSS，7.5kDa，10wt％)、聚乙烯基磺酸(PVSA，10wt％)、聚烯丙基胺(PAA，17kDa，10wt％)、聚-L-赖氨酸(PLL，150kDa，1wt％)各50μl，用混合机搅拌10分钟。用离心机离心(10000G，1min)而除去上清液，获得了吸附有各个聚合物的氧化铈。
＜比较例4＞使用了吸附有水溶性的中性聚合物以外的水溶性的各聚合物的氧化铈作为载体的核酸回收
在1.5ml的管中量取比较例3中制作的、吸附有作为水溶性的中性聚合物以外的水溶性的聚合物的聚丙烯酸(PAcA，5.1kDa，10wt％)、聚苯乙烯磺酸(PSS，7.5kDa，1wt％)、聚乙烯基磺酸(PVSA，10wt％)、聚烯丙基胺(PAA，17kDa，10wt％)、聚-L-赖氨酸(PLL，150kDa，1wt％)的氧化铈各0.5mg作为载体使用。洗脱液使用了磷酸缓冲液(0.5M，pH值为8)。载体和洗脱液以外的条件、操作与比较例1同样地进行，算出核酸的回收率。将结果示于表3中。
由这些结果可知，在将吸附有聚丙烯酸、聚乙烯基磺酸和聚苯乙烯磺酸的氧化铈用于载体的情况下，成为核酸的吸附率、洗脱率都低，核酸的回收率也低的结果。此外，在使用了吸附有聚烯丙基胺和聚-L-赖氨酸的氧化铈作为载体的情况下，虽然核酸的吸附率保持得高，但成为洗脱率低、回收率也低的结果。
＜实施例1＞水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体的制作
在1.5ml管中量取各0.5mg的氧化铈。作为聚合物水溶液，在其中分别加入作为水溶性的中性聚合物的聚乙烯醇(11％乙酰化，PVA，18kDa，10wt％)、聚(2-乙基-2-唑啉)(PEOz，5kDa，10wt％)、聚乙二醇(PEG，10kDa，10wt％)、聚丙烯酰胺(PAAm，40kDa，10wt％)、羟基丙基甲基纤维素)(HPMC，10kDa，10wt％)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，10kDa，10wt％)各50μl。此外，关于聚丙二醇(PPG，4kDa，10wt％)与聚N-异丙基丙烯酰胺(pNIPAAm，30kDa，10wt％)的水溶液，加入乙醇直到聚合物溶解为止，然后向0.5mg的氧化铈加入各50μl。其它条件、操作与比较例3同样地进行，获得了吸附有各个聚合物的氧化铈的载体。
＜实施例2＞使用了水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体的核酸回收
在1.5ml的管中量取实施例1中制作的吸附有下述各水溶性的中性聚合物的氧化铈各0.5mg并作为载体而使用，所述各水溶性的中性聚合物为聚乙烯醇、聚(2-乙基-2-唑啉)、聚乙二醇、聚丙二醇、聚丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮。其它条件、操作与比较例4同样地进行，算出核酸的吸附率、洗脱率、回收率。将结果示于表3中。
由这些结果可知，与比较例4相比，在使用了水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体的情况下，在核酸的吸附率保持得高的状态下，洗脱率提高，回收率也提高。
【表3】
氧化铈所吸附的聚合物 吸附率[％] 洗脱率[％] 回收率[％]
PSS 3 24 1 比较例4
PAcA 14 10 1 比较例4
PVSA 5 13 1 比较例4
PVA 99 99 98 实施例2
PEOz 99 85 84 实施例2
PEG 98 92 92 实施例2
pNIPAAm 95 60 57 实施例2
PAAm 99 99 98 实施例2
HPMC 98 96 94 实施例2
PVP 99 95 94 实施例2
PPG 98 95 93 实施例2
PAA 95 0 0 比较例4
PLL 93 0 0 比较例4
<比较例5>水溶性的中性聚合物以外的水溶性的聚合物的ζ电位的测定
将比较例4中使用的作为水溶性的中性聚合物以外的水溶性的聚合物的聚丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯基磺酸、聚烯丙基胺、聚-L-赖氨酸以终浓度成为0.1wt％以上且10wt％以下的方式溶解于磷酸缓冲液(10mM，pH值为7)，使用大塚电子株式会社的ELS-Z测定ζ电位。将结果示于表4中。表4是取得通过本测定而获得的ζ电位、与使用了吸附有各个聚合物的氧化铈作为载体的DNA22的回收率(比较例4的结果)的关系，按照ζ电位的值低的顺序排列的结果。
由这些结果可知，比较例4中使用的水溶性的中性聚合物以外的水溶性聚合物的ζ电位为-17mV以下、或+11mV以上。
<实施例3>水溶性的中性聚合物的ζ电位测定
以终浓度成为1wt％以上且10wt％以下的方式，将实施例2中使用的作为水溶性的中性聚合物的聚乙烯醇、聚(2-乙基-2-唑啉)、聚乙二醇、聚丙二醇、聚丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮溶解于磷酸缓冲液(10mM，pH值为7)，通过与比较例5同样的方法测定ζ电位。表4是取得通过本测定获得的ζ电位、与使用了吸附有各个聚合物的氧化铈作为载体的DNA22的回收率(实施例2的结果)的关系，按照ζ电位的值低的顺序排列的结果。
由这些结果可知，实施例2中核酸的回收率提高的水溶性的中性聚合物的ζ电位在pH值为7的溶液中为-4mV以上且+6.5mV以下，与具有-17mV以下和+11mV以上的ζ电位的水溶性的聚合物相比，回收率提高。
【表4】
氧化铈所吸附的聚合物 ζ电位[mV] 回收率[％]
PSS -37 1 比较例5
PAcA -41 1 比较例5
PVSA -17 1 比较例5
PVA -4.0 98 实施例3
PEOz -2.7 84 实施例3
PEG -1.2 92 实施例3
pNIPAAm -1.4 57 实施例3
PAAm -1.1 98 实施例3
HPMC -0.89 94 实施例3
PVP +1.1 94 实施例3
PPG +6.5 93 实施例3
PAA +11 0 比较例5
PLL +14 0 比较例5
<实施例4>水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体所吸附的核酸的洗脱与洗脱液的关系
按照实施例1，制作聚乙二醇吸附于氧化铈表面的载体，在1.5ml管中量取各0.5mg。作为洗脱液，分别使用了0.5M柠檬酸缓冲液(pH值为5、6)，0.5M磷酸缓冲液(pH值为7、8)、0.5M Tris-EDTA缓冲液(0.5M Tris-HCl，0.5M EDTA，pH值为8)。其它条件、操作与比较例1同样地进行，算出核酸的吸附率、洗脱率、回收率。将结果示于表5中。
由这些结果可知，使用任一缓冲液作为洗脱液，都能够以高收率回收核酸。
【表5】
洗脱液 吸附率[％] 洗脱率[％] 回收率[％]
柠檬酸缓冲液(0.5M，pH5) 99 58 58
柠檬酸缓冲液(0.5M，pH6) 99 70 70
磷酸缓冲液(0.5M，pH7) 99 86 86
磷酸缓冲液(0.5M，pH8) 98 92 92
Tris-EDTA缓冲液(0.5M，pH8) 99 74 72
<实施例5>使用了水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体的核酸的回收率与核酸的长度的关系
按照实施例1，制作聚乙二醇吸附于氧化铈表面而得的载体，在1.5ml管中量取各0.5mg。作为包含核酸的溶液，使用了分别溶解了250ng的DNA566、250ng的pUC19(2.7kbp)、250ng的大肠杆菌基因组片段(>10kbp)的6M硫氰酸胍水溶液100μl。其它条件、操作与比较例3同样地进行，通过电泳算出核酸的回收率。将结果示于表6中。
由这些结果可知，通过使用作为水溶性的中性聚合物的聚乙二醇吸附于氧化铈表面而得的载体，从而能够有效率地回收具有任一长度的核酸。
[表6]
碱基长度 回收率[％]
566bp 99
2.7k bp 91
10k bp以上 84
＜实施例6＞从胎牛血清的核酸回收
按照实施例1，制作聚乙二醇于氧化铈表面的载体，在1.5ml管中量取各2.5mg。作为包含核酸的溶液，使用了溶解了100pmol的DNA22的6M硫氰酸胍水溶液100μl与具有30mg/ml的蛋白质浓度的胎牛血清100μl的混合溶液。其它条件、操作与比较例4同样地进行，算出核酸的吸附率、洗脱率、回收率。对RNA22也进行同样的实验。将结果示于表7中。另外，回收液中的蛋白质浓度为Bradford试验的检测限度以下(0.25mg/ml以下)。
由这些结果可知，通过使用聚乙二醇吸附于氧化铈表面的载体，DNA22、RNA22都能够从血清高效率地回收。
[表7]
核酸 吸附率 洗脱率 回收率[％]
DNA22 99 93 92
RNA22 99 87 86
＜实施例7＞吸附于氧化铈表面的水溶性的中性聚合物的分子量的效果
将分子量为6kDa、10kDa、500kDa的聚乙二醇、与分子量为18kDa、40kDa、150kDa(都是11％乙酰化)的聚乙烯醇分别以成为10wt％的方式进行调制而作为聚合物溶液使用。载体使用与实施例1同样地操作，调制各分子量的聚乙二醇吸附于氧化铈表面而得的载体。其它条件、操作与比较例4同样地进行，算出核酸的吸附率、洗脱率、回收率。将结果示于表8中。
由这些结果可知，具有任一分子量的聚合物，都能够回收核酸。
【表8】
<实施例8>本发明的载体的制作方法中的水溶性的中性聚合物的浓度和搅拌时间的关系
在1.5ml管中量取各0.5mg的氧化铈。在其中，作为聚合物水溶液，分别以0.1wt％、1wt％、10wt％的浓度加入作为水溶性的中性聚合物的聚乙二醇(PEG，10kDa)各50μl。对于各浓度，用混合机分别搅拌1分钟、5分钟、30分钟。用离心机离心(10000G，1min)而除去上清液，获得了聚乙二醇吸附于氧化铈表面的载体。此外，与比较例4同样地进行，算出核酸的回收率。将结果示于表9中。
由这些结果可知，在任一条件下制作的载体都能够有效率地回收核酸。
【表9】
混合时间 PEG浓度 回收率[％]
1分钟 0.1wt％ 51
1wt％ 53
10wt％ 93
5分钟 0.1wt％ 70
1wt％ 83
10wt％ 91
30分钟 0.1wt％ 75
1wt％ 89
10wt％ 99
<实施例9>本发明的载体的制作方法中的水溶性的中性聚合物的浓度和浸渍时间的关系
在1.5ml管中量取各0.5mg的氧化铈。在其中，作为聚合物水溶液，以0.1wt％、1wt％、10wt％的浓度分别加入作为水溶性的中性聚合物的聚乙二醇(PEG，10kDa)各50μl，不进行一切的冲吸等搅拌操作，分别静置5分钟、30分钟。用离心机离心(10000G，1min)而除去上清液，获得了聚乙二醇吸附于氧化铈表面的载体。此外，与比较例4同样地进行，算出核酸的回收率。将结果示于表10中。
由这些结果可知，在任一条件下制作的载体都能够有效率地回收核酸。
【表10】
混合时间 PEG浓度 回收率[％]
5分钟 0.1wt％ 62
1wt％ 74
10wt％ 80
30分钟 0.1wt％ 71
1wt％ 69
10wt％ 92
<实施例10>制作本发明的载体时有无离心分离操作与核酸的回收率的关系
在1.5ml管中量取各0.5mg的氧化铈。在其中，作为聚合物水溶液，以10wt％的浓度加入作为水溶性的中性聚合物的聚乙二醇(PEG，10kDa)50μl，用混合机搅拌10分钟。作为之后的操作，在实施例1中，进行了采用离心机进行的离心分离操作和除去上清液的操作，但实施例10中未进行这些操作。使用了这样操作而制作的载体，除此以外，与比较例4同样地进行，算出核酸的吸附率、洗脱率、回收率，在表11中示出结果。
由这些结果可知，如果与使用实施例1中制作的载体进行了核酸的回收的实施例2的结果之中，使用了聚乙二醇作为水溶性的中性聚合物的情况下的核酸的回收率的结果相比，则无论通过哪种方法制作本发明的载体，都能够有效率地回收核酸。
[表11]
离心分离操作 吸附率[％] 洗脱率[％] 回收率[％]
有 98 92 92 实施例2
无 99 94 93 实施例10
＜实施例11＞使用了本发明的载体的、从人血浆的游离DNA回收
在2支1.5ml管中量取人血浆各300μl，加入Buffer RLT各450μl，通过冲吸进行混合。所得的2支试样之中，第1支使用本发明的载体回收基因组，第2支作为对照而用市售试剂盒回收基因组。
首先，在上述准备的第1支试样中，添加在与实施例1相同条件下制作的吸附有聚乙二醇的氧化铈5mg并进行混合。用混合机搅拌15分钟，离心(10000G，1min)而舍弃上清液。对剩下的载体加入0.05％Tween水400μl，进行涡旋。将该操作进一步进行2次。然后，加入50μl的磷酸缓冲液(0.5M，pH值为8)并用混合机搅拌30分钟。用离心机离心(10000G，1min)，将上清液作为核酸溶液而回收。
接着，从第2支试样，使用市售试剂盒(MagMax cell-FreeDNA Isolation kit，サーモフィッシャー株式会社)，按照实验方案，进行了游离DNA的回收。此时，使洗脱液的体积为50μl。将用本发明的载体和市售试剂盒回收的游离DNA洗脱液进行电泳(10％丙烯酰胺，100V，35min)，用SYBR Gold染色。用荧光扫描仪测定凝胶的荧光图像，通过图像解析进行游离DNA组分(160～200bp)的谱带浓度比的解析。人血浆所包含的游离DNA的绝对量不明，因此代替回收率，算出本发明的载体与市售试剂盒的回收量之比。将结果示于表12中。
由这些结果可知，通过使用本发明的载体，从而即使使用人血浆作为生物学试样，也能够以市售试剂盒的9.9倍的收量回收游离DNA。
[表12]
＜实施例12＞使用了本发明的载体的从大肠杆菌(DH5α)的基因组回收
大肠杆菌(DH5α)用LB的液体培养基培养。在基因组回收时，通过OD600的测定值算出培养液中的大肠杆菌浓度。从培养液分取各5×107cells而转移到2支1.5ml管。所得的2支试样之中，第1支使用本发明的载体回收基因组，第2支作为对照使用市售试剂盒回收基因组。大肠杆菌的细胞数在OD600＝1时作为109cells/ml而计算。
首先，在第1支试样中加入Buffer RLT Plus 100μl进行涡旋。将该溶液与在与实施例1相同条件下制作的吸附有聚乙二醇的氧化铈5mg混合。用混合机搅拌15分钟，离心(10000G，1min)而舍弃上清液。对剩下的载体加入0.05％Tween水400μl，进行涡旋。将该操作进一步进行2次。然后，加入50μl的磷酸缓冲液(0.5M，pH值为8)并用混合机搅拌30分钟。用离心机离心(10000G，1min)，将上清液作为核酸溶液而回收。
接着，从第2支试样，使用市售试剂盒(DNeasy blood&Tissue kit，QIAGEN社)，按照试验方案，进行基因组回收。此时，使洗脱液的体积为50μl。
将用本发明的载体和市售试剂盒回收的基因组洗脱液进行电泳(1％琼脂糖，100V，60min)，用溴化乙锭染色。用荧光扫描仪测定凝胶的荧光图像，进行了基因组组分(25kbp附近)的谱带浓度比的图像解析。大肠杆菌所包含的基因组的绝对量不明，因此代替回收率，算出本发明的载体与市售试剂盒的回收量的比。将结果示于表12中。
由这些结果可知，通过使用本发明的载体，即使使用培养液中的大肠杆菌(DH5α)作为生物学试样，也能够以市售试剂盒的3.8倍的收量回收基因组。
＜实施例13＞使用了本发明的载体的从裂殖酵母(NBRC1628)的基因组回收
裂殖酵母(NBRC1628)在向YPB培养基中添加了2％琼脂糖的板上培养，然后，转移到YPD的液体培养基进行培养。在基因组回收时，通过OD600的测定值测定培养液中的裂殖酵母浓度来算出。从培养液分取各5×105cells而转移到2支1.5ml管。所得的2支试样之中，第1支使用本发明的载体回收基因组，第2支作为对照而使用市售试剂盒回收基因组。此时细胞数在OD600＝1时作为107cells/ml而计算。
首先，在第1支试样中加入酵母裂解酶(Zymolyase)溶液(1M山梨糖醇、100mMEDTA、14mM巯基乙醇、100U/ml酵母裂解酶(Zymolyase)，pH值为7.4)600μl，在30℃下静置30分钟。然后，离心(5000G，10min)而除去上清液，获得了颗粒。在其中加入Buffer RLT Plus200μl进行了涡旋。将该溶液与在与实施例1相同条件下制作的吸附有聚乙二醇的氧化铈5mg混合。用混合机搅拌15分钟，离心(10000G，1min)而舍弃上清液。对剩下的载体加入0.05％Tween水400μl，进行涡旋。将该操作进一步进行2次。然后，加入50μl的磷酸缓冲液(0.5M，pH值为8)并用混合机搅拌30分钟。用离心机离心(10000G，1min)，将上清液作为核酸溶液而回收。
接着，从第2支试样，使用市售试剂盒(DNeasy blood&Tissue kit，QIAGEN社)，按照试验方案，进行了基因组回收。此时，使洗脱液的体积为50μl。将用本发明的载体与市售试剂盒回收的基因组洗脱液进行电泳(1％琼脂糖，100V，60min)，用溴化乙锭染色。用荧光扫描仪测定凝胶的荧光图像，进行了基因组组分(25kbp附近)的谱带浓度比的图像解析。裂殖酵母所包含的基因组的绝对量不明，因此代替回收率，算出本发明的载体与市售试剂盒的回收量的比。将结果示于表12中。
由这些结果可知，通过使用本发明的载体，从而即使使用裂殖酵母(NBRC1628)作为生物学试样，也能够以市售试剂盒的3.8倍的收量回收基因组。
＜实施例14＞使用了本发明的载体的从芽殖酵母(NBRC0216)的基因组回收
使裂殖酵母(NBRC1628)为芽殖酵母(NBRC0216)，除此以外，其它条件、操作与实施例13同样地进行。将结果示于表12中。
由这些结果可知，通过使用本发明的载体，即使使用芽殖酵母(NBRC0216)作为生物学试样，也能够以市售试剂盒的3.5倍的收量回收基因组。
＜实施例15＞使用了本发明的载体的从粘着细胞(Panc10.05)的基因组回收
关于粘着细胞(Panc10.05)，向RPMI培养基中以成为10％(v/v)的方式添加胎牛血清，用25cm2细胞培养用烧瓶培养。在基因组回收时，使用TrypLE Express将细胞从培养烧瓶剥离。将剥离的细胞转移到15ml管，进行离心(1500rpm，5min，室温)而形成颗粒，将上清液吸引除去。然后，加入2ml培养基而再悬浮。计算细胞数，从该细胞悬浮液分取各5×104cells而转移到2支1.5ml管，离心(300G，5min)而形成颗粒，除去上清液。所得的2支试样之中，第1支使用本发明的载体来回收基因组，第2支作为对照而使用市售试剂盒回收基因组。
首先，向第1支试样中加入Buffer RLT Plus 100μl而进行涡旋。将该溶液与在与实施例1相同条件下制作的吸附有聚乙二醇的氧化铈5mg混合。用混合机搅拌15分钟，离心(10000G，1min)而舍弃上清液。对剩下的载体加入0.05％Tween水400μl，进行涡旋。将该操作进一步进行2次。然后，加入50μl的磷酸缓冲液(0.5M，pH值为8)并用混合机搅拌30分钟。用离心机离心(10000G，1min)，将上清液作为核酸溶液而回收。
接着，从第2支试样，使用市售试剂盒(DNeasy blood&Tissue kit，QIAGEN社)，按照试验方案，进行了基因组回收。此时，使洗脱液的体积为50μl。将用本发明的载体与市售试剂盒回收的基因组洗脱液进行电泳(1％琼脂糖，100V，60min)，用溴化乙锭染色。用荧光扫描仪测定凝胶的荧光图像，进行了基因组组分(25kbp附近)的谱带浓度比的图像解析。粘着细胞所包含的基因组的绝对量不明，因此代替回收率，算出本发明的载体与市售试剂盒的回收量的比。将结果示于表12中。
由这些结果可知，通过使用本发明的载体，即使使用粘着细胞(Panc10.05)作为生物学试样，也能够以市售试剂盒的8.6倍的收量回收基因组。
＜实施例16＞使用了本发明的载体的从悬浮细胞(Jurkat)的基因组回收
关于悬浮细胞(Jurkat)，向RPMI培养基中以成为10％(v/v)的方式添加胎牛血清，用25cm2细胞培养用烧瓶培养。在基因组回收时，将细胞转移至15ml管，离心(1500rpm，5min，室温)而形成颗粒，将上清液吸引除去。加入2ml培养基而再悬浮。其它条件、操作与实施例15同样地进行。将结果示于表12中。
由这些结果可知，通过使用本发明的载体，从而即使使用悬浮细胞(Jurkat)作为生物学试样，也能够以市售试剂盒的5.9倍的收量回收基因组。
＜实施例17＞从尿的核酸回收
按照实施例1，制作聚乙二醇吸附于氧化铈表面的载体，在1.5ml管中量取1.5mg。作为包含核酸的溶液，调制溶解了100pmol的DNA22的人工尿(0.2g/l CaCl2，0.4g/l MsSO4，8g/l NaCl，20g/l尿素，0.3％氨)1ml。在人工尿中加入1M的乙酸缓冲液(pH值为4)200μl而进行涡旋，将混合液加入到载体。其它条件、操作与比较例4同样地进行，算出核酸的吸附率、洗脱率、回收率。将结果示于表13中。
由这些结果可知，通过使用聚乙二醇吸附于氧化铈表面的载体，从而即使使用尿作为生物学试样，也能够高效率地回收DNA22。
[表13]
核酸 吸附率 洗脱率 回收率[％]
DNA22 99 70 69
＜比较例5＞仅使用了四氧化三铁作为载体的核酸的回收方法
将比较例1中的α-氧化铁变更为四氧化三铁，除此以外，以与比较例1同样的条件、操作回收核酸。将结果示于表13中。
由这些结果可知，在使用了四氧化三铁作为载体的情况下，虽然核酸吸附，但是核酸的洗脱率低。如果将比较例5与比较例1的结果汇总，则可知：在使用了任一种类的氧化铁作为载体的情况下，都不能有效率地回收核酸。
[表14]
产业可利用性
根据本发明，能够从生物学试样，通过简便的方法高效率地回收从pre-miRNA、miRNA那样非常短的核酸到基因组那样的长的核酸。

Claims (9)

1.一种核酸的回收方法，其特征在于，是从生物学试样中回收核酸的方法，其包含以下工序：
工序a)，将水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体和包含核酸的溶液进行混合，使核酸吸附于载体的工序，
工序b)，从在工序a)中混合后的溶液中分离出吸附有所述核酸的载体的工序，以及
工序c)，向工序b)中分离出的吸附有所述核酸的载体中加入洗脱液，来回收核酸的工序。
2.根据权利要求1所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述水溶性的中性聚合物是在pH值为7的溶液中具有-10mV以上且+10mV以下的ζ电位的聚合物。
3.根据权利要求1或2所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述聚合物为聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-唑啉)、聚丙二醇、聚丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺或羟基丙基甲基纤维素。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述洗脱液为缓冲液。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的核酸的回收方法，其特征在于，所述生物学试样为血液、尿、唾液、粘膜、汗、培养细胞、培养细胞的培养液、组织试样、标本、微生物、微生物的培养液或病毒。
6.一种载体，其是水溶性的中性聚合物吸附于氧化铈表面而得的载体。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述水溶性的中性聚合物是在pH值为7的溶液中具有-10mV以上且+10mV以下的ζ电位的聚合物。
8.根据权利要求6或7所述的载体，其特征在于，所述水溶性的中性聚合物为聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-唑啉)、聚丙二醇、聚丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺或羟基丙基甲基纤维素。
9.一种核酸回收用的试剂盒，其特征在于，具备权利要求6～8中任一项所述的载体、和缓冲液。
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