CN113105524B - 一种多肽衍生物铜络合物及其制备方法和应用、一种抗癌药物 - Google Patents

一种多肽衍生物铜络合物及其制备方法和应用、一种抗癌药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种多肽衍生物铜络合物及其制备方法和应用、一种抗癌药物，属于生物医药技术领域。本发明提供的多肽衍生物铜络合物，包括(S)‑2‑癸酰氨基‑3‑(1‑萘基)丙酰基‑亮氨酰‑缬氨酸和CuCl2。本发明将(S)‑2‑癸酰氨基‑3‑(1‑萘基)丙酰基‑亮氨酰‑缬氨酸与CuCl2络合，所得络合物能够充当螯合剂，与内源铜相互作用并螯合内源铜，从而降低了其在肿瘤生长和血管生成中的可用性；本发明提供的多肽衍生物铜络合物能够抑制肿瘤特异性蛋白酶并使其凋亡，实现良好的抗肿瘤活性。同时，本发明提供的多肽衍生物铜络合物具有体内毒性小、成本低廉的优势，能够作为铂类药物的廉价和安全的替代品。

Description

一种多肽衍生物铜络合物及其制备方法和应用、一种抗癌 药物
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种多肽衍生物铜络合物及其制备方法和应用、一种抗癌药物。
背景技术
顺铂是金属铂类络合物，属于细胞周期非特异性抗肿瘤药，可破坏DNA、抑制肿瘤生长，具有抗菌谱广、对乏氧细胞有效的特点，在临床中广泛应用。然而，顺铂具有较大的副作用，如恶心、呕吐、食欲减低、腹泻等，且具有神经系统毒性和肾脏毒性；同时，顺铂的长期应用也会使得肿瘤细胞产生耐药性。
近年来，很多学者致力于开发新的抗肿瘤活性更好、副作用更小、耐药性更低的金属配合物来代替顺铂治疗。铜是所有活生物体中必不可少的微量元素，对于维持多种蛋白质和酶的功能至关重要，但在肿瘤中，铜的代谢严重改变，肿瘤细胞和正常细胞对铜的反应具有差异性，这为铜复合物作为抗癌药的发展奠定了基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多肽衍生物铜络合物及其制备方法和应用、一种抗癌药物，本发明提供的多肽衍生物铜络合物具有良好的抗肿瘤活性，且副作用小、耐药性低。
为了实现上述发明的目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种多肽衍生物铜络合物，具有式1所示结构：
Figure BDA0003016706710000011
本发明提供了上述多肽衍生物铜络合物的制备方法，包括以下步骤：
将CuCl2溶液与(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸依次进行超声混合和冻干，得到多肽衍生物铜络合物。
优选的，所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与CuCl2的摩尔比为0.5～5:1。
优选的，所述超声混合的功率为500～1000W，时间为20～50min。
优选的，所述冻干的温度为-40～-20℃，时间为8～12h。
本发明提供了上述多肽衍生物铜络合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供了一种抗肿瘤药物，包括抗癌活性成分和上述多肽衍生物铜络合物。
优选的，所述抗癌活性成分为紫杉醇、多西他赛、吉西他滨和5-氟尿嘧啶中的一种或几种。
优选的，所述多肽衍生物铜络合物与抗癌活性成分的摩尔比为20～40:1。
本发明提供了一种多肽衍生物铜络合物，具有式1所示结构。本发明将(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与CuCl2络合，所得络合物能够充当螯合剂，与内源铜相互作用并螯合内源铜，从而降低了其在肿瘤生长和血管生成中的可用性；本发明提供的多肽衍生物铜络合物能够抑制肿瘤特异性蛋白酶并使其凋亡，实现良好的抗肿瘤活性。本发明以(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸作为配位化合物，其具有羧基脂肪链，能够增加络合物的入胞性。且(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸是内源性物质，口服基本无毒；铜是人体必需元素，在氨基酸及多肽衍生物络合物中也属于低毒物质。因此，本发明提供的多肽衍生物铜络合物具有体内毒性小、成本低廉的优势，能够作为铂类药物的廉价和安全的替代品。
本发明提供了一种抗肿瘤药物，包括抗癌活性成分上述多肽衍生物铜络合物。本发明提供的多肽衍生物铜络合物能够与抗癌活性药物分子，如紫杉醇进行配位，从而提高抗癌药物的药效，增强和补充治疗活性。
附图说明
图1为(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的红外光谱图；
图2为多肽衍生物铜络合物Cu-C10NalLeuVal的红外光谱图；
图3为抗癌药物Cu-C10NalLeuVal-TAX的红外光谱图；
图4为紫杉醇的红外光谱图；
图5为C10NalLeuVal与Cu-C10NalLeuVal的紫外光谱图；
图6为C10NalLeuVal、Cu-C10NalLeuVal-TAX与胶束4的紫外光谱图；
图7为10-5MCu-C10NalLeuVal水溶液、10-5MCu-C10NalLeuVal-TAX水溶液的丁达尔现象图；
图8为Cu-C10NalLeuVal和Cu-C10NalLeuVal-TAX的粒径测量图；
图9为Cu-C10NalLeuVal和Cu-C10NalLeuVal-TAX的Zeta电位测量图；
图10为10-5MCu-C10NalLeuVal水溶液的透射电镜图；
图11为Cu-C10NalLeuVal-TAX的透射电镜图；
图12为Cu-C10NalLeuVal的SEM图；
图13为Cu-C10NalLeuVal-TAX的SEM图；
图14为不同受试化合物体外抗A549细胞迁移图片；
图15为不同受试化合物体外抗A549/TAX细胞迁移图片；
图16为不同受试化合物体外抗A549细胞侵袭图片；
图17为不同受试化合物体外抗A549/TAX细胞侵袭图片。
具体实施方式
本发明提供了一种多肽衍生物铜络合物，具有式1所示结构：
Figure BDA0003016706710000031
在本发明中，所述多肽衍生物铜络合物由(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与CuCl2络合而成。
在本发明中，所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的结构式如式2所示：
Figure BDA0003016706710000041
在本发明中，所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的制备方法优选包括以下步骤：
(1)L-Val-OBzl与Boc-Leu进行第一缩合反应，得到Boc-Leu-Val-OBzl；
(2)所述Boc-Leu-Val-OBzl与第一脱保护试剂进行第一脱保护基反应，得到HCl·Leu-Val-OBzl；
(3)Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸与所述HCl·Leu-Val-OBzl进行第二缩合反应，得到Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
(4)所述Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
(5)癸酸与所述HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯进行第三缩合反应，得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
(6)在流动H2条件下，所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯在Pd/C催化下进行氢解反应，得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸。
在本发明中，L-Val-OBzl与Boc-Leu进行第一缩合反应，得到Boc-Leu-Val-OBzl。在本发明中，第一缩合反应体系中还优选包括EDC和HOBt，所述Boc-Leu、EDC、HOBt和L-Val-OBzl的摩尔比优选为1:1:1:1.1。在本发明中，所述第一缩合反应体系的pH值优选为9。在本发明中，所述第一缩合反应在极性有机溶剂中进行，所述极性有机溶剂优选为四氢呋喃。
本发明优选先将Boc-Leu、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、HOBt与极性有机溶剂混合，在冰浴条件下进行活化，得到活化混合液；再向所述活化混合液中加入L-Val-OBzl，调节pH值至8～10，进行第一缩合反应，得到Boc-Leu-Val-OBzl。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合；在本发明中，所述极性有机溶剂优选为乙腈、四氢呋喃或二甲基甲酰胺。在本发明中，所述活化的时间优选为20～30min；本发明通过所述活化，能够生成活泼酯来活化羧基。在本发明中，所述调节pH值的pH值调节剂优选为N-甲基吗啡啉(NMM)；本发明通过调节pH值，能够使氨基游离。
所述第一缩合反应的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃；时间优选为12～24h，更优选为16～20h。
在第一缩合反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第一缩合反应后，本发明优选对所述第一缩合反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
将所述第一缩合反应液依次进行去除极性有机溶剂、萃取分离、洗涤有机相、干燥和柱层析分离，得到Boc-Leu-Val-OBzl纯品。
本发明优选使用旋转蒸发仪去除极性有机溶剂。
在本发明中，所述萃取分离优选包括以下步骤：向所述去除有机溶剂后的第一缩合反应液中加入乙酸乙酯，进行超声混合，之后加入蒸馏水，得到上层油相和下层水相，通过分液漏斗分离出去下层水相。
在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选依次为饱和NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液、饱和KHSO4溶液、饱和NaCl溶液、饱和NaHCO3和饱和NaCl溶液；每种洗涤剂的洗涤次数优选为3次。
在本发明中，所述干燥优选包括以下步骤：向洗涤后的油相中加入干燥剂进行干燥，之后过滤除去干燥剂，所得滤液进行蒸干。在本发明中，所述干燥剂优选为无水Na2SO4，所述干燥剂干燥的时间优选为2～10h，更优选为4～8h。本发明优选使用旋转蒸发仪进行所述蒸干。
在本发明中，所述柱层析分离的固定相优选为硅胶，流动相优选为乙酸乙酯和石油醚；所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:5。
得到所述Boc-Leu-Val-OBzl后，本发明将所述Boc-Leu-Val-OBzl与氯化氢-乙酸乙酯溶液进行第一脱保护基反应，得到HCl·Leu-Val-OBzl。在本发明中，所述第一脱保护试剂优选为氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液(TFA)；所述氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液的摩尔浓度优选为2～4mol/L，更优选为3mol/L；所述Boc-Leu-Val-OBzl的质量与第一脱保护试剂的体积比优选为1g：8～14mL，更优选为1g：10～12mL。本发明优选在冰浴搅拌的条件下进行所述第一脱保护基反应，所述第一脱保护基反应的时间优选为6～10h，更优选为7～8h。
在第一脱保护基反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第一脱保护基反应后，本发明优选对所得第一脱保护基反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
对所述第一脱保护基反应液依次进行浓缩、洗涤和干燥，得到HCl·Leu-Val-OBzl纯品。
在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩；本发明对所述减压浓缩没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的减压浓缩方式即可，所浓缩后的状态优选为糖浆状。在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为无水乙酸乙酯；所述干燥的方式优选为减压抽干。本发明优选重复所述浓缩、洗涤和干燥，所述重复的次数优选为三次。
得到所述HCl·Leu-Val-OBzl后，本发明将Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸与所述HCl·Leu-Val-OBzl进行第二缩合反应，得到Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，所述第二缩合反应体系中优选还包括EDC和HOBt；所述Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸、EDC、HOBt与HCl·Leu-Val-OBzl的摩尔比优选为1:1～1.3:0.2～1:1～1.2，更优选为1:1:1:1.1。
本发明优选先将HCl·Leu-Val-OBzl、EDC、HOBt与极性有机溶剂混合，在冰浴条件下进行活化，得到活化混合液；再向所述活化混合液中加入Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸，调节pH值至8～9，进行第二缩合反应，得到Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合；在本发明中，所述极性有机溶剂优选为乙腈。在本发明中，所述活化的时间优选为20min；本发明通过所述活化，能够生成活泼酯活化羧基组分。在本发明中，所述调节pH值的pH值调节剂优选为N-甲基吗啡啉(NMM)；所述第二缩合反应的温度优选为室温，时间优选为12h。
在第二缩合反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第二缩合反应后，本发明优选对所述第一缩合反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
将所述第二缩合反应液依次进行去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离，得到Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯纯品。
在本发明中，所述去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离的具体操作方式与上文中第一缩合反应液的后处理中的操作方式相同，在此不再赘述。
得到所述Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯后，所述Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，所述第二脱保护试剂优选为氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液(TFA)；所述氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液的摩尔浓度优选为2～4mol/L，更优选为3mol/L。；所述Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯的质量与第二脱保护试剂的体积比优选为1g：8～15mL，更优选为1g：10～12mL。本发明优选在冰浴搅拌的条件下进行所述第二脱保护基反应，所述第二脱保护基反应的时间优选为6～10h，更优选为7～8h。
在第二脱保护基反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第二脱保护基反应后，本发明优选对所得第二脱保护基反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
对所述第二脱保护基反应液依次进行浓缩、洗涤和干燥，得到HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯纯品。
在本发明中，所述浓缩、洗涤和干燥的具体操作方式与上文第一脱保护基反应液后处理中的具体操作方式相同，在此不再赘述。
得到所述HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯后，癸酸与所述HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯进行第三缩合反应，得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，第三缩合反应体系中优选还包括EDC和HOBt，所述癸酸、EDC、HOBt和HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯的摩尔比优选为1:1～1.3:0.2～1:1～1.2，更优选为1:1:1:1.1。本发明优选先将癸酸、EDC、HOBt与极性有机溶剂混合，在冰浴条件下进行活化，得到活化混合液；再向所述活化混合液中加入EDC、HOBt和HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯，调节pH值至8～9，进行第三缩合反应，得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合；在本发明中，所述极性有机溶剂优选为乙腈、四氢呋喃或二甲基甲酰胺。在本发明中，所述活化的时间优选为20～30min；本发明通过所述活化，能够生成活泼酯活化羧基组分。在本发明中，所述调节pH值的pH值调节剂优选为N-甲基吗啡啉(NMM)；本发明通过调节pH值，能够使氨基游离。
在本发明中，所述第三缩合反应的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃；时间优选为12～24h，更优选为16～20h。
在第三缩合反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第三缩合反应后，本发明优选对所述第三缩合反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
将所述第三缩合反应液依次进行去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离，得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯纯品。在本发明中，所述去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离的具体操作方式与上文对第一缩合反应液后处理的具体操作方式相同，在此不再赘述。
得到所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯后，在密闭H2条件下，所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯在Pd/C催化下进行氢解反应，得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸。在进行氢解反应前，本发明优选使用极性溶剂将所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯溶解；所述极性有机溶剂优选为四氢呋喃。本发明对所述极性有机溶剂的用量没有特殊的要求，能够将所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯溶解即可；所述溶解的温度优选为35～40℃，更优选为36～38℃。
在本发明中，所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与Pd/C的质量比优选为10:1。在本发明中，所述氢解反应的温度优选为室温，时间优选为6～12h；所述氢解反应时H2的气压优选为1.1～1.4倍大气压。
在氢解反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述氢解反应后，本发明优选对所述氢解反应液依次进行过滤和蒸干，得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸纯品。本发明对所述过滤的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的过滤方式即可；本发明通过所述过滤，除去所述氢解反应液中的Pd/C催化剂。本发明优选使用旋转蒸发仪进行所述蒸干。
在本发明中，所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的制备过程如式A所示。
Figure BDA0003016706710000101
本发明提供了上述多肽衍生物铜络合物的制备方法，包括以下步骤：
将CuCl2溶液与(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸依次进行超声混合和冻干，得到多肽衍生物铜络合物。
在本发明中，所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与CuCl2的摩尔比优选为0.5～5:1，更优选为1～4:1，进一步优选为2～3:1。
在本发明中，所述CuCl2溶液的浓度优选为2.0～5.03.4mg/mL；在本发明中，所述超声混合的功率优选为500～1000W，更优选为600～800W；时间优选为20～50min；更优选为30～40min。在本发明中，所述冻干的温度优选为-40～-20℃，更优选为-35～-25℃；时间优选为8～12h，更优选为9～10h。
本发明提供了上述多肽衍生物铜络合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供了一种抗肿瘤药物，包括抗癌活性成分和上述多肽衍生物铜络合物。
在本发明中，所述抗癌活性成分优选为紫杉醇、多西他赛、吉西他滨和5-氟尿嘧啶中的一种或几种。在本发明中，所述多肽衍生物铜络合物与抗癌活性成分的摩尔比优选为20～40:1，更优选为25～35:1。
下面结合实施例对本发明提供的一种多肽衍生物铜络合物及其制备方法和应用、一种抗癌药物进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸(简称C10NalLeuVal)的制备
(一)制备Boc-Leu-Val-OBzl
称取1.15g(5mmol)Boc-Leu、0.96g(5mmol)EDC、0.68g(5mmol)HOBt，放入搅拌子，加入20mL乙腈，冰浴下活化20min，称取1.35g(5.5mmol)HCl·H-Val-OBzl加入茄瓶中，并加入NMM2mL调pH至9，室温下反应12小时，TLC监测反应(乙酸乙酯/石油醚1：2，Rf＝0.3)，原料点消失终止反应。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到黄色粘稠样物，加入乙酸乙酯，超声得到浅黄色混悬液，加入蒸馏水，溶液分层。将混合溶液倒入分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液、饱和KHSO4溶液、饱和NaCl溶液、饱和NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液各萃洗3遍。酯层用无水Na2SO4干燥2小时，利用水泵减压过滤，除去Na2SO4，滤液用旋转蒸发仪蒸干。用乙酸乙酯和石油醚进行硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚1：5)，得到目标产物，白色蜡状固体，称重1.74g，产率82.86％。
ESI-MS(m/e):421[M+H]+,443[M+Na]+，Mp88.1-88.5℃；[α]25 D＝-39.99(c＝0.1,CH3OH)。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝7.98(d,J＝8.2Hz,1H),7.36(d,J＝2.9Hz,5H),6.91(d,J＝8.4Hz,1H),5.19(m,2H),4.22(dd,J＝8.2,6.2Hz,1H),4.03(m,1H),2.05(m,1H),1.57(s,2H),1.36(s,10H),0.84(ddt,J＝8.9,6.5,3.7Hz,12H).
(二)制备HCl·Leu-Val-OBzl
称取1.74g(4.14mmol)Boc-Leu-Val-OBzl于茄瓶中，加入搅拌子，冰浴搅拌下缓慢滴加17mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4M)，并置干燥管，冰浴搅拌下反应6小时后，TLC监测(乙酸乙酯/石油醚1：2，Rf＝0.3)原料点消失终止反应。反应液在水泵下减压浓缩，残留物加入20mL无水乙酸乙酯溶解，再减压抽干，重复磨洗3遍，得到白色固体。称重1.35g，产率91.84％。
ESI-MS(m/e):321[M+H]+，Mp125.3-126.5℃；[α]25 D＝-29.99(c＝0.1,CH3OH)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ/ppm＝8.39(s,2H),7.77(d,J＝7.2Hz,1H),7.32(s,5H),5.13(q,J＝12.2Hz,2H),4.48(t,J＝5.9Hz,1H),4.35(s,1H),2.24(s,1H),1.77(m,1H),1.25(m,2H)0.92(dt,J＝16.2,5.5Hz,12H).
(三)制备Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯
将1.00g(3.17mmol)Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸、0.62g(3.25mmol)EDC、0.43g(3.19mmol)HOBt于茄瓶中，加入搅拌子加入30mL乙腈，冰浴下活化20min，称取1.35g(3.79mmol)HCl·Leu-Val-OBzl加入20mL乙腈溶解于另一茄瓶中，并加入NMM1mL调pH至9。然后将两反应液混合，反应12小时，TLC(乙酸乙酯/石油醚1：2，Rf＝0.3)监测反应，原料点消失。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到浅黄色粘稠样物，加入乙酸乙酯，超声得到浅黄色混悬液，加入蒸馏水，溶液澄清分层。将混合溶液转移至分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和NaHCO3、饱和NaCl、饱和KHSO4、饱和NaCl、饱和NaHCO3、饱和NaCl各萃洗3遍。用无水Na2SO4干燥2小时，利用水泵减压过滤除去Na2SO4，滤液用旋转蒸发仪蒸干。用乙酸乙酯和石油醚进行硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚1：5)，得到目标产物白色固体，称重1.67g，产率85.20％。
ESI-MS(m/e):618[M+H]+，Mp152.9-154.2℃；[α]25 D＝-59.99(c＝0.1,CH3OH)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.15(d,J＝8.04Hz,1H),7.88(d,J＝7.53Hz,1H),7.78(d,J＝7.86Hz,1H),7.54(m,2H),7.37(m,6H),7.28(s,1H),6.52(d,J＝8.19Hz,1H),6.37(d,J＝7.35Hz,1H),5.18(q,J＝12.21Hz,2H),4.52(m,2H),4.41(m,1H),3.66(m,1H),3.47(m,1H),2.19(m,1H),1.95(m,1H),1.38(m,10H),0.90(m,12H).
(四)制备HCL·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯
向盛有1.67g(2.71mmol)Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯于茄瓶中，加入搅拌子，冰浴搅拌下缓慢滴加16mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4M),并置干燥管，冰浴搅拌下反应6小时后终止反应。TLC监测(乙酸乙酯/石油醚1：2，Rf＝0.3)原料点消失终止反应。用水泵将反应液减压抽干,残留物加入20mL乙酸乙酯溶解，再减压抽干，重复磨洗3遍，得到白色固体，称重1.45g，产率97.32％。
ESI-MS(m/e):518[M+H]+，Mp209.4-210.6℃；[α]25 D＝-41.72(c＝0.1,CH3OH)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.72(d,J＝8.04Hz,1H),8.42(s,4H),8.32(d,J＝7.17Hz,1H),7.94(d,J＝7.41Hz,1H),7.84(m,1H),7.56(m,2H),7.35(s,7H),5.10(d,J＝3.27Hz,2H),4.50(d,J＝7.47Hz,1H),4.17(t,J＝6.30Hz,2H),3.47(s,2H),3.34(s,2H),3.17(s,1H),2.50(s,4H),2.10(m,1H),1.61(m,2H),1.38(m,2H),0.92(t,J＝8.58Hz,6H),0.84(s,6H).
(五)制备(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯
称取0.55g(3.20mmol)癸酸、0.61g(3.20mmol)EDC、0.43g(3.20mmol)HOBt于茄瓶中，加入搅拌子加入20mL乙腈，冰浴下活化20min；将1.45g(2.62mmol)HCL·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯于另一茄瓶加入20mL乙腈溶解，并加入NMM 1mL调pH至9。将两反应液混合，反应12小时，有白色固体析出，TLC监测反应(乙酸乙酯/石油醚1：2，Rf＝0.3)，原料点消失，终止反应。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到浅黄色粘稠样物，加入乙酸乙酯，超声得到白色混悬液，加入蒸馏水，不溶解。溶液分层上层为白色乳液，下层溶液澄清。将混合溶液倒入分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和NaHCO3、饱和NaCl、饱和KHSO4、饱和NaCl、饱和NaHCO3、饱和NaCl各洗3遍。用水泵减压过滤，得到白色固体即为产物，称重1.24g，产率70.86％。
ESI-MS(m/e):672[M+H]+，Mp185.5-187.5℃；[α]25 D＝-20.99(c＝0.1,CH3OH)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.17(d,J＝7.44Hz,3H),8.11(d,J＝8.22Hz,1H),7.90(d,J＝7.11Hz,1H),7.76(d,J＝7.26Hz,1H),7.52(m,2H),7.38(s,2H),7.35(s,5H),5.11(d,J＝12.54Hz,2H),4.68(m,1H),4.50(m,1H),4.22(t,J＝6.69Hz,1H),3.51(m,1H),3.13(m,1H),2.09(m,1H),1.97(t,J＝6.33Hz,2H),1.59(m,1H),1.45(m,2H),1.22(m,12H),1.01(s,2H),0.87(m,16H)；
13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝172.68,172.59,171.63,171.57,136.31,134.29,133.81,132.11,128.98,128.83,128.46,127.70,127.36,126.42,125.92,125.67,125.67,124.21,66.22,57.93,53.50,51.36,41.47,35.67,34.90,31.74,30.30,29.26,29.11,28.86,25.57,24.55,23.49,22.53,22.20,19.36,18.63,14.40.
(六)制备(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸
将1.24g(1.85mmol)(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯加入30mL四氢呋喃，40℃加热溶解，加入钯碳130mg，使用三通管连接反应瓶和氢气袋,先用真空水泵抽走反应液中的空气，然后通入氢气,如此反复3次,确保茄瓶内排除空气布满氢气，室温搅拌6小时,TLC监测反应(乙酸乙酯/石油醚1：2，Rf＝0.3)，原料点消失，终止反应，将钯碳过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干，称重0.9g，产率84.11％。
ESI-MS(m/e):580[M-H]-，Mp77.8-79.8℃；[α]25 D＝-11.67(c＝0.1,CH3OH)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.17(t,J＝7.68Hz,2H),7.85(m,2H),7.53(m,1H),7.39(m,1H),4.68(m,1H),4.41(m,1H),4.13(m,1H),3.54(m,1H),3.37(m,1H),3.14(m,1H),2.23(m,1H),2.03(m,2H),1.62(m,1H),1.48(m,3H),1.22(m,14H),1.01(s,1H),0.87(m,15H)；13CNMR(75MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝173.14,172.51,172.46,171.71,134.27,133.81,132.09,128.98,127.71,127.38,126.45,125.94,125.67,124.25,57.46,57.37,53.41,51.51,41.30,35.65,34.85,33.55,31.75,30.35,29.25,28.85,28.53,27.85,25.58,24.58,23.55,22.54,22.17,19.51,18.40,14.41.
本实施例六步反应总产率为30.98％。
所得(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的红外光谱图如图1所示。
实施例2多肽衍生物铜络合物Cu-C10NalLeuVal的制备
①称取3.4mgCuCl2·2H2O，加入1mL蒸馏水溶解，溶液澄清呈浅蓝色。
②称取11.6mg(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸，加入上述配置好的CuCl2溶液中，超声30min，溶液呈乳状。
③将上述乳液利用冷冻干燥机在-20℃下冻干10h后，得到黄绿色固体，即为多肽衍生物铜络合物Cu-C10NalLeuVal，记为C10NLVCu。
所得多肽衍生物铜络合物Cu-C10NalLeuVal的红外光谱图如图2所示。
实施例3抗癌药物Cu-C10NalLeuVal-TAX
①称取3.4mgCuCl2·2H2O，加入1mL蒸馏水溶解，溶液澄清呈浅蓝色。
②称取11.6mg(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸，加入上述配置好的CuCl2溶液中，超声30min，溶液呈乳状。
③称取0.85mg紫杉醇，加入上述②溶液中，超声30min，溶液呈乳状。
④将上述乳液利用冷冻干燥机-20℃下冻干10h后，得到黄绿色固体，即为抗癌药物Cu-C10NalLeuVal-TAX，记为C10NLVCuTAX。
所得抗癌药物Cu-C10NalLeuVal-TAX的红外光谱图如图3所示，紫杉醇的红外光谱图如图4所示。
对比例1
称取11.6mg(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和0.85mg紫杉醇与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪在35℃下以200rpm的速率旋蒸20min，制成薄膜，加入75％乙醇1mL，超声溶液分散，加入蒸馏水9ml，冻干后得到白色粉末，所得产品记为胶束4。
性能测试
(一)紫外光谱
实施例1所得C10NalLeuVal与实施例2所得Cu-C10NalLeuVal在10-4M的浓度下测得的紫外光谱图如图5所示。
实施例1所得C10NalLeuVal、实施例3所得Cu-C10NalLeuVal-TAX与对比例1所得胶束4在10-4M的浓度下测得的紫外光谱图如图6所示。由图5可以看出，C10NalLeuVal络合铜以后，得到的Cu-C10NalLeuVal紫外吸收峰为发生变化，其吸光度增加。由图6可以看出，胶束4紫外吸收峰为与C10NalLeuVal一致，Cu-C10NalLeuVal-TAX紫外吸收峰与Cu-C10NalLeuVal一致。
(二)纳米结构表征
(1)丁达尔效应
利用超纯水配置成10-5MCu-C10NalLeuVal水溶液、10-5M Cu-C10NalLeuVal-TAX水溶液，使用650nm激光笔进行照射，两溶液均有明显的丁达尔现象，结果如图7所示，图7中(a)为未照射的溶液，(b)为激光笔照射下的溶液，(a)、(b)中从左到右依次为10-5MCu-C10NalLeuVal水溶液，Cu-C10NalLeuVal-TAX水溶液，水。
(2)激光纳米粒度仪测定粒径及Zeta电位
使用激光纳米粒度仪，利用DTS(Nano)软件，在25℃下，测定10-5M Cu-C10NalLeuVal水溶液和10-5MCu-C10NalLeuVal-TAX水溶液的粒径及Zeta电位，其中Cu-C10NalLeuVal和Cu-C10NalLeuVal-TAX的粒径测量图如图8所示，Cu-C10NalLeuVal和Cu-C10NalLeuVal-TAX的Zeta电位测量图如图9所示。由图8和图9可以看出，Cu-C10NalLeuVal粒径大小为198.1±34.0，Zeta电位为-17.2±5.43；Cu-C10NalLeuVal-TAX粒径大小为329.4±40.52，Zeta电位为-12.9±3.78。
(3)透射电子显微镜成像
利用超纯水制备10-5M Cu-C10NalLeuVal水溶液和10-5M Cu-C10NalLeuVal-TAX水溶液，取7μL滴在铜网上，37℃烘箱中干燥，利用透射电子显微镜观察。
10-5M Cu-C10NalLeuVal水溶液的透射电镜图如图10所示，显示Cu-C10NalLeuVal呈粒径20nm左右的纳米颗粒；Cu-C10NalLeuVal-TAX的透射电镜图如图11所示，显示Cu-C10NalLeuVal-TAX由小纳米颗粒聚集呈球，中间有空隙，呈石榴状，粒径在100～200nm。
(4)扫描电镜成像
利用S-4800高分辨发射扫描显微镜观察Cu-C10NalLeuVal和Cu-C10NalLeuVal-TAX的纳米特征，Cu-C10NalLeuVal的SEM图如图12所示，可以看出Cu-C10NalLeuVal呈粒径20nm左右的纳米颗粒；Cu-C10NalLeuVal-TAX的SEM图如图13所示，可以看出Cu-C10NalLeuVal-TAX的粒径在100～200nm，表面不平整。
(三)体外抗肿瘤增殖活性评价
本实验采用MTT法测定了Cu-C10NalLeuVal和Cu-C10NalLeuVal-TAX对S180细胞、A549细胞、MCF-7细胞和HCT116细胞的抑制率，计算IC50值。
1)半悬浮细胞株(S180)
S180细胞是半悬浮细胞，长时间培养可看到细胞贴壁生长，但用吸管吹打可是细胞悬浮，不需要加胰酶消化，细胞愈合度在80％以上可进行传代。用吸管轻轻吹打，并将细胞混悬液转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至T25细胞培养瓶中,在37℃、5％CO2的培养箱中培养，观察细胞生长情况。
取对数期生长的S180细胞，细胞计数后按照每孔100μL含有5000个细胞种板，放置于37℃，含有5％CO2环境的细胞培养箱中进行培养，培养时间2h后加入药物，每种受试药物设6孔并设置对照孔，对照孔中不给药，只加入含有5‰DMSO完全培养基，放置于37℃，含有5％CO2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μL配置好的MTT溶液(浓度为5mg/mL)，再放置于细胞培养箱中进行培养，培养时间约为4小时，终止培养。取出96孔板，将其放入离心机中进行离心，设置离心机转速为1000rpm，10min。离心后小心取出96孔板，将孔内的培养液吸除干净，再用枪头向每孔中加入150μL的DMSO，将96孔板放于摇床上进行震荡摇匀，使结晶物甲臜充分溶解于DMSO中。最后，在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm，测定各孔的吸光度值，与对照组相比计算细胞的存活率。利用GraphPad Prism5通过对数浓度与细胞存活百分比的线性回归曲线拟合来计算IC50。实验共重复三次，然后取平均值，所得结果见表1。
2)贴壁细胞株
HCT116细胞、MCF-7细胞、A549/TAX细胞都属于贴壁细胞，取对数期生长的细胞倒出培养瓶中的液体，加入2mL的PBS缓冲液冲洗两次，以便将培养瓶内残留的血清清洗干净，加入1mL胰酶，放入37℃、5％CO2的培养箱中消化2-3分钟，观察细胞变为球形流动状，则加入新的完全培养基2mL终止消化，用吸管轻轻吹起，将细胞混悬液转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，然后再向管中加入新鲜的完全培养基，用灭菌过的枪头吹打均匀。然后进行细胞计数。
按照每孔100μl含有5000个细胞种板，放置于37℃，含有5％CO2环境的细胞培养箱中进行培养，培养时间6h后加入药物，每种受试药物设6孔并设置对照孔，对照孔中不给药，只加入含有5‰DMSO完全培养基，放置于37℃，含有5％CO2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μL配置好的MTT溶液(浓度为5mg/mL)，再放置于细胞培养箱中进行培养，培养时间约为4小时，终止培养。取出96孔板，将孔内的溶液吸除干净，再用枪头向每孔中加入150μL的DMSO，将96孔板放于摇床上进行震荡摇匀，使结晶物甲臜充分溶解于DMSO中。最后，在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm，测定各孔的吸光度值，与对照组相比计算细胞的存活率。利用GraphPad Prism5通过对数浓度与细胞存活百分比的线性回归曲线拟合来计算IC50。实验共重复三次，然后取平均值，所得结果见表1。
表1各受试样品对各肿瘤细胞的IC50(μM)
Figure BDA0003016706710000181
Figure BDA0003016706710000191
注：n＝3，经t检验，a：同种细胞Cu-C10NalLeuVal与C10NalLeuVal相比，P<0.01；b：同种细胞Cu-C10NalLeuVal-TAX与TAX相比，P<0.05。
由表1可以看出，经统计分析同种细胞Cu-C10NalLeuVal与C10NalLeuVal相比，有显著差异，抗肿瘤增殖活性增强；同种细胞Cu-C10NalLeuVal-TAX与TAX相比，有显著差异，抗肿瘤活性有所提高。说明化合物络铜后抗肿瘤增殖活性增强。
(四)逆转耐药活性评价
采用MTT法评价Cu-C10NalLeuVal-TAX对耐紫衫醇细胞株A549/TAX的细胞毒性，计算半数抑制浓度(IC50)。
每孔接种100μL含有3000个A549/TAX细胞，放置于37℃，含有5％CO2环境的细胞培养箱中进行培养，培养6h后细胞贴壁加入配置的受试样品，每种受试样品设6孔并设置对照孔，对照孔中不给药，只加入含有5‰DMSO的PBS，放置于37℃，含有5％CO2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μL配置好的MTT溶液(浓度为5mg/mL)，再放置于细胞培养箱中进行培养，培养时间为4h，终止培养。取出96孔板，将孔内的培养液吸除干净，再向每孔中加入150μL的DMSO，将96孔板放于平板振荡器上震荡摇匀10min，使结晶物甲臜充分溶解于DMSO中。最后，在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm，测定各孔的吸光度值，与对照组相比计算受试样品对细胞的抑制率。利用GraphPad Prism5通过对数浓度与细胞存活百分比的线性回归曲线拟合来计算IC50。实验共重复三次，然后取平均值，所得结果如表2所示。
表2各受试样品对A549/TAX细胞的IC50(μM)
Figure BDA0003016706710000192
Figure BDA0003016706710000201
TAX对A549/TAX细胞的IC50为51.72±3.69μM，Cu-C10NalLeuVal-TAX对A549/TAX细胞的IC50为0.97±0.19μM，根据逆转耐药倍数的计算公式：逆转耐药倍数＝未加逆转剂的IC50/加入逆转剂的IC50，逆转耐药倍数为53.32。
(五)体外抗肿瘤迁移活性评价
取对数生长期的细胞，显微镜下观察细胞生长状态良好形态饱满，透明度大，折光性良好，均贴壁且培养液上清透明无漂浮物，弃去原培养基，加入2mLPBS缓冲液清洗2次后，加入1mL胰酶消化细胞2min，加入含血清培养基终止消化，用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散，将细胞混悬液转移至经过灭菌的15mL离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入5mL不含血清培养基，混匀后再次离心，弃上清，目的是除去残留的含血清的培养基。用滴管轻轻吹打细胞使其分散均匀，利用细胞计数板在显微镜下进行计数，并加入适量不含血清培养基，配成细胞浓度为5×105个/mL的细胞悬液。Transwell小室上室每孔加入100μL细胞悬液，同时加入受试药物的溶液25μL，阴性对照组加入含有0.5％DMSO的PBS。下室加入600μL含血清的RPMI-1640培养基，放置于37℃，含有5％CO2环境的细胞培养箱中进行培养8小时。
8小时后，从孵箱中取出Transwell小室，使用移液枪将上室液体小心吸出，避免破坏Transwell的聚碳酸酯膜，并在上室每孔中加入100μL PBS缓冲液进行洗涤，使用移液枪将上室液体小心吸出，用蓬松的棉签轻轻擦去残留的液体，重复此操作3次使上室膜上无细胞残留。使用移液枪将下室液体吸出，并加入600μL4％多聚甲醛，固定上室膜下侧细胞30min，30min后吸除下室4％多聚甲醛，每孔中加入600μL0.1％的结晶紫染色液，染色15min，15min后吸除染色液并用镊子夹住小室边缘，放入盛有蒸馏水的烧杯清洗，重复洗涤3次。置于通风橱晾干后于显微镜下拍照计数。每孔选取9个视野，每个视野细胞分布均匀且数量基本一致，并利用ImageJ软件进行计数。不同受试化合物体外抗A549细胞迁移图片如图14所示。图14中，A：PBS，B：RGDS 20μM；C：C10NalLeuVal 20μM；D：Cu-C10NalLeuVal 20μM。不同受试化合物体外抗A549/TAX细胞迁移图片如图15所示，图15中，A：PBS，B：RGDS 20μM；C：C10NalLeuVal 20μM；D：Cu-C10NalLeuVal 20μM。
体外抗肿瘤细胞迁移结果如表3所示。
表3各受试化合物体外抗肿瘤细胞迁移活性
Figure BDA0003016706710000211
注：n＝9，经t检验，a：与PBS相比，P<0.01；b：与C10NalLeuVal相比，P>0.05。
经统计分析Cu-C10NalLeuVal组与PBS组有显著差异，说明Cu-C10NalLeuVal有体外抗迁移的作用；与C10NalLeuVal组相比没有差异，说明Cu-C10NalLeuVal与C10NalLeuVal组体外抗肿瘤细胞迁移的作用相当。
(七)体外抗肿瘤侵袭活性评价
利用Transwell小室评价体外抗A549、A549/TAX细胞侵袭活性，需要先在Transwell小室上室铺一层基质胶，模拟肿瘤细胞发生侵袭时的体内环境，细胞侵入下室需降解基质胶。实验方法与Transwell小室抗迁移实验相似。
1)包被基质胶：将冻存于-20℃冰箱中呈固态的Matrigel基质胶置于4℃冰箱过夜，使Matrigel基质变成粉红色的液态。取960μL无血清R1640培养基加入240μL Matrigel基质胶(4：1比例)，充分混和均匀，加入至Transwell小室上室，每孔加100μL，然后Transwell小室将37℃，5％CO2的细胞孵箱中孵育5h，使基质胶凝固。
2)水化基底膜：用移液枪小心吸除上室剩余液体，加入50μL相应无血清培养基，置于37℃，5％CO2的细胞孵箱中孵育30min。之后用移液枪小心吸除上室剩余液体。
3)接种细胞：取对数生长期的细胞，显微镜下观察细胞生长状态良好形态饱满，透明度大，折光性良好，均贴壁且培养液上清透明无漂浮物，弃去原培养基，加入2mL PBS缓冲液清洗2次后，加入1mL胰酶消化细胞2min，加入含血清培养基终止消化，用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散，将细胞混悬液转移至经过灭菌的15mL离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入5mL不含血清培养基，混匀后再次离心，弃上清，目的是除去残留的含血清的培养基。用滴管轻轻吹打细胞使其分散均匀，利用细胞计数板在显微镜下进行计数，并加入适量不含血清培养基，配成细胞浓度为5×105个/mL的细胞悬液。Transwell小室上室每孔加入100μL细胞悬液，同时加入受试药物的溶液25μL，设置复孔。下室加入600μL含血清的RPMI-1640培养基，放置于37℃，含有5％CO2环境的细胞培养箱中进行培养12小时。
4)后处理：使用移液枪将上室液体小心吸出，并在上室每孔中加入100μLPBS缓冲液进行洗涤，使用移液枪将上室液体小心吸出，用蓬松的棉签轻轻擦去残留的液体，重复此操作3次。使用移液枪将下室液体吸出，并加入600μL4％多聚甲醛，固定上室膜下侧细胞30min，30min后吸除下室4％多聚甲醛，每孔中加入600μL 0.1％的结晶紫染色液，染色15min，15min后吸除染色液并用镊子夹住小室边缘，放入盛有蒸馏水的烧杯清洗，重复洗涤3次。置于通风橱晾干后于显微镜下拍照计数。每孔选取9个视野，每个视野细胞分布均匀且数量基本一致，进行计数。不同受试化合物体外抗A549细胞侵袭图片如图16所示，图16中，A：PBS，B：RGDS 20μM；C：C10NalLeuVal 20μM；D：Cu-C10NalLeuVal 20μM。不同受试化合物体外抗A549/TAX细胞侵袭图片如图17所示，图17中，A：PBS，B：RGDS 20μM；C：C10NalLeuVal 20μM；D：Cu-C10NalLeuVal 20μM。
体外抗肿瘤细胞侵袭结果如表4所示。
表4各受试化合物体外抗肿瘤细胞侵袭活性
Figure BDA0003016706710000231
注：n＝9，经t检验，a：与PBS相比，P<0.01；b：与C10NalLeuVal相比，P<0.05。
经统计分析Cu-C10NalLeuVal组与PBS组有显著差异，说明Cu-C10NalLeuVal有体外抗侵袭的作用；与C10NalLeuVal组相比有统计学差异，Cu-C10NalLeuVal比C10NalLeuVal组体外抗肿瘤细胞侵袭的作用强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种多肽衍生物铜络合物，具有式1所示结构：
Figure FDA0003016706700000011
2.权利要求1所述的多肽衍生物铜络合物的制备方法，包括以下步骤：
将CuCl2溶液与(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸依次进行超声混合和冻干，得到多肽衍生物铜络合物。
3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与CuCl2的摩尔比为0.5～5:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述超声混合的功率为500～1000W，时间为20～50min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述冻干的温度为-40～-20℃，时间为8～12h。
6.权利要求1所述多肽衍生物铜络合物或权利要求2～5任意一项所述制备方法制备得到的多肽衍生物铜络合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.一种抗肿瘤药物，包括抗癌活性成分和权利要求1所述多肽衍生物铜络合物或权利要求2～5任意一项所述制备方法制备得到的多肽衍生物铜络合物。
8.根据权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗癌活性成分为紫杉醇、多西他赛、吉西他滨和5-氟尿嘧啶中的一种或几种。
9.根据权利要求7或8所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述多肽衍生物铜络合物与抗癌活性成分的摩尔比为20～40:1。
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