CN111718380B - 咔啉钌类络合物及其制备方法和应用 - Google Patents

咔啉钌类络合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了咔啉钌类络合物及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明提供的一系列咔啉钌类络合物，不仅能抑制肿瘤转移，并且对原发肿瘤具有抑制作用，生物活性高。本发明提供的络合物对肿瘤细胞具有选择性的杀伤作用，能够在体外形成比较稳定的球状纳米分子，并且能够与DNA和转铁蛋白相互作用；在体内实验中，S180小鼠肉瘤模型评价了络合物对原发肿瘤的抑制作用，LLC抗转移模型评价了络合物对肺癌的抗转移作用，并且利用ICP‑MS测定了其在生物体内的分布，同时对肿瘤组织进行免疫组化和免疫荧光分析，结果显示，络合物2b在生物体内能够抑制原发瘤的生长，并且能够抑制肿瘤在肺上的转移。

Description

咔啉钌类络合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及咔啉钌类络合物及其制备方法和应用。
背景技术
随着肿瘤发病率的逐年增加，抗肿瘤药物的研发受到越来越多的重视。顺铂是一种临床上广为应用的金属络合物抗肿瘤药物。除了铂类抗肿瘤药物之外，钌基金属络合物由于其独特的生物化学特征，在过去几十年中得到了大量研究，一些钌金属络合物已经证实有抑制肿瘤生长和抗肿瘤转移的作用，但对原发肿瘤没有抑制作用，且生物活性仍有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供咔啉钌类络合物及其制备方法和应用，本发明提供的咔啉钌类络合物不仅能抑制肿瘤转移，并且对原发肿瘤具有抑制作用，生物活性高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种咔啉钌类络合物，具有式I、式II或式III所示结构：
Figure BDA0002609776040000011
其中，所述R1为
Figure BDA0002609776040000012
所述R2为
Figure BDA0002609776040000013
所述R3为
Figure BDA0002609776040000014
Figure BDA0002609776040000015
本发明提供了上述技术方案所述咔啉钌类络合物的制备方法，
(i)当咔啉钌类络合物具有式I所示结构时，制备方法包括以下步骤：
将R1对应的配体化合物、顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物、乙醇和水混合后进行第一络合反应，得到具有式I所示结构的咔啉钌类络合物；
(ii)当咔啉钌类络合物具有式II所示结构时，制备方法包括以下步骤：
将R2对应的配体化合物、顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物和N,N-二甲基甲酰胺混合后进行第二络合反应，得到具有式II所示结构的咔啉钌类络合物；
(iii)当咔啉钌类络合物具有式III所示结构时，制备方法包括以下步骤：
将R3对应的配体化合物、六氯钌酸铵和N,N-二甲基甲酰胺混合后进行第三络合反应，得到具有式III所示结构的咔啉钌类络合物。
优选地，所述R1对应的配体化合物与顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物的摩尔比为1：1，所述顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物、乙醇和水的用量比为0.2mmol：(9～11)mL：(9～11)mL。
优选地，所述第一络合反应的温度为15～35℃，时间为22～26h。
优选地，所述R2对应的配体化合物与顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物的摩尔比为1：1，所述顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为0.2mmol：(18～22)mL。
优选地，所述第二络合反应的温度为78～82℃，时间为5～7h。
优选地，所述R3对应的配体化合物与六氯钌酸铵的摩尔比为2：1，所述六氯钌酸铵和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为0.25mmol：(18～22)mL。
优选地，所述第三络合反应的温度为78～82℃，时间为5～7h。
本发明提供了上述技术方案所述咔啉钌类络合物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤转移药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括肉瘤或肺癌。
本发明设计了一系列咔啉钌类络合物，咔啉是从天然产物薤白中提取的化合物，在抑制肿瘤生长等方面生物活性好，本发明提供的咔啉钌络合物不仅能抑制肿瘤转移，并且对原发肿瘤具有抑制作用，生物活性高。本发明的测试例中用MTT法测定其对不同肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒作用，结果显示本发明提供的络合物对肿瘤细胞具有选择性的杀伤作用，为了探索其作用机制，对其纳米自组装情况进行了鉴定，发现其能够在体外形成比较稳定的球状纳米分子，并且能够与DNA和转铁蛋白相互作用；利用ICP-MS测定了络合物2b中Ru元素在细胞内的定位，发现络合物2b中的钌元素主要集中在细胞核中；测定了络合物2b对肺癌细胞A549细胞周期和凋亡的影响，并用western blot的方法测定了细胞内的有关蛋白的表达情况，结果表明络合物2b在细胞内的作用途径可能有三种，一是通过引起DNA裂解而使细胞周期阻滞，二是通过PARP/ATM途径引发细胞凋亡，三是抑制PDL1的表达，从而减弱肿瘤细胞的免疫抑制作用；在体内实验中，S180小鼠肉瘤模型评价了络合物对原发肿瘤的抑制作用，LLC抗转移模型评价了络合物对肺癌的抗转移作用，并且利用ICP-MS测定了其在生物体内的分布，同时对肿瘤组织进行免疫组化和免疫荧光分析，结果显示，络合物2b在生物体内能够抑制原发瘤的生长，并且能够抑制肿瘤在肺上的转移，作用机制可能是因为引起肿瘤组织细胞的凋亡，同时能够引起CD31表达的降低从而抑制新生血管的生成，进而起到抗转移的作用。
附图说明
图1为Ru在细胞内分布图；
图2为配体化合物及Ru络合物在细胞内分布图；
图3为Ru在体内分布图；
图4为细胞内ROS含量(DCFH-DA法)图；
图5为受试化合物对细胞内ROS水平影响统计图；
图6为ROS升高/降低比率统计图；
图7为络合物2b(O-K-Ru)与DNA相互作用图；
图8为络合物3a(K-T-Ru)与DNA相互作用图；
图9为络合物3a(K-T-Ru)与BSA相互作用荧光曲线变化图；
图10为络合物2b(O-K-Ru)与BSA相互作用荧光曲线变化图；
图11为络合物6a(NBD-Ru)与BSA相互作用荧光曲线变化图；
图12为荧光增强关系图；
图13为络合物2b对细胞内蛋白表达的影响图；
图14为络合物2b对细胞周期及细胞凋亡的影响图；
图15为配体化合物2及络合物2b的纳米自组装性质表征图；
图16为C57小鼠肿瘤组织TUNLE及CD31免疫切片图。
具体实施方式
本发明提供了一种咔啉钌类络合物，具有式I、式II或式III所示结构：
Figure BDA0002609776040000031
其中，所述R1为
Figure BDA0002609776040000032
所述R2为
Figure BDA0002609776040000041
所述R3为
Figure BDA0002609776040000042
Figure BDA0002609776040000043
在本发明中，所述R1、R2以及R3结构中的断键代表相应的原子与Ru形成配位键。
在本发明中，所述咔啉钌类络合物以及R1、R2和R3对应的配体化合物具体如表1所示。
表1咔啉钌类络合物以及R1、R2和R3对应的配体化合物
Figure BDA0002609776040000044
Figure BDA0002609776040000051
本发明提供了上述技术方案所述咔啉钌类络合物的制备方法，本发明优选根据咔啉钌类络合物的具体结构采用不同的制备方法，下面详细说明。
本发明中若无特殊说明，所用原料为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，当咔啉钌类络合物具有式I所示结构时，制备方法包括以下步骤：
将R1对应的配体化合物、顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物、乙醇和水混合后进行第一络合反应，得到具有式I所示结构的咔啉钌类络合物。
在本发明中，所述R1对应的配体化合物即为表1中配体化合物3、配体化合物5或配体化合物6；所述R1对应的配体化合物与顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物((bpy)2RuCl2(2H2O))的摩尔比优选为1：1，所述(bpy)2RuCl2(2H2O)、乙醇和水的用量比优选为0.2mmol：(9～11)mL：(9～11)mL，更优选为0.2mmol：10mL：10mL。本发明优选将R1对应的配体化合物、(bpy)2RuCl2(2H2O)、乙醇和水混合后超声溶解，之后进行第一络合反应。
在本发明中，所述第一络合反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃；本发明优选在室温条件下进行第一络合反应，即不需要额外的加热或降温；在本发明的实施例中，具体是在25℃条件下进行第一络合反应；所述第一络合反应的时间优选为22～26h，更优选为24h。第一络合反应结束后，本发明优选将所得体系过滤，将滤液进行中性氧化铝柱层析(按体积比计，洗脱剂优选为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，得到具有式I所示结构的咔啉钌类络合物。
在本发明中，当咔啉钌类络合物具有式II所示结构时，制备方法包括以下步骤：
将R2对应的配体化合物、顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物和N,N-二甲基甲酰胺混合后进行第二络合反应，得到具有式II所示结构的咔啉钌类络合物。
在本发明中，所述R2对应的配体化合物即为表1中配体化合物1、配体化合物2或配体化合物4。在本发明中，所述R2对应的配体化合物与(bpy)2RuCl2(2H2O)的摩尔比优选为1：1，所述(bpy)2RuCl2(2H2O)和N,N-二甲基甲酰胺的用量比优选为0.2mmol：(18～22)mL，更优选为0.2mmol：20mL。本发明优选将R2对应的配体化合物、顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物和N,N-二甲基甲酰胺混合后超声溶解，之后进行第二络合反应。
在本发明中，所述第二络合反应的温度优选为78～82℃，更优选为80℃；时间优选为5～7h，更优选为6h。第二络合反应结束后，本发明优选将所得体系趁热过滤，滤饼烘干后，得到具有式II所示结构的咔啉钌类络合物。
在本发明中，当咔啉钌类络合物具有式III所示结构时，制备方法包括以下步骤：
将R3对应的配体化合物、六氯钌酸铵和N,N-二甲基甲酰胺混合后进行第三络合反应，得到具有式III所示结构的咔啉钌类络合物。
在本发明中，所述R3对应的配体化合物即为表1中配体化合物1、配体化合物2、配体化合物3或配体化合物4。在本发明中，所述R3对应的配体化合物与六氯钌酸铵((NH4)2RuCl6)的摩尔比优选为2：1，所述(NH4)2RuCl6和N,N-二甲基甲酰胺的用量比优选为0.25mmol：(18～22)mL，更优选为0.25mmol：20mL。本发明对各组分的加料顺序以及混合方式没有特殊限定，能够将各组分充分混合即可。
在本发明中，所述第三络合反应的温度优选为78～82℃，更优选为80℃；时间优选为5～7h，更优选为6h。第三络合反应结束后，本发明优选向所得体系中加入冰丙酮，析出未反应的原料(NH4)2RuCl6，过滤，将滤液进行中性氧化铝柱层析(按体积比，洗脱剂优选为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，得到具有式III所示结构的咔啉钌类络合物。
在本发明中，表1中各配体化合物(配体化合物1～6)优选采用本领域技术人员熟知的方法制备得到，具体在实施例中详细说明。
本发明提供了上述技术方案所述咔啉钌类络合物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤转移药物。在本发明中，所述肿瘤优选包括肉瘤或肺癌。在本发明中，所述抗肿瘤药物和抗肿瘤转移药物独立地包括所述咔啉钌类络合物和药学上可接受的辅料；所述抗肿瘤药物和抗肿瘤转移药物中咔啉钌类络合物的含量优选独立地为10～50wt.％，所述药学上可接受的辅料优选包括淀粉、环糊精和甘露醇中的一种或几种；所述抗肿瘤药物和抗肿瘤转移药物的剂型优选独立地包括片剂、纳米冻干粉或脂质体。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
制备3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(4H-KLSS，配体化合物1)
量取40mL蒸馏水置于250mL茄瓶中，加入0.1mL浓硫酸(98wt％)搅拌5min；加入色氨酸2.50g超声溶解，放入转子置于搅拌器上面搅拌；加入5mL甲醛，室温(25℃)搅拌条件下反应4h(用TLC监测反应，按体积比计，展开剂为乙酸乙酯：水：冰醋酸＝3：1：1，茚三酮染色后产物至淡黄色为止)；反应结束后加入氨水调节所得体系的pH值至6，静置30min，有大量类白色固体析出，之后用布氏漏斗抽滤，收集滤饼置于表面皿中晾干，得到2.568g目标化合物，即3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸，为白色固体。ESI-MS:217[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm)＝14.12(s,1H),11.20(s,1H),10.00(s,1H),7.50(d,1H,J＝7.7Hz),7.37(d,2H,J＝7.7Hz),7.11(t,1H,J＝7.3Hz),7.02(t,1H,J＝7.3Hz),4.48(dd,1H,J＝4.9Hz),4.38(s,1H),4.03(dd,1H,J＝7.1Hz),3.31(1H,dd,J＝6.9Hz),3.04(dd,1H,J＝8.6Hz)。
实施例2
制备(bpy)2Ru(II)(4H-KLSS)(络合物1a)
称取44mg(0.2mmol)配体化合物1于50mL茄瓶中，再加入104mg(0.2mmol)(bpy)2RuCl2(2H2O)和20mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，超声溶解后，80℃条件下反应6h；反应结束后趁热过滤，滤饼烘干后，得到88mg目标化合物，即(bpy)2Ru(II)(4H-KLSS)，为紫红色固体粉末。ESI/MS(m/z):629.3[M-Cl]+。
实施例3
制备Ru(IV)(4H-KLSS)Cl4(络合物1b)
称取108mg(0.5mmol)配体化合物1于50mL茄瓶中，再加入(NH4)2RuCl6(88mg,0.25mmol)和20mL DMF，80℃条件下反应6h；反应结束后加入冰丙酮，析出未反应的原料(NH4)2RuCl6，过滤，将滤液进行中性氧化铝柱层析，按体积比，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1，得到104mg目标化合物，即Ru(IV)(4H-KLSS)Cl4，为黑色固体粉末。ESI-MS(m/e):461.2[M+H]+。
实施例4
制备3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯
冰浴条件下，将6mL的SOCl2滴加到80mL无水甲醇中，反应混合物在0℃搅拌0.5h，加入3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3羧酸(4H-KLSS)4.32g(20mmol)，在室温条件下搅拌24h(TLC监测反应进程，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1)；反应结束后将所得体系在真空中浓缩，所得的粗品溶解在8mL甲醇中，然后减压干燥3次，残余物再次悬浮在乙醚中，在真空中浓缩3次；用柱层析法将所得残余物进行纯化(按体积比计，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得到1.65g(35.9％)目标产物，即3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯，为白色粉末。ESI/MS(m/z):231.4[M+H]+.1H NMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm)＝11.20(s,1H),10.15(s,1H),7.48(d,1H,J＝7.8Hz),7.38(d,1H,J＝8.1Hz),7.12(t,1H,J＝7.5Hz),7.02(t,1H,J＝7.5Hz),4.62(dd,1H,J1＝9.9Hz,J2＝5.1Hz),4.39(s,2H),3.83(s,3H),3.30(dd,1H,J1＝14.7Hz,J2＝4.5Hz),3.07(dd,1H,J1＝15.9Hz,J2＝10.2Hz)。
制备咔啉-3-羧酸甲酯
将3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯460mg(0.2mmol)溶于15mL丙酮中得到A溶液，将KMnO4474 mg(0.4mmol)溶于10mL水中得到B溶液，在0℃条件下将B溶液滴加至A溶液中，在室温条件下搅拌反应12h(TLC监测反应进程，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1)，加入乙醇结束反应；反应结束后将所得粗产物进行过滤，以去除生成的MnO2，在真空条件下浓缩去除溶剂，用柱层析法将所得残余物进行纯化(按体积比计，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝15：1)，得到174mg(38.5％)目标产物，即咔啉-3-羧酸甲酯，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e):227[M+H]+.1H NMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm)＝12.09(s,1H),8.97(s,1H),8.94(s,1H),8.41(d,1H,J＝7.8Hz),7.68(d,1H,J＝8.1Hz),7.61(t,1H,J＝7.5Hz),7.32(t,1H,J＝7.2Hz),3.91(s,3H)。
制备咔啉-3-羧酸(KLSS，配体化合物2)
将咔啉-3-羧酸甲酯100mg(0.044mmol)溶于10mL甲醇中，在冰浴条件下，加入2mol/L的NaOH溶液，将混合物pH值调至12，反应混合物在0℃搅拌反应6h(TLC监测反应进程，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1)，用KHSO4水溶液调节反应体系pH值为7，使反应终止；将所得体系进行过滤，滤液在减压下浓缩，得到糖浆类物质，将所述糖浆类物质与水混合，之后经过滤和干燥，得到63.2mg(56.7％)目标产物，即咔啉-3-羧酸，为砖红色粉末。ESI-MS(m/e):212.94[M+H]+.1H NMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm)＝12.20(s,1H),9.00(s,2H),8.45(d,1H,J＝7.8Hz),7.71(d,1H,J＝8.1Hz),7.64(t,1H,J＝7.5Hz),7.35(t,1H,J＝7.2Hz)。
实施例5
制备(bpy)2Ru(II)(KLSS)(络合物2a)
制备方法基本同实施例2，不同之处在于，将实施例2中的“44mg(0.2mmol)配体化合物1”替换为“44mg(0.2mmol)配体化合物2”，最终得到88mg目标化合物[(bpy)2Ru(II)(KLSS)，为紫红色固体粉末。ESI/MS(m/z):625.4[M-Cl]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm)＝9.65(1H,dd,J＝12.0Hz),9.57(s,1H),9.15(m,1H),8.59(t,1H,J＝7.2Hz),8.51(d,1H,J＝7.6Hz),8.42(d,2H,J＝7.5Hz),8.34(d,2H,J＝7.6Hz),8.03(d,3H,J＝7.5Hz),7.81(t,1H,J＝5.3Hz),7.74(t,1H,J＝5.3Hz),7.63(d,2H,J＝3.3Hz),7.48(d,2H,J＝3.3Hz),7.28(m,2H),7.14(d,1H,J＝5.7Hz),7.09(d,2H,J＝3.3Hz)。
实施例6
制备[Ru(IV)(KLSS)Cl4](络合物2b)
称取110mg(0.5mmol)配体化合物2于50mL茄瓶中，再加入(NH4)2RuCl6(88mg,0.25mmol)和10mL DMF，80℃条件下反应6h；反应结束后加入冰丙酮，析出未反应的原料(NH4)2RuCl6，过滤，将滤液进行中性氧化铝柱层析，按体积比，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1，得到104mg目标产物，即[Ru(IV)(KLSS)Cl4]，为黑色固体粉末。ESI-MS(m/e):455.5[M+H]+.1H NMR(300MHz,,DMSO-d6),δ(ppm)＝12.20(s,1H),9.00(s,2H),8.45(d,1H,J＝7.8Hz),7.71(d,1H,J＝8.1Hz),7.64(t,1H,J＝7.5Hz),7.35(t,1H,J＝7.2Hz)。
实施例7
制备N-Boc-3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸
将3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3羧酸(4H-KLSS)2.12g(10mmol)悬浮于40mL的DMF中，冰浴搅拌条件下向所得悬浮液中加入2.18g(10mmol)(Boc)2O；加三乙胺将反应混合物的pH值调到10，室温条件下反应48h，其中，反应开始后2h内每隔30min减压抽气一次，之后每隔7～8h减压抽气一次，TLC监测反应进度，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇：冰醋酸＝20：1：0.1；反应结束后将所得体系倒入表面皿中吹干，吹干后呈糖浆状，倒入乙酸乙酯溶解，用滴管吸取溶解液置于250mL分液漏斗中，用5wt％的KHSO4水溶液洗涤3次，再用饱和氯化钠洗3次，所得乙酸乙酯层中加入无水硫酸钠干燥剂干燥2h，过滤去除干燥剂；滤液用旋转蒸发仪减压旋干，得到糖浆状物质；所述糖浆状物质用乙酸乙酯磨洗，抽滤去除溶剂，得到800mg(25.3％)目标化合物，即N-Boc-3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸，为白色固体。
制备N-Boc-KLSS-Thr-OBzl
称取574.5mg N-Boc-3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸和269mg 1-羟基苯并三唑(HOBt)，冰浴条件下加入250mL茄瓶中，并用100mL干燥THF溶解；缓慢滴加由409mg二环己基碳二亚胺(DCC)和5mL THF配制而成的溶液，搅拌活化0.5h得到A液；将405mg(1.65mmol)HCl·Thr-OBzl(苏氨酸苄酯盐酸盐)用50mL干燥THF溶解，滴加N-甲基吗啡啉(NMM)调pH值到8，得到B液；将B液缓慢加入到A液中，用NMM调pH值到8，撤去冰浴，室温条件下反应4h(用TLC监测反应进程，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇：冰醋酸＝20：1：0.1)；反应结束后将反应液抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，得到的残余物与乙酸乙酯混合，置于250mL分液漏斗中；之后依次用饱和NaHCO3溶液洗3次、饱和NaCl溶液洗3次、5wt％KHSO4溶液洗3次、饱和NaCl溶液洗3次、饱和NaHCO3溶液洗3次、饱和NaCl溶液洗3次；分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥剂干燥，抽滤去除干燥剂，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，硅胶柱层析纯化(按体积比计，所用试剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得到340mg(50.6％)目标产物，即N-Boc-KLSS-Thr-OBzl，为白色晶体。ESI-MS:519.1[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm)＝10.78(s,1H),7.87(d,1H,J＝7.5Hz),7.31(s,5H),7.27(d,2H,J＝8.4Hz),7.03(t,1H,J＝7.5Hz),6.94(t,1H,J＝7.5Hz),5.28(s,2H),5.20(dd,1H,J1＝15.0Hz,J2＝6.0Hz),5.08(m,1H),4.97(m,2H),4.76(dd,1H,J1＝15.0Hz,J2＝7.5Hz),4.56(m,1H),4.31(m,1H),3.17(s,1H),2.98(m,1H),3.13(m,1H),1.67(m,1H),1.47(s,9H),1.01(d,3H,J＝3.6Hz)。
制备KLSS-Thr(配体化合物3)
称取597mg(1mmol)N-Boc-KLSS-Thr-OBzl于100mL茄瓶中，加20mL甲醇溶解后加入40mg钯碳(Pd/C)，反应气氛置换成H2后室温条件下反应4h(TLC监测反应进程，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1)；反应结束后过滤去除钯碳，滤液旋干得到透明粘液状物质；用20mL HCl的乙酸乙酯溶液(HCl的浓度为4mo/L)溶解，冰浴条件下反应4h(TLC监测反应进程，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇：冰醋酸＝20：1：0.1)；反应结束后抽干，所得固体物料再依次用无水乙酸乙酯和无水乙醚分别抽滤洗涤3次，得到390mg(95.8％)目标产物，即KLSS-Thr，为白色固体。ESI/MS(m/z):430.4[M+Na]+；1H NMR(300MHz.DMSO-d6),δ(ppm)＝10.74(s,1H),7.99(d,1H,J＝8.4Hz),7.40(d,1H,J＝7.5Hz),7.28(d,1H,J＝7.8Hz),7.02(t,1H,J＝7.5Hz),6.95(t,3H,J＝6.9Hz),4.21-4.12(m,2H),4.03(s,2H),3.66(dd,1H,J1＝9.3Hz,J2＝5.1Hz),3.01(dd,1H,J1＝15.3Hz,J2＝4.8Hz),2.88(dd,1H,J1＝15.3Hz,J2＝9.3Hz),1.06(d,1H,J＝6.3Hz)。IR：νO-H:3244cm-1；ν-CH3:2924cm-1,2853cm-1；νO＝C-N-H:1690cm-1；νC＝C:1609cm-1,1453cm-1；νC-O-H：1078cm-1,δ＝C-H：743cm-1(邻二取代)。
实施例8
制备bpyRu(II)(KLSS-Thr)Cl2(络合物3a)
称取82mg(0.2mmol)配体化合物3于50mL茄瓶中，再加入104mg(0.2mmol)(bpy)2RuCl2(2H2O)、10mL乙醇和10mL水，超声溶解后，室温条件下反应24h；反应结束后过滤，滤液进行中性氧化铝柱层析，按体积比计，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1，得到22mg目标化合物，即bpyRu(II)(KLSS-Thr)Cl2，为紫红色固体粉末。ESI/MS(m/z):646.4[M+H]+；1H NMR(300MHz,300MHz,DMSO-d6),δ(ppm)＝11.20(s,1H),9.98(s,2H),9.29(d,1H,J＝4.53Hz),8.93(d,1H,J＝7.8Hz),8.59(d,1H,J＝7.5Hz),8.19(t,1H,J＝7.65Hz),7.71(t,1H,J＝6.3Hz),7.46(d,2H,J＝7.5Hz),7.38(d,2H,J＝8.1Hz),7.38(t,1H,J＝8.1Hz),7.12(t,2H,J＝7.2Hz),7.03(t,2H,J＝7.2Hz),7.03(t,1H,J＝7.2Hz),4.36(m,5H),3.38(m,2H),1.17(d,3H,J＝6.0Hz)。
实施例9
制备Ru(II)(KLSS-Thr)Cl4(络合物3b)
制备方法基本同实施例6，不同之处在于，将实施例6中的“110mg(0.5mmol)配体化合物2”替换为“205mg(0.5mmol)配体化合物3”，最终得到153mg目标化合物Ru(II)(KLSS-Thr)Cl4，为黑色固体粉末。ESI-MS(m/e):616[M+H]+。
实施例10
制备KLSS-Ser(配体化合物4)
制备方法基本同实施例7，不同之处在于，将实施例7中的“405mg(1.65mmol)HCl·Thr-OBzl”替换为“399mg(1.65mmol)HCl·Ser-OBzl”(丝氨酸苄酯盐酸盐)，得到Boc-KLSS-Ser-OBzl；进而在Boc-KLSS-Ser-OBzl基础上制备得到KLSS-Ser(352mg，49.6％)。
Boc-KLSS-Ser-OBzl表征数据：1H NMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm)＝10.83(d,1H,J＝14.7Hz),8.29(d,1H,J＝5.1Hz),7.29(s,5H),7.29(d,1H,J＝7.2Hz),7.21(d,1H,J＝7.2Hz),7.03(dd,1H,J1＝14.4Hz,J2＝7.2Hz),6.94(dd,1H,J1＝14.4Hz,J2＝7.2Hz),5.12(s,2H),4.99(s,1H),4.91(s,1H),4.77(d,1H,J＝16.2Hz),4.55(m,1H),4.35(s,1H),3.72(dd,1H,J1＝10.5Hz,J2＝5.4Hz),3.62(dd,1H,J1＝10.8Hz,J2＝4.8Hz),3.26(dd,1H,J1＝15.6Hz,J2＝6.6Hz),2.97(dd,1H,J1＝15.6Hz,J2＝6.6Hz),1.45(s,9H)。
KLSS-Ser表征数据；ESI/MS(m/z):303.8[M+1]+；1H NMR(300MHz.DMSO-d6),δ(ppm)＝10.75(s,1H),8.18(d,1H,J＝7.8Hz),7.39(d,2H,J＝7.5Hz),7.28(d,1H,J＝7.8Hz),6.99(m,2H),4.29(m,1H),4.03(s,2H),3.78(dd,1H,J1＝6.3Hz,J2＝4.5Hz),3.76(d,1H,J＝4.5Hz),3.66(d,2H,J＝4.2Hz),3.64(dd,1H,J1＝6.9Hz,J2＝4.2Hz),3.00(dd,1H,J＝6.9Hz),2.70(dd,1H,J＝6.9Hz),1.88(s,1H)；IRνO-H:3328cm-1,νN-H:3194cm-1,ν-CH2:2954cm-1,νO＝C-N-H:1656cm-1,νC＝C:1600cm-1,δ-CH2:1556cm-1,νC-O-H：1066cm-1,δ＝C-H：736cm-1(邻二取代)；[α]D 25＝+170.6(c 0.1，CH3OH)。
实施例11
制备(bpy)2Ru(II)(KLSS-Ser)(络合物4a)
制备方法基本同实施例2，不同之处在于将实施例2中“44mg(0.2mmol)配体化合物1”替换为“60mg(0.2mmol)配体化合物4”，最终得到38mg目标化合物(bpy)2Ru(II)(KLSS-Ser)。ESI/MS(m/z):715.6[M+1]+；[α]D 25＝+104.7(c 0.1,CH3OH)。
实施例12
制备Ru(II)(KLSS-Ser)Cl4(络合物4b)
制备方法基本同实施例6，不同之处在于将实施例6中“110mg(0.5mmol)配体化合物2”替换为“205mg(0.5mmol)配体化合物4，最终得到153mg目标化合物Ru(II)(KLSS-Ser)Cl4，为黑色固体粉末。ESI-MS(m/e):616[M+H]+。
实施例13
制备KLSS-Hyp(配体化合物5)
制备方法基本同实施例7，不同之处在于，将实施例7中的“405mg(1.65mmol)HCl·Thr-OBzl”替换为“300mg(1.65mmol)HCl·Hyp-OCH3”(羟基脯氨酸甲酯盐酸盐)，得到Boc-KLSS-Hyp-OCH3；进而在Boc-KLSS-Hyp-OCH3基础上制备得到KLSS-Hyp(268mg，32.5％)，为红棕色固体粉末。
Boc-KLSS-Hyp-OCH3表征数据：1H NMR(300MHz.DMSO-d6)δ(ppm)＝10.77(s,1H),7.72(d,1H,J＝5.7Hz),7.69(d,1H,J＝3.9Hz),7.30(d,1H,J＝7.2Hz),7.00(m,2H),5.25(m,1H),5.18(m,1H),4.73(m,1H),4.53(d,1H,J＝7.2Hz),4.40(m,1H),4.30(d,1H,J＝7.2Hz),3.78(dd,1H,J1＝7.2Hz,J2＝6.9Hz),3.60(s,3H),3.13(m,1H),3.07(m,1H),1.51(d,9H,J＝7.2Hz)。
KLSS-Hyp表征数据：ESI/MS(m/z):329.74[M+1]+；1H NMR(300MHz.MeOD)δ(ppm)＝7.53(d,1H,J＝7.5Hz),7.39(d,1H,J＝8.1Hz),7.18(t,1H,J＝7.2Hz),7.09(t,1H,J＝7.2Hz),4.65(m,1H),4.59(m,1H),4.73(m,1H),3.87(d,1H,J＝4.5Hz),3.82(dd,1H,J1＝13.2Hz,J2＝6.6Hz),3.77(d,1H,J＝4.5Hz),3.56(dd,1H,J1＝3.0Hz,J2＝1.8Hz),3.091(dd,1H,J1＝3.3Hz,J2＝1.5Hz),2.42(m,1H),2.155(m,1H),2.029(s,1H)；IRνO-H/νN-H:2000-3500cm-1(形成分子内氢键),ν-CH2:2943cm-1,νO＝C:1731cm-1,νO＝C-N-H＝1645cm-1,νC＝C:1450cm-1,δ-CH2:1435cm-1,δ＝C-H：743cm-1(邻二取代)；[α]D 25＝-56.8(c 0.1CH3OH)。
实施例14
制备(bpy)Ru(II)(KLSS-Hyp)Cl2(络合物5a)
制备方法基本同实施例8，不同之处在于将实施例8中“82mg(0.2mmol)配体化合物3”替换为“65mg(0.2mmol)配体化合物5”，最终得到22mg目标化合物(bpy)Ru(II)(KLSS-Hyp)Cl2，为红棕色固体。ESI/MS(m/z):658.54[M+1]+；[α]D 25＝+26.6(c 0.1,CH3OH)。
实施例15
制备O-K-NBD(配体化合物6)
称取212mg KLSS和65mg HOBt，冰浴条件下，加入100mL茄瓶中，并用20mL无水DMF溶解；加入99mg DCC，搅拌活化0.5h；将100mg(0.40mmol)硝基氨基吡咯烷苯并恶嗪加入茄瓶中，滴加NMM调pH值到8；撤去冰浴，室温条件下进行反应12h(用TLC监测反应进程，按体积比计，展开剂为二氯甲烷：甲醇＝20：1)；反应结束后将所得体系用旋转蒸发仪减压浓缩至干，硅胶柱层析纯化(按体积比计，所用试剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得到118mg(66.3％)目标产物，即O-K-NBD，为黄色晶体。ESI-MS:468[M+Na]+.1H NMR(300MHz.DMSO-d6)δ(ppm)＝11.93(s,1H),9.15(d,1H,J＝7.17Hz),8.87(s,2H),8.50(d,1H,J＝8.6Hz),8.40(d,1H,J＝7.8Hz),7.62(m,2H,J＝7.3Hz),7.30(t,1H,J＝7.0Hz),6.33(d,1H,J＝8.9Hz),4.88(s,1H),4.42(m,2H),3.95(m,1H),2.40(m,2H)。
实施例16
制备NBD-Ru(络合物6a)
制备方法基本同实施例8，不同之处在于将实施例8中“82mg(0.2mmol)配体化合物3”替换为“89mg(0.2mmol)配体化合物6”，最终得到22mg目标化合物NBD-Ru，为紫红色固体粉末。ESI/MS(m/z):815[M+K]+；1H NMR(300MHz.DMSO-d6)δ(ppm)＝11.95(s,1H),9.98(d,1H,J＝4.8Hz),9.15(d,1H,J＝7.2Hz),8.87(s,2H),8.64(d,2H,J＝7.8Hz),8.48(d,2H,J＝7.7Hz),8.40(d,1H,J＝7.8Hz),8.22(t,1H,J＝8.6Hz),8.06(t,2H,J＝7.3Hz),7.95(s,1H),7.77(t,2H,J＝6.7Hz),7.65(m,4H),7.52(d,1H,J＝5.2Hz),7.30(t,2H,J＝7.2Hz),7.10(t,1H,J＝6.2Hz),6.33(d,1H,J＝8.1Hz),5.59(d,2H,J＝7.5Hz),4.86(d,1H,J＝5.1Hz),4.36(m,2H),3.85(s,2H),2.41(m,2H)。
测试例1评价钌络合物的体外抗肿瘤活性(MTT法)
将生长状态良好且处于对数生长期的贴壁细胞用PBS缓冲液洗3次，0.25％胰酶消化至大部分细胞从瓶壁脱落，加入相应培养基终止消化，沿壁吹打至细胞完全脱落，转移至15mL离心管中，于3000rpm离心3min，弃去上清液，加培养基吹打重悬，计数，细胞密度为3～4×104个/mL，接种于96孔板中，每孔加入100μL(96孔板外围每孔加100μL PBS缓冲液进行液封)。在条件为37℃、5％CO2的孵箱中孵育4h，观察细胞贴壁情况，当贴壁率达到50％以上时给药。给药每孔加25μL受试样品液，轻轻晃动均匀(每板均须设置空白和阳性对照)。于孵箱培养48h后，每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，孵箱中孵育4h，吸去上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡15min充分溶解沉淀。5min内使用酶标仪于570nm和490nm波长下测定每孔OD(吸光度)值。按照式a计算抑制率，实验重复三次，根据抑制率和受试化合物的浓度计算受试化合物的IC50(半数有效抑制浓度)值。结果见表2。
抑制率＝[(空白组的OD平均值–化合物组的OD平均值)/空白组的OD值]×100％ 式a。
表2受试化合物体外抗细胞增殖活性结果(IC50±SD，μM，n＝6)
Figure BDA0002609776040000141
测试例2评价钌络合物体内抑制肿瘤增殖实验(移植性小鼠S180肉瘤模型)
体内抗肿瘤细胞增殖实验(移植性小鼠肉瘤模型)实验所用瘤源：S180小鼠肉瘤细胞，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代保留。
选用传代后一周的S180腹水瘤模型的小鼠，断颈处死，用75％医用酒精对腹部进行消毒，剖开腹腔，取其腹水S180瘤液，经过1000r/min×3min离心后，除去细胞碎片，用生理盐水稀释3倍，利用MUSE流式细胞仪测试细胞活力与密度，结果显示活度为92.27％>90％，密度为2.27×107个/mL。
将此细胞悬液稀释到密度为1.5×107个/mL，吸取0.2mL接种到健康小鼠右侧腋皮下，完成实体瘤动物模型的建立。
各组连续给药7天后，第8天对各组小鼠称重后，断颈处死，用镊子固定小鼠右侧腋下实体瘤生长部位，剖开皮肤，暴露肿瘤，之后钝性剥离，称重，按照式b计算各组化合物对于实体瘤的抑制活性，并进行t检验。
抑瘤率＝[(空白对照组平均瘤重-试验组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重]×100％ 式b。
剥离小鼠体内的实体瘤后，再剖离出其心、肝、脾、肾和脑并称取重量，按照式c进行心指数、肝指数、脾指数、肾指数和脑指数的测定，并进行t检验。
各器官指数＝(器官重量/处死体重)×100％ 式c。
通过移植性小鼠肉瘤模型，各组化合物体内瘤重结果如表3所示。
表3各受试化合物影响下小鼠瘤重结果
Figure BDA0002609776040000151
注：Pt(顺铂)为阳性对照；剂量为5mg/kg，腹腔注射给药；DOX(阿霉素)为阳性对照；剂量为1mg/kg，腹腔注射给药；化合物剂量为5mg/kg、2.5mg/kg、1mg/kg，腹腔给药；Control为腹腔注射1％DMSO+20％2-羟丙基-β-环糊精。结果经t检验，a代表与Control相比，p<0.01，b代表与Control相比，p<0.05。
由表3可知，络合物5mg/kg和2.5mg/kg 3a,2b,6a在S180小鼠肉瘤模型中对原发肿瘤有很好的抑制作用，并且呈剂量依赖性。
测试例3评价钌络合物体内抑制肿瘤转移实验(小鼠Lewis肺癌转移模型)
Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)，购自ATCC。选用DMEM培养基(其中含10％经灭活的胎牛血清，1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素)培养LLC细胞。按照贴壁细胞培养方法，每两天传代一次，富集细胞。
待细胞生长状态良好、处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度至1×107/mL，胎盘蓝(Tryanblue)拒染实验示活细胞数>95％。取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL/只(含肿瘤细胞数约为2×106/只)。小鼠接种后8～10天可以长出绿豆粒大小的肿瘤，作为瘤源备用。
取接种8～10天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，颈椎脱臼，用75％乙醇浸泡消毒10min，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块重(g)与生理盐水体积(mL)为1：3的比例加入4℃预冷的生理盐水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×107个/mL，胎盘蓝(Tryanblue)拒染实验示活细胞数>95％。
取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL(含肿瘤细胞数约为2×106/只)。小鼠接种后8～10天可以生长成绿豆粒大的肿瘤，测量肿瘤体积，按肿瘤平均体积分组进行实验。
各组连续给药11天，每天测量瘤体积后，第12天对各组小鼠称重测量瘤体积后，断颈处死，用镊子固定小鼠右侧腋下实体瘤生长部位，剖开皮肤，暴露肿瘤，之后钝性剥离，称重，按照式b计算各组化合物对于实体瘤的抑制活性，并进行t检验。
剥离小鼠体内的实体瘤后，再剖离出其心、肺、肝、脾、肾和脑并称取重量，记录肿瘤肺部转移率及转移瘤结数，按照式c进行心指数、肝指数、脾指数、肾指数和脑指数的测定，并进行t检验。
通过小鼠Lewis肺癌转移模型，各组化合物体内肺转移瘤结数如表4所示。
表4各受试化合物影响下小鼠原始肿瘤及肺转移瘤结数
Figure BDA0002609776040000161
注：NAMI-A为阳性对照，剂量为35mg/kg，前三天连续给药，后9天隔天给药；化合物剂量为5mg/kg、2.5mg/kg、1mg/kg，腹腔给药；Vehicle组为腹腔注射生理盐水。结果经t检验；a代表与Vehicle组相比，p<0.01；b代表与Vehicle组相比，p<0.05。
由表4可知，5mg/kg的3a和2b既能够抑制小鼠原始肿瘤的生长，又能够抑制肺转移的发生，同时2b在低剂量2.5mg/kg及1mg/kg的情况下也能抑制原始肿瘤的生长。
测试例4 ICP/MS评价亚细胞分布
收集指数生长的细胞，并将所产生的单细胞悬浮液以105个/mL接种在T-75的细胞培养皿中(或者100mm的组织培养板(Costar)中)，在37℃下培养过夜；弃去旧培养基，重新加入15mL新培养基+3.75mL化合物溶液(1640配制，5倍浓度)；培养24h后，PBS缓冲液洗3次，用细胞刮刀将细胞收集起来，细胞悬液于4℃、800g离心7min，再悬浮于1.5mL的缓冲液中，得到均匀的细胞悬液；将细胞悬液转移到1mL的玻璃匀浆器中，冰水浴下研磨30～40次；将细胞匀浆转移到离心管中，于4℃、800g条件下离心5min，细胞核分布于沉淀中，线粒体分布在上清液中；取沉淀加入0.5mL的缓冲液A，将另一预冷的离心管中加入1mL的缓冲液B，将悬液置于缓冲液B之上，于4℃、1000g条件下离心10min，弃去上清，得到较纯的细胞核沉淀，用100μL储存缓冲液重悬细胞核，取5μL用BCA测蛋白，其余去测ICP/MS。在另一预冷的离心管中预先加入0.5mL的缓冲液C，将上述得到的上清液0.5mL(缓冲液C与上清液体积比为1：1)，沿着管壁小心加入到离心管中，覆盖于缓冲液C的上层；4℃、15000g条件下离心10min，离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管中。线粒体沉在管底；在线粒体沉淀中加入0.2mL缓冲液重悬线粒体沉淀，4℃、15000g条件下离心10min，弃上清；100μL线粒体存储液重悬线粒体沉淀，取5μL用BCA测蛋白，其余去测ICP/MS。
BCA蛋白含量测定：绘制标准曲线；加入细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)15mL，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30min，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值。
吸光值带入标准曲线，得到的蛋白含量μg/20*样品稀释倍数(4倍)＝原始蛋白含量。
ICP/MS测定Ru的含量：将线粒体及细胞核沉淀加入255μL水中使得总体积为350μL，并将样品混合液(300μL)加入70％硝酸(500μL)在微波消解仪消解0.5h，程序设定见表5。然后将样品加入900μL水，用于电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)，以空白对照为参比，计算Ru含量。
表5微波消解仪消解程序
Figure BDA0002609776040000171
图1为Ru在细胞内分布图，由图1可知，络合物3a(K-T-Ru)以及络合物2b(O-K-Ru)主要分布在细胞核(N)，络合物6a(NBD-Ru)主要分布在线粒体(M)。
测试例5激光共聚焦观察NBD-Ru细胞分布
取1mL A549细胞浓度105个/mL种在confocal小室中，培养过夜，第二天加药，给药浓度为25μM，用培养基配制，将confocal小室里面的培养液吸出，加入1mL药液，孵箱孵育8h和24h；不同给药时间点取出，将培养基吸出，PBS缓冲液洗2遍，加入1mL4％多聚甲醛，室温固定30min；PBS缓冲液洗2遍之后，加入1mL浓度为1μg/mL的DAPI，染色10～15min，PBS缓冲液洗3遍，摇床上摇10min，最后一次加入含有抗荧光淬灭剂的PBS缓冲液(5μL+995μL PBS)，激光共聚焦下观察。图2为配体化合物及Ru络合物在细胞内分布图，由图2可知，激光共聚焦测试结果印证了上述实验结果，络合物6a(绿色荧光)主要分布在细胞质中，没有进细胞核。
测试例6 ICP/MS评价Ru体内分布
配制消解液(HNO3与30％H2O2的体积比为3：2)，现配现用；取ICR小鼠内脏，称重加入消解管中，每个内脏组织不能超过0.5g，加入3mL消解液，用MARS Xpress微波消解仪消解，消解方法同测试例4，消解后用超纯水定容到10mL。
在Ru原液(浓度为1000μg/mL，麦克林)基础上配制Ru标准溶液，浓度为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5625ng/mL、0.78125ng/mL、0.390625ng/mL和0，内标采用铑Rh标准溶液100μg/mL，仪器采用Agilent Technologies8800ICP-MS Triple Quad。
图3为Ru在体内分布图。由图3可知，络合物2b和络合物3a给药浓度为5mg/kg，络合物6a给药浓度为1mg/kg，ICP结果显示络合物2b靶向肿瘤的比例为29.6％，均高于另外两种化合物。
测试例7 Ru络合物对细胞内ROS的影响
细胞内活性氧水平检测是运用DCFH-DA的方法，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通过细胞膜，从而使得探针很容易被装载到细胞内，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
于六孔板中加入1mL细胞浓度105个/mL的A549细胞，培养过夜，第二天加药，给药浓度为50μM，用培养基配制，将六孔板中的培养液吸出，加入1mL药液，孵箱孵育24h；24h后去除细胞培养液，PBS缓冲液洗2遍，不含EDTA的胰酶消化15min，转移至1.5mL EP管中，3000r/min条件下离心3min，去除上清，加入1mL浓度为10μM的DCFH-DA，37℃孵育20min，混匀使得探针充分与细胞接触；离心去除染液，以PBS缓冲液洗3遍，流式细胞仪检测绿色荧光强度，每个药重复三孔，统计绿色荧光强度平均值。
取1mL A549细胞浓度105个/mL种在confocal小室中，培养过夜，第二天加药，给药浓度为50μM，用培养基配制，将confocal小室里面的培养液吸出，加入1mL药液，孵箱孵育24h；24h后将培养基吸出，PBS缓冲液洗2遍，加入1mL浓度为10μM的DCFH-DA，37℃孵育染色20min，PBS缓冲液洗3遍，摇床上摇10min，洗涤结束加入PBS缓冲液，用激光共聚焦观察绿色荧光强弱，并且用流式细胞仪定量绿色荧光强度，其中，ROS抑制率按照式d计算：
ROS抑制率＝(化合物绿色荧光强度-对照组绿色荧光强度)/对照组绿色荧光强度 式d。
图4为细胞内ROS含量(DCFH-DA法)图，图5为受试化合物对细胞内ROS水平影响统计图，图6为ROS升高/降低比率统计图。由图4～6可知，络合物2b和络合物3a能够抑制ROS的生成，同时，在扣除络合物6a的本身荧光之后，络合物6a依旧能够增强ROS的生成。
测试例9 Ru络合物与ct-DNA相互作用
称取ct-DNA 5 mg，溶于10mL PBS缓冲液中，搅拌过夜使其充分溶解，得到ct-DNA原液，稀释10倍之后测UV曲线，计算OD260/OD280＝1.88＞1.8，说明ct-DNA没有被蛋白质污染，可以使用；采用公式A＝ε*b*c计算得到ct-DNA的浓度为1.17×10-4mol/L，其中A为吸光度，ε为吸收系数，c为浓度，b为比色皿宽度1cm，则原液浓度为1.17×10-3mol/L。配制化合物溶液，使其最大紫外吸收在1左右，络合物2b(O-K-Ru)的浓度为2.5×10-5g/mL，络合物3a(K-T-Ru)的浓度为1.25×10-5g/mL。
紫外比色皿中加入3mL化合物溶液，依次往对照及样品溶液中加入3μL的ct-DNA，观察并记录紫外曲线的变化，根据Benesi-Hildebrand方程绘制[DNA]/(εa-εf)–[DNA]散点图，斜率与截距之比即为络合物的结合常数。
图7为络合物2b(O-K-Ru)与DNA相互作用图，图8为络合物3a(K-T-Ru)与DNA相互作用图。根据Benesi-Hildebrand方程算得络合物的结合常数如表6所示。
表6络合物的结合常数
Figure BDA0002609776040000191
由以上结果可知，络合物2b与DNA的结合常数比络合物3a大，说明络合物2b可能对DNA的结合能力更强，影响更大。
测试例10Ru络合物与人转铁蛋白(hTF)相互作用
称取hTF 10mg，溶于10mL PBS缓冲液中，使其充分溶解，得到hTF原液，稀释2倍之后测UV曲线，采用公式A＝ε*b*c计算得到hTF的浓度为8.98×10-6mol/L，其中A为吸光度，ε为吸收系数11300L/mol/cm，c为浓度，b为比色皿宽度1cm，则原液浓度为1.796×10-5mol/L。配制化合物2b(O-K-Ru),3a(K-T-Ru)和6a(NBD-Ru)10-3mol/L。
向荧光比色皿中加入3mL的hTF溶液，加入3μL的钌络合物溶液，设置激发波长为290nm，发射波长为300nm～550nm，观察并记录荧光曲线的变化，根据荧光淬灭方程F/F0＝1+Ksv*[Q],Kq＝Ksv/τ0(τ0为色氨酸的平均荧光寿命，5.78*10-9s)，log[(F0-F)/F]＝logK+nlog[Q]，绘制F/F0–[Q]散点图和log[(F0-F)/F]-log[Q]，计算结合常数和结合位点等。
图9为络合物2b(O-K-Ru)与hTF相互作用荧光曲线变化图，图10为络合物3a(K-T-Ru)与hTF相互作用荧光曲线变化图，图11为络合物6a(NBD-Ru)与hTF相互作用荧光曲线变化图，图12为荧光淬灭关系图。由图9～12可知，随着钌络合物的加入，hTF的荧光强度降低，说明钌络合物与转铁蛋白发生结合作用，表7为钌络合物与hTF结合参数，由表7可知，络合物2b与hTF的结合常数最大。
表7络合物2b和hTF的淬灭常数(Ksv,L·mol-1)、生物分淬灭速率(Kq,L·mol -1·s-1)、结合常数(Kb,L·mol-1)和结合位点数目(n)
Figure BDA0002609776040000201
测试例11细胞周期及细胞凋亡
1细胞周期
1.1细胞样品的准备：
A549细胞给药24h后，小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内，在1000g条件下离心3～5min，沉淀细胞。小心吸除上清，残留约50μL的培养液，以避免吸走细胞；加入1mL冰浴预冷的PBS缓冲液，重悬细胞，并转移到1.5mL离心管内，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约50μL的PBS缓冲液，以避免吸走细胞；轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
1.2细胞固定：将细胞加入1mL冰浴预冷的体积分数为70％的乙醇水溶液中，轻轻吹打混匀，4℃固定30min或更长时间，1000g条件下离心3～5min，沉淀细胞；小心吸除上清，残留约50μL的乙醇水溶液，以避免吸走细胞；加入1mL冰浴预冷的PBS缓冲液，重悬细胞，并转移到1.5mL离心管内；再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约50μL的PBS缓冲液，以避免吸走细胞；轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
1.3碘化丙啶染色液的配制：参考表8，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液。
表8碘化丙啶染色液的配制方案
Figure BDA0002609776040000202
1.4染色：每管细胞样品中加入0.5mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min。随后可以4℃或冰浴避光存放。
1.5流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
2细胞凋亡(Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒)
a.把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS缓冲液洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。
b.加入上述步骤收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000g条件下离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS缓冲液轻轻重悬细胞并计数。
c.取5～10万重悬的细胞，1000g条件下离心5min，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
d.加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。
e.加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
f.室温(25℃)避光孵育10～20min，随后置于冰浴中；孵育过程中可以重悬细胞2～3次以改善染色效果。
g.随即用于流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光。
3细胞凋亡(Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒)
a.吸除细胞培养液，加入PBS缓冲液洗涤一次。
b.加入195μL Annexin V-PE结合液。
c.加入5μL Annexin V-PE，轻轻混匀。
d.室温(25℃)避光孵育10～20min。
e.随即在荧光显微镜下观察，Annexin V-PE为红色荧光。
图14为络合物2b对细胞周期及细胞凋亡的影响图，由图14可知，流式细胞仪和激光共聚焦结果显示细胞被阻滞在了G2/M期，给药后细胞发生明显凋亡。
测试例12 Ru络合物对A549细胞内蛋白表达的影响
1样本蛋白提取
(1)按照Protein Extraction Kit(强)(GenePool/GPP1814)或ProteinExtraction Kit(中)(GenePool/GPP1815)试剂盒说明书操作，对细胞样品进行蛋白提取。
(2)依照电泳上样量需要，用水及SDS-PAGE Loading Buffer(5×)(GenePool/GPP1820)调整蛋白浓度，100℃煮沸变性10min。
2SDS-PAGE凝胶配制
按SDS-PAGE Gel Kit(GenePool/GPP1816)说明书操作，根据目的蛋白的分子量，配制12％(Cleaved PARP，CDK1)，13％(PDL1)，15％(gamma H2A.X，Cleaved Caspase-3)，6％(ATM)的分离胶的分离胶，5％浓缩胶。
3SDS-PAGE凝胶电泳
(1)待检测蛋白样品上样量：上样60μg。
(2)电泳条件：浓缩胶恒压80V，约20min；分离胶恒压120V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。
4湿转转膜
(1)转膜方法：准备一张大小合适的PVDF膜，浸泡于甲醇中30s，再转移至WBTransfer Buffer(GenePool/GPP1817)中，备两张与PVDF膜大小一样的厚滤纸浸泡于WBTransfer Buffer(GenePool/GPP1817)中备用；切除多余凝胶部分，按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序放入海绵垫夹层中，赶尽气泡。
(2)转膜条件：按照电流300mA恒流转膜；0.22μm孔径PVDF膜，转膜时间0.5h，1.5h，2h。
5WB检测目的蛋白
(1)封闭：转移结束后将PVDF膜浸泡于Milk Blocking Buffer(GenePool/GPP1819)/BSA Blocking Buffer(GenePool/GPP1818)中，摇床中轻摇1h。
(2)一抗稀释：用1％BSA/5％milk稀释一抗。
(3)一抗孵育：封闭结束后，将PVDF膜置于杂交袋中，加入步骤(2)中配制好的一抗，用封膜机封口，4℃孵育过夜。
(4)洗膜：TBST(GenePool/GPP1822)洗膜3次，每次5min。
(5)二抗孵育：用Milk Blocking Buffer(GenePool/GPP1819)稀释二抗，羊抗兔-HRP或羊抗小鼠-HRP(根据一抗来源自行选择相应二抗)1：5000稀释，室温轻摇50min。
(6)洗膜：TBST(GenePool/GPP1822)洗膜4次，每次5min。
(7)ECL(GenePool/GPP1824)反应、胶片曝光：将PVDF膜浸泡于ECL(GenePool/GPP1824)显色液中1min，暗室中曝光、显影并定影。
图13为络合物2b对细胞内蛋白表达的影响图。对目的蛋白条带进行灰度值的统计，发现与凋亡有关的cleavedPARP及cleaved caspase 3蛋白表达明显增加，同时ATM、γ-H2A.X、CDK1和PDL1的表达明显降低，并且都具有剂量依赖性。
测试例13 Ru络合物纳米自组装性质
将配体化合物2及络合物2b分别溶解在水中，配成0.01mg/mL的溶液，将其滴在铜网上，在干燥器中晾干48h，之后在透射电子显微镜和扫描电子显微镜上观察拍照。
水合纳米粒径和zeta电位是在纳米粒度仪上测定，将配体化合物2及络合物2b分别用1％DMSO水溶液配成0.01g/mL的溶液，用盐酸调节pH值到2和5.5。
图15为配体化合物2及络合物2b的纳米自组装性质表征图，其中，A为配体化合物2(上)和络合物2b(下)的透射电镜照片；B为配体化合物2(上)和络合物2b(下)的扫描电镜照片；C为配体化合物2(上)和络合物2b(下)的水合粒径变化曲线；D为配体化合物2(上)和络合物2b(下)的Zeta电位变化曲线(96h内)。由图15可知，络合物2b与配体化合物2均呈球状，粒径分别在50nm和200nm之间，相比于配体化合物2，络合物2b的粒径大小更有助于化合物借助EPR效应向肿瘤组织靶向。此外，络合物2b的Zeta电位在96h内基本不变，而配体化合物2在96h内逐渐归于0，因此络合物2b在水溶液中能够保持稳定。
测试例14 C57小鼠肿瘤组织免疫切片
1免疫组化
(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I15min-二甲苯II 15min-无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。
(2)抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH＝9.0)的修复盒中于蒸锅内进行抗原修复，温度达到95℃后计时30min，自然冷却后将玻片置于PBS缓冲液(pH＝7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(3)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min。
(4)画圈：将玻片置于PBS缓冲液(pH＝7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)。
(5)血清封闭：在圈内滴加5％BSA室温孵育30min。
(6)加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS缓冲液按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)。
(7)加二抗：玻片置于PBS缓冲液(pH＝7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，室温孵育1h。
(8)洗涤：将玻片置于PBS缓冲液(pH＝7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤4次，每次5min。
(9)孵育HRP：切片稍甩干后在圈内滴加稀释后的HRP抗体覆盖组织，室温孵育30min。
(10)洗涤：将玻片置于PBS缓冲液(pH＝7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤4次，每次5min。
(11)DAB显色：去除PBS缓冲液，每张切片加50～200μL新鲜配制DAB溶液，显微镜控制显色。
(12)复染核：显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，1％盐酸酒精分化(5～10s)，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
(13)透明、封片：切片经过梯度酒精(70～100％)1min一个梯度，脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
(14)全景扫描：切片于全景扫描仪中观察并采集图像。
2TUNEL法检测肿瘤组织凋亡
(1)对于石蜡切片：依次将切片放入二甲苯I15min-二甲苯II 15min-无水乙醇I5min-无水乙醇II 5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗，待用。
(2)样本通透：滴加50μL通透试剂工作液37℃孵育10～30min。
(3)预孵育：弃掉通透试剂工作液，PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，滴加50μL Tunel检测液37℃孵育5min。
(4)Tunel试剂孵育：弃掉Tunel检测液，滴加50μL Tunel试剂于湿盒内37℃孵育1～2h，Tunel试剂按表9配制。
表9 Tunel试剂配制方案
Figure BDA0002609776040000241
(5)FITC试剂孵育：弃掉Tunel试剂，PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，滴加50μL FITC试剂工作液37℃避光孵育30min。
(6)DAPI复染细胞核：弃掉FITC试剂工作液，PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
(7)封片：弃掉DAPI染液，PBS缓冲液避光洗涤2次，每次5min，用抗荧光淬灭封片剂封片。
(8)镜检：全景扫描细胞核在紫外光激发下为蓝色，Tunel阳性表达为绿色。
3免疫切片IOD统计
使用IPP6软件分析切片照片，同一批次切片选用统一标准。
图16为C57小鼠肿瘤组织TUNLE及CD31免疫切片图，其中，A为Tunel法测定的肿瘤组织细胞凋亡图，B为凋亡统计图，C为肿瘤组织CD31免疫组化图，D为CD31表达统计图。由图16可知，给药组(络合物2b)肿瘤细胞的凋亡率明显增加，同时CD31表达水平明显降低，这说明给药组小鼠肿瘤组织新生血管减少，从而阻碍肿瘤细胞的生长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种咔啉钌类络合物，其特征在于，具有式I、式II或式III所示结构：
Figure FDA0002609776030000011
其中，所述R1为
Figure FDA0002609776030000012
所述R2为
Figure FDA0002609776030000013
所述R3为
Figure FDA0002609776030000014
Figure FDA0002609776030000015
2.权利要求1所述咔啉钌类络合物的制备方法，其特征在于，
(i)当咔啉钌类络合物具有式I所示结构时，制备方法包括以下步骤：
将R1对应的配体化合物、顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物、乙醇和水混合后进行第一络合反应，得到具有式I所示结构的咔啉钌类络合物；
(ii)当咔啉钌类络合物具有式II所示结构时，制备方法包括以下步骤：
将R2对应的配体化合物、顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物和N,N-二甲基甲酰胺混合后进行第二络合反应，得到具有式II所示结构的咔啉钌类络合物；
(iii)当咔啉钌类络合物具有式III所示结构时，制备方法包括以下步骤：
将R3对应的配体化合物、六氯钌酸铵和N,N-二甲基甲酰胺混合后进行第三络合反应，得到具有式III所示结构的咔啉钌类络合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述R1对应的配体化合物与顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物的摩尔比为1：1，所述顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物、乙醇和水的用量比为0.2mmol：(9～11)mL：(9～11)mL。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述第一络合反应的温度为15～35℃，时间为22～26h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述R2对应的配体化合物与顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物的摩尔比为1：1，所述顺式-二氯双(2,2'-联吡啶)钌二水合物和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为0.2mmol：(18～22)mL。
6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于，所述第二络合反应的温度为78～82℃，时间为5～7h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述R3对应的配体化合物与六氯钌酸铵的摩尔比为2：1，所述六氯钌酸铵和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为0.25mmol：(18～22)mL。
8.根据权利要求2或7所述的制备方法，其特征在于，所述第三络合反应的温度为78～82℃，时间为5～7h。
9.权利要求1所述咔啉钌类络合物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤转移药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肉瘤或肺癌。
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