CN101838374B - 仿细胞外层膜结构聚合物交联纳米胶束的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿细胞外层膜结构聚合物交联纳米胶束的制备方法，属于生物医用材料和纳米技术领域。本发明所述仿细胞外层膜结构聚合物交联纳米胶束是以一种带有仿细胞外层膜结构的磷酰胆碱基团和长链疏水烷基以及三甲氧基硅基团的可交联两亲性三元随机共聚物在水中自组装得到的具有核壳结构的纳米胶束，并通过调节胶束溶液pH催化三甲氧基硅基团发生水解缩合，得到交联的纳米聚合物胶束。本发明得到的聚合物纳米胶束具有仿细胞外层膜结构的壳层，在体内循环中可以避免网状内皮系统及单核巨噬细胞的吞噬，延长药物在体内的滞留时间，交联可以显著提高胶束稳定性，避免了胶束结构随外部环境的变化而改变。

Description

仿细胞外层膜结构聚合物交联纳米胶束的制备方法

技术领域

本发明涉及一种仿细胞外层膜结构纳米聚合物胶束的制备方法，属于生物医用材料技术领域。

背景技术

近几十年来，制药工业迅速发展，微球、脂质体、聚合物胶束等药用载体已有了广泛的研究。微球适合化学栓塞及局部注射，但不适于注射用药，这种载体在使用过程中易被网状内皮吞噬系统非特异性吸收，使药物到达不了网状内皮系统以外的靶位。脂质体可用于多种给药途径和制剂，当它作为抗癌药物载体时可使药物选择性地杀伤癌细胞，提高疗效，但它的结构不稳定，且载药率低。与之相比，聚合物胶束载药范围广、结构稳定、具有优良的组织渗透性、体内滞留时间长，能使药物有效地到达靶点。而且，聚合物胶束粒径较小，一般在纳米尺寸范围内，远小于体内细胞，多数与大蛋白大小相仿，在体内不易作为异物受到排斥。近年来，两亲性聚合物胶束体系在药物传递方面的应用已有广泛的研究(Kataoka K.，et al.Advanced DurgDelivery Reviews，2001，47：113-131；Kakizawa Y.，et al.Biomacromolecules，2001，2(2)：491-497；Shuai X.T.，et al.Bioconjugate Chemistry，2004，15(3)：441-448)。

两亲聚合物在选择性溶剂中，在分子间的疏水作用力、氢键、静电相互作用等推动下自发构筑形成聚合物胶束，溶解性差的片段形成胶束的核，溶解性好的片段形成溶剂化壳层。胶束的疏水性内核为疏水性药物提供了储存的微环境，从而可以增加疏水性药物的溶解度，提高药物的利用率。胶束亲水性的外壳还可以避免纳米粒子被蛋白质吸附和被巨噬细胞识别并吞噬，有效延长药物在体内的循环时间，提高治疗作用。两亲性聚合物与小分子表面活性剂相比，其临界胶束浓度(CMC)很低，即当聚合物溶液浓度很低时也能形成胶束；又由于其组成疏水核心的碳链长，使核心紧密而稳定，稀释到浓度低于CMC时解缔合也很缓慢，即使经血液稀释，胶束也在体内可以稳定存在并保持一定的药物浓度，使得胶束在解缔合之前将包载的药物送至靶位。

从目前的研究进展来看，对于两亲聚合物自组装胶束化的研究，主要集中在两亲性的嵌段共聚物，尤其是结构规整的两嵌段和三嵌段聚合物(TailleferJ.，et al.Journal of Pharmaceutical Sciences，2000，89(1)：52-62；Oh I.，et al.International Journal of Pharmaceutics，1999，181(1)：107-115；Zhou Y.X.，et al.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2008，61(2)：164-169)。EP03970307A2公开了一种两亲性嵌段聚合物胶束，并将治疗活性药物通过化学键连接在该聚合物疏水组分上。这种药物载体的不利之处在于，必须在嵌段共聚物中引入可反应的活性官能团。EP0520888A1公开了一种由聚乳酸和聚(烯化氧)嵌段共聚物制成的纳米级颗粒，该纳米级颗粒显示出降低被网状内皮系统的吸收。嵌段聚合物胶束由于其独特的结构及良好的稳定性，在药物传输和靶向载体方面的的应用显示出光明的前景。但是，嵌段共聚物的合成及纯化过程较为复杂。

近年来，有研究者尝试无规双亲性共聚物在溶液中的自组装行为。王晓工等在研究光诱导自组装中证实光敏性无规共聚物聚(2-(4-偶氮苯基)苯氧乙基丙烯酸酯/丙烯酸)(PPAPE)在选择性溶剂中可组装形成纳米级胶体球(WangX.G.，et al.Macromolecules，2006，39(3)：1108-1115)。Faysal等以无规共聚物聚(4-(氯甲基)苯乙烯-苯乙烯)，制备而成的含二胺吡啶胸腺嘧啶功能团通过氢键相互作用自组装形成特定形态(Faysal I.，et al.Journal of the AmericanChemical Society，2000，122(24)：5895-5896)。Liu等报道了P(PS-co-PMAA)可以在水溶液中进行自组装，得到特殊的有序结构多孔和碗状聚集体(Liu X.Y.，et al.Macromolecules，2005，38(16)：6749-6751)。施冬健等报道了光敏性的双亲性无规共聚物聚ε-己内酯改性丙烯酸酯肉桂酸酯/甲基丙烯酸在选择性溶剂中可自组装形成纳米结构的胶束(施冬健等，高分子学报，2004(4)：600-604)。这些研究结果表明无规共聚物可以在选择性溶剂中实现自组装胶束化。

随着对于聚合物胶束作为药物传递系统研究的进一步深入，人们发现在溶液中形成的这种有序结构也存在不稳定的问题，往往会随着外部环境如溶剂、温度、pH、离子强度等的变化而变化。在体循环中，大多数憎水及表面带电荷的纳米药物载体不能完全躲避单核巨噬细胞的吞噬。因此设计稳定的生物相容性纳米材料是药物载体设计的关键课题。

磷酰胆碱是组成细胞膜的基本单元(如卵磷脂等)的亲水端基(头部)，是细胞外层膜中的最外层(对外)基团。磷酰胆碱同时带有正、负两种电荷，因而具有很强的结合水的能力。这种性质使富含磷酰胆碱基团的材料不易吸附及沉集蛋白质、脂质体、细胞等生物体成分，已有大量研究表明，含有磷酰胆碱基团的高聚物材料都有着很好的生物相容性(Ishihara K.，et al.Biomedical Materials Reserch，1998，39(2)：323-330；Ishihara K.，et al.PolymerJournal，1990，22(5)：355-360)。在含磷酰胆碱类化合物的研究中，最具代表性的是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)。MPC聚合物以纳米胶束形式作为药物载体的应用也有研究。Lewis等将MPC与pH敏感性的单体甲基丙烯酸二异丙基氨基乙酯(DPA)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEA)分别进行共聚，在一系列pH条件下制备了聚合物胶束，并研究了胶束的稳定性(SalvageJ.P.，et al.Journal of Controlled Release，2005，104：259-270)。Ishihara等以MPC为亲水基团、苯乙烯为憎水基团，通过自由基聚合法合成了MPC聚合物。透射电镜测试表明该聚合物在一定条件下可形成尺寸分布较窄的球形纳米胶束，可以通过改变单体的分子量和投料量调节胶束的大小。利用化学分析的电子光谱对纳米胶束进行测试，表明PMPC链倾向于分布在纳米胶束的表面(shihara K.，et al.Journal of Polymer Science：Part A：Polymer Chemistry，2000，38：3052-3058)。

中国专利ZL2006101050499公开了一种结构通式(I)所示的仿细胞膜结构共聚物及其制备方法，该三元共聚物可用于制备仿细胞外层膜结构涂层。

发明内容

本发明目的在于提供一种稳定仿细胞外层膜纳米聚合物胶束的制备方法，依照该方法制备的聚合物胶束可作为药物传递载体。

一种仿细胞外层膜结构聚合物交联纳米胶束的制备方法，其特征在于：

在x、y、z中，x摩尔百分数为20～80％，y为20～80％，z为10～40％，n＝2～18；

用有机和/或无机碱调节结构式(I)所示的聚合物胶束溶液pH为8～11，催化三甲氧基硅基团水解缩合，但不会使其侧基酯键水解断裂，得到聚合物交联纳米胶束，其粒径为50～500nm。

所述的有机/或无机碱为氨水、三乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾。

对于水溶性较好的结构式(I)所示的聚合物用直接溶解法，具体方法如下：聚合物用二次蒸馏水溶解，超声摇振使聚合物完全溶解后，振荡器摇振8～24h，离心处理后，上清液用砂芯漏斗过滤，即可得到聚合物胶束溶液。

对于在水中溶解性较差的结构式(I)所示的聚合物用溶剂挥发法，具体方法如下：聚合物溶解于四氢呋喃或氯仿中，然后用滴管吸取该聚合物溶液剧烈搅拌下缓慢滴加入二次蒸馏水中，搅拌使溶液中的有机溶剂完全挥发，离心处理后，用砂芯漏斗过滤上清液，即得到聚合物胶束溶液。

本发明的优点与积极效果：本发明得到的聚合物纳米胶束具有仿细胞外层膜结构的壳层，在体内循环中可以避免网状内皮系统及单核巨噬细胞的吞噬，延长药物在体内的滞留时间。通过改变可交联基团的含量可以调节聚合物胶束的通透性，从而可以控制药物释放速率。另一方面，交联可以显著提高胶束稳定性，避免了胶束结构随外部环境的变化而改变。这种具有仿细胞外层膜结构的聚合物交联胶束在药物控缓释领域有着广阔的应用前景。

本发明从细胞膜仿生角度出发，以带有磷酰胆碱基团的可聚合单体2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)作为亲水性单体，甲基丙烯酸烷基酯作为疏水性单体，甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅(TSMA)单体引入可交联基团，通过自由基共聚得到可交联的两亲性三元随机共聚物。磷酰胆碱基团的引入赋予该聚合物材料良好的生物相容性；长的疏水烷基链能够形成紧密的核；三甲氧基硅基团在适当条件下可以发生水解缩合。这种三元聚合物在水中形成的聚合物胶束具有仿细胞外层膜结构的壳层，调节胶束溶液的pH，即可以得到交联的聚合物胶束溶液，使得聚合物胶束的稳定性进一步提高，保持自组装后的胶束形态保持不变。

附图说明

图1为仿细胞外层膜结构可交联两亲性三元随机共聚物聚合反应方程式；

图2为聚合物胶束扫描电镜照片；

图3为交联聚合物胶束扫描电镜照片。

具体实施方式

可交联两亲性三元随机共聚物的合成参照CN1916040A公开的仿细胞膜结构聚合物的制备方法：反应三颈瓶中加入少量异丙醇，通氮气，于50～90℃下恒温，将三种单体按一定比例溶于异丙醇中混匀，单体总质量0.5～3％的引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶于少量四氢呋喃中。单体溶液和引发剂溶液混匀后，以6～7d/s的速度滴加到反应瓶中，滴加完毕后改为密封体系。6h后补加1～5‰的引发剂。总反应时间为24h。反应完毕后根据产物的极性选择适当沉淀剂提纯。

向聚合物胶束溶液中加入一定量的有机和/或无机碱调节溶液pH为8～11，放置在振荡器上振摇24～48h后冷冻干燥即可得到交联聚合物胶束，该聚合物胶束具有仿细胞外层膜结构的亲水壳层，因而在水中溶解性很好。

聚合物胶束及交联聚合物胶束的形貌和尺寸用扫描电镜进行表征。具体方法如下：用微量移液器移取少量聚合物胶束溶液和交联聚合物胶束溶液分别涂覆在盖玻片上，然后立即将玻璃片基置于已预先制冷至-45℃的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥12h，即可得到扫描电镜测试样品。样品喷金后测试扫描电镜。

芘荧光探针法测得此类三元共聚物临界胶束浓度在10^-6mg/mL数量级，远小于小分子表面活性剂。催化交联之后聚合物临界胶束浓度显著降低，所得胶束稳定性提高。

本发明所述仿细胞外层膜结构交联纳米聚合物主要用于包裹疏水性或略水溶性的药物。载药聚合物胶束的制备方法：将疏水性或略水溶性的药物溶解于适当的有机溶剂中，在剧烈搅拌下将该溶液缓慢滴加到聚合物胶束溶液中，敞口搅拌使溶液中的有机溶剂完全挥发后冷冻干燥，即可得到载药聚合物胶束溶液。

实施例1：分析天平称取2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)1.1301g溶解于45mL异丙醇中，甲基丙烯酸十八烷基酯(SMA)1.2968g溶解于45mL异丙醇中，微量移液器移取548μLγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅(TSMA)。单体溶液混匀后倒入恒压滴液漏斗中。称取引发剂(AIBN)0.0299g溶解于6mL四氢呋喃中。量筒移取4mL引发剂溶液加入恒压滴液漏斗中混匀。反应三颈瓶中加入10mL异丙醇，通氮气升温至80℃。待温度恒定后开始滴加单体引发剂混合溶液。3～4.5h滴完后改为密封体系。反应6h后一次性加入剩余2mL引发剂溶液，继续反应至24h。反应完毕后将反应瓶中的溶液倒入圆底烧瓶中旋蒸浓缩后加入丙酮沉淀，沉淀用异丙醇溶解，丙酮沉淀两次后所得产物30℃真空干燥，即得PMST553聚合物。合成中所用的溶剂进行无水处理。

实施例2：分析天平称取2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)1.4354g溶解于50mL异丙醇中，甲基丙烯酸十八烷基酯(SMA)0.7079g溶解于30mL异丙醇中，微量移液器移取498μLγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅(TSMA)。单体溶液混匀后倒入恒压滴液漏斗中。称取引发剂(AIBN)0.0266g溶解于6mL四氢呋喃中。量筒移取4mL引发剂溶液加入恒压滴液漏斗中混匀。反应三颈瓶中加入10mL异丙醇，通氮气升温至80℃。待温度恒定后开始滴加单体引发剂混合溶液。约4.5h滴完后改为密封体系。反应6h后一次性加入剩余2mL引发剂溶液，继续反应至24h。反应完毕后将反应瓶中的溶液倒入圆底烧瓶中旋蒸浓缩后加入乙醚沉淀，沉淀用异丙醇溶解，乙醚沉淀两次后所得产物30℃真空干燥，即得PMST733聚合物。合成中所用的溶剂进行无水处理。

实施例3：

准确称取PMST73310mg，用二次蒸馏水定容至10mL，超声处理2min，摇振使聚合物完全溶解后，振荡器60r/min摇振12h，使胶束在溶液中分布均一。130Hz离心10min后，用砂芯漏斗过滤上清液，即得到PMST733聚合物胶束溶液。

实施例4：

准确称取PMST55350mg，用约3mL氯仿溶解，漩涡混匀器混匀。用滴管移取聚合物的氯仿溶液在剧烈搅拌下滴加入30mL二次蒸馏水中，敞口搅拌12h后将溶液转入50mL容量瓶中定容，超声处理2min，振荡器60r/min摇振12h，使胶束在溶液中分布均一。130Hz离心10min后，用砂芯漏斗过滤上清液，即得到PMST553聚合物胶束溶液。从图3可见，与图2相比，交联后的聚合物胶束更为致密。

实施例5：

向10mLPMST733聚合物胶束溶液中加入100μL三乙胺，pH试纸测得溶液pH为8～9。将该溶液放置在振荡器上振摇48h，即得PMST733交联聚合物胶束溶液。溶液冷冻干燥后就可以得到PMST733交联聚合物胶束粉末。

实施例6：

向10mL PMST553聚合物胶束溶液中加入10μL 0.1024M氢氧化钠水溶液，pH试纸测得溶液pH约为9，将该溶液放置在振荡器上振摇48h，即得PMST553交联聚合物胶束溶液。溶液冷冻干燥后就可以得到PMST553交联聚合物胶束粉末。

实施例7：

向10mL干净的容量瓶中加入10μL1.37×10^-4M芘(疏水性模型分子)的丙酮溶液，敞口在通风橱中放置10min，丙酮挥发完全后，加入10mLPMST553聚合物胶束溶液，将该溶液放置在振荡器上振摇12h，即可得到载芘的聚合物胶束溶液，溶液冷冻干燥后就可以得到载芘聚合物胶束粉末。

实施例8：

向10mL干净的容量瓶中加入10μL1.37×10^-4M芘(疏水性模型分子)的丙酮溶液，敞口在通风橱中放置10min，丙酮挥发完全后，加入10mLPMST553聚合物胶束溶液，将该溶液放置在振荡器上振摇12h，得到载芘的聚合物胶束溶液。向溶液中加入100μL三乙胺，摇匀后放置在振荡器上振摇48h，即可得到载芘的交联聚合物胶束，溶液冷冻干燥后得到载芘的交联聚合物胶束粉末。

Claims (2)

1.一种仿细胞外层膜结构聚合物交联纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：

（1）用分析天平称取2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱 1.1301g溶解于45mL 异丙醇中，甲基丙烯酸十八烷基酯 1.2968g 溶解于45mL异丙醇中，微量移液器移取548μL γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅；

（2）将单体溶液混匀后倒入恒压滴液漏斗中，称取引发剂AIBN 0.0299g 溶解于6mL 四氢呋喃中，量筒移取4mL 引发剂溶液加入恒压滴液漏斗中混匀，反应三颈瓶中加入10mL 异丙醇，通氮气升温至80℃，待温度恒定后开始滴加单体引发剂混合溶液，3~4.5h 滴完后改为密封体系，反应6h 后一次性加入剩余2mL 引发剂溶液，继续反应至24h，反应完毕后将反应瓶中的溶液倒入圆底烧瓶中旋蒸浓缩后加入丙酮沉淀，沉淀用异丙醇溶解，丙酮沉淀两次后所得产物30℃真空干燥，即得PMST553 聚合物，合成中所用的溶剂进行无水处理；

（3）准确称取PMST553聚合物50 mg，用3mL氯仿溶解，漩涡混匀器混匀；用滴管移取PMST553聚合物的氯仿溶液在剧烈搅拌下滴加入30mL二次蒸馏水中，敞口搅拌12h后将溶液转入50mL容量瓶中定容，超声处理2min，振荡器60 r/min摇振12 h，使胶束在溶液中分布均一，130Hz离心10 min后，用砂芯漏斗过滤上清液，即得到PMST553聚合物胶束溶液；

（4）向10mL PMST553聚合物胶束溶液中加入10μL 0.1024M氢氧化钠水溶液，pH试纸测得溶液pH为9，将该溶液放置在振荡器上振摇48h，即得PMST553交联聚合物胶束溶液，溶液冷冻干燥后得到PMST553交联聚合物胶束粉末。

2.一种仿细胞外层膜结构聚合物交联纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：

（1）用分析天平称取2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱 1.4354g溶解于50mL 异丙醇中，甲基丙烯酸十八烷基酯 0.7079g 溶解于30mL异丙醇中，微量移液器移取498μLγ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅；

（2）将单体溶液混匀后倒入恒压滴液漏斗中，称取引发剂AIBN 0.0266g 溶解于6mL 四氢呋喃中，量筒移取4mL 引发剂溶液加入恒压滴液漏斗中混匀，反应三颈瓶中加入10mL 异丙醇，通氮气升温至80℃，待温度恒定后开始滴加单体引发剂混合溶液，4.5h 滴完后改为密封体系，反应6h 后一次性加入剩余2mL 引发剂溶液，继续反应至24h，反应完毕后将反应瓶中的溶液倒入圆底烧瓶中旋蒸浓缩后加入乙醚沉淀，沉淀用异丙醇溶解，乙醚沉淀两次后所得产物30℃真空干燥，即得PMST733 聚合物，合成中所用的溶剂进行无水处理；

（3）准确称取PMST733聚合物10 mg，用二次蒸馏水定容至10 mL，超声处理2 min，摇振使聚合物完全溶解后，振荡器60 r/min摇振12 h，使胶束在溶液中分布均一，130Hz离心10 min后，用砂芯漏斗过滤上清液，即得到PMST733聚合物胶束溶液；

（4）向10mLPMST733聚合物胶束溶液中加入100μL三乙胺，pH试纸测得溶液pH为8~9，将该溶液放置在振荡器上振摇48h，即得PMST733交联聚合物胶束溶液，溶液冷冻干燥后得到PMST733交联聚合物胶束粉末。

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