CN102212178B

CN102212178B - 一种具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102212178B
Application number: CN2011100890368A
Authority: CN
Inventors: 任天斌; 袁伟忠; 雷雪; 刘秋明; 侠文娟
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2011-04-11
Filing date: 2011-04-11
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2031-04-11
Also published as: CN102212178A

Abstract

本发明涉及一种具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物、制备方法及其应用。该方法主要步骤如下：对聚乙二醇表面改性，采用原子转移自由基聚合法（ATRP）来进行分子设计，使PEG两端逐步接上聚甲基丙烯酸-2-（二甲氨基）乙酯（PDMAEMA）和聚2-甲基-2-丙烯酸-2-（2-甲氧基乙氧基）乙酯（PMEO₂MA）链段，制备了PMEO₂MA-b-PDMAEMA-b-PEG-b-PDMAEMA-b-PMEO₂MA五嵌段共聚物。本发明产物结构为线性，合成步骤简单，分子大小可控，具备温度和pH双重敏感性，可用于药物传递、基因载体、记忆元件开关的等多种智能材料领域。

Description

一种具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物、制备方法及其应用。

背景技术

环境敏感性胶束的结构、物理性质、化学性质可以随外界环境如温度、pH值、溶剂、外加应力、光强度（可见光和紫外光）、电磁场或各种化学、生命物质等的变化而发生可逆突跃性变化，已在药物控制释放体系、记忆元件开关、人造肌肉、化学存储器、物料分离等领域显示了良好的应用前景

随着对高分子材料功能要求的日益提高以及研究的深入，发展具有良好生物相容性、多重响应性功能的尤其是能够同时对两种或两种以上外界刺激产生响应的智能胶束已成为这一领域的重要发展方向，其中研究最多的是pH及温度双重响应型胶束。这是由于pH和温度变化在许多实际应用中（如药物可控释放）最容易得到又便于操作的两种刺激信号，而且是生理、生物和化学系统中的两个重要因素。

环境敏感性胶束的制备，离不开具有智能响应性的两亲性嵌段共聚物的合成和自组装成胶束。而嵌段共聚物合成方法，如原子自由基转移聚合法（ATRP），结合活性开环聚合法（ROP）和可逆加成-断裂转移自由基聚合（RAFT）法等。其中，ATRP是最常用的方法。

ATRP 集自由基聚合与活性聚合的优点于一身，具有反应速度快、反应温度适中、适用单体范围广、分子设计能力强等优点，许多研究人员都曾用此法合成新的聚合物，例如，Katja Jankova等于1998年用ATRP法合成了PS-b-PEG-b-PS，Jing Xu等于2010年用ATRP 法合成PDMA-b-PEO-b-PDMA。

环境敏感性胶束的刺激相应功能通常根据单体的功能来划分。由单体聚合成的高分子材料，就相应具有温度敏感性、光（可见、紫外或射线等）敏性、pH敏感性等。这类聚合物有：聚异丙基丙烯酰胺（PNIPAm）、聚甲基丙烯酸-2-（二甲氨基）乙酯（PDMAEMA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚2-甲基-2-丙烯酸-2-（2-甲氧基乙氧基）乙酯（PMEO₂MA）等。

甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)是一种用途广泛的多功能单体，它同时具有烯烃、胺、酯类化合物的特性，在一定条件下可发生聚合、加成、季铵化和水解等化学反应，是一种用途广泛的中间体，这种单体及其深加工产品具有无毒、在环境中易降解等优点，因此世界各国都非常重视它的开发应用。DMAEMA具有对温度及pH响应性，所制备的高聚物PDMAEMA也是一种对温度和pH值敏感的高分子化合物，故可以考虑用作药物传输载体及改性生物大分子的表面。如范晓东等运用ATRP技术，以大分子引发剂法将DMAEMA接枝到聚对氯甲基苯乙烯P(p-CMS)主链上，合成了梳状两亲性高聚物并研究了其温度及pH值敏感行为。

近年来，一些以聚异丙基丙烯酞胺为温度敏感组分的转基因载体被研制成功，并得到了很好的转染结果。Hinrichs等首次将异丙基丙烯酰胺（PNIPAm）与甲基丙烯酸-2-（二甲氨基）乙酯（DMAEMA）的共聚物作为温度和pH值响应的转基因载体，其中NIPAAm提供温度响应性，DMAEMA存在氨基，可提供一定的正电荷密度，可与DNA的静电相互作用形成复合物。

最近，侧链为寡聚乙二醇的温度敏感聚合物越来越引起研究者们的兴趣，有替代PNIPAAm之势。这类温敏聚合物具有更好的生物相容性，相转变几乎不受水溶液浓度、离子强度和链长等因素影响。该类温敏聚合物有很好的生物应用前景。聚2-甲基-2-丙烯酸-2-（2-甲氧基乙氧基）乙酯（PMEO₂MA）是该类聚合物的典型代表，其水溶液的LCST为26℃。

发明内容

本发明目的在于提供一种具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物及其制备方法。

本发明提供的一种具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物的结构如下式所示：

其中，m为60~100，n为10~50，p为20~160。单体DMAEMA和MEO₂MA共聚比为3:(2~8)。

本发明提供的具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物的制备方法，经过以下步骤：先制备Br-PEG-Br引发剂，然后采用顺序加料的原子转移自由基聚合法（ATRP），合成PDMAEMA-b-PEG-b-PDMAEMA三嵌段共聚物，再以此为引发剂，合成PMEO₂MA-b-PDMAEMA-b-PEG-b-PDMAEMA-b-PMEO₂MA五嵌段共聚物；具体步骤如下：

（1）引发剂的制备

PEG与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:(8~16)。.

将干燥PEG2000和干燥三乙胺（TEA），置于圆底烧瓶里，干燥CH₂Cl₂作溶剂；恒压漏斗中加入2-溴异丁酰溴和干燥二氯甲烷（CH₂Cl₂），0.5~1h内滴定至烧瓶中；冰水浴2h，之后常温反应24h。

反应完毕，进行后处理：过滤除去不溶物，饱和碳酸氢钠溶液冲洗，萃取，取下层液体用无水硫酸镁干燥除水，过滤除去固体，乙醚沉淀三次得到引发剂Br-PEG-Br。

（2）PDMAEMA-b-PEG-b-PDMAEMA三嵌段共聚物的合成

将步骤（1）得到的引发剂和干燥后的单体DMAEMA 按一定比例各自称料，催化剂CuBr和配位剂PMDETA的摩尔量均为引发剂的两倍，干燥二甲基甲酰胺（DMF）适量，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下60℃反应2~3h。

反应完毕，进行后处理：加适量四氢呋喃（THF）溶解烧瓶中的产物，过中性氧化铝柱，除去铜盐，浓缩除掉大部分THF，用正己烷沉淀三次，得到ABA型三嵌段共聚物。

（3）PMEO₂MA-b-PDMAEMA-b-PEG-b-PDMAEMA-b-PMEO₂MA五嵌段共聚物的合成

将步骤（2）得到的产物做引发剂，和去除阻聚剂的单体MEO₂MA 按一定比例各自称料，催化剂CuBr和配位剂PMDETA的摩尔量均为引发剂的两倍，干燥DMF适量，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下80℃反应12~24h。

反应完毕，进行后处理，同步骤（2），得到ABCBA型五嵌段共聚物。

本发明提供的具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物，拥有既可以做胶束用于药物控制缓释系统，也可用于基因载体，还可用于记忆元件开关等领域的广泛应用。

本发明采用两步ATRP逐步聚合法，结合两种功能单体，制备ABCBA型五嵌段共聚物，是前人没有做过的。制得的五嵌段共聚物，其结构为线性，合成步骤简单，分子大小可控，具备温度和pH双重敏感性，可用于生物传感器、膜、药物控制释放、细胞培养基、生物分子离析及酶活性控制等领域。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不意味着对本发明保护范围的限制。

实施例1

制备步骤：

（1）引发剂的制备

称取干燥PEG2000 10g，干燥三乙胺（TEA）8.08g，置于圆底烧瓶里，干燥CH₂Cl₂作溶剂；量取2-溴异丁酰溴10mL，干燥CH₂Cl₂10mL倒入恒压漏斗，0.5h内滴定至烧瓶中；冰水浴2h，之后常温反应24h。

（2）PDMAEMA-b-PEG-b-PDMAEMA三嵌段共聚物的合成

表1 四种主要原料摩尔比

引发剂（1）	CuBr	PMDEPA	DMAEMA
				1	2	2	120

称取步骤（1）得到的引发剂1.5g，干燥后的单体DMAEMA 14.149g，催化剂CuBr 0.216g，配位剂PMDETA 314.32μL，干燥DMF 5mL，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下60℃反应2h。

表2 四种主要原料摩尔比

引发剂（2）	CuBr	PMDEPA	MEO2MA
				1	2	2	80

单体DMAEMA与MEO₂MA的共聚比为3:2。

称取步骤（2）得到的产物1.67g，去除阻聚剂的单体MEO₂MA 1.203g，催化剂CuBr 0.02295g，配位剂PMDETA 33.492μL，干燥DMF 2mL，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下80℃反应12h。

应用于药物载体：

将此全亲水五嵌段共聚物溶于超纯水中，配成质量浓度为1mg/mL的水溶液。将能治疗慢性骨髓样白血病（CML）的抗肿瘤药物伊马替尼（lmatinib）加入该共聚物水溶液中，自组装形成以伊马替尼为核，该共聚物为壳的胶束，0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，测其药物包覆率为57.6%。静置30分钟后，采取不同的调控路线进行测试：（1）37℃，调控pH缓慢变化 pH=4→pH=7→pH=10；（2）pH=4，温度缓慢调控37℃→20℃→37℃。对于调控路线（l）来说其药物释放率由54.7%逐渐变化为10.5%；调控路线（2）其药物释放率为54.7%，随温度降低至20℃，药物释放率逐渐降到12.8%，再渐渐回升到48.6%。改变载体溶液pH值和温度可以控制伊马替尼的释放率，以此来达到在肿瘤部位的缓释作用。

实施例2

制备步骤：

（1）引发剂的制备

（2）P(DMAEMA)-b-PEG-b-P(DMAEMA)三嵌段共聚物的合成

表3 四种主要原料摩尔比

引发剂（1）	CuBr	PMDEPA	DMAEMA
				1	2	2	120

称取步骤（1）得到的引发剂3g，干燥后的单体DMAEMA 28.298g，催化剂CuBr 0.432g，配位剂PMDETA 628.64μL，干燥DMF 10mL，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下60℃反应2h。

（3）P(MEO₂MA)-b-P(DMAEMA)-b-PEG-b-P(DMAEMA)-b-P(MEO₂MA)五嵌段共聚物的合成

表4 四种主要原料摩尔比

引发剂（2）	CuBr	PMDEPA	MEO2MA
				1	2	2	160

单体DMAEMA与MEO₂MA的共聚比为3:4。

称取步骤（2）得到的产物3.34g，去除阻聚剂的单体MEO₂MA 4.813g，催化剂CuBr 0.0459g，配位剂PMDETA 66.984μL，干燥DMF 5mL，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下80℃反应12h。

应用于基因载体：

将得到的最终产物(LCST为28℃)2mg溶于l mL超纯水中，滤菌，与pGL3质粒DNA溶液混合配制成基因载体/DNA复合物，复合质量比为30/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染3小时后，采取不同的调控路线进行转染后的培养：（1）pH=4，37℃，48h；（2）pH=7，37℃，48h；（3）pH=10，37℃，48h；（4）pH=4，37℃（21h）→20℃（3h）→37℃（24h）。48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：对于调控路线（l）来说为8.23×l0⁷RLU/mg protein；调控路线（2）为9.72×l0⁷ RLU/mg protein；调控路线（3）为1.45×l0⁸ RLU/mg protein；调控路线（4）为1.13×l0⁸ RLU/mg protein。

实施例3

制备步骤：

（1）引发剂的制备

称取干燥PEG2000 10g，干燥三乙胺（TEA）8.08g，置于圆底烧瓶里，干燥CH₂Cl₂作溶剂；量取2-溴异丁酰溴10mL，干燥干燥CH₂Cl₂10mL倒入恒压漏斗，0.5h内滴定至烧瓶中；冰水浴2h，之后常温反应24h。

（2）P(DMAEMA)-b-PEG-b-P(DMAEMA)三嵌段共聚物的合成

表5 四种主要原料摩尔比

引发剂（1）	CuBr	PMDEPA	DMAEMA
				1	2	2	120

称取步骤（1）得到的引发剂6g，干燥后的单体DMAEMA 56.596g，催化剂CuBr 0.864g，配位剂PMDETA 1257.28μL，干燥DMF 20mL，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下60℃反应2h。

表6 四种主要原料摩尔比

引发剂（2）	CuBr	PMDEPA	MEO2MA
				1	2	2	320

单体DMAEMA与MEO₂MA的共聚比为3:8。

称取步骤（2）得到的产物1.67g，去除阻聚剂的单体MEO₂MA 4.813g，催化剂CuBr 0.02295g，配位剂PMDETA 33.492μL，干燥DMF 2mL，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下80℃反应12h。

应用于纳米膜：

将明胶溶解于浓度88%的浓甲酸中，在室温下磁力搅拌1h，配制明胶浓度为15%的电纺液。将浓度10%的五嵌段共聚物水溶液加入到上述制备的15%明胶溶液中，制备Gel/共聚物 90/10(w/w)的混合溶液，同时溶液中加入2%的溶菌酶用于制备载药纤维膜。保持电压为30kV、纺丝距离为10cm、喷丝孔内径为0.47mm进行电纺丝制备纳米膜。将该纳米膜浸在不同pH的水溶液里，进行释药检测：（1）37℃，调控pH缓慢变化 pH=4→pH=7→pH=10；（2）pH=4，温度缓慢调控37℃→20℃→37℃。对于调控路线（l）来说其药物释放率由36.2%逐渐变化为9.5%；调控路线（2）其药物释放率为32.4%，随温度降低至20℃，药物释放率逐渐降到6.8%，再渐渐回升到33.7%。

Claims

1.一种具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物，其特征在于该五嵌段共聚物的结构式为：

Figure 2011100890368100001DEST_PATH_IMAGE001

其中，m为60~100，n为10~50，p为20~160；

所述五嵌段共聚物是通过聚乙二醇改性，两端逐步接上具有温度和pH双重敏感性的DMAEMA和MEO₂MA得到，其中：单体DMAEMA和MEO₂MA共聚比为3:(2~8)。

2.一种如权利要求1所述的具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）引发剂的制备

将干燥PEG2000和干燥三乙胺，置于圆底烧瓶里，干燥二氯甲烷作为溶剂；恒压漏斗中加入2-溴异丁酰溴和干燥二氯甲烷，0.5~1h内滴定至烧瓶中；冰水浴2h，之后常温反应24h；反应完毕，进行后处理：过滤除去不溶物，饱和碳酸氢钠溶液冲洗，萃取，取下层液体用无水硫酸镁干燥除水，过滤除去固体，乙醚沉淀三次得到引发剂Br-PEG-Br；其中：PEG与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:(8~16)；

（2）PDMAEMA-b-PEG-b-PDMAEMA三嵌段共聚物的合成

将步骤（1）得到的引发剂和干燥后的单体DMAEMA按比例各自称料，催化剂CuBr和配位剂PMDETA的摩尔量均为步骤(1)得到的引发剂的两倍，干燥二甲基甲酰胺适量，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下60℃反应2~3h；反应完毕，进行后处理：加四氢呋喃溶解烧瓶中的产物，过中性氧化铝柱，除去铜盐，浓缩除掉大部分THF，用正己烷沉淀三次，得到ABA型三嵌段共聚物；

将步骤（2）得到的产物做引发剂，和去除阻聚剂的单体MEO₂MA 按比例各自称料，催化剂CuBr和配位剂PMDETA的摩尔量均为步骤(2)得到的产物的两倍，干燥DMF适量，置于圆底烧瓶中，在氩气保护气氛下80℃反应12~24h；反应完毕，进行后处理，加适量四氢呋喃溶解烧瓶中的产物，过中性氧化铝柱，除去铜盐，浓缩除掉大部分THF，用正己烷沉淀三次，得到ABCBA型五嵌段共聚物；其中：单体DMAEMA和MEO₂MA共聚比为3:(2~8)。

3.一种如权利要求1所述的具备温度和pH双重敏感性的五嵌段共聚物作为增强药物的靶向功能的药物载体，或用于转基因实现对于DNA运输和表达的调控，或用于智能开关。