CN112898432A

CN112898432A - 能结合CD32B和CD79b的双特异性单价Fc双抗体及其用途

Info

Publication number: CN112898432A
Application number: CN202110078461.0A
Authority: CN
Inventors: 莱斯利·S·约翰逊; 黄玲; K·沙哈; 埃兹奥·泊韦尼; 保罗·A·摩尔; 陈蔚
Original assignee: Macrogenics Inc
Current assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2014-08-06
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2034-08-06
Also published as: SG11201600855VA; JP2016527314A; CA2920021C; TW201536805A; CN112898432B; ES2720730T3; PH12016500242A1; PL3030264T3; AU2014306105A1; US20160194396A1; CN105611943B; CA2920021A1; EA033658B1; BR112016002738A2; UA116479C2; EA201690325A1; JP6395834B2; DK3030264T3; KR20160042004A; PT3030264T

Abstract

本发明涉及能结合CD32B和CD79b的双特异性单价Fc双抗体及其用途。本发明涉及双特异性单价双抗体，其包含免疫球蛋白Fc结构域(“双特异性单价Fc双抗体”)，并由三条多肽链构成，并且具有至少一个对CD32B的表位具有特异性的结合位点和一个对CD79b的表位具有特异性的结合位点(即“CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体”)。本发明的双特异性单价Fc双抗体能同时结合CD32B和CD79b。本发明涉及这类组合物、涉及包含这类双特异性单价Fc双抗体的药物组合物、并涉及将其用于治疗炎性疾病或疾病状况，特别是系统性红斑狼疮(SLE)和移植物抗宿主病的方法。

Description

能结合CD32B和CD79b的双特异性单价Fc双抗体及其用途

本申请是申请日为2014年8月6日，申请号为201480045937.9(PCT/US2014/049848)，发明名称为“能结合CD32B和CD79b的双特异性单价Fc双抗体及其用途”的中国专利申请的分案申请。

对相关申请的交叉引用：

本申请要求美国专利申请第61/864,217号(2013年8月9日提交；未决)、第61/866,416号(2013年8月15日提交；未决)、第61/869,519号(2013年8月23日提交；未决)以及第61/907,525号(2013年11月22日提交；未决)的优先权，每一上述申请均通过引用以其整体并入本文。

涉及的序列表:

根据37 C.F.R.1.821以及下面的条款，本申请包括一个或多个序列表，所述序列表以纸质或者计算机可读介质的形式公开，并且通过引用将所述纸质公开和计算机可读公开以其整体并入本文。

背景技术

技术领域

本发明涉及双特异性单价双抗体，其包含免疫球蛋白Fc结构域(“双特异性单价Fc双抗体”)，由三条多肽链构成，并且具有至少一个对CD32B的表位具有特异性的结合位点和一个对CD79b的表位具有特异性的结合位点(即“CD32B xCD79b Fc双抗体”)。本发明的双特异性单价Fc双抗体能同时结合CD32B和CD79b。本发明涉及含有这类双特异性单价Fc双抗体的这类组合物、药物组合物，并涉及它们在治疗炎性疾病或疾病状况，特别是系统性红斑狼疮(SLE)和移植物抗宿主病中的用途。

相关技术描述

I.Fcγ受体和CD32B

抗原抗体复合物与免疫系统细胞的相互作用导致一系列应答，范围从效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱粒以及吞噬作用，到免疫调节信号，如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用都通过抗体或免疫复合物的Fc结构域与造血细胞上特异性细胞表面受体的结合而启动。抗体和免疫复合物触发的细胞应答的多样性由Fc受体的结构异质性引起。Fc受体共享结构相关的配体结合结构域，所述相关的配体结合结构域据推测介导细胞内信号传导。

Fc受体是免疫球蛋白基因超家族蛋白的成员。它们是能结合免疫球蛋白分子的Fc部分的表面糖蛋白。该家族的每个成员都通过Fc受体α链上的识别结构域识别一个或多个同种型的免疫球蛋白。

Fc受体根据它们对免疫球蛋白亚型的特异性而界定(见Ravetch J.V.等(1991)“Fc Receptors,”Annu.Rev.Immunol.9:457-92；Gerber J.S.等(2001)“Stimulatory AndInhibitory Signals Originating From The Macrophage FcγReceptors,”Microbesand Infection,3:131-139；Billadeau D.D.等(2002)“ITAMs Versus ITIMs:Striking ABalance During Cell Regulation,”J.Clin.Invest.2(109):161-168l；Ravetch J.V.等(2000)“Immune Inhibitory Receptors,”Science 290:84-89；Ravetch J.V.等(2001)“IgG Fc Receptors,”Annu.Rev.Immunol.19:275-90；Ravetch J.V.(1994)“FcReceptors:Rubor Redux,”Cell,78(4):553-60)。

能结合IgG抗体的Fc受体称为“FcγRs”。该家族的每一成员都是完整的膜糖蛋白，具有与C2组(C2-set)免疫球蛋白-相关结构域相关的细胞外结构域、单个跨膜结构域和长度可变的胞质内结构域。有三个已知的FcγRs，称为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)以及FcγRIII(CD16)。这三个受体由不同的基因编码；然而，这三个家族成员之间的广泛同源性表明：它们或许通过基因复制而来源于共同的祖先。

FcγRII(CD32)蛋白是40KDa完整膜糖蛋白，所述膜糖蛋白由于对单体Ig的低亲和性(10⁶M^-1)而仅结合复合的(complexed)IgG。该受体是存在于所有造血细胞上的最广泛表达的FcγR，所述造血细胞包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞以及血小板。FcγRII在其免疫球蛋白结合链中仅具有2个免疫球蛋白样区，因此对IgG的亲和性比FcγRI低得多。有三种人类FcγRII基因(FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIC(CD32C))，所有这三种基因都结合聚集体或免疫复合物中的IgG。

FcγRIIA和FcγRIIB胞质结构域中的明显差异对受体连接产生了两种功能上不同的应答。基本差异是，结合IgG Fc区后，FcγRIIA同种型引发导致免疫系统激活(例如吞噬作用、呼吸爆发等)的细胞内信号传导，而结合IgG Fc区后，FcγRIIB同种型引发导致免疫系统受到减弱或抑制(例如抑制B细胞激活等)的信号。

这类激活信号和抑制信号都在FcγR与IgG Fc区连接后通过FcγR转导。这些完全相反的功能由不同的受体同种型之间的结构差异造成。被称为免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif,ITAMs)或免疫受体酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibitory Motif,ITIMS)的受体的胞质信号传导结构域中的两个不同的结构域导致不同的应答。不同的胞质酶向这些结构的募集指示FcγR介导的细胞应答的结果。含有ITAM的FcγR复合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，而含有ITIM的复合物仅包括FcγRIIB。

人类嗜中性粒细胞表达FcγRIIA基因。通过免疫复合物或特异性抗体交联而进行的FcγRIIA聚集用来聚集ITAM与促进ITAM磷酸化的受体相关激酶。ITAM磷酸化充当Syk激酶的停靠位点，Syk激酶的激活导致下游底物(例如PI₃K)的激活。细胞激活导致促炎介质的释放。

FcγRIIB基因表达于B淋巴细胞上；其细胞外结构域与FcγRIIA具有96％的同一性，并以不可辨别的方式结合IgG复合体。ITIM在FcγRIIB的胞质结构域中的存在限定了FcγR的这种抑制性亚类。已经确定了这种抑制的分子基础。当FcγRIIB以免疫复合物的IgG免疫球蛋白的Fc区的方式与激活受体共连接时，FcγRIIB ITIM变成磷酸化的，并吸引肌醇多磷酸5’-磷酸酶(SHIP)的SH2结构域，该酶水解由于含有ITAM的FcγR介导的赖氨酸激酶激活而释放的磷酸肌醇信使，从而防止细胞内Ca⁺⁺的流入。因此，FcγRIIB和激活受体的这类交联抑制了激活受体的活性，并因此抑制细胞响应性。在B细胞上，B细胞激活、B细胞增殖以及抗体分泌受到抑制或中止。从而在抗原检测开始时，发生单体IgG抗原键合，并且，结合抗体的Fc区结合激活FcγR的ITAM，从而介导免疫系统的激活。随着宿主应答的进行，形成能结合FcγRIIB的多聚IgG抗原免疫复合物(因此共连接这类复合物与激活受体)，从而导致免疫应答的抑制和最终停止(见，例如美国专利第8,445,645号、第8,217,147号、第8,216,579号、8,216,574号、第8,193,318号、第192,737号、第8,187,593号、第8,133,982号、第8,044,180号、第8,003,774号、7,960,512号、第7,786,270号、第7,632,497号、第7,521,542号、第7,425,619号、第7,355,008号和美国专利公开第2012/0276094号、第2012/0269811号、第2012/0263711号、第2012/0219551号、第2012/0213781号、第2012/0141476号、第2011/0305714号、第2011/0243941号、第2010/0322924号、第2010/0254985号、第2010/0196362号、第2010/0174053号、第2009/0202537号、第2009/0191195号、第2009/0092610号、第2009/0076251号、第2009/0074771号、第2009/0060910号、第2009/0053218号、第2009/0017027号、第2009/0017026号、第2009/0017023号、第2008/0138349号、第2008/0138344号、第2008/0131435号、第2008/0112961号、第2008/0044429号、第2008/0044417号、第2007/0077246号、第2007/0036799号、第2007/0014795号、第2007/0004909号、第2005/0260213号、第2005/0215767号、第2005/0064514号、第2005/0037000号、第2004/0185045)。

II.B细胞受体和CD79b

B细胞是负责产生抗体的免疫系统细胞。B细胞对抗原的应答是正常免疫系统的基本组成部分。B细胞具有特异性细胞表面受体(B细胞受体；“BCR”)。如果B细胞遇到能结合该细胞的BCR的抗原，则会刺激B细胞增殖并产生对结合抗原具有特异性的抗体。为了对抗原产生有效应答，还需要BCR相关蛋白和T细胞援助。抗原/BCR复合物被内在化，并且对抗原进行蛋白分解加工。一小部分抗原保持与B细胞表面上的主要组织相容性复合物-II(“MHC-II”)分子复合，其中复合物可以被T细胞识别。被这类抗原呈递激活的T细胞分泌多种诱导B细胞成熟的淋巴因子。

通过BCR进行的信号传导在抗体的产生、自体免疫以及免疫耐受性的建立方面发挥重要作用(Gauld,S.B.等(2002)“B Cell Antigen Receptor Signaling:Roles In CellDevelopment And Disease,”Science 296(5573):1641-1642)。结合自身抗原但仍然在骨髓中的成熟B细胞通过凋亡而消除。相比之下，成熟B细胞上的抗原结合导致激活、增殖、无反应性以及凋亡。所观察到的具体功能应答取决于B细胞是否通过其他表面受体和被激活的特定信号转导途径接受共刺激信号。

BCR由膜免疫球蛋白构成，膜免疫球蛋白与CD79的非共价结合的α和β亚基(分别为“CD79a”和“CD79b”)形成BCR复合物。CD79a和CD79b是信号转导亚基，其含有信号转导所需的保守的免疫受体酪氨酸激活基序(“ITAM”)(Dylke,J.等(2007)“Role of theextracellular and transmembrane domain of Ig-alpha/beta in assembly of the Bcell antigen receptor(BCR),”Immunol.Lett.112(1):47-57；Cambier,J.C.(1995)“NewNomenclature For The Reth Motif(or ARH1/TAM/ARAM/YXXL),”Immunol.Today 16:110)。BCR复合物通过多价抗原进行的聚集启动CD79a和CD79b ITAM的转磷酸作用和受体相关激酶的激活(DeFranco,A.L.(1997)“The Complexity Of Signaling PathwaysActivated By The BCR,”Curr.Opin.Immunol.9:296-308；Kurosaki,T.(1997)“MolecularMechanisms In B-Cell Antigen Receptor Signaling,”Curr.Opin.Immunol.9:309-318；Kim,K.M.等(1993)“Signalling Function Of The B-Cell Antigen Receptors,”Immun.Rev.132:125-146)。磷酸化的ITAM募集其他效应子如PI₃K、PLC-γ以及Ras/MAPK途径的成员。这些信号传导事件是造成B细胞增殖以及激活标记(如MHC-II和CD86)表达增加的原因，需要所述激活标记来引发B细胞随后与T辅助(“T_h”)细胞相互作用。

III.炎性疾病或疾病状况

炎症是身体的白细胞和化学剂保护我们的身体免遭外来物质如细菌和病毒感染的过程。其特征通常是受影响的区域疼痛、肿胀、发热和发红。被称为细胞因子和前列腺素的化学剂控制这一过程，并以有序和自我限制的级联释放到血液或受影响的组织中。化学剂的这种释放增加向损伤或感染区域的血液流量，并可以导致发红和发热。一些化学剂引起流体向组织中的泄漏，从而引起肿胀。这种保护过程可以刺激神经并引起疼痛。当在相关区域中发生有限的一段时间时，这些变化对身体有利。

炎性疾病或疾病状况反映了免疫系统对身体自身细胞和组织的攻击(即“自体免疫”应答)。存在许多以不同方式影响身体的自体免疫病。例如，在患有多发性硬化症的个体中大脑受到影响，在患有克罗恩病的个体中肠受到影响，以及在患有类风湿性关节炎的个体中各种关节的滑膜、骨和软骨受到影响。随着自体免疫病的发展，可能导致一种或多种身体组织的破坏、器官的异常生长或器官功能的改变。自体免疫病可能仅影响一个器官或组织类型或可能影响多个器官和组织。通常受到自体免疫病影响的器官和组织包括红细胞、血管、结缔组织、内分泌腺(例如甲状腺或胰腺)、肌肉、关节以及皮肤。自体免疫病的实例包括但不限于桥本氏甲状腺炎、恶性贫血、阿狄森氏病、1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、皮肌炎、斯耶格伦氏综合佂、皮肌炎、红斑狼疮、多发性硬化症、自体免疫内耳疾病、重症肌无力、赖特综合征、格雷夫斯病、自体免疫性肝炎、家族性腺瘤性息肉病以及溃疡性结肠炎。

当身体的正常保护性免疫系统通过攻击其存在有利于身体的外来细胞或组织(例如排斥移植物(宿主抗宿主疾病))或引入的移植物的免疫活性细胞排斥免疫抑制宿主的细胞(移植物抗宿主病)而引起损伤时，也可以发生炎性疾病或疾病状况(DePaoli,A.M.等(1992)“Graft-Versus-Host Disease And Liver Transplantation,”Ann.Intern.Med.117:170-171；Sudhindran,S.等(2003)“Treatment Of Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation With Basiliximab Followed By BowelResection,”Am J Transplant.3:1024-1029；Pollack,M.S.等(2005)“Severe,Late-OnsetGraft-Versus-Host Disease In A Liver Transplant Recipient Documented ByChimerism Analysis,”Hum.Immunol.66:28-31；Perri,R.等(2007)“Graft Vs.HostDisease After Liver Transplantation:A New Approach Is Needed,”LiverTranspl.13:1092-1099；Mawad,R.等(2009)“Graft-Versus-Host Disease PresentingWith Pancytopenia After En Bloc Multiorgan Transplantation:Case Report AndLiterature Review,”Transplant Proc.41:4431-4433；Akbulut,S.等(2012)“Graft-Versus-Host Disease After Liver Transplantation:A Comprehensive LiteratureReview,”World J.Gastroenterol.18(37):5240-5248)。

尽管最近在治疗这类疾病或疾病状况方面取得了进展，但是对能治疗或预防炎性疾病或疾病状况的组合物的需要仍然存在。

IV.双特异性双抗体

完整的未修饰抗体(例如IgG)结合抗原表位的能力取决于免疫球蛋白轻链和重链(即分别为VL结构域和VH结构域)上可变结构域的存在。双抗体的设计基于单链Fv构建体(scFv)(见例如Holliger等(1993)“’Diabodies’:Small Bivalent And BispecificAntibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448；US 2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388(Mertenset al.)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody ToBoth The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth FactorReceptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672；WO02/02781(Mertens等)；Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEADiabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For TumorTargeting Applications,”Protein Eng Des Sel.17(1):21-27；Wu,A.等(2001)“Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein IsMediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its FunctionalEnhancement By Fusion Of Human Fc Region,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small RecombinantBispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For CancerTherapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。

抗体轻链和抗体重链的相互作用，特别是其VL结构域和VH结构域的相互作用，形成了抗体表位结合位点之一。相比之下，scFv构建体包含抗体的单个多肽链中所含的VL和VH结构域，其中所述结构域被长度足以允许两个结构域自组装成功能性表位结合位点的灵活连接体隔开。如果由于连接体的长度不足(小于约12个氨基酸残基)使VL和VH结构域的自组装变得不可能，则两个scFv构建体彼此相互作用，形成双价分子，在所述双价分子中，一条链的VL结构域与另一条链的VH结构域结合(在Marvin等(2005)“RecombinantApproaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26:649-658中所做的评述)。

天然抗体仅能结合一个表位种类(即单特异性)，尽管它们能结合该种类的多个拷贝(即表现出二价或多价)。现有技术已经注意到产生在能够结合两种或多种不同表位种类(即除了二价或多价外还表现出双特异性或多特异性)方面不同于这类天然抗体的双抗体的能力(见例如Holliger等(1993)“’Diabodies’:Small Bivalent And BispecificAntibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448；US 2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388(Mertens等)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To BothThe Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth FactorReceptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672；WO02/02781(Mertens等)；Mertens,N.等,“New Recombinant Bi-and Trispecific AntibodyDerivatives,”In:NOVEL FRONTIERS IN THE PRODUCTION OF COMPOUNDS FOR BIOMEDICALUSE,A.VanBroekhoven等(Eds.),Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,TheNetherlands(2001),pages 195-208；Wu,A.等(2001)“Multimerization Of A ChimericAnti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through VariableDomain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004)“A DiabodyFor Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human FcRegion,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“ConstructionOf A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell EngagingAntibodies For Cancer Therapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。

非单特异性双抗体的提供带来了明显优势：共连接和共定位表达不同表位的细胞的能力。二价双抗体因此具有广泛的应用，包括治疗和免疫诊断。二价使得在各种应用中设计和改造双抗体时具有很大的灵活性，提供对多聚抗原的增强的亲和力、不同抗原的交联、以及依赖于两个靶抗原的存在定向靶向特定细胞类型。由于它们提高的效价、低解离率以及从循环中快速清除(对于小尺寸双抗体，处于或低于约50kDa)，本领域已知的双抗体分子还在肿瘤造影领域表现出特定用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour TargetingBy Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,”ProteinEng.10:1221)。特别重要的是，不同细胞的共连接，例如细胞毒性T细胞与肿瘤细胞的交联(Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,”Nature 314:628-631,and Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells ByCytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305)。

双抗体表位结合结构域也可以被引导至任何免疫效应细胞如CD3、CD16、CD32或CD64的表面决定簇，其表达于T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞或其他单核细胞上。在许多研究中，据发现，与效应细胞决定簇例如Fcγ受体(FcγR)结合的双抗体也激活效应细胞(Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-CellsMediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T-cell Activation In Colon CarcinomaInduced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEABispecific Fusion Proteins,”Cancer Res.59:2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。通常，效应细胞激活通过抗原结合抗体与效应细胞经Fc-FcγR相互作用的结合而触发；因此，就这一点而言，本发明的双抗体分子可以不依赖它们是否包含Fc结构域而表现出Ig样功能(例如如在本领域已知的任何效应功能测定中测定的或本文示例的(例如ADCC测定))。通过交联肿瘤细胞和效应细胞，双抗体不仅使效应细胞临近肿瘤细胞，而且还导致有效的肿瘤杀伤(参见例如Cao等(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,”Adv.Drug.Deliv.Rev.55:171-197)。

然而，实现上述优势的费用很高。这类非单特异性双抗体的形成需要成功组装两条或多条独特而不同的多肽(即这样的形成要求双抗体通过不同多肽链种类的异源二聚化而形成)。这一事实与单特异性双抗体相反，其通过相同多肽链的同源二聚化而形成。因为为了形成非单特异性双抗体，必须提供至少两条不同的多肽(即两个多肽种类)，且因为这类多肽的同源二聚化导致无活性分子(Takemura,S.等(2000)“Construction Of ADiabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)，因此这类多肽的产生必须以防止相同种类多肽之间的共价结合的方式实现(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(SmallRecombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)。因此，现有技术教导了这类多肽的非共价结合(见例如Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific ConjugationAnd Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its FunctionalEnhancement By Fusion Of Human Fc Region,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small RecombinantBispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both TheEpidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor ReceptorFor Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。

然而，现有技术认识到，由非共价结合的多肽构成的双特异性双抗体不稳定，且易于解离成非功能性单体(见例如Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-LikeBispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And TheInsulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。

在面对这种挑战时，现有技术已经成功地研发了稳定的共价结合的异源二聚非单特异性双抗体(见例如WO 2006/113665；WO/2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO/2012/162068；Johnson,S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With NovelFv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor CytolysisAnd In Vivo B-Cell Depletion,”J.Molec.Biol.399(3):436-449；Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma ReceptorIIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943；Moore,P.A.等(2011)“Application Of DualAffinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell KillingOf B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551)。这类方法涉及将一个或多个半胱氨酸残基工程化到每一种所用多肽种类中。例如，已经证明，向这类构建体的C末端添加半胱氨酸残基允许多肽链之间的二硫键合，从而稳定所得的异源二聚体，而不干扰二价分子的结合特性。

尽管有样的成功，但是稳定的功能性异源二聚非单特异性的产生仍然可以通过仔细考虑和放置多肽链中所用的结构域而得到进一步改善。本发明因此涉及特异性多肽的提供，所述特异性多肽经特别设计以通过共价键合，形成能同时结合CD32B和CD79b的异源二聚Fc双抗体。

发明概述

本发明涉及包含免疫球蛋白Fc区的CD32B x CD79b双特异性单价双抗体(“CD32Bx CD79b双特异性单价Fc双抗体”)。本发明的CD32B x CD79b双特异性单价Fc双抗体由三条多肽链构成(“第一”、“第二”以及“第三”多肽链)，其中第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合，并且第一多肽链和第三多肽链彼此共价键合。这类共价键合例如通过位于每一条多肽链中的半胱氨酸残基的二硫键合进行。本发明的CD32B x CD79b双特异性单价Fc双抗体的第一多肽链和第二多肽链以异源二聚体的方式彼此结合，形成一个对CD32B的表位具有特异性的结合位点和一个对CD79b的表位具有特异性的结合位点。本发明的CD32B x CD79b双特异性单价Fc双抗体因此是单价的，因为它们仅能结合CD32B表位的一个拷贝和结合CD79b表位的一个拷贝，但是双特异性的，因为单个双抗体能同时结合CD32B的表位和结合CD79b的表位。本发明的双特异性单价Fc双抗体能同时结合CD32B和CD79b。本发明涉及这类CD32B x CD79b双特异性单价Fc双抗体，并涉及含有这类双特异性单价Fc双抗体的药物组合物。本发明还涉及使用这类双抗体治疗炎性疾病或疾病状况，特别是系统性红斑狼疮(SLE)和移植物抗宿主病的方法。

具体而言，本发明提供了双特异性单价Fc双抗体，其中双特异性单价Fc双抗体能特异性结合CD32B的表位和结合CD79b的表位，并具有IgG Fc结构域，其中双特异性单价Fc双抗体包含第一多肽链、第二多肽链以及第三多肽链，其中第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合，并且第一多肽链和第三多肽链彼此共价键合，并且其中：

A.第一多肽链在N末端到C末端的方向上包含：

i.结构域1，包含：

(1)亚结构域(亚结构域)(1A)，其包含含有半胱氨酸的肽(特别是，具有序列(肽1)SEQ ID NO:1的肽)；以及

(2)亚结构域(1B)，其包含IgG Fc结构域的多肽部分(最优选，具有IgG免疫球蛋白Fc区的CH2和CH3结构域)；

ii.结构域2，包含：

(1)亚结构域(2A)，其包含能结合CD32B的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD32B)(SEQ IDNO:11)；以及

(2)亚结构域(2B)，其包含能结合CD79b的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD79b)(SEQ IDNO:14)，

其中亚结构域(2A)和(2B)被肽连接体(特别是具有序列SEQ ID NO:4的肽连接体(连接体2))彼此隔开；

iii.结构域3，其中结构域3是E螺旋(E-coil)结构域(SEQ ID NO:7)或K螺旋(K-coil)结构域(SEQ ID NO:8)，其中结构域3与结构域2被肽连接体(特别是具有序列SEQ IDNO:5的肽连接体)隔开；以及

iv.C末端间隔肽(特别是具有序列SEQ ID NO:6的间隔肽)；

B.第二多肽链在N末端到C末端的方向上包含：

i.结构域1，包含：

(1)亚结构域(1A)，其包含能结合CD79b的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD79b)(SEQ IDNO:13)；和

(2)亚结构域(1B)，其包含能结合CD32B的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD32B)(SEQ IDNO:12)；

其中，亚结构域(1A)和(1B)彼此被肽连接体(特别是具有序列SEQ ID NO:4的肽连接体(连接体2))隔开；

ii.结构域2，其中结构域2是K-螺旋结构域(SEQ ID NO:8)或E-螺旋结构域(SEQID NO:7)，其中结构域2与结构域1被肽连接体(特别是具有序列SEQ ID NO:5的肽连接体)隔开；且其中第一多肽链的结构域3和第二多肽链的结构域2不都是E螺旋结构域或不都是K螺旋结构域；以及

C.第三多肽链在N末端到C末端的方向上包含：结构域1，其包含：

(1)亚结构域(1A)，其包含含有半胱氨酸的肽(特别是具有序列(肽1)SEQ ID NO:1的肽连接体)；和

且其中：

(a)第一多肽链和第三多肽链的IgG Fc结构域的多肽部分形成IgG Fc结构域；

(b)第一多肽链的VL结构域和第二多肽链的VH结构域形成能特异性结合CD32B表位的抗原结合结构域；以及

(c)第一多肽链的VH结构域和第二多肽链的VL结构域形成能特异性结合CD79b表位的抗原结合结构域。

本发明还提供了双特异性单价Fc双抗体，其中双特异性单价Fc双抗体能特异性结合CD32B的表位和结合CD79b的表位，并具有IgG Fc结构域，其中双特异性单价Fc双抗体包含第一多肽链、第二多肽链以及第三多肽链，其中第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合，且第一多肽链和第三多肽链彼此共价键合，以及其中：

A.第一多肽链在N末端到C末端的方向上包含：

i.结构域1，包含：

(1)亚结构域(1A)，其包含含有半胱氨酸的肽(特别是具有序列(肽1)SEQ ID NO:1的肽连接体)；以及

ii.结构域2，包含：

(1)亚结构域(2A)，其包含能结合CD79b的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD79b)(SEQ IDNO:13)；和

(2)亚结构域(2B)，其包含能结合CD32B的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD32B)(SEQ IDNO:12)；

其中，亚结构域(2A)和(2B)彼此被肽连接体(特别是具有序列SEQ ID NO:4的肽连接体)隔开；

iii.结构域3，其中结构域3是E螺旋结构域(SEQ ID NO:7)或K螺旋结构域(SEQ IDNO:8)，其中结构域3与结构域2被肽(特别是具有序列SEQ ID NO:5的肽连接体)隔开；以及

iv.C末端间隔肽(特别是具有序列SEQ ID NO:6的间隔肽)；

B.第二多肽链在N末端到C末端的方向上包含：

i.结构域1，包含：

(1)亚结构域(1A)，其包含能结合CD32B的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD32B)(SEQ IDNO:11)；和

(2)亚结构域(1B)，其包含能结合CD79b的单克隆抗体的VH结构域(VH_CD79b)(SEQ IDNO:14)；

其中，亚结构域(1A)和(1B)彼此被肽连接体(特别是具有序列SEQ ID NO:4的肽连接体)隔开；

ii.结构域2，其中结构域2是K螺旋结构域(SEQ ID NO:8)或E螺旋结构域(SEQ IDNO:7)，其中结构域2与结构域1被肽连接体(特别是具有序列SEQ ID NO:5的肽连接体)隔开；且其中，第一多肽链的结构域3和第二多肽链的结构域2并不都是E螺旋结构域或并不都是K螺旋结构域；以及

C.第三多肽链在N末端到C末端的方向上包含结构域1，其包含：

以及其中：

(a)第一多肽链和第三多肽链的Fc结构域的多肽部分形成IgG Fc区；

(b)第一多肽链的VL结构域和第二多肽链的VH结构域形成能特异性结合CD79b的表位的抗原结合结构域；以及

(c)第一多肽链的VH结构域和第二多肽链的VL结构域形成能特异性结合CD32B的表位的抗原结合结构域。

本发明还涉及所有这类双特异性单价Fc双抗体的实施方案，其中第一多肽链的结构域1包含不同于第三多肽链的结构域1的序列的序列。

本发明还涉及所有这类双特异性单价Fc双抗体的实施方案，其中所述第一多肽链的所述亚结构域(1B)具有氨基酸序列SEQ ID NO:9，且所述第三多肽链的所述亚结构域(1B)具有氨基酸序列SEQ ID NO:10。

本发明还涉及所有这类双特异性单价Fc双抗体的实施方案，其中所述第一多肽链的所述亚结构域(1B)具有氨基酸序列SEQ ID NO:10，且所述第三多肽链的所述亚结构域(1B)具有氨基酸序列SEQ ID NO:9。

本发明还涉及所有这类双特异性单价Fc双抗体的实施方案，其中所述第一多肽链的结构域1和/或所述第三多肽链的结构域1包含表现出与Fcγ受体的结合发生改变的变异的CH2-CH3序列。

本发明还涉及所有这类双特异性单价Fc双抗体的实施方案，其中所述第一多肽链的结构域3包含E螺旋(SEQ ID NO:7)，且结所述第二多肽链的构域2包含K螺旋(SEQ ID NO:8)。

本发明还涉及所有这类双特异性单价Fc双抗体的实施方案，其中所述第一多肽链的结构域3包含K螺旋(SEQ ID NO:8)，且所述第二多肽链的结构域2包含E螺旋(SEQ ID NO:7)。

本发明还提供了包含IgG免疫球蛋白Fc的双特异性单价双抗体(双特异性单价Fc双抗体)，其中所述双特异性单价Fc双抗体包含：

(1)具有氨基酸序列SEQ ID NO:15的第一多肽链；

(2)具有氨基酸序列SEQ ID NO:16的第二多肽链；以及

(3)具有氨基酸序列SEQ ID NO:17的第三多肽链，其中所述第三多肽链的氨基酸残基1-10是肽1(SEQ ID NO:1)，且所述第三多肽链的氨基酸残基11-227是IgG抗体Fc区的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:10)；

其中所述第一多肽链和第二多肽链彼此通过第一二硫键共价键合；且所述第一多肽链和第三多肽链彼此通过第二二硫键共价键合。

本发明还提供了包含任何上述双特异性单价Fc双抗体和生理上可接受的载体的药物组合物。

本发明还提供了这类药物组合物在治疗炎性疾病或疾病状况中的用途，具体而言，所述炎性疾病或疾病状况是自体免疫病，特别是，其中所述自体免疫病是系统性红斑狼疮(SLE)。

本发明还提供了这类药物组合物在治疗炎性疾病或疾病状况中的用途，具体而言，其中所述炎性疾病或疾病状况是移植物抗宿主病(GvHD)。

附图简介

图1说明优选的双特异性单价Fc双抗体的三条多肽链和共价结合链的结构。

图2说明可选的双特异性单价Fc双抗体的三条多肽链和共价结合的链的结构。

图3A-3B显示优选的CD32B xCD79b Fc双抗体和非Fc CD32B xCD79b(ABD)双抗体抑制人类初级B细胞增殖的能力。

图4A-4B显示优选的CD32B xCD79b Fc双抗体、非Fc CD32B xCD79b(ABD)双抗体以及非Fc CD32B xCD79b双抗体抑制幼稚

细胞(图4A)和记忆B细胞(图4B)中的信号传导的能力。

图5A-5C显示优选的CD32B xCD79b Fc双抗体或非Fc CD32B xCD79b(ABD)双抗体抑制SLE细胞增殖的能力。据发现，这类抑制与疾病状态无关。

图6A-6B显示优选的CD32B xCD79b Fc双抗体或非Fc CD32B xCD79b双抗体体内调节B细胞应答的能力，并显示优选的CD32B xCD79b Fc双抗体的意料不到的优越性。

图7显示优选的CD32B xCD79b Fc双抗体降低小鼠异源GvHD的能力。

发明详述

本发明涉及双特异性单价双抗体，其包含免疫球蛋白Fc结构域(“双特异性单价Fc双抗体”)，并且由三条多肽链构成，且具有至少一个对CD32B的表位具有特异性的结合位点和一个对CD79b的表位具有特异性的结合位点(即“CD32B xCD79b Fc双抗体”)。本发明的双特异性单价Fc双抗体能同时结合CD32B和CD79b。本发明涉及含有这类双特异性单价Fc双抗体的组合物、药物组合物以及涉及将其用于治疗炎性疾病或疾病状况，特别是系统性红斑狼疮(SLE)和移植物抗宿主病的方法。

如上所述，CD79b由B细胞表达，因此表达于响应抗原识别而增殖的细胞上。能以免疫特异性结合CD79b的双抗体能结合这类B细胞。CD32B是FcγR，且表达于B细胞上。能以免疫特异性结合FcγRIIB(CD32B)的抗体，特别是结合FcγRIIB但不实质上干扰或妨碍Fc结合的这类抗体能增强FcγRIIB与免疫复合物的激活受体共连接的能力。能结合CD32B和CD79b两者的双特异性单价Fc双抗体具有响应不需要的B细胞激活、B细胞增殖以及抗体分泌而抑制或妨碍宿主的免疫系统的能力。这类双特异性单价Fc双抗体因此能用于治疗炎性疾病和病症。

I.本发明优选的CD32B x CD79b Fc双抗体

本发明优选的CD32B xCD79b Fc双抗体称为“Fc”双抗体，原因在于它们包含Fc结构域。如图1所示，这类Fc双抗体由三条多肽链构成，其中第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合，且第一多肽链和第三多肽链彼此键合。第一多肽链的VL结构域与第二多肽链的VH结构域相互作用，从而形成对第一抗原(即CD32B或CD79b)具有特异性的第一功能性抗原结合位点。同样地，第二多肽链的VL结构域与第一多肽链的VH结构域相互作用，从而形成对第二抗原(即CD79b或CD32B，取决于对第一抗原的确定)具有特异性的第二功能性抗原结合位点。因此，第一多肽链和第二多肽链VL和VH结构域的选择是协调的，从而这两条多肽链总共包含能结合CD32B和CD79b的VL结构域和VH结构域(即它们包含VL_CD32B/VH_CD32B和VL_CD79b/VH_CD79b)(图1)。每一这类VL和VH结构域和分隔它们的间插连接体共同称为分子的抗原结合结构域。

本发明Fc双抗体的Fc结构域可以是完整的Fc区(例如完整的IgG区)或仅仅是完整Fc区的片段。尽管本发明双特异性单价Fc双抗体的Fc结构域可以具有结合一个或多个Fc受体(例如FcγR(s))的能力，但更优选的是，这类Fc结构域会使与FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)的结合减少(相对于野生型Fc区所表现出的结合)，或会实质上消除这类Fc结构域结合这类受体的能力。本发明双特异性单价Fc双抗体的Fc结构域可以包括完整Fc区的一些或所有CH2结构域和/或一些或所有CH3结构域，或可以包含变异的CH2和/或变异的CH3序列(相对于完整Fc区的CH2或CH3结构域，其可以包括例如一个或多个插入和/或一个或多个缺失)。本发明双特异性单价Fc双抗体的Fc结构域可以包含非Fc多肽部分，或可以包含非天然的完整Fc区的一部分，或可以包含CH2和/或CH3结构域的非天然存在的取向(诸如，例如两个CH2结构域或两个CH3结构域，或按N末端到C末端的方向，CH3结构域连接于CH2结构域等)。

优选CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体的第一多肽链包含(在N末端到C末端的方向上)：氨基末端，含有半胱氨酸的肽(肽1)，IgG Fc结构域(优选抗体Fc区的CH2和CH3结构域，最优选抗体Fc区的会使与FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)的结合减少(相对于野生型Fc区所表现出的结合)的CH2和CH3结构域，或会实质上消除这类Fc结构域结合这类受体的能力)，第一间插间隔肽(连接体1)，能结合CD32B或CD79b的单克隆抗体的VL结构域(即VL_CD32B或VL_CD79b)，第二间插间隔肽(连接体2)，能结合CD79b(如果这类第一多肽链含有VL_CD32B)或CD32B(如果这类第一多肽链含有VL_CD79b)的单克隆抗体的VH结构域，含有半胱氨酸的第三间插间隔肽(连接体3)，促进异源二聚体的(heterodimer-promoting)结构域，任选的第四间隔肽(连接体4)以提供对促进异源二聚体的结构域的改善的稳定，以及C末端(图1)。

优选CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体的第二多肽链包含(在N末端到C末端的方向上)：氨基末端，能结合CD79b或CD32B的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD79b或VL_CD32B，取决于针对于双抗体的第一多肽链所选的VL结构域)，间插连接体肽(连接体2)，能结合CD32B(如果这类第二多肽链含有VL_CD79b)或CD32B(如果这类第二多肽链含有VL_CD32B)的单克隆抗体的VH结构域，含有半胱氨酸的间隔肽(连接体3)，促进异源二聚体的结构域，以及C末端(图1)。

优选CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体的第三多肽链包含(在N末端到C末端的方向上)：氨基末端，含有半胱氨酸的肽(肽1)，具有与第一多肽链的Fc结构域相同的同种型的IgG Fc结构域(优选抗体Fc区的CH2和CH3结构域)，以及C末端。优选地，第三多肽链的Fc结构域会使与FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)的结合减少(相对于野生型Fc区所表现出的结合)，或会实质上消除这类Fc结构域结合这类受体的能力(图1)。

第一条链和第三条链的含有半胱氨酸的肽(肽1)可以由相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列构成，并且会含有1、2、3或更多个半胱氨酸残基。特别是，优选的肽1具有氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：DKTHTCPPCP。第一间插间隔肽(连接体1)包含氨基酸序列(SEQ IDNO:2)：APSSS，且更优选具有氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：APSSSPME。优选的第二间插间隔肽(连接体2)具有序列SEQ ID NO:4：GGGSGGGG。优选的含有半胱氨酸的第三间插间隔肽(连接体3)会含有1、2、3或更多个半胱氨酸。优选的含有半胱氨酸的间隔肽(连接体3)具有的序列为SEQ ID NO:5：GGCGGG。优选的第四间隔肽(连接体4)具有序列GGG，或为SEQ ID NO:6：GGGNS。

最优选的是，间插连接体肽(连接体2，其隔开这类VL和VH结构域)的长度经选择实质上或完全防止多肽链的VL和VH结构域彼此结合。因此第一多肽链的VL和VH结构域实质上或完全不能彼此结合。同样，第二多肽链的VL和VH结构域实质上或完全不能彼此结合。

第一多肽和第二多肽的促进异源二聚体的结构域彼此不同，并且经设计彼此结合，从而促进第一多肽链和第二多肽链的结合。因此，在优选的实施方案中，这些多肽链之一会被改造为含有促进异源二聚体的“E螺旋”结构域(SEQ ID NO:7)：

EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK

其残基会在pH 7时形成负电荷，而两条多肽链中的另一条会被改造为含有促进异源二聚体的“K螺旋”结构域(SEQ ID NO:8)：

KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE

其残基会在pH 7时形成正电荷。这类带电荷的结构域的存在促进第一多肽和第二多肽之间的结合，并因此促进异源二聚化。向哪条链提供哪种螺旋并不重要，只要在第一多肽链和第二多肽链上所用的螺旋不同从而促进这类链之间的异源二聚化即可。

如上文所述，优选突变第一和第三多肽的CH2和CH3结构域，以减少(相对于野生型Fc区)或消除与FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)的结合。这类突变在本领域中是熟知的，包括位置234和235的氨基酸取代、位置265的取代或位置297的取代(参见例如美国专利第5,624,821号，在此通过引用将其并入)。在优选的实施方案中，CH2和CH3结构域包括在位置234用丙氨酸以及在位置235用丙氨酸进行的取代。

第一多肽和第三多肽的CH2和/或CH3结构域不必相同，且有利的是，将它们修饰成促进这两条多肽之间的复合。例如，可以将氨基酸取代(优选用包含形成‘杵(knob)’的大侧基的氨基酸，例如色氨酸，进行的取代)引入CH2或CH3结构域中，从而使得空间干扰会防止与类似突变的结构域的相互作用，并且会迫使突变的结构域与这样的结构域配对：在所述结构域中，改造进了互补或适应性突变，即‘臼(hole)’，(例如用甘氨酸进行取代)。这类突变组可以被改造进任何包含Fc双抗体分子的多肽对中，并且进一步改造进所述对的多肽链的任何部分中。相对于同源二聚化偏爱异源二聚化的蛋白质工程的方法在本领域中是熟知的，特别是相对于免疫球蛋白样分子的改造而言，并且包括在本文中(见例如Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy ChainHeterodimerization,”Protein Engr.9:617-621,Atwell等(1997)“Stable HeterodimersFrom Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage DisplayLibrary,”J.Mol.Biol.270:26-35,和Xie等(2005)“A New Format Of BispecificAntibody:Highly Efficient Heterodimerization,Expression And Tumor CellLysis,”J.Immunol.Methods 296:95-101；每一上述文献在此通过引用以其整体并入本文)。优选将‘杵’改造到第一多肽链的CH2-CH3结构域中，并将‘臼’改造到第三多肽链的CH2-CH3结构域中。因此‘杵’会有助于防止第一多肽链通过其CH2和/或CH3结构域同源二聚化。因为第三多肽链优选含有‘臼’取代，其会与第一多肽链异源二聚化以及与自身同源二聚化。通过将天然IgG Fc区修饰为含有修饰T366W，产生优选的杵。通过将天然IgG Fc区修饰为含有修饰T366S、L368A以及Y407V，产生优选的臼。为了有助于从最终的包含第一多肽链、第二多肽链以及第三多肽链的双特异性单价Fc双抗体中纯化第三多肽链同源二聚体，第三多肽链的CH2和CH3结构域的蛋白A结合位点优选通过位置435(H435R)的氨基酸取代而突变。为了有助于从最终的包含第一多肽链、第二多肽链以及第三多肽链的双特异性单价Fc双抗体中纯化第三多肽链同源二聚体，第三多肽链的CH2和CH3的结构域的蛋白A结合位点优选通过氨基酸取代而突变。因此，第三多肽链同源二聚体不会结合蛋白A，而双特异性单价Fc双抗体会保留其通过第一多肽链上的蛋白A结合位点结合蛋白的能力。

存在于第一多肽链中的抗体Fc区的CH2和CH3结构域的优选序列为(SEQ ID NO:9)：

存在于第三多肽链中的抗体Fc区的CH2和CH3结构域的优选序列为(SEQ ID NO:10)：

抗体的结合CD32B的VL结构域(VL_CD32B)的优选序列为(SEQ ID NO:11)：

抗体结合CD32B的VH结构域(VH_CD32B)的优选序列为(SEQ ID NO:12)：

抗体的结合CD79b的VL结构域(VL_CD79b)的优选序列为(SEQ ID NO:13)：

抗体的结合CD79b的VH结构域(VH_CD79b)的优选序列为(SEQ ID NO:14)：

因此，第一多肽链的优选序列在N末端到C末端的方向上具有以下结构：肽1、IgGFc区的CH2-CH3结构域、连接体1、抗体的结合CD32B的VL结构域(VL_CD32B)、连接体2、抗体的结合CD79b的VH结构域(VH_CD79b)、连接体3、E螺旋结构域、连接体4以及C末端。这一优选多肽的氨基酸序列为(SEQ ID NO:15)：

在SEQ ID NO:15中，氨基酸残基1-10是肽1(SEQ ID NO:1)，氨基酸残基11-227是IgG抗体Fc区的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:9)，氨基酸残基228-235是连接体1(SEQ IDNO:3)，氨基酸残基236-342是抗体的结合CD32B的VL结构域(VL_CD32B)(SEQ ID NO:11)，氨基酸残基343-350是连接体2(SEQ ID NO:4)，氨基酸残基351-463是抗体的结合CD79b的VH结构域(VH_CD79b)(SEQ ID NO:14)，氨基酸残基464-469是连接体3(SEQ ID NO:5)，氨基酸残基470-497是促进异源二聚体的E螺旋结构域(SEQ ID NO:7)，以及氨基酸残基498-502是连接体4(SEQ ID NO:6)。

编码第一多肽链的优选的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:23)：

gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagccccttccagctcccctatggaagacatccagatgacccagtctccatcctccttatctgcctctgtgggagatagagtcaccatcacttgtcgggcaagtcaggaaattagtggttacttaagctggctgcagcagaaaccaggcaaggcccctagacgcctgatctacgccgcatccactttagattctggtgtcccatccaggttcagtggcagtgagtctgggaccgagttcaccctcaccatcagcagccttcagcctgaagattttgcaacctattactgtctacaatattttagttatccgctcacgttcggaggggggaccaaggtggaaataaaaggaggcggatccggcggcggaggccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggcgcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctactggatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatcggaatgattgatccttcagacagtgaaactcactacaatcaaaagttcaaggacagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagctatgggctactgggggcaagggaccacggtcaccgtctcctccggaggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcgggaactct

第二多肽链的优选的序列为(SEQ ID NO:16)：

在SEQ ID NO:16中，氨基酸残基1-112是抗体的结合CD79b的VL结构域(VL_CD79b)(SEQ ID NO:13)，氨基酸残基113-120是连接体2(SEQ ID NO:4)，氨基酸残基121-236是抗体的结合CD32B的VH结构域(VH_CD32B)(SEQ ID NO:12)，氨基酸残基237-242是连接体3(SEQID NO:5)，以及氨基酸残基243-270是促进异源二聚体的K螺旋结构域(SEQ ID NO:8)。

编码第二多肽链的优选的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:24)：

gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcctgcaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggtttcagcagaggccaggccaatctccaaaccgcctaatttatctggtgtctaaactggactctggggtcccagacagattcagcggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctggcaaggtacacattttccgctcacgttcggcggagggaccaagcttgagatcaaaggaggcggatccggcggcggaggcgaagtgcagcttgtggagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccctgagactctcttgtgccgcctctggattcacttttagtgacgcctggatggactgggtccgtcaggccccaggcaaggggcttgagtgggttgctgaaattagaaacaaagctaaaaatcatgcaacatactatgctgagtctgtgatagggaggttcaccatctcaagagatgacgccaaaaacagtctgtacctgcaaatgaacagcttaagagctgaagacactgccgtgtattactgtggggctctgggccttgactactggggccaaggcaccctggtgaccgtctcctccggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag

第三多肽链的优选的序列为SEQ ID NO:17：

在SEQ ID NO:17中，氨基酸残基1-10是肽1(SEQ ID NO:1)，以及氨基酸残基11-227是IgG抗体Fc区的CH2和CH3结构域(SEQ ID NO:10)。

编码第三多肽链的优选的多核苷酸具有序列(SEQ ID NO:25)：

gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgagttgcgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

如在WO 2012/018687中所公开的，为了改善双抗体分子的体内药代动力学特性，可以在双抗体分子的一个或多个末端，将该分子修饰为含有血清结合蛋白的多肽部分。最优选的是，将这类血清结合蛋白的多肽部分安置于双抗体分子的C末端处。出于这种目的，血清结合蛋白的特别优选的多肽部分是链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(ABD)。链球菌属(Streptococcus)菌株G148的蛋白G的白蛋白结合结构域3(ABD3)是特别优选的。

链球菌属菌株G148的蛋白G的白蛋白结合结构域3(ABD3)由形成稳定三螺旋束的46个氨基酸残基组成，并具有广泛的白蛋白结合特异性(Johansson,M.U.等(2002)“Structure,Specificity,And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-BindingModules,”J.Biol.Chem.277(10):8114-8120)。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白，在人类中半衰期为19天。白蛋白具有几个允许其非共价结合其他蛋白并由此延长其血清半衰期的小分子结合位点。优选的是，使用短的连接体(连接体5)(如GGGS(SEQ ID NO:18)或GGGNS(SEQID NO:6)将这类多肽链的E螺旋(或K螺旋)与白蛋白结合结构域隔开。优选的白蛋白结合结构域(ABD)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:19)：

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALID EILAALP

II.本发明的可选的CD32B x CD79b Fc双抗体

本发明的可选的CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体分子图示于图2中。这类可选的CD32B xCD79b Fc双抗体分子具有三条多肽链，其中，第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合，且第一多肽链和第三多肽链彼此键合。可选的CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体分子的结构域的顺序不同于优选的CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体分子的结构域的顺序。然而，在优选的CD32B x CD79b Fc双抗体的情况下，可选的CD32B x CD79b双特异性单价Fc双抗体第一多肽链的VL结构域与可选的CD32B x CD79b双特异性单价Fc双抗体第二多肽链的VH结构域相互作用，从而形成对第一抗原(即CD32B或CD79b)具有特异性的第一功能性抗原结合位点。同样，可选的CD32B x CD79b双特异性单价Fc双抗体第二多肽链的VL结构域与可选的CD32B x CD79b双特异性单价Fc双抗体第一多肽链的VH结构域相互作用，从而形成对第二抗原(即CD79b或CD32B，取决于对第一抗原的确定)具有特异性的第二功能性抗原结合位点。因此，第一多肽链和第二多肽链VL和VH结构域的选择是协调的，从而这两条多肽链总共包含能结合CD32B和CD79b的VL和VH结构域(即它们包含VL_CD32B/VH_CD32B和VL_CD79b/VH_CD79b)(图2)。每一这类VL和VH结构域和隔开它们的间插连接体共同称为所述分子的抗原结合结构域。

这类可选的CD32B xCD79b Fc双抗体的第一多肽链在N末端到C末端的方向上包含氨基末端、能结合CD32B或CD79b的单克隆抗体的VL结构域(即VL_CD32B或VL_CD79b)、间插间隔肽(连接体2)、能结合CD79b(如果这类第一多肽链含有VL_CD32B)或CD32B(如果这类第一多肽链含有VL_CD79b)的单克隆抗体的VH结构域、含有半胱氨酸的第三间插间隔肽(连接体3)、促进异源二聚体的结构域、任选的第四间隔肽(连接体4)以提供对促进异源二聚体的结构域(优选E螺旋结构域)的改善的稳定、含有半胱氨酸的肽(肽1)、IgG Fc结构域(优选抗体Fc区的CH2和CH3结构域)，以及C末端。优选，第一多肽链的Fc结构域会使与FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)的结合减少(相对于野生型Fc区所表现出的结合)，或会实质上消除这类Fc结构域结合这类受体的能力(图2)。

这类可选的CD32B xCD79b Fc双抗体的第二多肽链在N末端到C末端的方向上包含氨基末端、能结合CD79b或CD32B的单克隆抗体的VL结构域(即VL_CD79b或VL_CD32B，取决于针对双抗体的第一多肽链所选的VL结构域)、间插连接体肽(连接体2)、能结合CD32B(如果这类第二多肽链含有VL_CD79b)或CD32B(如果这类第二多肽链含有VL_CD32B)的单克隆抗体的VH结构域、含有半胱氨酸的间隔肽(连接体3)、促进异源二聚体的结构域(优选K螺旋结构域)，以及C末端(图2)。

优选的CD32B xCD79b Fc双抗体的第三多肽链在N末端到C末端的方向上包含氨基末端、含有半胱氨酸的肽(肽1)、具有与第一多肽链的Fc结构域相同的同种型的IgG Fc结构域(优选抗体Fc区的CH2和CH3结构域)以及C末端。优选，第三多肽链的Fc结构域会使与FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)的结合减少(相对于野生型Fc区所表现出的结合)，或会实质上消除这类Fc结构域结合这类受体的能力(图2)。

III.药物组合物

本发明的组合物包括可用于制造药物组合物(例如不纯的或非无菌的组合物)和药物组合物(即适合施用于对象或患者的组合物)的散装(bulk)药物组合物，其可用来制备单位剂型。这类组合物包含预防有效量或者治疗有效量的本发明的CD32BxCD79b Fc双抗体，且特别是本文公开的任何CD32B xCD79b Fc双抗体或这类剂以及药学上可接受的载体的组合。优选，本发明的组合物包含预防有效量或者治疗有效量的一种或多种本发明的分子和药学上可接受的载体。

本发明还包括这样的药物组合物，其包含这类CD32B xCD79b Fc双抗体、对特定自体免疫或炎性疾病抗原具有特异性的第二治疗抗体(例如自体免疫或炎性疾病抗原特异性单克隆抗体)、以及药学上可接受的载体。

在具体实施方案中，术语“药学上可接受的”表示获得联邦政府或州政府管理结构的许可或列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他通常获得认可的药典中，供用于动物，特别是用于人类。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或媒介。这类药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液可以用作液体载体，特别是对于可注射溶液而言。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、滑石粉(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、1,2-乙二醇、水、乙醇等。若需要，组合物也可以含有小量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。

通常，本发明组合物的成分被单独提供或以单位剂型的形式混合在一起，例如作为标明活性剂量的密封容器中的冻干粉或无水浓缩物，所述容器如安剖或袋(sachette)。当通过输注施用组合物时，其可以用含有无菌的药物级水或盐水的输注瓶分配。如果通过注射施用所述组合物，则可以提供一安剖注射用无菌水或盐水，以便可以在施用前混合所述组分。

可以将本发明的组合物配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于用阴离子形成的盐，所述阴离子例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子，以及用阳离子形成的盐，所述阳离子例如来自氢氧化纳、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充以单独的这类公开的CD32B xCD79b Fc双抗体或填充以所述双抗体和这类药学上可接受的载体。另外，用于治疗疾病的一种或多种其他预防性或治疗性剂也可以包括于所述药物包装或试剂盒中。本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充以本发明药物组合物的一种或多种成分。任选地与这类容器关联的可以是采用管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形的布告(notice)，所述布告反映了管理机构许可制造、使用或销售，供施用于人类。

本发明提供了用于上述方法中的试剂盒。在一实施方案中，试剂盒包含本发明的一种或多种分子。在另一实施方案中，试剂盒还包含一个或多个容器中的可用于治疗自体免疫病或炎性疾病的一种或多种其他预防剂或治疗剂。在另一实施方案中，试剂盒还包含结合与自体免疫病或炎性疾病相关的自体免疫病或炎性疾病抗原的一种或多种抗体。在某些实施方案中，其他预防剂或治疗剂是化学治疗剂。在其他实施方案中，预防剂或治疗剂是生物治疗剂或激素治疗剂。

IV.本发明组合物的用途

本发明的CD32B xCD79b Fc双抗体能治疗与CD79b表达相关或特征为CD79b表达或与具有针对该疾病的B细胞组分有关或特征为具有针对该疾病的B细胞组分的任何疾病或疾病状况。因此，包含这类分子的药物组合物可以用于诊断或治疗自体免疫病或炎性疾病或疾病状况，而无限制。

因此本发明可以用于治疗、预防或减缓B细胞介导的疾病或病症的发展和/或改善B细胞介导的疾病或病症的症状，包括移植排斥、移植物抗宿主病(GvHD)和系统性红斑狼疮(SLE)。

V.给药方法

通过向对象施用有效量的本发明的药物组合物，可以提供所述本发明的组合物用来治疗、预防和改善与疾病、病症或感染相关的一种或多种症状。在优选的方面，这类组合物基本上是纯的(即基本上不含限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。在具体实施方案中，对象是动物，优选哺乳动物，如非灵长类(例如牛、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物等)或灵长类(例如，猴子，如食蟹猴(cynomolgous monkey)、人类等)。在优选的实施方案中，对象是人类。

各种送递系统是已知的，并且可以用于施用本发明的组合物，例如封装于脂质体中、微粒、微胶囊、能表达抗体或融合蛋白的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu等(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNACarrier System,”J.Biol.Chem.262:4429-4432)，构建核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分等。

施用本发明双特异性单价Fc双抗体的方法包括但不限于胃肠外施用(例如真皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内以及皮下)、硬脑膜外以及粘膜(例如鼻内和口腔途径)。在具体实施方案中，肌肉内、静脉内或皮下施用本发明的分子。组合物可以通过任何方便途径施用，例如通过输注或大丸剂注射、通过上皮膜或粘膜与皮肤膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。给药可以是全身的或局部的。另外，也可以应用肺给药，例如通过使用吸入器或喷雾器和具有雾化剂的制剂。参见例如美国专利第6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078号；和PCT公开第WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；以及WO99/66903号，每一上述文献都通过引用以其整体并入本文。

本发明还使得本发明的CD32B x CD79b Fc双抗体被包装于标有这类分子的量的密封的容器如安剖或袋中。在一实施方案中，本发明的CD32B x CD79b Fc双抗体作为冻干无菌粉或无水浓缩物提供于密封容器中，并且可以用例如水或盐水重构至施用于个体的适当浓度。优选地，本发明的CD32B x CD79b Fc双抗体作为冻干无菌粉提供于密封容器中，其单位剂量为至少5μg，更优选至少10μg、至少15μg、至少25μg、至少50μg、至少100μg或至少200μg。

本发明的冻干的CD32B x CD79b Fc双抗体应当在其最初的容器中储存于2-8℃之间，并且所述分子应当在重构后的12小时内、优选在6小时内、在5小时内、在3小时内或在1小时内施用。在可选的实施方案中，本发明的CD32B x CD79b Fc双抗体以液体的形式提供于标明所述分子、融合蛋白或缀合分子的量和浓度的密封容器中。优选地，本发明液体形式的CD32B x CD79b Fc双抗体提供于这样的密封容器中：在所述容器中所述分子存在的浓度为至少1μg/ml，更优选至少2.5μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml或至少100μg/ml。

可以通过标准的临床技术，确定本发明的CD32B x CD79b Fc双抗体的有效治疗、预防或改善与病症相关的一种或多种症状的量。待用于制剂中的精确剂量还取决于给药途径和疾病状况的严重程度，并且应当根据从业者的判断和每一患者的情况决定。有效剂量可以根据来源于体外或动物模型测试系统的剂量应答曲线来推断。

对于本发明所包括的CD32B x CD79b Fc双抗体而言，施用于患者的剂量通常为至少约0.01μg/kg对象体重、至少约0.05μg/kg对象体重、至少约0.1μg/kg对象体重、至少约0.2μg/kg对象体重、至少约0.5μg/kg对象体重、至少约1μg/kg对象体重、至少约2μg/kg对象体重、至少约5μg/kg对象体重、至少约10μg/kg对象体重、至少约20μg/kg对象体重、至少约50μg/kg对象体重、至少约0.1mg/kg对象体重、至少约1mg/kg对象体重、至少约5mg/kg对象体重、至少约10mg/kg对象体重、至少约30mg/kg对象体重、至少约50mg/kg对象体重、至少约75mg/kg对象体重、至少约100mg/kg对象体重、至少约125mg/kg对象体重、至少约150mg/kg对象体重或更多。

通过修饰如脂质化增强双特异性单价Fc双抗体的吸收和组织渗透，可以减少或改变本发明双特异性单价Fc双抗体的给药剂量和频率。

在一实施方案中，可以计算施用于患者的本发明CD32B x CD79b Fc双抗体的剂量，供用作单一剂治疗。在另一实施方案中，本发明的双特异性单价Fc双抗体与其他治疗组合物联合使用，并且施用于患者的剂量低于当这类双特异性单价Fc双抗体分子作为单一剂治疗使用时的剂量。

在具体实施方案中，可能期望将本发明的药物组合物局部施用于需要治疗的区域，这可以通过以下方式实现，例如但不限于局部输注、注射或移植物手段，所述移植物是多孔的、非多孔的或明胶材料，包括膜，如硅橡胶(sialastic)膜或纤维。优选，当施用本发明的分子时，必须小心施用所述分子不吸收的材料。

在另一实施方案中，可以在泡，特别是脂质体中送递所述组合物(见Langer(1990)“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)；Treat等,在LIPOSOMES INTHE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER,Lopez-Berestein和Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)中；Lopez-Berestein,同上,pp.3 17-327；通常出处同上)。

在另一实施方案中，可以在控释系统或缓释系统中送递所述组合物。可以使用本领域技术人员已知的任何技术产生包含本发明的一种或多种分子的缓释制剂。见例如美国专利第4,526,938号；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；Ning等(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using ASustained-Release Gel,”Radiotherapy&Oncology39:179-189,Song等(1995)“AntibodyMediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal ofPharmaceutical Science&Technology 50:372-397；Cleek等(1997)“BiodegradablePolymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For LocalDelivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，每一上述文献均通过引用以其整体并入。在一实施方案中，可以将泵用于控释系统中(见Langer,同上；Sefton,(1987)“Implantable Pumps,”CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14:201-240；Buchwald等(1980)“Long-Term,Continuous Intravenous Heparin Administration By AnImplantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent VenousThrombosis,”Surgery 88:507-516；and Saudek等(1989)“A Preliminary Trial Of TheProgrammable Implantable Medication System For Insulin Delivery,”N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一实施方案中，可以用聚合物材料实现抗体的控释(见例如MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE,Langer和Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY,DRUG PRODUCT DESIGNAND PERFORMANCE,Smolen和Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Levy等(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By LocalControlled-Release Diphosphonate,”Science 228:190-192；During等(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant:In VivoCharacterization,”Ann.Neurol.25:351-356；Howard等(1989)“Intracerebral DrugDelivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,”J.Neurosurg.7(1):105-112)；美国专利第5,679,377号；美国专利第5,916,597号；美国专利第5,912,015号；美国专利第5,989,463号；美国专利第5,128,326号；PCT公开第WO 99/15154号；以及PCT公开第WO99/20253号)。缓释制剂所用的聚合物的实例包括但不限于聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinylacetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoeste)。在另一实施方案中，可使控释系统接近治疗靶标(例如肺)放置，因此仅需要全身剂量的一部分(见例如Goodson,在MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLEDRELEASE,同上,vol.2,pp.115-138(1984)中)。在另一实施方案中，根据Dunn等(见U.S.5,945,155)，使用可用作控释移植物的聚合物组合物。该特定方法基于聚合物系统中生物活性材料原位控释的治疗效果。移植通常发生于患者身体内需要治疗的任何地方。在另一实施方案中，使用非聚合物持续送递系统，由此对象身体内的非聚合物移植物被用作药物送递系统。一旦移植到身体中，移植物的有机溶剂会从组合物中消散、分散或过滤到周围组织液中，并且非聚合物材料会逐渐凝结或沉淀，形成固体微孔基质(参见U.S.5,888,533)。

控释系统在Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)的综述中有论述。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来生产包含本发明的一种或多种治疗剂的缓释制剂。见例如美国专利第4,526,938号；国际公开第WO 91/05548和WO 96/20698号；Ning等(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A HumanColon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy&Oncology39:179-189,Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-CirculatingEmulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody ForCardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；and Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，每一上述文献通过引用以其整体并入本文。

在本发明的组合物是编码本发明的双特异性单价Fc双抗体的核酸的具体实施方案中，通过将核酸构建为适合的核酸表达载体的一部分，并例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射或通过使用微粒轰击(例如基因枪；生物弹道技术(Biolistic)，Dupont)，或涂覆以脂质或细胞表面受体或转染剂，或使其与已知进入细胞核的同源框样肽连接(见例如Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox PeptideRegulates Neural Morphogenesis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1864-1868)等施用所述核酸，以便其变成细胞内的，使得核酸可以体内施用，以促进其编码的双特异性单价Fc双抗体的表达。可选地，可以将细胞引入细胞内并通过同源重组整合到宿主细胞DNA中，以进行表达。

用治疗有效量或预防有效量的本发明的CD32B x CD79b Fc双抗体治疗对象，可以包括单一治疗，或优选可以包括一系列治疗。在优选的实例中，用本发明的分子治疗对象，每周一次，持续约1-10周，优选2-8周，更优选约3-7周，甚至更优选约4、5或6周。在其他实施方案中，施用本发明的药物组合物，一日一次，一日两次或一日三次。在其他实施方案中，施用所述药物组合物，一周一次，一周两次，每两周一次，一月一次，每六周一次，每两月一次，一年两次或一年一次。应当认识到，用于治疗的分子的有效剂量可以随着具体治疗的过程增加或降低。

已经按通常的方式描述了本发明，通过参考下述实施例，会更容易地理解本发明，所述实施例以示例的方式提供，而非意图限制本发明，除非另有说明。

实施例1：构建CD32BxCD79b双特异性单价Fc双抗体和对照双抗体

表1包含优选的已经表达和纯化的CD32B xCD79b Fc双抗体多肽链的序列列表。另外，产生了两个对照双抗体：一个是针对CD32B和FITC的双特异性单价双抗体，另一是针对CD79b和FITC的双特异性单价双抗体。

据发现，上述CD32B xCD79b Fc双抗体能同时结合CD32B和结合CD79b。据发现，对照CD32B x FITC双抗体能同时结合CD32B和结合FITC。据发现，对照CD79bx FITC双抗体能同时结合CD79b和结合FITC。CD32B x CD79b Fc双抗体是由三条多肽链(每一所述氨基酸序列的一条链)构成的异源三聚体。形成双特异性单价双抗体的方法提供于WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068以及WO 2012/162067中。

为了进一步证明这类优选的CD32B xCD79b Fc双抗体的优势，还制备了两个含有非Fc的CD32B xCD79b双抗体。这两个双抗体每个都由两条多肽链构成，不同在于一个双抗体(CD32B xCD79b(ABD)双抗体)含有白蛋白结合结构域，而另一双抗体(CD32B xCD79b双抗体)则不含有白蛋白结合结构域：

CD32B xCD79b(ABD)双抗体

CD32B xCD79b(ABD)双抗体由第一多肽链形成，第一多肽链在N末端到C末端的方向上包含：抗体的结合CD32B的VL结构域(VL_CD32B)、连接体2、抗体的结合CD79b的VH结构域(VH_CD79b)、连接体3、E螺旋结构域、连接体5、白蛋白结合结构域以及C末端。第二多肽链在N末端到C末端的方向上包含抗体的结合CD79b的VL结构域(VL_CD79b)、连接体2、抗体的结合CD32B的VH结构域(VH_CD32B)、连接体3、K螺旋结构域以及C末端。这类多肽的氨基酸序列如下：

第一多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)：

第二多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)：

CD32B xCD79b双抗体

CD32B xCD79b双抗体与CD32B xCD79b(ABD)双抗体的不同之处在于不具有白蛋白结合结构域。因此这类双抗体由第一多肽链形成，第一多肽链在N末端到C末端的方向上包含：抗体的结合CD32B的VL结构域(VL_CD32B)、连接体2、抗体的结合CD79b的VH结构域(VH_CD79b)、连接体3、E螺旋结构域、以及C末端。第二多肽链在N末端到C末端的方向上包含：抗体的结合CD79b的VL结构域(VL_CD79b)、连接体2、抗体的结合CD32B的VH结构域(VH_CD32B)、连接体3、K螺旋结构域以及C末端。该双抗体的这类第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:22)：

该双抗体的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:21)，其如上文所示。

实施例2：CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体抑制人类初级B细胞增殖

为了进一步证明本发明的CD32B xCD79b Fc双抗体阻碍或抑制免疫系统的能力，在存在从两个供体获得的初级人类B细胞的情况下，孵育上述优选的CD32B xCD79b Fc双抗体。在存在山羊抗人类IgM FcμF(ab)₂(5μg/ml)和不同浓度的CD32B x CD79b Fc双抗体或CD32B xCD79b ABD双抗体的情况下，48小时后，通过³H-TdR的摄取，监控增殖。结果示于图3A(供体1)和图3B(供体2)中，并显示在存在CD32B xCD79b Fc双抗体或CD32B xCD79b(ABD)双抗体的情况下，B细胞增殖显著减少。

实施例3：CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体抑制幼稚B细胞和记忆B细胞中的信号传导

为了进一步证明本发明的CD32B xCD79b Fc双抗体阻碍或抑制B细胞的免疫系统信号传导的能力，在存在单独的山羊抗人类IgM Fcμ(抗-μ)(30μg/ml)或还存在上述优选的CD32B xCD79b Fc双抗体的情况下，将纯化的幼稚或记忆B细胞孵育30分钟。由图4A(幼稚B细胞)和图4B(记忆B细胞)可以看出，优选的CD32B xCD79b Fc双抗体、CD32B xCD79b(ABD)双抗体或CD32B xCD79b双抗体的存在都明显降低B细胞信号传导。

实施例4：CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体抑制SLE患者B细胞增殖

为了进一步证明本发明的CD32B xCD79b Fc双抗体阻碍或抑制B细胞的免疫系统信号传导的能力，在存在单独的山羊抗人类IgM Fcμ(抗-μ)或还存在上述优选的CD32BxCD79b Fc双抗体的情况下，孵育患有系统性红斑狼疮(SLE)的患者的B细胞。通过³H-TdR的吸收监控增殖。

如图5A所示，据发现上述优选的CD32B xCD79b Fc双抗体能结合CD32B和CD79b。图5B表明，提供山羊抗人类IgM(GAH抗-μ)使B细胞的增殖相对于对照增加，以及额外施用上述优选的CD32B xCD79b Fc双抗体或CD32B xCD79b(ABD)双抗体显著抑制这类增殖的程度。

据发现，上述优选的CD32B xCD79b Fc双抗体或CD32B xCD79b(ABD)双抗体降低患有SLE的个体的B细胞增殖程度的能力与疾病状态无关。相对于在仅存在山羊抗人类IgM(GAH抗-μ)的情况下所观察到的增殖，患有活性或非活性SLE的患者中B细胞增殖降低的程度约为40％，并因此与疾病状态无关(图5C)。图5C进一步证明，优选的CD32B xCD79b Fc双抗体比CD32B xCD79b(ABD)双抗体提供了更强的抑制。

实施例5：CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体体内调节B细胞应答

为了进一步证明本发明的CD32B xCD79b Fc双抗体阻碍或抑制B细胞的免疫系统信号传导的能力，将人类PBMC注射到免疫缺陷NSG小鼠中(Agliano,A.等(2008)“HumanAcute Leukemia Cells Injected In NOD/Ltsz-Scid/IL-2Rgamma Null Mice GenerateA Faster And More Efficient Disease Compared To Other NOD/Scid-RelatedStrains,”Int.J.Cancer 123(9):2222-2227；Sanchez,P.V.等(2009)“A RobustXenotransplantation Model For Acute Myeloid Leukemia,”Leukemia 23(11):2109-2117；Racki,W.J.等(2010)“NOD-Scid IL2rgamma(Null)Mouse Model Of Human SkinTransplantation And Allograft Rejection,”Transplantation 89(5):527-536；Choi,B.等(2011)“Human B Cell Development And Antibody Production In Humanized NOD/SCID/IL-2Rγ(Null)(NSG)Mice Conditioned By Busulfan,”J.Clin.Immunol.31(2):253-264；Sartelet,H.等(2012)“Description Of A New Xenograft Model OfMetastatic Neuroblastoma Using NOD/SCID/Il2rg Null(NSG)Mice,”In Vivo 26(1):19-29；Spranger,S.等(2012)“NOD/scid IL-2Rg(null)Mice:A Preclinical ModelSystem To Evaluate Human Dendritic Cell-Based Vaccine Strategies in vivo,”J.Transl.Med.10:30；von Bonin,M.等(2013)“in vivo Expansion Of Co-TransplantedT Cells Impacts On Tumor Re-Initiating Activity Of Human Acute MyeloidLeukemia In NSG Mice,”PLoS One.8(4):e60680)。给动物施用对照媒介(100μl磷酸缓冲盐水(PBS)/动物，q3d x 2周)、上述优选的CD32B xCD79b Fc双抗体(100μl/动物，q3d x 2周)或CD32B xCD79b双抗体(仅由两条多肽链构成，并且含有白蛋白结合结构域)。在第7天和第14天，如通过ELISA检测血浆中人类IgM(图6A)或人类IgG(图6B)的存在，两者都指示移植物抗宿主病的发作。

接受对照媒介的小鼠表现出高水平的人类IgM和人类IgG。相比之下，在接受上述优选的CD32B xCD79b Fc双抗体的小鼠中，基本上未检测到这类抗体(图6A和图6B)。已接受CD32B xCD79b双抗体的小鼠，与接受对照媒介的小鼠相比，表现出人类IgM和人类IgG水平减少，但是这类水平基本上高于接受CD32B xCD79b Fc双抗体的水平。这些发现证明，双特异性单价CD32B xCD79b双抗体具有治疗用途和效力，但是本发明的上述优选的CD32BxCD79b Fc双抗体出人意外地优于这类非Fc双抗体，并且具有甚至更强的治疗用途和效力(图6A和图6B)。

实施例6：CD32B xCD79b双特异性单价Fc双抗体降低小鼠中的异源GvHD

为了进一步证明本发明的CD32B xCD79b Fc双抗体阻碍或抑制B细胞的免疫系统信号传导的能力，将人类PBMC(5x10⁶个细胞，静脉内注射)注射到免疫缺陷NOD.scid IL2rγ空(null)NSG小鼠中。给动物施用对照媒介(100μl磷酸缓冲盐水(PBS)/动物)、上述优选的CD32B xCD79b Fc双抗体(5mg/kg或10mg/kg)或抗CD20抗体(利妥昔单抗(rituximab)；5mg/kg；按剂量给药一次)。随时间测定小鼠的累积存活率。如图7所示，相对于接受PCS对照或利妥昔单抗的小鼠，接受任一剂量的CD32B xCD79b Fc双抗体的动物表现出显著增强的存活率。

通过引用将本说明书提到的所有出版物和专利并入本文中，并入的程度如同具体且单独指出通过引用以其整体并入每一个体出版物或专利申请。尽管结合具体实施方案已经描述了本发明，但是应当理解到，通常遵循本发明的原理，可对其进行进一步修饰，且本申请意图涵盖本发明的任意变型、用途或适应性变化，并包括属于本发明所属领域的已知的或惯常的实践的、与本公开内容的这类偏离，并且可以应用于本文所示的基本特征。

优选的实施方式：

1.双特异性单价Fc双抗体，其中所述双特异性单价Fc双抗体能特异性结合CD32B的表位和结合CD79b的表位，并且具有IgG Fc结构域，其中所述双特异性单价Fc双抗体包含第一多肽链、第二多肽链以及第三多肽链，其中所述第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合，且所述第一多肽链和第三多肽链彼此共价键合，且其中：

A.所述第一多肽链在N末端到C末端的方向上包含：

i.结构域1，包含：

(1)亚结构域(1A)，其包含含有半胱氨酸的肽(SEQ ID NO:1)；和

(2)亚结构域(1B)，其包含具有IgG免疫球蛋白Fc区的CH2和CH3结构域的IgG Fc结构域的多肽部分；

ii.结构域2，包含：

(1)亚结构域(2A)，其包含能结合CD32B的单克隆抗体的VL结构域(VL_CD32B)(SEQ IDNO:11)；和

其中所述亚结构域(2A)和(2B)彼此被肽连接体(连接体2)(SEQ ID NO:4)隔开；

iii.结构域3，其中所述结构域3是E螺旋结构域(SEQ ID NO:7)或K-螺旋结构域(SEQ ID NO:8)，其中所述结构域3与所述结构域2被肽连接体(SEQ ID NO:5)隔开；以及

iv.C末端间隔肽(SEQ ID NO:6)；

B.所述第二多肽链在N末端到C末端的方向上包含：

i.结构域1，包含：

其中所述亚结构域(1A)和(1B)彼此被肽连接体(连接体2)(SEQ ID NO:4)隔开；

ii.结构域2，其中所述结构域2是K螺旋结构域(SEQ ID NO:8)或E螺旋结构域(SEQID NO:7)，其中所述结构域2与所述结构域1被肽连接体(SEQ ID NO:5)隔开；且其中所述第一多肽链的所述结构域3和所述第二多肽链的所述结构域2不都是E螺旋结构域或不都是K螺旋结构域；以及

C.所述第三多肽链在N末端到C末端的方向上包含结构域1，所述结构域1包含：

(1)亚结构域(1A)，其包含含有半胱氨酸的肽(SEQ ID NO:1)；以及

以及其中：

(a)所述第一多肽链和第三多肽链的IgG Fc结构域的所述多肽部分形成所述IgGFc结构域；

(b)所述第一多肽链的所述VL结构域和所述第二多肽链的所述VH结构域形成能特异性结合CD32B的表位的抗原结合结构域；以及

(c)所述第一多肽链的所述VH结构域和所述第二多肽链的所述VL结构域形成能特异性结合CD79b的表位的抗原结合结构域。

2.如项目1所述的双特异性单价Fc双抗体，其中所述第一多肽链的所述亚结构域(1B)包含不同于所述第三多肽链的所述亚结构域(1B)的序列。

3.如项目1所述的双特异性单价Fc双抗体，其中所述第一多肽链的所述亚结构域(1B)具有氨基酸序列SEQ ID NO:9，且所述第三多肽链的所述亚结构域(1B)具有氨基酸序列SEQ ID NO:10。

4.如项目1所述的双特异性单价Fc双抗体，其中所述第一多肽链的所述亚结构域(1B)具有氨基酸序列SEQ ID NO:10，且所述第三多肽链的所述亚结构域(1B)具有氨基酸序列SEQ ID NO:9。

5.如项目1-2中任一项所述的双特异性单价Fc双抗体，其中所述第一多肽链的所述结构域1和/或所述第三多肽链的所述结构域1包含变异的CH2-CH3序列，所述变异的CH2-CH3序列表现出与Fcγ受体的改变的结合。

6.如项目1-5中任一项所述的双特异性单价Fc双抗体，其中所述第一多肽链的所述结构域3包含E螺旋(SEQ ID NO:7)，且所述第二多肽链的所述结构域2包含K螺旋(SEQ IDNO:8)。

7.如项目1-5中任一项所述的双特异性单价Fc双抗体，其中所述第一多肽链的所述结构域3包含K螺旋(SEQ ID NO:8)，且所述第二多肽链的所述结构域2包含E螺旋(SEQ IDNO:7)。

8.双特异性单价Fc双抗体，其中所述双特异性单价Fc双抗体能特异性结合CD32B的表位和结合CD79b的表位，并具有IgG Fc结构域，其中所述双特异性单价Fc双抗体包含：

(1)具有氨基酸序列SEQ ID NO:15的第一多肽链；

(2)具有氨基酸序列SEQ ID NO:16的第二多肽链；以及

其中所述第一多肽链和所述第二多肽链通过第一二硫键彼此共价键合，且所述第一多肽链和第三多肽链通过第二二硫键彼此共价键合。

9.药物组合物，其包含项目1-8中任一项所述的双特异性单价Fc双抗体和生理上可接受的载体。

10.项目9所述的药物组合物在治疗炎性疾病或疾病状况中的用途。

11.如项目10所述的用途，其中所述炎性疾病或疾病状况是自体免疫病。

12.如项目10所述的用途，其中所述自体免疫病是系统性红斑狼疮(SLE)。

13.如项目9所述的用途，其中所述炎性疾病或疾病状况是移植物抗宿主病(GvHD)。

序列表

<110> 宏观基因股份有限公司

L•S•约翰逊

黄玲

K•沙哈

E•本维尼

P•摩尔

陈蔚

<120> 能结合CD32B和CD79b的双特异性单价Fc双抗体及其用途

<130> 1301.0110PCT

<150> US 61/864,217

<151> 2013-08-09

<150> US 61/866,416

<151> 2013-08-15

<150> US 61/869,519

<151> 2013-08-23

<150> US 61/907,525

<151> 2013-11-22

<160> 25

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ala Pro Ser Ser Ser

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体2

<400> 4

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体3

<400> 5

Gly Gly Cys Gly Gly Gly

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体4

<400> 6

Gly Gly Gly Asn Ser

1 5

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 促进异源二聚体的E螺旋结构域

<400> 7

Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val

1 5 10 15

Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys

20 25

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 促进异源二聚体的K螺旋结构域

<400> 8

Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val

1 5 10 15

Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu

20 25

<210> 9

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 存在于第一多肽链中的抗体Fc区的CH2和CH3结构域的优选序列

<400> 9

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 10

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 存在于第三多肽链中的抗体Fc区的CH2和CH3结构域的优选序列

<400> 10

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体的结合CD32B的VL结构域的优选序列

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体的结合CD32B的VH结构域的优选序列

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体的结合CD79b的VL结构域的优选序列

<400> 13

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体的结合CD79b的VH结构域的优选序列

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 15

<211> 502

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一多肽链的优选序列

<400> 15

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu Asp Ile Gln Met Thr

225 230 235 240

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

245 250 255

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln

260 265 270

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr

275 280 285

Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr

290 295 300

Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

305 310 315 320

Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly

325 330 335

Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val

340 345 350

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val

355 360 365

Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met

370 375 380

Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met

385 390 395 400

Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

405 410 415

Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

420 425 430

Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

435 440 445

Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

450 455 460

Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala

465 470 475 480

Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu

485 490 495

Lys Gly Gly Gly Asn Ser

500

<210> 16

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二多肽链的优选序列

<400> 16

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

130 135 140

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys

165 170 175

Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp

210 215 220

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly

225 230 235 240

Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu

245 250 255

Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu

260 265 270

<210> 17

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第三多肽链的优选序列

<400> 17

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 18

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接体5

<400> 18

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 19

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 优选的白蛋白结合结构域(ABD)

<400> 19

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu

20 25 30

Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro

35 40 45

<210> 20

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD32B x CD79b (ABD)双抗体第一多肽链的氨基酸序列

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

130 135 140

Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

145 150 155 160

Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn

165 170 175

Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

180 185 190

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

195 200 205

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

210 215 220

Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu

225 230 235 240

Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu

245 250 255

Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val

260 265 270

Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys

275 280 285

Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile

290 295 300

Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro

305 310

<210> 21

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD32B x CD79b(ABD)双抗体第二多肽链的氨基酸序列

<400> 21

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Asn Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

130 135 140

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Lys

165 170 175

Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ala Leu Gly Leu Asp

210 215 220

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly

225 230 235 240

Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu

245 250 255

Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu

260 265 270

<210> 22

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD32B x CD79b双抗体第一多肽链的氨基酸序列

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

130 135 140

Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

145 150 155 160

Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn

165 170 175

Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser

180 185 190

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

195 200 205

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

210 215 220

Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu

225 230 235 240

Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu

245 250 255

Val Ala Ala Leu Glu Lys

260

<210> 23

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码多肽链SEQ ID NO:15的优选多核苷酸

<400> 23

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420

aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa agccccttcc agctccccta tggaagacat ccagatgacc 720

cagtctccat cctccttatc tgcctctgtg ggagatagag tcaccatcac ttgtcgggca 780

agtcaggaaa ttagtggtta cttaagctgg ctgcagcaga aaccaggcaa ggcccctaga 840

cgcctgatct acgccgcatc cactttagat tctggtgtcc catccaggtt cagtggcagt 900

gagtctggga ccgagttcac cctcaccatc agcagccttc agcctgaaga ttttgcaacc 960

tattactgtc tacaatattt tagttatccg ctcacgttcg gaggggggac caaggtggaa 1020

ataaaaggag gcggatccgg cggcggaggc caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag 1080

gtgaagaagc ctggcgcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc 1140

agctactgga tgaactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatcggaatg 1200

attgatcctt cagacagtga aactcactac aatcaaaagt tcaaggacag agtcaccatg 1260

accacagaca catccacgag cacagcctac atggagctga ggagcctgag atctgacgac 1320

acggccgtgt attactgtgc gagagctatg ggctactggg ggcaagggac cacggtcacc 1380

gtctcctccg gaggatgtgg cggtggagaa gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct 1440

ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg 1500

aactct 1506

<210> 24

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码多肽链SEQ ID NO:16的优选多核苷酸

<400> 24

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60

atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120

tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac cgcctaattt atctggtgtc taaactggac 180

tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240

agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300

ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg cggcggaggc 360

gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgagactc 420

tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc 480

ccaggcaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca 540

tactatgctg agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600

ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta ctgtggggct 660

ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg tctcctccgg aggatgtggc 720

ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca 780

cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag 810

<210> 25

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码多肽链SEQ ID NO:17的优选多核苷酸

<400> 25

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420

aaccaggtca gcctgagttg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcgt cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa a 681

Claims

1.一种双特异性单价Fc双抗体在制备用于治疗炎性疾病或疾病状况的药物中的用途，

其中所述双特异性单价Fc双抗体以至少5μg，更优选至少10μg、至少15μg、至少25μg、至少50μg、至少100μg或至少200μg的单位剂型提供，

其中所述双特异性单价Fc双抗体能特异性结合CD32B的表位和结合CD79b的表位，并且具有IgG Fc结构域，其中所述双特异性单价Fc双抗体包含第一多肽链、第二多肽链以及第三多肽链，其中所述第一多肽链和第二多肽链彼此共价键合，且所述第一多肽链和第三多肽链彼此共价键合，且其中：

A.所述第一多肽链在N末端到C末端的方向上包含：

i.结构域1，包含：

(1)亚结构域1A，其为含有半胱氨酸的肽且所述含有半胱氨酸的肽的氨基酸序列为SEQID NO:1；和

(2)亚结构域1B，其为具有IgG免疫球蛋白Fc区的CH2和CH3结构域的IgG Fc结构域的多肽部分；

ii.结构域2，包含：

(1)亚结构域2A，其为能结合CD32B的单克隆抗体的VL结构域且所述VL结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；和

(2)亚结构域2B，其为能结合CD79b的单克隆抗体的VH结构域且所述VH结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:14，

其中所述亚结构域2A和2B彼此被肽连接体隔开且所述肽连接体的氨基酸序列为SEQID NO:4；

iii.结构域3，其中所述结构域3是E螺旋结构域且所述E螺旋结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，或K-螺旋结构域且所述K-螺旋结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，其中所述结构域3与所述结构域2被肽连接体隔开且所述肽连接体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；以及

iv.C末端间隔肽且所述C末端间隔肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:6；

B.所述第二多肽链在N末端到C末端的方向上包含：

i.结构域1，包含：

(1)亚结构域1A，其为能结合CD79b的单克隆抗体的VL结构域，且所述VL结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；和

(2)亚结构域1B，其为能结合CD32B的单克隆抗体的VH结构域，且所述VH结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；

其中所述亚结构域1A和1B彼此被肽连接体隔开且所述肽连接体的氨基酸序列为SEQID NO:4；

ii.结构域2，其中所述结构域2是K螺旋结构域且所述K螺旋结构域的氨基酸序列为SEQID NO:8，或E螺旋结构域且所述E螺旋结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，其中所述结构域2与所述结构域1被肽连接体隔开且所述肽连接体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；且其中所述第一多肽链的所述结构域3和所述第二多肽链的所述结构域2不都是E螺旋结构域且不都是K螺旋结构域；以及

(1)亚结构域1A，其为含有半胱氨酸的肽，且所述含有半胱氨酸的肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；以及

以及其中：

(a)所述第一多肽链和第三多肽链的IgG Fc结构域的所述多肽部分形成所述IgG Fc结构域；

2.如权利要求1所述的用途，其中所述第一多肽链的所述亚结构域1B包含不同于所述第三多肽链的所述亚结构域1B的序列。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述第一多肽链的所述亚结构域1B的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，且所述第三多肽链的所述亚结构域1B的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述第一多肽链的所述亚结构域1B的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，且所述第三多肽链的所述亚结构域1B的氨基酸序列为SEQ ID NO:9。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述第一多肽链的所述结构域1和/或所述第三多肽链的所述结构域1包含变异的CH2-CH3序列，所述变异的CH2-CH3序列表现出与Fcγ受体的改变的结合。

6.如权利要求2所述的用途，其中所述第一多肽链的所述结构域1和/或所述第三多肽链的所述结构域1包含变异的CH2-CH3序列，所述变异的CH2-CH3序列表现出与Fcγ受体的改变的结合。

7.如权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述第一多肽链的所述结构域3包含E螺旋且所述E螺旋的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，且所述第二多肽链的所述结构域2包含K螺旋且所述K螺旋的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

8.如权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述第一多肽链的所述结构域3包含K螺旋且所述K螺旋的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，且所述第二多肽链的所述结构域2包含E螺旋且所述E螺旋的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。

9.一种双特异性单价Fc双抗体在制备用于治疗炎性疾病或疾病状况的药物中的用途，

其中所述双特异性单价Fc双抗体能特异性结合CD32B的表位和结合CD79b的表位，并具有IgG Fc结构域，其中所述双特异性单价Fc双抗体包含：

(1)第一多肽链且所述第一多肽链的氨基酸序列为SEQ ID NO:15；

(2)第二多肽链且所述第二多肽链的氨基酸序列为SEQ ID NO:16；以及

(3)第三多肽链且所述第三多肽链的氨基酸序列为SEQ ID NO:17，其中所述第三多肽链的氨基酸残基1-10是肽1且所述肽1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，且所述第三多肽链的氨基酸残基11-227是IgG抗体Fc区的CH2和CH3结构域，且所述CH2和CH3结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；

10.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中以患者体重的至少约0.01μg/kg、至少约0.05μg/kg、至少约0.1μg/kg、至少约0.2μg/kg、至少约0.5μg/kg、至少约1μg/kg、至少约2μg/kg、至少约5μg/kg、至少约10μg/kg、至少约20μg/kg、至少约50μg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约30mg/kg、至少约50mg/kg、至少约75mg/kg、至少约100mg/kg、至少约125mg/kg、至少约150mg/kg或更多向患者施用所述单位剂型。

11.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中一周一次，一周两次，每两周一次，一月一次，每六周一次，每两月一次，一年两次或一年一次施用所述单位剂型。

12.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述炎性疾病或疾病状况是自体免疫病。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述自体免疫病是系统性红斑狼疮。

14.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述炎性疾病或疾病状况是移植物抗宿主病。