CN112763598A - Hplc法分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法 - Google Patents

Hplc法分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法 Download PDF

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CN112763598A CN202011542215.8A CN202011542215A CN112763598A CN 112763598 A CN112763598 A CN 112763598A CN 202011542215 A CN202011542215 A CN 202011542215A CN 112763598 A CN112763598 A CN 112763598A
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Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及HPLC法分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法，采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液和乙腈为A流动相，乙腈和甲醇混合液为B流动相，进行梯度洗脱，进入检测器进行检测。本发明可以有效地将噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质分开，且该方法具有很高的灵敏度及分离度，重复性及耐用性好，操作简单，结果稳定可靠，对于实现噁拉戈利钠中间体质量控制具有极其重要的意义。

Description

HPLC法分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，尤其是一种分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法。
背景技术
噁拉戈利钠为是一种GnRH受体拮抗剂，通过与脑垂体中的GnRH受体竞争性结合来抑制内源性GnRH信号传导，噁拉戈利钠给药导致黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的剂量依赖性抑制，导致卵巢性激素，雌二醇和黄体酮的血液浓度降低，临床适用于治疗与子宫内膜异位症相关的中度至重度疼痛。
目前由于噁拉戈利上市不久，其质量标准还未收录于最新版美国药典中，相关分析方法报道比较少。专利CN110501446公开了一种噁拉戈利钠原料及其合成中间体的分析方法，对原料药和4个起始物料以及3个中间体进行了检测，但是该分析方法未考虑原料带入的杂质和工艺过程中产生的杂质，远不能满足实际生产过程中质量控制的需求。
通常来说，一种药物杂质总含量应小于1.0％，单个杂质含量应小于0.1％，对于制备噁拉戈利钠过程中产生的杂质或引入的有关物质，不论是在原料药还是制剂中均需要进行严格控制。5-(2-氟-3-甲氧基苯基)-1-(2-氟-6-(三氟甲基)苄基)-6-甲基嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮为噁拉戈利钠的关键中间体，该化合物的质量控制对高质量的噁拉戈利钠原料药制备起到重要的作用，所以开发一种高效且精确的分析方法，对噁拉戈利钠关键中间体进行质量分析，对后续制备高纯度的噁拉戈利钠有着重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种HPLC法分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法；本发明的方法可以有效的将噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质分开，且该方法具有很高的灵敏度及分离度，重复性及耐用性良好，操作简单，结果稳定可靠。
为实现上述目的，本申请人经过大量的试验，确定了本发明的技术方案为：
HPLC法分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法，所述方法采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M中的一种或者多种，具体结构式如下所示：
Figure BDA0002849271870000011
Figure BDA0002849271870000021
所述流动相A为磷酸盐缓冲液与有机溶剂的混合溶剂，所述流动相B为有机溶剂。
所述噁拉戈利钠关键中间体为5-(2-氟-3-甲氧基苯基)-1-(2-氟-6-(三氟甲基)苄基)-6-甲基嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮，是合成噁拉戈利钠的关键中间体，其化学式为C20H15F5N2O3，结构式如式(Ⅰ)如下：
Figure BDA0002849271870000022
本发明中，“噁拉戈利钠的关键中间体”又称为“式Ⅰ化合物”；式Ⅰ化合物可以以1-(2-氟-6-(三氟甲基)苄基)脲为原料，通过以下制备方法得到：
Figure BDA0002849271870000031
进一步，所述流动相A为磷酸盐缓冲液与-乙腈体积比为95:5；
所述磷酸盐缓冲液是15～25mmol/L的磷酸氢二钾水溶液，磷酸氢二钾水溶液用磷酸调节pH值至5.6-6.0；优选磷酸氢二钾水溶液用磷酸调节pH值5.8；
作为一种优选，所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐浓度为18～22mmol/L；
作为一种优选，所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐浓度为18mmol/L；
进一步，所述流动相B为乙腈、乙醇和甲醇的一种或多种；
进一步，所述流动相B为乙腈和甲醇的混合溶液；
进一步，所述流动相B为乙腈和甲醇体积比为92～98:2～8的混合溶液；优选乙腈和甲醇体积比为95:5的混合溶液。
进一步，所述梯度洗脱设置如下：
Figure BDA0002849271870000032
所述流动相进行洗脱的流速为0.7-1.3ml/min；
作为一种优选，所述梯度洗脱设置如下：
Figure BDA0002849271870000033
所述流动相进行洗脱的流速为1.0ml/min。
进一步，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的填料颗粒粒径为2-5μm；所述色谱柱的柱温为25-35℃。
作为一种优选，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的填料颗粒粒径为3.5μm；所述色谱柱的柱温为30℃。
进一步，所述检测器的检测波长为210±2nm。
作为一种优选，所述检测器的检测波长为210nm。
进一步，HPLC法分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法，所述相关杂质为杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，具体包括以下步骤：
1)配制供试品溶液：取供试样品溶于稀释剂中，制成每1ml中约含1mg的溶液，得供试品溶液；
2)配制对照溶液：取供试品溶液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含1μg的溶液，作为对照溶液。
3)配制系统适用性溶液：取噁拉戈利钠关键中间体及其杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M，用稀释剂溶解稀释制成系统适用性溶液；
4)取步骤3)所述系统适用性溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定噁拉戈利钠关键中间体及其杂质的保留时间，再分别取步骤1)所述供试品溶液和步骤2)所述对照溶液进样，按主成分自身对照法计算供试品溶液中噁拉戈利钠关键中间体中杂质的含量。
5)噁拉戈利钠关键中间体及其杂质杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M的线性相关系数如下表所示：
名称 浓度范围(μg/ml) 线性方程 相关系数(r)
式I化合物 0.0510～5.1030 y＝78.3824x+0.2480 0.9999
杂质A 0.2096～5.2398 y＝35.9701x-1.5910 0.9999
杂质B 0.0451～4.5079 y＝73.4965x-1.1344 0.9999
杂质C 0.0532～5.3195 y＝35.9677x+0.1179 0.9999
杂质D 0.0518～5.1807 y＝40.8203x+0.2410 0.9999
杂质E 0.0306～5.1045 y＝55.8647x+0.8746 0.9999
杂质F 0.0307～5.1146 y＝61.1244x+0.6686 0.9999
杂质G 0.0851～5.3218 y＝45.5931x+0.5931 0.9999
杂质H 0.2264～5.6594 y＝26.4118x+0.1322 0.9999
杂质I 0.0547～5.4720 y＝78.1262x+1.3087 0.9999
杂质J 0.0516～5.1559 y＝78.8802x-0.2530 0.9999
杂质K 0.0511～5.1131 y＝83.3316x-0.0923 0.9999
杂质L 0.0103～5.1385 y＝202.7332x+1.8443 0.9999
杂质M 0.0813～5.0836 y＝28.5971x+0.1438 0.9999
进一步，所述稀释剂为乙腈-水(体积70：30)的溶液。
本发明的目的之二在于提供一种于固液分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其杂质的试剂组合物，由以下试剂组成：
试剂A：磷酸盐缓冲液与有机溶剂的混合溶剂；
试剂B：有机溶剂；
所述相关杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M的一种或多种；
所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐浓度为15～25mmol/L；所述有机溶剂为乙腈、乙醇和甲醇的混合液。
作为一种优选，所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐浓度为18mmol/L；所述有机溶剂为乙腈和甲醇(95:5)的混合溶液。
本发明提供的用于固液分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其杂质的试剂组合物能有效分离噁拉戈利钠关键中间体及其杂质，对于实现噁拉戈利钠关键中间体及噁拉戈利钠质量控制具有极其重要的意义。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种HPLC法分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法，本发明的方法可以有效的将噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质分开，且该方法具有很高的灵敏度及分离度，重复性及耐用性良好，操作简单，结果稳定可靠。
2)经研究发现，该式I关键中间体的杂质J、杂质I、杂质K和该关键中间体结构非常接近，若是在这一步不控制，继续反应带入到原料药中就很难除去，所以在这一步反应中需要严格监控各个杂质，即本发明中噁拉戈利钠关键中间体的分析研究对合成反应的控制及质量的提高起着至关重要的作用，也直接影响噁拉戈利钠成品的质量，所以该方法对于实现噁拉戈利钠关键中间体及噁拉戈利钠质量控制具有极其重要的意义。
附图说明
图1本发明实施例条件下系统适用性溶液色谱图，出峰顺序依次为保留时间Rt4.343为杂质A、Rt6.246为杂质B、Rt7.764为杂质C、Rt8.135为杂质D、Rt9.677为杂质E、Rt10.786为杂质F、Rt16.487为杂质G、Rt20.074为杂质H、Rt24.485为式I化合物、Rt25.715为杂质I、Rt29.922为杂质J、Rt30.93为杂质K、Rt33.961为杂质L、Rt34.815为杂质M；
图2对照例1条件下系统适用性溶液色谱图；
图3对照例2条件下系统适用性溶液色谱图；
图4对照例3条件下系统适用性溶液色谱图；
图5对照例4条件下系统适用性溶液色谱图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。本实施例中的噁拉戈利钠关键中间体指的是式I化合物。
本发明中的化合物除了杂质J、杂质I、杂质K和杂质F外，均可以从外面购买得到。杂质J、杂质I、杂质K和杂质F合成方法如下：
制备例一5-(2-氟-3-甲氧基苯基)-6-甲基-1-(2-(三氟甲基)苄基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(杂质J)的合成
向500ml三口瓶中加入30.0g 5-碘-6-甲基-1-(2-三氟甲基苄基)-吡啶-2,4(1H,3H)-二酮，15.7g 2-氟-3-甲氧基苯硼酸，105ml丙酮，降温到0～15℃。然后滴加氢氧化钾水溶液(15.7g/175ml)，滴毕，搅拌约30min，用N2置换反应器3次，加入85mg二叔丁基膦二茂铁二氯化钯Pd(dtbpf)Cl2，将反应升温至约55℃，保温搅拌至LCMS检测反应完全。将反应液降至室温，加入4.2g硅藻土，搅拌45min,过滤，滤饼用丙酮/水/氢氧化钾(11ml/32ml/1.6g)淋洗并抽干。向滤液中滴入THF/乙醇/H2O(63ml/32ml/21ml)，滴毕,将反应升温至60℃，保温搅拌0.5h，将反应液降至室温，滤饼用90ml水/60ml甲醇淋洗并抽干，滤饼升温至50℃，真空烘干得28.85g类白色固体，该化合物经过核磁、LCMS、红外、紫外等检测，确定其结构符合其特征，其中LC-MS[M+H]+：m/z＝409。
制备例二1-(2-氟-6-(三氟甲基)苄基)-5-(3-甲氧基苯基)-6-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(杂质I)的制备
向500ml三口瓶中加入36.0g 1-(2-氟-6-(三氟甲基苄基)-5-碘-6-甲基吡啶-2,4(1H,3H)-二酮，16.2g间甲氧基苯硼酸，125ml丙酮，降温到0～15℃。然后滴加氢氧化钾水溶液(18.0g/200ml)，滴毕搅拌30min，用N2置换反应3次，加入0.11g二叔丁基膦二茂铁二氯化钯Pd(dtbpf)Cl2，将反应升温至约55℃，保温搅拌至LCMS检测反应完全。将反应液降至室温，加入3.3g硅藻土，搅拌0.5h,过滤，滤饼用丙酮/水/氢氧化钾(13ml/38ml/1.9g)淋洗并抽干。向滤液中滴入THF/乙醇/H2O(75ml/38ml/25ml)，滴毕,将反应升温至60℃，保温搅拌0.5h，将反应液降至室温，过滤后，滤饼真空烘干得32.0g类白色固体。该化合物经过核磁、LCMS、红外、紫外等检测，确定其结构符合其特征，其中LC-MS[M+H]+：409。
制备例三5-(3-甲氧基苯基)-6-甲基-1-(2-(三氟甲基)苄基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(杂质K)的制备
向500ml三口瓶中加入30.0g 5-碘-6-甲基-1-(2-三氟甲基苄基)-吡啶-2,4(1H,3H)-二酮，14.1g间甲氧基苯硼酸，105ml丙酮，搅拌，降温到0～15℃。然后滴加氢氧化钾水溶液(15.6g/175ml水)，滴毕，搅拌约30min，用N2置换反应器3次，加入86mg二叔丁基膦二茂铁二氯化钯Pd(dtbpf)Cl2，将反应升温至约55℃，保温搅拌至LCMS检测反应完全。将反应液降至室温，加入4.2g硅藻土，搅拌45min,过滤，滤饼用丙酮/水/氢氧化钾(11ml/32ml/1.6g)淋洗并抽干。向滤液中滴入THF/乙醇/H2O(63ml/32ml/21ml)，滴毕,将反应升温至60℃，保温搅拌0.5h，让反应液自然降至室温，过滤，滤饼用90ml水/60ml甲醇淋洗并抽干，滤饼升温至50℃，真空烘干得26.7g类白色固体。该化合物经过核磁、LCMS、红外、紫外等检测，确定其结构符合其特征，其中LCMS[M+H]+m/z＝391。
制备例四6-甲基-1-(2-(三氟甲基)苄基)嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮(杂质F)的制备
向1L三口瓶中加入48.1g 1-(2-三氟甲基)苄基脲、395mL乙腈、46.3g NaI，搅拌，将反应液降温至0～15℃，依次滴加25.5g二乙烯酮、35.9g三甲基氯硅烷，保温反应30min后，自然升温至室温过夜，降温至0～15℃，滴加600mL水，滴加完毕，搅拌过夜，降温至0～10℃，析晶，过滤，滤饼真空干燥至恒重，得到53.4g类白色固体，
该化合物经过核磁、LCMS、红外、紫外等检测，确定其结构符合其特征，其中LC-MS[M+H+ACN]+m/z＝326、[M+H]+m/z＝285。
实施例一
1色谱条件：
色谱柱：Waters Symmetry C18，150mm×4.6mm，3.5μm，流动相A：18mmol/L磷酸盐缓冲液溶液(用磷酸调节pH值至5.8)-乙腈(体积比95:5)，流动相B：乙腈和甲醇(体积比为95:5)，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下：
Figure BDA0002849271870000061
流速：1ml/min，柱温：30℃，检测波长：210nm，进样体积：20μl。
2方法与结果
2.1溶液配制
取噁拉戈利钠关键中间体适量，精密称定，加乙腈-水(体积比70:30)溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含1μg的溶液，作为对照溶液。
2.2专属性
取噁拉戈利钠关键中间体和杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M各适量，精密称定，置同一量瓶中，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml含式I化合物约1mg及各杂质均约为5μg的溶液，作为系统适用性溶液。精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，系统适用性溶液结果见图2。系统适用性溶液中，噁拉戈利钠关键中间体与相邻杂质峰的分离度为2.4，保留时间Rt为24.485。
2.3精密度
取噁拉戈利钠关键中间体约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；精密移取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，再移取1ml置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，作为对照溶液。精密量取上述供试品溶液、对照溶液进样，记录色谱图。按加校正因子的主成分自身对照法计算6份供试品溶液中各有关物质含量的RSD。6份供试品溶液中检出有关杂质结果均为0.04％，RSD为0％，小于3.0％，符合高效液相色谱法对有关物质检测的要求。
2.4线性和范围
取噁拉戈利钠关键中间体及其杂质对照品适量，加稀释剂溶解并稀释制成浓度均为20μg/ml的溶液，作为线性储备液。分别移取储备液0.5ml置20ml、1ml置25ml、1ml置20ml、3ml置50ml、3ml置20ml量瓶中，5ml置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，作为线性供试液。以峰面积对浓度进行线性回归，得线性方程(表1)，噁拉戈利钠关键中间体及其杂质在线性范围内具有良好的线性关系。
表2线性测定结果
名称 浓度范围(μg/ml) 线性方程 相关系数(r)
式I化合物 0.0510～5.1030 y＝78.3824x+0.2480 0.9999
杂质A 0.2096～5.2398 y＝35.9701x-1.5910 0.9999
杂质B 0.0451～4.5079 y＝73.4965x-1.1344 0.9999
杂质C 0.0532～5.3195 y＝35.9677x+0.1179 0.9999
杂质D 0.0518～5.1807 y＝40.8203x+0.2410 0.9999
杂质E 0.0306～5.1045 y＝55.8647x+0.8746 0.9999
杂质F 0.0307～5.1146 y＝61.1244x+0.6686 0.9999
杂质G 0.0851～5.3218 y＝45.5931x+0.5931 0.9999
杂质H 0.2264～5.6594 y＝26.4118x+0.1322 0.9999
杂质I 0.0547～5.4720 y＝78.1262x+1.3087 0.9999
杂质J 0.0516～5.1559 y＝78.8802x-0.2530 0.9999
杂质K 0.0511～5.1131 y＝83.3316x-0.0923 0.9999
杂质L 0.0103～5.1385 y＝202.7332x+1.8443 0.9999
杂质M 0.0813～5.0836 y＝28.5971x+0.1438 0.9999
2.5定量限和检测限
取噁拉戈利钠关键中间体及其杂质对照品适量，配制成一系列的溶液，S/N≥10时，作为定量限溶液，S/N≥3时，作为检测限溶液。噁拉戈利钠关键中间体及其杂质的定量限和检测限结果见表2.
表2定量限和检测限结果
Figure BDA0002849271870000071
Figure BDA0002849271870000081
3结论：
在该色谱条件下，噁拉戈利钠关键中间体及其杂质可以完全分离，该方法专属性强、准确度好、精密度高、重复性好、系统适用性好，符合药物质量研究标准的技术要求，所得结果稳定可靠。
对照例1：
1色谱条件：
色谱柱：Waters Symmetry C18，150mm×4.6mm，3.5μm，流动相A：20mmol/L磷酸盐缓冲液溶液(用磷酸调节pH值至6.0)-乙腈(95:5)，流动相B：乙腈，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下：
Figure BDA0002849271870000082
2方法同实施例一，系统适用性溶液色谱图2。
3结论：在该色谱条件下，保留时间Rt 24.396的杂质I与Rt 23.521的式I化合物未完全分离，影响杂质I的定量结果与定性判断。
对照例2：
1色谱条件：
色谱柱：Waters Symmetry C18，150mm×4.6mm，3.5μm，流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液，流动相B：乙腈，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下：
Figure BDA0002849271870000083
2方法同实施例一，系统适用性溶液色谱图见图3。
3结论：在该色谱条件下，保留时间Rt 24.260分钟的杂质I与Rt 24.000分钟的式I化合物未完全分离，影响杂质的定量结果与定性判断。
对照例3：
1色谱条件：
色谱柱：Waters Symmetry C18，250mm×4.6mm，5μm，流动相A：0.1％磷酸水溶液，流动相B：乙腈，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下：
Figure BDA0002849271870000091
2方法同实施例一，系统适用性溶液色谱图见图4。
3结果：保留时间Rt 27.783峰为式I化合物与杂质I重叠峰，Rt 29.452的峰为杂质J与杂质K重叠峰。影响杂质的定量结果与定性判断。
对照例4：
1色谱条件：
色谱柱：Waters Symmetry C18，150mm×4.6mm，3.5μm，流动相A：20mmol/L磷酸盐缓冲液溶液(用磷酸调节pH值至6.0)，流动相B：乙腈，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下：
Figure BDA0002849271870000092
2方法同实施例一，系统适用性溶液色谱图见图5。
3结果：保留时间Rt 18.924的式I化合物与Rt 19.572的杂质I未能基线分离，Rt15.557的杂质H与其他杂质未分离开。影响杂质的定量结果与定性判断。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.HPLC法分离测定噁拉戈利钠关键中间体及其相关杂质的方法，所述方法采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述相关杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M中的一种或者多种，具体结构式如下所示：
Figure FDA0002849271860000011
Figure FDA0002849271860000021
所述流动相A为pH5.8磷酸盐缓冲液-乙腈体积比为95:5的混合液，所述流动相B为乙腈和甲醇的混合液，其中所述乙腈和甲醇体积比为92～98:2～8；
所述噁拉戈利钠关键中间体为5-(2-氟-3-甲氧基苯基)-1-(2-氟-6-(三氟甲基)苄基)-6-甲基嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮，是合成噁拉戈利钠的关键中间体，其化学式为C20H15F5N2O3，结构式如式(Ⅰ)如下：
Figure FDA0002849271860000022
所述梯度洗脱设置如下：
Figure FDA0002849271860000023
所述流动相进行洗脱的流速为0.7-1.3ml/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为18～22mmol/L磷酸氢二钾水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B为乙腈和甲醇体积比为95:5的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱设置如下：
Figure FDA0002849271860000024
Figure FDA0002849271860000031
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的填料颗粒粒径为2-5μm；所述色谱柱的柱温为25-35℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测器的检测波长为210±2nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相关杂质为杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M对照品，具体包括以下步骤：
1)配制供试品溶液：取供试样品溶于稀释剂中，制成每1ml中约含1mg的溶液，得供试品溶液；
2)配制对照溶液：取供试品溶液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含1μg的溶液，作为对照溶液。
3)配制系统适用性溶液：取噁拉戈利钠关键中间体及其杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M，用稀释剂溶解稀释制成系统适用性溶液；
4)取步骤3)所述系统适用性溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定噁拉戈利钠关键中间体及其杂质的保留时间，再分别取步骤1)所述供试品溶液和步骤2)所述对照溶液进样，按主成分自身对照法计算供试品溶液中噁拉戈利钠关键中间体中杂质的含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为乙腈-水体积比为70:30的溶液。
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