CN108732276B - 马昔腾坦有关物质的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马昔腾坦有关物质的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相C18柱，以8～12mmol/L磷酸二氢钾水溶液‑乙腈为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；其中磷酸二氢钾水溶液用氢氧化钠调节pH为4.5～5.5。本方法可对马昔腾坦原料药的有关物质进行快速准确的定性及定量分析。

Description

马昔腾坦有关物质的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及马昔腾坦有关物质的高效液相色谱分析方法。

背景技术

马昔腾坦是由Actelion开发的双重内皮素受体拮抗剂，2013年FDA批准上市，临床用于肺动脉高压的治疗。其结构式如下所示：

对原料药及制剂进行质量控制一直是药物研发中的重点和难点，而对杂质的研究又是质量控制中的重中之重。马昔腾坦合成过程中的起始原料、中间体、副产物及降解产物等均可能成为残留在终产品中的杂质，进而影响产品质量。

目前对马昔腾坦有关物质的研究以及质控分析方法的研究鲜有文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种马昔腾坦及其有关物质的高效液相色谱分析方法。

本申请发明人对马昔腾坦合成过程中可能存在的杂质进行了深入分析，并鉴定了以下9个杂质：

本发明提供的方法可以实现马昔腾坦与上述9个杂质的分离测定，实现主峰与各杂质峰的分离度≥1.5、各杂质间的分离度≥1.2。本发明的高效液相色谱分析方法包括以下步骤：

(1)色谱条件设置：采用反相C18柱，以8～12mmol/L磷酸二氢钾水溶液-乙腈为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；其中磷酸二氢钾水溶液用氢氧化钠调节pH为4.5～5.5；

(2)样品溶液配制：采用极性溶剂溶解马昔腾坦原料，配制成浓度为0.1～1mg/mL的溶液；

(3)检测：取配制的马昔腾坦溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。

其中，步骤(1)中梯度洗脱优选采用以下方式：

所述流动相A中磷酸二氢钾水溶液与乙腈的比例为85～95：15～5，优选90：10；

步骤(1)中柱温为25～35℃；检测波长为210～310nm，优选210nm；流动相速度为0.8～1.2mL/min，优选1.0mL/min；

步骤(3)中极性溶剂选自乙腈、甲醇，优选乙腈；进样量为10～20μL；

优选采用色谱柱为250×4.6mm、粒径5μm的YMC-Pack ODS-A。

本发明的有益效果：采用本发明的方法可有效分离及测定马昔腾坦原料药及制剂中的有关物质，上述9个杂质可以同时测定，各杂质峰间的分离度≥1.2，主峰与杂质峰间的分离度≥1.5。利用本发明的方法可以快速准确地进行原料药马昔腾坦及其制剂的有关物质的定性及定量分析，保证马昔腾坦及其制剂的质量可控性。

附图说明

图1是实施例2中杂质A定位溶液的色谱图

图2是实施例2中杂质B定位溶液的色谱图

图3是实施例2中杂质C定位溶液的色谱图

图4是实施例2中杂质D定位溶液的色谱图

图5是实施例2中杂质E定位溶液的色谱图

图6是实施例2中杂质H定位溶液的色谱图

图7是实施例2中杂质I定位溶液的色谱图

图8是实施例2中杂质J定位溶液的色谱图

图9是实施例2中杂质L定位溶液的色谱图

图10是实施例2中系统适用性溶液的色谱图

图11是实施例2中供试品溶液的色谱图

具体实施方式

以下实施例仅对本发明内容作进一步说明，并不限定本发明。本发明的方法也并不限于上述9个杂质，任何采用本发明方法分离测定马昔腾坦与选自上述杂质中的1～9个杂质的任意组合都落入本发明范围内，以及任何采用本发明方法分离测定马昔腾坦与包含上述杂质中的1～9个杂质的任意组合都落入本发明范围内。

杂质E、杂质L的制备参照现有文献方法制备，其它杂质参照下述实施例1方法制备。

实施例1杂质对照品的制备

1.杂质A的制备

取2.0g反应物加入单口瓶中，加入20ml无水乙醇、1.0gPd/C和1.0g甲酸铵，回流反应4h，反应完全后，降至室温，抽滤，将滤液倒入100ml 10％柠檬酸水溶液，加150ml乙酸乙酯萃取次，有机相浓缩得固体。将粗品用无水甲醇重结晶得1.1g固体，纯度100％。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ8.62(1H,s),8.21(1H,s),7.52(2H,d),7.45(3H,m),2.80(2H,t),1.43(2H,m),0.80(3H,t)

2.杂质B的制备

取2.0g反应物加入单口瓶中，加入20ml无水甲醇和2.0g甲醇钠，回流反应4h，反应完全后，降至室温，将滤液倒入50ml 10％柠檬酸水溶液搅拌3h，抽滤，滤饼干燥得1.4g固体，纯度100％。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ9.77(1H,s),8.52(1H,s),7.64(2H,d),7.22(3H,d),3.82(3H,s),2.82(2H,q),1.45(2H,m),0.82(3H,t).

3.杂质C的制备

杂质C的制备方法参照杂质B的制备，将甲醇钠用乙醇钠替换。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ9.73(1H,s),8.49(1H,s),7.62(2H,d),7.22(3H,d),4.34(2H,q),2.79(2H,s),1.42(2H,m),1.21(3H,t),0.80(3H,t).

4.杂质D的制备

取10.0gⅡb及80ml乙二醇二甲醚加入单口瓶中，加入6.9g乙二醇和14.5g叔丁醇钾，回流搅拌反应15h，反应完全后，降至室温，将滤液倒入500ml 10％柠檬酸水溶液搅拌4h，抽滤，滤饼干燥得8.0g中间体。上述固体加入48ml甲醇，回流搅拌至溶清，降至室温，抽滤，干燥得4.1g固体。

1.6g钠氢经四氢呋喃洗涤两次后加入单口瓶中，40ml四氢呋喃为溶剂，搅拌。缓慢加入上述所得中间体，搅拌1h后加入16ml DMF和5.4g原料Ⅱc，加热至65℃，反应4h。降温至25℃，将滤液倒入400ml 10％柠檬酸水溶液搅拌，加400ml乙酸乙酯萃取3次，有机相用200ml饱和氯化钠洗涤分液，有机相浓缩至干得固体，加80ml甲醇回流搅拌至溶清，降至室温，抽滤，干燥得5.1g固体，纯度100％。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ8.70(4H,s),8.46(1H,s),7.40(2H,d),7.27(2H,d),4.62(8H,d).

5.杂质H的制备

称取3.0g马昔腾坦加入到单口瓶中，加入30ml无水乙醇和1.5gPd/C以及0.6g甲酸铵，加热回流反应4h，降至室温，将反应液倒入300ml柠檬酸水溶液中，搅拌析晶2h，抽滤，滤饼干燥得1.6g固体。粗品用甲醇重结晶得1.0g固体。HPLC纯度100％。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ9.35(1H,s),8.57(2H,d),8.50(1H,s),7.37(3H,d),7.23(3H,d),7.13(1H,t),4.66(2H,s),4.57(2H,s),2.81(2H,q),1.42(2H,m),0.80(3H,t).

6.杂质I的制备

制备杂质I的方法与制备马昔腾坦的方法相类似，使用的原料药由丙胺基磺酰胺钾盐替换为异丙胺基磺酰胺钾盐，后处理方法也与马昔腾坦后处理类似。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ9.79(1H,s),8.70(2H,s),8.49(1H,s),7.55(2H,d),7.15(3H,d),4.64(2H,t),4.58(2H,t),3.33(1H,m),1.02(6H,d).

7.杂质J的制备

取10.0g中间体Ⅴ、5.1g甲酸铵、5.0gPd/C和100ml无水乙醇加至反应瓶中，加热回流2h，抽滤，20ml无水乙醇淋洗。滤液倒入300ml 10％柠檬酸水溶液中，加50ml乙酸乙酯萃取3次，有机相用40.2g无水硫酸镁干燥，抽滤浓缩得固体，固体加10ml无水甲醇，加热至回流，降温至20℃搅拌析晶，抽滤，5ml无水甲醇淋洗，滤饼干燥得2.1gⅤ-6。

向单口瓶中加入0.7g钠氢、21ml四氢呋喃和上述2.1gⅤ-6，搅拌1h后加入5ml DMF和1.4g5-溴-2-氯嘧啶，加热至60℃，反应2h。降温至25℃，将滤液倒入60ml 10％柠檬酸水溶液，搅拌，加入150ml乙酸乙酯萃取3次，有机相加38.6g无水硫酸镁干燥，抽滤，有机相浓缩至干得固体，加10ml无水甲醇加热至回流，降温至12℃搅拌析晶，抽滤，滤饼干燥得1.8g固体，HPLC纯度：97.2％。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ9.36(1H,s),8.69(2H,s),8.49(1H,s),7.35(3H,m),7.22(3H,m),4.64(2H,m),4.57(2H,m),2.78(2H,q),1.41(2H,m),0.80(3H,t).

实施例2

仪器：Agilent 1100/1260高效液相色谱仪

色谱柱：YMC-Pack ODS-A(250×4.6mm，5μm)

流动相：10mmol/L磷酸二氢钾(氢氧化钠溶液调节pH为5.0)水溶液-乙腈(90:10)为流动相A；乙腈为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱：

检测波长：210nm

流速：1mL/min

柱温：30℃

进样量：10μL

定位溶液配制：取各杂质适量，精密称定，分别加乙腈溶解并稀释制成每1mL约含2.5μg的溶液。

供试品溶液配制：精密称取马昔腾坦适量，置于量瓶中，用乙腈溶解并稀释制成0.5mg/mL的溶液。

自身对照溶液配制：精密量取供试品溶液1mL置于100mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，作为自身对照溶液。

系统适用性溶液配制：称取马昔腾坦适量，加入各杂质定位溶液，制成每1mL中含马昔腾坦约0.5mg，含各杂质约2.5μg的溶液，作为系统适用性溶液。

测定：取空白溶液乙腈、各定位溶液、自身对照溶液、系统适用性溶液、马昔腾坦供试品溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

结果：空白溶液对测定无干扰；各杂质定位溶液的色谱图分别见图1～9，杂质A、H、E、B、J、C、I、马昔腾坦、杂质L、杂质D依次出峰，保留时间分别为5.441min、9.957min、15.438min、18.040min、18.981min、23.586min、24.852min、25.805min、34.353min、40.162min。

系统适用性溶液的色谱图见图10，马昔腾坦与各杂质的色谱分离参数结果如下表所示，马昔腾坦与相邻杂质以及各杂质间的分离度均符合要求。

供试品溶液色谱图见图11，测定结果表明，按乘以校正因子自身对照法计算各杂质的含量，杂质E含量为0.01％，杂质A、H、B、J、C、I、L、D未检出，马昔腾坦纯度为99.94％。

实施例3耐用性试验

在实施例2的检测色谱条件的基础上改变初始比例流动相A中乙腈含量、pH值、柱温、流速、波长条件，考察检测方法的耐用性。

溶液配制及测定方法参照实施例2，各色谱条件见下表所示：

结果如下表所示：

实施例4检测限

取马昔腾坦溶液、各杂质溶液用乙腈逐级稀释，分别进样10μl，按信噪比3：1时即为检测限浓度。结果如下：杂质A、H、E、B、J、C、I、马昔腾坦、杂质L、D的检测限分别为0.029、0.026、0.027、0.040、0.043、0.042、0.029、0.070、0.045、0.049μg/ml。

实施例5专属性试验

本申请发明人对马昔腾坦进行了破坏降解试验，考察所产生的降解产物与主峰的分离情况以验证本方法专属性是否达到要求。

未破坏：取马昔腾坦适量，加乙腈溶解，稀释制成每1mL约含0.5mg的溶液；

酸破坏：取本品约10mg，置20ml量瓶中，加入1.0mol/L盐酸溶液1ml，破坏24小时后加入等量的1.0mol/L氢氧化钠溶液中和，再加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得；

碱破坏：取本品约10mg，置20ml量瓶中，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液1ml，破坏9小时后加入等量的1.0mol/L盐酸溶液中和，再加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得；

氧化破坏：取本品约10mg，置20ml量瓶中，加入30％双氧水1ml破坏24小时后，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得；

高温破坏(固体)：取本品约10mg，置20ml量瓶中，在105℃下破坏24小时，然后加乙腈溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；

高温破坏(溶液)：取本品约10mg，置20ml量瓶中，加乙腈使溶解，在80℃下破坏24小时，稀释至刻度，摇匀，即得；

光照破坏(固体)：取本品约10mg，置20ml量瓶中，在4500Lx光强下照射27小时后，加乙腈使溶解，稀释至刻度，摇匀，即得；

光照破坏(溶液取本品约10mg，置20ml量瓶中，加乙腈使溶解，稀释至刻度，摇匀，在4500Lx光强下照射27小时，即得。

测定：按照实施例2的色谱条件，分别取上述样品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见下表所示：

结果显示，本品对碱不稳定，在碱破坏条件下有明显降解杂质产生；其它破坏条件下均无超过0.2％的降解杂质产生。各破坏条件下的最小分离度均大于1.5，降解产物与主峰能够完全分离，说明本方法专属性好。

Claims (9)

1.一种马昔腾坦有关物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

色谱条件设置：采用反相C18柱，以8~12mmol/L磷酸二氢钾水溶液-乙腈为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；其中磷酸二氢钾水溶液用氢氧化钠调节pH为4.5~5.5；

样品溶液配制：采用极性溶剂溶解马昔腾坦原料，配制成浓度为0.1~1mg/mL的溶液；

检测：取配制的马昔腾坦溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析；

其中，流动相A中磷酸二氢钾水溶液与乙腈的比例为85~95：15~5；梯度洗脱采用以下方式：

时间(分钟) 流动相A(%) 流动相B(%) 0 60 40 30 40 60 40 22 78 50 22 78

所述有关物质选自下列化合物：

、

、

、

、

、

或

中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述有关物质替换为下列化合物，

、

、

、

、

、

、

、

和

。

3.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，磷酸二氢钾水溶液与乙腈的比例为90：10。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，柱温为25~35^oC。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，检测波长为210~310nm。

6.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，流动相速度为0.8~1.2mL/min。

7.根据权利要求6所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，流动相速度为1.0mL/min。

8.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，极性溶剂选自乙腈或甲醇。

9.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于，采用色谱柱为250×4.6mm、粒径5μm 的YMC-Pack ODS-A。

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