CN112575020A - 能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建方法 - Google Patents

能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建方法，其构建方法方法为：(1)分别构建载体pSI‑ggpP，pSI‑ggpS和pSI‑ggpPS：(2)构建载体pSI‑2522ggpPS：(3)构建下调蔗糖合成载体pSII‑drfbA：(4)将载体pSI‑2522ggpPS和pSII‑drfbA依次转入聚球藻UTEX 2973中，获得能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。实验证明，本发明的基因工程菌株最终GG产率为1.3mg/L/H，且在0.5M NaCl条件下，比对照菌株提高62％。这对利用光合微生物生产GG及提高Syn2973耐盐性具有重要的理论及实际意义。

Description

能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建 方法
技术领域
本发明属于工业微生物领域，具体涉及能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建方法及应用。
背景技术
盐度是重要的非生物因子，尤其是对于水生生物。为了在高盐度环境中生存，生物必须调整其内部水势并避免盐离子毒性。适应外部高盐度环境，生物主要通过相容性溶质的积累和离子的主动输出。相容性溶质是一类低分子质量的有机化合物，易溶于水，一般不带净电荷，在高渗透或盐胁迫下在细胞内高浓度积聚，而不干扰新陈代谢。在盐胁迫细胞中相容性溶质的积累主要用来弥补水势的差异，帮助细胞吸水，建立或维持膨胀压力。蓝细菌的耐盐性与相容性物质的合成密切相关。GG(甘油葡萄糖苷)，是一类由甘油与葡萄糖分子以糖苷键结合而成的物质，可以在中度耐盐(嗜盐)蓝细菌、某些异养细菌和真菌中，从头合成以抵抗盐胁迫。GG的甜度比蔗糖高0.55倍，热稳定性高，热着色性低，吸湿性低，保水能力高。它是一种大分子的稳定剂，可用于蛋白质药物等的长期保存，还可作为化妆品添加剂，保健食品原料和治疗剂等。近年来，GG的生物合成在不同微生物中进行了探索。与化学合成和酶催化相比，使用微生物作为生物催化剂具有原料灵活，可以通过基因工程有效地改造生成合成所需的前体。
蓝细菌(Cyanobacteria)，是地球上最早出现的能够利用光和二氧化碳作为唯一能源和碳源的革兰氏阴性光合微生物。近年来，合成生物学策略和工具的出现和应用使得改造蓝细菌成为一种替代传统石油基础生产的可再生生物燃料和化学品底盘细胞的可行性选择，如合成乙醇(5.50g/L)，异戊二烯(1.26g/L)，聚羟基丁酸酯(1.16g/L)和3-羟基丙酸(837.18mg/L)。更重要的是，与其他光合微藻相比，蓝细菌具有易于遗传操作和相对较快生长速度的优势。但是，目前蓝细菌的生产力仍低于传统异养模式菌株如大肠杆菌和酿酒酵母，其中，最主要的瓶颈是蓝细菌的生长速度较慢。例如，集胞藻PCC 6803在300μmolphotons m-2s-1，3％二氧化碳，和30℃培养条件下倍增时间为6.6小时，而以空气中二氧化碳为碳源，倍增时间长达12小时，而聚球藻PCC 7942和聚球藻PCC 7002的倍增时间分别为4.9小时和4.1小时，比集胞藻PCC 6803稍微快一些。但仍远低于大肠杆菌和酿酒酵母，这将限制蓝细菌用于生物燃料和化学品生产的大规模培养。最近分离得到的聚球藻UTEX 2973(Synechococcus elongatus UTEX 2973，简称Syn2973)。在BG-11，41℃，500μmolphotons·m-2·s-1和3％二氧化碳培养条件下，Syn2973的倍增时间可以达到1.9小时，接近酿酒酵母的倍增时间(1.67小时)。由于淡水紧缺，利用海水进行蓝细菌大规模培养未来不可避免，而Syn2973作为淡水蓝藻，对盐胁迫敏感，高浓度盐显著抑制了Syn2973的生长。因此，提高Syn2973的耐盐性是今后利用其作为自养光合微生物细胞制造厂的迫切需要。在不耐盐菌株中合成相容溶质是提高宿主耐盐性的关键策略。相关技术及菌株的创建将对GG的生物合成及提高Syn2973耐盐性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。
本发明的第二个目的是提供一种能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌在生产甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)分别构建载体pSI-ggpP，pSI-ggpS和pSI-ggpPS：
将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸磷酸酶的基因ggpP连接组装成载体pSI-ggpP；
将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpS；
以pSI-ggpP为模板，反向PCR扩增得到pSI-ggpP质粒骨架；
将pSI-ggpP质粒骨架与从所述载体pSI-ggpS中获得的启动子Ptrc和编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpPS；
pSI-SPE质粒骨架核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述基因ggpP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述基因ggpS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)构建载体pSI-2522ggpPS：
将pSII-CM质粒骨架与编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶的基因Syn7942-2522连接组装成载体pSII-2522；
将pSI-ggpPS为模板，反向PCR扩增得到pSI-ggpPS质粒骨架；
将pSI-ggpPS质粒骨架与从载体pSII-2522中获得的启动子PCPC560和编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶基因Syn7942-2522连接组装成载体pSI-2522ggpPS；
所述pSII-CM质粒骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述基因Syn7942-2522的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(3)构建下调蔗糖合成载体pSII-drfbA：
将pSII-CM质粒骨架与序列PpsbA2M-asrfbA-micC-TrbcL-Pcpc560-hfq连接组装成载体pSII-drfbA；
所述PpsbA2M-asrfbA-micC-TrbcL-Pcpc560-hfq核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(4)将所述载体pSI-2522ggpPS和pSII-drfbA依次转入聚球藻UTEX 2973中，获得能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。
上述方法构建的能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。
上述能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌在生产甘油葡萄糖苷中的应用。
本发明的优点：
本发明利用合成生物学方法围绕GG(甘油葡萄糖苷)合成的限速问题对聚球藻UTEX2973进行系统的针对性改造，得到一种能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌，实验证明，本发明的基因工程菌株最终GG产率为1.3mg/L/H，且在0.5M NaCl条件下，本发明的工程菌株生长比对照菌株提高62％。这对利用光合微生物生产GG及提高Syn2973耐盐性具有重要的理论及实际意义。
附图说明
图1为载体pSI-2522ggpPS图示。
图2为载体pSII-drfbA图示。
图3为工程菌株和对照菌株(含有空质粒pSI-SPE和pSII-CM)在0.5M NaCl条件下生长曲线。
图4为本发明工程菌产量分析图。图4-A)为对照菌株的气质分析图谱；图4-B)为工程菌株GG产量分析图谱；图4-C)为GG质谱图谱。
具体实施方式
本发明各实施例使用聚球藻UTEX 2973(Synechococcus elongates UTEX 2973)，保藏自美国UTEX藻种资源保藏中心
(https://utex.org/collections/living-algal-strains/products/utex-2973)，于2015年9月7日购入。
pSI-SPE和pSII-CM(Li S,Sun T,Xu C,et al.Development and optimizationof genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcuselongatus UTEX 2973[J].Metabolic.Engineering,2018,48:163-174.)
大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α)感受态细胞购自全式金公司，大肠杆菌HB101(E.coli HB101)购自宝生物生物技术有限公司。
下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明但并不用于限制本发明。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
1、构建载体pSI-ggpP：
以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列为上、下游引物，以质粒pSI-SPE为模板进行反向PCR扩增得到pSI-SPE质粒骨架(SEQ ID NO.1)，采用细菌基因组提取试剂盒提取集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)基因组作为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增得到编码甘油葡萄糖苷-磷酸磷酸酶的基因ggpP(SEQ ID NO.2)，将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸磷酸酶的基因ggpP连接组装成载体pSI-ggpP；
2、构建载体pSI-ggpS：
采用细菌基因组提取试剂盒提取集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)基因组作为模板，以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增得到编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS(SEQ ID NO.3)，将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpS；
3、构建载体pSI-ggpPS：
以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10所示核苷酸序列为上、下游引物，以质粒pSI-ggpP为模板，反向PCR扩增得到pSI-ggpP质粒骨架，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12所示核苷酸序列为上、下游引物，以所述载体pSI-ggpS为模板进行PCR扩增得到启动子Ptrc和编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS；将pSI-ggpP质粒骨架与启动子Ptrc和基因ggpS连接。22℃反应1小时。反应结束后转化大肠杆菌DH5a，分别用SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.12所示核苷酸序列为上、下游引物菌落PCR验证。得到载体pSI-ggpPS。
实施例2
1、构建载体pSII-2522和pSI-2522ggpPS
(1)构建载体pSII-2522：以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.16所示核苷酸序列为上、下游引物，以质粒pSII-CM为模板进行反向PCR扩增得到pSII-CM质粒骨架(SEQ ID NO.4)；采用细菌基因组提取试剂盒提取聚球藻Syn2973基因组作为模板，以SEQ ID NO.14和SEQ IDNO.15所示核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增得到编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶的基因Syn7942-2522(SEQ ID NO.5)，将pSII-CM质粒骨架与编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶的基因Syn7942-2522连接组装成载体pSII-2522；
(2)构建载体pSI-2522ggpPS：
以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.12所示核苷酸序列为上、下游引物，以质粒pSI-ggpPS为模板进行反向PCR扩增得到pSI-ggpPS质粒骨架；以SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.15为上、下游引物，以质粒pSII-2522为模板进行PCR扩增得到启动子PCPC560和编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶的基因Syn7942-2522；将pSI-ggpPS质粒骨架与启动子PCPC560和基因Syn7942-2522连接，22℃反应1小时。反应结束后转化大肠杆菌DH5a，分别以SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.15为上、下游引物，菌落PCR验证，得到载体pSI-2522ggpPS(见图1)。
实施例3
构建下调蔗糖合成载体pSII-drfbA：
以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.18为上、下游引物，以质粒pSII-CM为模板进行反向PCR扩增得到pSII-CM质粒骨架与基因合成序列PpsbA2M-asrfbA-micC-TrbcL-Pcpc560-hfq(SEQ ID NO.6)连接组装成载体pSII-drfbA(见图2)。
实施例4
1.将上述载体pSI-2522ggpPS和pSII-drfbA依次转入聚球藻UTEX 2973中，具体操作如下：
(1)将E.coli HB101和含有目标质粒E.coli DH5a菌体分别在LB培养基中培养过夜，然后以1:50的比例接入含有50μg/mL壮观霉素的10mL新鲜LB培养基中。当细胞生长至对数期(OD600nm≈0.5)，用新鲜LB培养基将大肠杆菌菌株清洗两次以去除含有的抗生素，然后重悬在0.1mL的LB培养基中，将E.coli DH5a和E.coli HB101的混合在一起，孵化30分钟。
(2)取1mL处于对数增长时期的Syn2973(OD750nm≈1)离心并重悬于0.2mL BG11培养基中。
(3)将步骤(2)获得的混合液体与步骤(1)获得的菌液混合，孵育30分钟。涂于含有无菌过滤膜(0.45微孔)BG11琼脂板上。在100μmol photons m-2s-1的强度下孵育24小时后，将过滤膜转移到一个新的含有50μg/mL壮观霉素的BG11琼脂板上。在200μmol photons m- 2s-1的光照下培养7天后，可以看到单菌落，菌落PCR，验证得到工程菌株
所述液体BG 11培养基：NaNO3 1.5 g，K2HPO4.3H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.075g，EDTA 0.001g，Na2CO3 0.02g，H3BO3 2.86 g，MnCl2·4H2O 1.81g，ZnSO4·7H2O 0.222g，NaMoO4·5H2O 0.390g，CuSO4·5H2O 0.079g，Co(NO3)2·6H2O 0.0494g，CaCl2·2H2O0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，加水至1L。
所述固体BG 11培养基：NaNO3 1.5g，K2HPO4.3H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.075g，EDTA 0.001g，Na2CO3 0.02g，H3BO3 2.86g，MnCl2·4H2O 1.81g，ZnSO4·7H2O 0.222g，NaMoO4·5H2O 0.390g，CuSO4·5H2O 0.079g，Co(NO3)2·6H2O 0.0494g，CaCl2·2H2O0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，琼脂15g，加水至1L。
2、将得到的工程菌株进行生长表型测定，在100mL摇瓶中，加入20mL新鲜液体BG11培养基，加入25μg/mL壮观霉素和10μg/mL氯霉素，培养种子液到对数期；测种子液(OD750nm≈1)，并按照初始OD为0.1计算需接入种子液体积，在培养开始时向培养基中加入0.5M NaCl进行盐胁迫实验测定，每隔12小时，取样在分光光度计(UV-1750,Shimadzu,Kyoto,Japan)OD750 nm下测量，直到到稳定期，每次做三个独立生物性重复。在0.5M NaCl条件下，工程菌株生长比对照菌株(含有空质粒pSI-SPE和pSII-CM)提高62％(见图3)。
3、GG产量分析：取含有相应0.5M NaCl浓度下对数中期细胞1OD，13300rpm离心5分钟，细胞沉淀复溶于体积浓度为80％的乙醇水溶液中，并置于65℃金属浴中4h，13000rpm离心10分钟。取200μL，加入内标(山梨醇)，用离心旋干仪悬干，用于气相质谱检测，每个样品都要进一步做硅烷化试剂衍生化，首先将上述旋干样品，进行衍生化反应，衍生化后的样品运用安捷伦5975B/6890N气相质谱检测，色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25um film；Restek,Bellefonte,PA,USA)。使用超高压纯氮作为载气，流速为1mL/分钟，上样体积为1μL，使安捷伦7890自动进样，无分流模式自动进样。进样口和传输管的温度设为280℃。温度梯度为：80℃保持0.25分钟,以10℃/分钟速度增加到280℃，保持5分钟；离子源和四级杆的温度分别设为250℃和150℃。质谱检测范围设置为m/z从50到500，溶剂延迟时间为5分钟，扫描速度为3光谱/秒。色谱图用安捷伦数据分析软件进行分析(见图4)，GG产率为1.3mg/L/H。
序列表
<110> 天津大学
<120> 能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌及构建方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatccggcag ccggcggagc gctgctttct tggcaagcgg tcgccagccc caacgccagg 60
gctgccagcc cgaaacagcg gggcaaggca gcttggaagg gcgatcgcag cacgggcatg 120
gcaatgtctc tctgaaggaa tgcagacctt attcgtacag ccagggttga atcgtggggg 180
tccaatcact tagctctgct gggctaaacc agagagcaat ttcctgttgt gctgtttcga 240
ttgcatccga gccatggatg atgttgcggc caatattgac accaaaatca ccacggatgg 300
tgcccggttc tgccgtcagc ggattggtag cgccgatcaa cttgcgagca gccgccacaa 360
cgccttcgcc ttccaagacg atcgccacga tcggcccaga ggtgatgaac tcgacgaggc 420
cattgaagaa ggggcgctcg cggtggacag catagtgctg ttcggccagc tcgcgactgg 480
gcttcagctg ctttaggccc accagtttga agcctttttg ctcaaagcgg ccgatgatcg 540
taccgaccaa accccgctga acgccatcgg gcttgatggc aataaatgtg cgttccacag 600
acatctagat agtcctcaag acgaggcaag cattgagctt gccttcctat ggttcgggat 660
cactgggatt cttgacaagc gatcgcggtc acatcgctat ctcttaggac ttcgcagcgg 720
gcgagtcgga ttgacccggt agggatttcg ccagatcaat gcccgtggtt tgtttcagct 780
tctccagcaa gctagcgatt tgggtagcgc tgccttcccc ttcgccaatc acagtgatcg 840
actccacgtc gatatctggc acggtgcctg aaagcgtgac gagcagggac tcgatataaa 900
cgcagaaagg cccacccgaa ggtgagccag tgtgactcta gtagagagcg ttcaccgaca 960
aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt tcgactgagc ctttcgtttt atttgatgcc 1020
tggttatttg ccgactacct tggtgatctc gcctttcacg tagtggacaa attcttccaa 1080
ctgatctgcg cgcgaggcca agcgatcttc ttcttgtcca agataagcct gtctagcttc 1140
aagtatgacg ggctgatact gggccggcag gcgctccatt gcccagtcgg cagcgacatc 1200
cttcggcgcg attttgccgg ttactgcgct gtaccaaatg cgggacaacg taagcactac 1260
atttcgctca tcgccagccc agtcgggcgg cgagttccat agcgttaagg tttcatttag 1320
cgcctcaaat agatcctgtt caggaaccgg atcaaagagt tcctccgccg ctggacctac 1380
caaggcaacg ctatgttctc ttgcttttgt cagcaagata gccagatcaa tgtcgatcgt 1440
ggctggctcg aagatacctg caagaatgtc attgcgctgc cattctccaa attgcagttc 1500
gcgcttagct ggataacgcc acggaatgat gtcgtcgtgc acaacaatgg tgacttctac 1560
agcgcggaga atctcgctct ctccagggga agccgaagtt tccaaaaggt cgttgatcaa 1620
agctcgccgc gttgtttcat caagccttac ggtcaccgta accagcaaat caatatcact 1680
gtgtggcttc aggccgccat ccactgcgga gccgtacaaa tgtacggcca gcaacgtcgg 1740
ttcgagatgg cgctcgatga cgccaactac ctctgatagt tgagtcgata cttcggcgat 1800
caccgcttcc ctcatgatgt ttaactttgt tttagggcga ctgccctgct gcgtaacatc 1860
gttgctgctc cataacatca aacatcgacc cacggcgtaa cgcgcttgct gcttggatgc 1920
ccgaggcata gactgtaccc caaaaaaaca gtcataacaa gccatgaaaa ccgccactgc 1980
gccgttacca ccgctgcgtt cggtcaaggt tctggaccag ttgcgtgagc gcatacgcta 2040
cttgcattac agcttacgaa ccgaacaggc ttatgtccac tgggttcgtg ccttcatccg 2100
tttccacggt gtgcgggatc cgatatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa 2160
tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaaccgg tgtttggatt gtcggagttg 2220
tactcgtccg ttaaggatga acagttcttc ggggttgagt ctgctaacta attagccatt 2280
aacagcggct taactaacag ttagtcattg gcaattgtca aaaaattgtt aatcagccaa 2340
aacccactgc ttactgatgt tcaacttcga cagcgcttct ggagcaggaa gatgtcgcgg 2400
gcattagcac cagcggtctg ccaagcctcc gccagccgtt gggtcccttc cgcttgagct 2460
tttccatctt cgacgatacg ggcggcggcc ccccgcgctt ccgcgatcgc ccgtttacaa 2520
gctgcctcag ctggggcgat cacatcggct tgaagttgct gctgcacctg tttgatccgc 2580
tcctgctgca cagggagttc tgcttggcta cgagcgactt cggtagcaat gtccgcttca 2640
gcttcggcca ccaccgcttc gcgccgcgtc aacgcatcct gaatccggcg ctcggcctcg 2700
gcttgggcga tcgctacatc gcgatcgatc cgacgcaggg ccgtgatctt gtcattttcg 2760
gccgtttgga tcgcagaggc agcctgggca tcggcttcag caattcgggc atctcgctgc 2820
agatcagccc gctgcttgcg tccactagcc gagagataac cgacctcatc ggaaatgttc 2880
tggacttgca gcgtatcgag gactagaccc agctgctcaa ggtcatcctc cgcctcttcc 2940
agcagacttt tggcaaaggc aattttgtcc tcgttgatct gctccggcgt gaggctggct 3000
aaaacaccac gcaagttgcc ttcgagggtc tccttggcaa tttgctcgat ttccttacgg 3060
tttttgccaa gcagccgctc gatcgcgttg tggatggtcg gttcttcccc agcaatcttg 3120
atattggcaa cgccttcaac agtcagggga atgccgccct tggagaaggc attggaaacg 3180
cgcaactcaa tgatcatgtt ggtcagatcc atgcggagcg ctttttccag cagaggtacc 3240
cgcaggctgc tgccgccctt gaccaagcga tagccaactc ggcggccatc actactgcgg 3300
cgactactgc cagcaaagat caaaatttca ctgggttggc agatgtagta gagattgcgc 3360
aggactaagc tgccagcccc ggcgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 3420
tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 3480
aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 3540
tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 3600
ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 3660
tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 3720
gtattatccc gtgttgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 3780
aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 3840
agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 3900
acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 3960
actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 4020
accacgatgc ctgcagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 4080
actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 4140
cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 4200
cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 4260
gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 4320
ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 4380
tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 4440
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 4500
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 4560
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 4620
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 4680
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 4740
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 4800
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 4860
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 4920
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 4980
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 5040
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 5100
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 5160
gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 5220
gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 5280
gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac 5340
cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtataca 5400
ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg 5460
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 5520
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc 5580
ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt 5640
ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta atgtctggct tctgataaag cgggccatgt 5700
taagggcggt tttttcctgt ttggtcactg atgcctccgt gtaaggggga tttctgttca 5760
tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg 5820
aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg 5880
accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc 5940
cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg 6000
acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc 6060
aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat 6120
tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga 6180
tcatgcgcac ccgtggccag gacccaacgc tgcccgagat gcgccgcgtg cggctgctgg 6240
agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc aagggttggt ttgcgcattc acagttctcc 6300
gcaagaattg attggctcca attcttggag tggtgaatcc gttagcgagg tgccgccggc 6360
ttccat 6366
<210> 2
<211> 1500
<212> DNA
<213> 集胞藻(Synechocystis sp.)
<400> 2
atgaattcat cccttgtgat cctttaccac cgtgagccct acgacgaagt tagggaaaat 60
ggcaaaacgg tgtatcgaga gaaaaagagt cccaacggga ttttgcccac cctcaaaagt 120
ttttttgccg atgcggaaca gagcacctgg gtcgcatgga aacaggtttc gccgaagcaa 180
aaggatgatt ttcaggcgga tatgtccatt gaaggccttg gcgatcgttg tacggtgcgc 240
cgggtgcccc tgacggcgga gcaggtaaaa aacttctatc acatcacttc caaggaagcc 300
ttttggccca ttctccactc tttcccctgg cagttcacct acgattcttc tgattgggat 360
aattttcagc acattaaccg cttatttgcc gaggcggcct gtgccgatgc cgatgacaat 420
gcattgtttt gggtccacga ctataacctc tggttagcgc ccctttacat tcgtcagctc 480
aagcccaacg ccaagattgc ctttttccac cacaccccct tccccagcgt tgatattttc 540
aatattttgc cctggcggga ggcgatcgta gaaagcttgc tggcctgtga tctctgtggt 600
tttcatattc cccgctacgt agaaaatttt gtcgccgtgg cccgtagtct caagccggtg 660
gaaatcacca gacgggttgt ggtagaccaa gcctttaccc cctacggtac ggccctggcg 720
gaaccggaac tcaccaccca gttgcgttat ggcgatcgcc tcattaacct cgatgcgttt 780
cccgtgggca ccaatccggc aaatatccgg gcgatcgtgg ccaaagaaag tgtgcaacaa 840
aaagttgctg aaattaaaca agatttaggc ggtaagaggc taattgtttc cgctgggcgg 900
gtggattacg tgaagggcac caaggaaatg ttgatgtgct atgaacgtct actggagcgt 960
cgccccgaat tgcaggggga aattagcctg gtagtccccg tagccaaggc cgctgaggga 1020
atgcgtattt atcgcaacgc ccaaaacgaa attgaacgac tggcagggaa aattaacggt 1080
cgctttgcca aactgtcctg gacaccagtg atgctgttca cctctccttt agcctatgag 1140
gagctcattg ccctgttctg tgccgccgac attgcctgga tcactcccct gcgggatggg 1200
ctaaacctgg tggctaagga gtatgtggtg gctaaaaatg gcgaagaagg agttctgatc 1260
ctctcggaat ttgccggttg tgcggtggaa ctacccgatg cggtgttgac taacccctac 1320
gcttccagcc gtatggacga atccattgac caggccctgg ccatggacaa agacgaacag 1380
aaaaaacgca tggggagaat gtacgccgcc attaagcgtt acgacgttca acaatgggcc 1440
aatcacctac tgcgggaagc ctacgccgat gtggtactgg gagagccccc ccaaatgtag 1500
<210> 3
<211> 1269
<212> DNA
<213> 集胞藻(Synechocystis sp.)
<400> 3
atggtattac accaacaacg tttctccctc gaccatggag ctttttgtca aaccttagcc 60
caaactgaaa atttactcat tgtccaagac ttggatgggg tctgcatgga attagtgcaa 120
gatcccctca gtcgccgcct ggatgccgat tatgtccggg ccaccaccct gtttgctgaa 180
catttttacg tgttgaccaa tggggagcac gtgggaaaaa gaggagtaca gggcattgtg 240
gaacaatcct ttggggatgc ttcctttgtg caacaggaag gcctatattt gcccggtttg 300
gcggccgggg gagtgcagtg gcaggatcgc catggcaaag taagtcatcc tggagtgggg 360
caaacggagc tggagttttt agcggcggtg cccgaaaaaa tcactaattg tttaaaaacc 420
ttttttggcg atcgccccca ttccctatcc ccagagcaat tacaaacggg cattgaagct 480
tcggttttag ataatgtggc ttcccccacc gccaatttaa ataccttggc caatctgtta 540
caagactttc cgcaaattta ccgagatttg caggaaacca tggctcaatt attggatcag 600
ttgatggcgg aagccgttgc ccagggtttg gggaatagtt tttttgtcca ctatgctccc 660
aatttaggta gggatgaacg aggtaaggaa attattcgtt gggccaaagc tggggattcc 720
ggcaccaccg attttcaatt tatgttgcgg ggtggggtca aagaagccgg ggttttggct 780
ttgctaaatc gttactatca caatcggaca gggcaatatc ctctgggaga aagttttagt 840
gctcgccaag cgcccccatc ccaccaggac ttgttgcatt tggtgaaagc gcaatttgat 900
ccggccttga tgccgctgat cattggagtt ggggatacgg tcaccagtca ggtggatgaa 960
gctaccgggg aaattcgacg tggcgggagc gatcgccaat ttttgcaatt aatccaagat 1020
ttgggggatt ggggaaatca cggtaactta gtggtgtatg tggacagttc ccagggggag 1080
gtgaaaaatc gccaacctct acaactagaa accgtggcgg ggcaaaccca agtggtggct 1140
ggccctgggg atatgcggga cagggaagag ccattgaaga tcaatgtggc ttttcctggt 1200
ggccatgacc aatatgtagc ggcgtttaag caggcggccc agcgccgaag agtccatttt 1260
tcccagtag 1269
<210> 4
<211> 8643
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatccacgc attttaattc tggatgaggc gacttcggcg cttgattccg agtccgaaac 60
cttggtgcaa gaggccctag aacgggtgat gcagggacgg acggtcttta tcattgctca 120
ccgtctggct acggttcgta atgccagccg catcttggtg atggagcgcg gccagattgt 180
tgaggcaggc aatcacgatg cgctgttggc agaggctggc cgctatgcgc gatactacgc 240
acagcaattt cgtgcctgat caggattaat gaaacggacg ccccagactg aattgccgga 300
ctgggaagcg atcgcggatt tggatgcgat cgtggtcgat aaacgagctc gtaagcgggc 360
cacggcagcg aaagggcgac ggcgcgatcg ccggtatgga aaacgcttgc tgcagcatca 420
gatcgatgcg atcgccgaag actgtgacct agatgaggaa gcatgagcga actgggcttg 480
agtctgacgg cgatcgcgat ttttaccacg acggcattag ctttggtggg accaatgctg 540
ggtagttctc cgctgctacc ggcgggattg ggttttagcc tcttggtgct gttcagtctg 600
gatgcggtga cttggcaggg gcggggtgcc acgttactgc tcgatggcat tcagcagcga 660
tcgcccgaat atcgtcagcg gattttgcat cacgaagcgg gtcactactt ggtagcaacc 720
gcgctggctc gagtataaac gcagaaaggc ccacccgaag gtgagccagt gtgactctag 780
tagagagcgt tcaccgacaa acaacagata aaacgaaagg cccagtcttt cgactgagcc 840
tttcgtttta tttgatgcct ggttacgccc cgccctgcca ctcatcgcag tactgttgta 900
attcattaag cattctgccg acatggaagc catcacagac ggcatgatga acctgaatcg 960
ccagcggcat cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt gcccatggtg aaaacggggg 1020
cgaagaagtt gtccatattg gccacgttta aatcaaaact ggtgaaactc acccagggat 1080
tggctgagac gaaaaacata ttctcaataa accctttagg gaaataggcc aggttttcac 1140
cgtaacacgc cacatcttgc gaatatatgt gtagaaactg ccggaaatcg tcgtggtatt 1200
cactccagag cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa aacggtgtaa caagggtgaa 1260
cactatccca tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat acggaattcc ggatgagcat 1320
tcatcaggcg ggcaagaatg tgaataaagg ccggataaaa cttgtgctta tttttcttta 1380
cggtctttaa aaaggccgta atatccagct gaacggtctg gttataggta cattgagcaa 1440
ctgactgaaa tgcctcaaaa tgttctttac gatgccattg ggatatatca acggtggtat 1500
atccagtgat ttttttctcc attttagctt ccttagctcc tgaaaatctc gataactcaa 1560
aaaatacgcc cggtagtgat cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc 1620
gatcaacgtc tcattttcgc caaaagttgg cccagggctt cccggtatca acagggacac 1680
caggatttat ttattctgcg aagtgatctt ccgtcacagg taggatccga tgcggccgca 1740
cctgtagaga agagtccctg aatatcaaaa tggtgggata aaaagctcaa aaaggaaagt 1800
aggctgtggt tccctaggca acagtcttcc ctaccccact ggaaactaaa aaaacgagaa 1860
aagttcgcac cgaacatcaa ttgcataatt ttagccctaa aacataagct gaacgaaact 1920
ggttgtcttc ccttcccaat ccaggacaat ctgagaatcc cctgcaacat tacttaacaa 1980
aaaagcagga ataaaattaa caagatgtaa cagacataag tcccatcacc gttgtataaa 2040
gttaactgtg ggattgcaaa agcattcaag cctaggcgct gagctgtttg agcatcccgg 2100
tggcccttgt cgctgcctcc gtgtttctcc ctggatttat ttaggtaata tctctcataa 2160
atccccgggt agttaacgaa agttaatgga gatcagtaac aataactcta gggtcattac 2220
tttggactcc ctcagtttat ccgggggaat tgtgtttaag aaaatcccaa ctcataaagt 2280
caagtaggag attaattcaa ccggtgtttg gattgtcgga gttgtactcg tccgttaagg 2340
atgaacagtt cttcggggtt gagtctgcta actaattagc cattaacagc ggcttaacta 2400
acagttagtc attggcaatt gtcaaaaaat tgttaatcag ccaaaaccca ctgcttactg 2460
atgttcaact tcgacagcac tagtggttac ccgtgacggg ctacaccctc tcagcgtggg 2520
aagcgctgcg ccaaggacaa cctggtcgcg ggggtgtgca gttccaagca gctgcgctag 2580
aagccgaagc cgcacagggg caactcagtc agcgatcgct ggaacagtgg tgtcaggtgt 2640
tgatggccgg tgcagcggca gagcaactgg tctacggcaa cgtggaaggg ggagctgacg 2700
atcgcgccca gtggaaacaa ctgtggcggc aactcgatcg caatcctgcc gaagcggatt 2760
tacgcagtcg ctggggattg ttacgggcga agactttact ggagcaacaa cgtcccgcct 2820
acgatgcttt ggtggcggcg atggctgcag aggccagcat tgaagactgc aatcaagcga 2880
tcgccactgc ttgggtagaa gaacctgcga tcgccgctta gtgaagagtc cagaagattc 2940
ccctcccctc tcgcccaatg gacaagggaa atgtgattca gcatgagtca agtccccagt 3000
gcatggatgg gtgtgcaatg acggacagag gctgttgact ctcagttatc cctgtaagcc 3060
aaatcgtccg aaaatcacca gctgaaacgg ttagggttgc attgttttta agcacgagcc 3120
atcaacagta agagcgatcg cgcaggaacg gtttagtgtg tagttgcggc gcgagcaggg 3180
gttagggatt gggcaatgct gtggagttat cttttggcga cgattggagc agactgggca 3240
gcagtcgcat atcgtcaaaa atgagatggg caccggcttc ttgcagacgc caagcgggca 3300
tggaacccgc gtagccaaac acttgcattc ctgccgccac gcctgccgct actcccaagg 3360
gggtgtcttc gatcacagcg caggccgtag gattaacccc gaagcgatcg gcggccaaca 3420
aaaagacatc gggaaatggc ttgccgcgag gtacttcagt cacgctgaag attcgtccct 3480
caaatcgtgg ccagagcttc gtcaggctca gtgtggttcg catcttttga tgatcaccac 3540
tggacgcaac acagtagggc aattcaagag catccaaagc ctcttcaacc ccaggaacgg 3600
cttgtagatg cgtttctaac gcgatacggg tacggcgttg atagtgctga acaaagtcag 3660
ggggtggagg attgcctaac cgtcgctcaa ttagtttgag acagtcagcc atggaatgac 3720
ccacaaactg ctcaaacatg tcatccaaag tcaccaacag acccagttca ttgagcatgt 3780
ctgcaaagac gcgattagtg atgcgttcgc tatcaacaag cacaccatca cagtcgaaaa 3840
tcaccagctg aaacggtgaa gtttgcattg tttttaagca cgagccatca acagtaagag 3900
cgatcgcgct gggacgatgt aatcgcgccg taggcagggt tttgcctcat ccggcagatg 3960
acaagcttcg cccctctaca cagcccagaa ctatggtaaa ggcgcacgaa aaaccgccag 4020
gtaaactctt ctcaaccccc aaaacgccct ctgtttaccc atggaaaaaa cgacaattac 4080
aagaaagtaa aacttatgtc atctataagc ttcgtgtata ttaacttcct gttacaaagc 4140
tttacaaaac tctcattaat cctttagact aagtttagtc agttccaatc tgaacatcga 4200
caaatacata aggaattata accaaatgaa catcaaaaag tttgcaaaac aagcaacagt 4260
attaaccttt actaccgcac tgctggcagg aggcgcaact caagcgtttg cgaaagaaac 4320
gaaccaaaag ccatataagg aaacatacgg catttcccat attacacgcc atgatatgct 4380
gcaaatccct gaacagcaaa aaaatgaaaa atatcaagtt cctgagttcg attcgtccac 4440
aattaaaaat atctcttctg caaaaggcct ggacgtttgg gacagctggc cattacaaaa 4500
cgctgacggc actgtcgcaa actatcacgg ctaccacatc gtctttgcat tagccggaga 4560
tcctaaaaat gcggatgaca catcgattta catgttctat caaaaagtcg gcgaaacttc 4620
tattgacagc tggaaaaacg ctggccgcgt ctttaaagac agcgacaaat tcgatgcaaa 4680
tgattctatc ctaaaagacc aaacacaaga atggtcaggt tcagccacat ttacatctga 4740
cggaaaaatc cgtttattct acactgattt ctccggtaaa cattacggca aacaaacact 4800
gacaactgca caagttaacg tatcagcatc agacagctct ttgaacatca acggtgtaga 4860
ggattataaa tcaatctttg acggtgacgg aaaaacgtat caaaatgtac agcagttcat 4920
cgatgaaggc aactacagct caggcgacaa ccatacgctg agagatcctc actacgtaga 4980
agataaaggc cacaaatact tagtatttga agcaaacact ggaactgaag atggctacca 5040
aggcgaagaa tctttattta acaaagcata ctatggcaaa agcacatcat tcttccgtca 5100
agaaagtcaa aaacttctgc aaagcgataa aaaacgcacg gctgagttag caaacggcgc 5160
tctcggtatg attgagctaa acgatgatta cacactgaaa aaagtgatga aaccgctgat 5220
tgcatctaac acagtaacag atgaaattga acgcgcgaac gtctttaaaa tgaacggcaa 5280
atggtatctg ttcactgact cccgcggatc aaaaatgacg attgacggca ttacgtctaa 5340
cgatatttac atgcttggtt atgtttctaa ttctttaact ggcccataca agccgctgaa 5400
caaaactggc cttgtgttaa aaatggatct tgatcctaac gatgtaacct ttacttactc 5460
acacttcgct gtacctcaag cgaaaggaaa caatgtcgtg attacaagct atatgacaaa 5520
cagaggattc tacgcagaca aacaatcaac gtttgcgcct agcttcctgc tgaacatcaa 5580
aggcaagaaa acatctgttg tcaaagacag catccttgaa caaggacaat taacagttaa 5640
caaataacgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 5700
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 5760
tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 5820
tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 5880
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 5940
ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga 6000
cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 6060
ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 6120
tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 6180
gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 6240
ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgcagc 6300
aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 6360
acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 6420
tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 6480
cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 6540
gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 6600
taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 6660
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 6720
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 6780
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 6840
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 6900
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 6960
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 7020
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 7080
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 7140
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 7200
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 7260
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 7320
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 7380
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 7440
tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 7500
tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct 7560
gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 7620
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt 7680
gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 7740
tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 7800
cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc tgcggtaaag ctcatcagcg 7860
tggtcgtgaa gcgattcaca gatgtctgcc tgttcatccg cgtccagctc gttgagtttc 7920
tccagaagcg ttaatgtctg gcttctgata aagcgggcca tgttaagggc ggttttttcc 7980
tgtttggtca ctgatgcctc cgtgtaaggg ggatttctgt tcatgggggt aatgataccg 8040
atgaaacgag agaggatgct cacgatacgg gttactgatg atgaacatgc ccggttactg 8100
gaacgttgtg agggtaaaca actggcggta tggatgcggc gggaccagag aaaaatcact 8160
cagggtcaat gccagcgctt cgttaataca gatgtaggtg ttccacaggg tagccagcag 8220
catcctgcga tgcagatccg gaacataatg gtgcagggcg ctgacttccg cgtttccaga 8280
ctttacgaaa cacggaaacc gaagaccatt catgttgttg ctcaggtcgc agacgttttg 8340
cagcagcagt cgcttcacgt tcgctcgcgt atcggtgatt cattctgcta accagtaagg 8400
caaccccgcc agcctagccg ggtcctcaac gacaggagca cgatcatgcg cacccgtggc 8460
caggacccaa cgctgcccga gatgcgccgc gtgcggctgc tggagatggc ggacgcgatg 8520
gatatgttct gccaagggtt ggtttgcgca ttcacagttc tccgcaagaa ttgattggct 8580
ccaattcttg gagtggtgaa tccgttagcg aggtgccgcc ggcttccatt caggtcgagg 8640
tgg 8643
<210> 5
<211> 927
<212> DNA
<213> 聚球藻(Synechococcus elongatus)
<400> 5
atgcaagagg caaaagttgc ggcaattttg ggagccggtg cttggggaac gaccctggct 60
cagctcttgc gcagcaatgg ccttgaggtg cggcaatggt ctcgccgaag tgagacctct 120
ttggcagcaa cattggcaga ggccgatctc tggattatgg cggtctccat ggccggcttg 180
gcttccgtgg cggatcaagt ggcagccctc caactgggcg atcgcgcgat ttgggtgagt 240
gcaactaaag gactggcgga tctgggctgg cggactccct ctcaggttct cagcgatcgc 300
ttcccgctgc agccgattac ggtgctctca gggcccaatc tttccaagga aattagccag 360
ggattacccg cagcgaccgt gattgccagt cgcgatcgcc atgcagcggc cgtggttcag 420
caggcgtttg ccagcgatcg ctttcgggtc tataccaatc gcgatcccct cggaaccgag 480
ctgggcgggg ctctcaaaaa tgtgattgcg atcgctgtcg gggtctgtga tggtctctgt 540
ctgggtgcca atgcgcgatc ggccttggta acgcgagcct tggcagaaat tctgcgcgtg 600
ggggcctatt tcggtgcccg cacggaaacg ttctttggac tgtcagggct aggtgattta 660
ctggcgacct gcaccagtcc gctcagtcgc aactatcaag ttggattccg gctcgcgcaa 720
ggtgagagct tggctgcggc actaacggcg atcgcagcca cggctgaagg cgtatctacc 780
gctcgagtgc tggcccagct ggccagccgt gagggactag agttgccgat cgcagcctgt 840
gtggcggagt tgttagataa ccggatttcg ccaacaaccg ccattgagcg gctgatggct 900
cgcgatctga aagcggaatt ggtctga 927
<210> 6
<211> 2288
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatcaataag tattaggtat atggatcata attgtatgcc cgactattgc ttaaactgac 60
tgaccactga ccttaagagt aatggcgtgc aaggcccagt gatcaatttc attatttttc 120
attatttcat ctccattgtc cctgaaaatc agttgtgtcg cccctctaca cagcccagaa 180
ctatggtaaa ggcgcacgaa aaaccgccag gtaaactctt ctcaaccccc aaaacgccct 240
ctgtttaccc atggaaaaaa cgacaattac aagaaagtaa aacttatgtc atctataagc 300
ttcgtgtata ttaacttcct gttacaaagc tttacaaaac tctcattaat cctttagact 360
aagtttagtc agttccaatc tgaacatcga caaatacatc tcgaggatgc cgcgccgtgc 420
ctcggtcatt ttctgttggg ccattgcatt gccactgatt ttccaacata taaaaagaca 480
agcccgaaca gtcgtccggg ctttttttgg taccaccggt gtttggattg tcggagttgt 540
actcgtccgt taaggatgaa cagttcttcg gggttgagtc tgctaactaa ttagccatta 600
acagcggctt aactaacagt tagtcattgg caattgtcaa aaaattgtta atcagccaaa 660
acccactgct tactgatgtt caacttcgac agccgtcaca ggtaggatcc gatgcggccg 720
ctatcaataa gtattaggta tatggatcat aattgtatgc ccgactattg cttaaactga 780
ctgaccactg accttaagag taatggcgtg caaggcccag tgatcaattt cattattttt 840
cattatttca tctccattgt ccctgaaaat cagttgtgtc gcccctctac acagcccaga 900
actatggtaa aggcgcacga aaaaccgcca ggtaaactct tctcaacccc caaaacgccc 960
tctgtttacc catggaaaaa acgacaatta caagaaagta aaacttatgt catctataag 1020
cttcgtgtat attaacttcc tgttacaaag ctttacaaaa ctctcattaa tcctttagac 1080
taagtttagt cagttccaat ctgaacatcg acaaatacat ctcgagggca gccacgaaca 1140
gaatccgcat tttctgttgg gccattgcat tgccactgat tttccaacat ataaaaagac 1200
aagcccgaac agtcgtccgg gctttttttg gtaccaccgg tgtttggatt gtcggagttg 1260
tactcgtccg ttaaggatga acagttcttc ggggttgagt ctgctaacta attagccatt 1320
aacagcggct taactaacag ttagtcattg gcaattgtca aaaaattgtt aatcagccaa 1380
aacccactgc ttactgatgt tcaacttcga cagcacctgt agagaagagt ccctgaatat 1440
caaaatggtg ggataaaaag ctcaaaaagg aaagtaggct gtggttccct aggcaacagt 1500
cttccctacc ccactggaaa ctaaaaaaac gagaaaagtt cgcaccgaac atcaattgca 1560
taattttagc cctaaaacat aagctgaacg aaactggttg tcttcccttc ccaatccagg 1620
acaatctgag aatcccctgc aacattactt aacaaaaaag caggaataaa attaacaaga 1680
tgtaacagac ataagtccca tcaccgttgt ataaagttaa ctgtgggatt gcaaaagcat 1740
tcaagcctag gcgctgagct gtttgagcat cccggtggcc cttgtcgctg cctccgtgtt 1800
tctccctgga tttatttagg taatatctct cataaatccc cgggtagtta acgaaagtta 1860
atggagatca gtaacaataa ctctagggtc attactttgg actccctcag tttatccggg 1920
ggaattgtgt ttaagaaaat cccaactcat aaagtcaagt aggagattaa ttcactcgaa 1980
tggctaaggg gcaatcttta caagatccgt tcctgaacgc actgcgtcgg gaacgtgttc 2040
cagtttctat ttatttggtg aatggtatta agctgcaagg gcaaatcgag tcttttgatc 2100
agttcgtgat cctgttgaaa aacacggtca gccagatggt ttacaagcac gcgatttcta 2160
ctgttgtccc gtctcgcccg gtttctcatc acagtaacaa cgccggtggc ggtaccagca 2220
gtaactacca tcatggtagc agcgcgcaga atacttccgc gcaacaggac agcgaagaaa 2280
ccgaataa 2288
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accggtgttt ggattgtcgg 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtgtgaaat tgttatccgc tcac 24
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaggtcgaca tgaattcatc ccttgtgatc 30
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaggagctcc tactgggaaa aatggactc 29
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaggtcgaca tgaattcatc ccttgtgatc 30
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggcggccg cctacatttg ggggggctct c 31
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catccgtttc cacggtgtg 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgcaagagg caaaagttgc g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcagaccaat tccgctttca g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgaattaatc tcctacttga c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acctgtagag aagagtccct g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgatcggcac gtaagaggtt c 21

Claims (3)

1.能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)分别构建载体pSI-ggpP，pSI-ggpS和pSI-ggpPS：
将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸磷酸酶的基因ggpP连接组装成载体pSI-ggpP；
将pSI-SPE质粒骨架与编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpS；
以pSI-ggpP为模板，反向PCR扩增得到pSI-ggpP质粒骨架；
将pSI-ggpP质粒骨架与从所述载体pSI-ggpS中获得的启动子Ptrc和编码甘油葡萄糖苷-磷酸合酶的基因ggpS连接组装成载体pSI-ggpPS；
pSI-SPE质粒骨架核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述基因ggpP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述基因ggpS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)构建载体pSI-2522ggpPS：
将pSII-CM质粒骨架与编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶的基因Syn7942-2522连接组装成载体pSII-2522；
将pSI-ggpPS为模板，反向PCR扩增得到pSI-ggpPS质粒骨架；
将pSI-ggpPS质粒骨架与从载体pSII-2522中获得的启动子PCPC560和编码甘油-3-磷酸甘油脱氢酶基因Syn7942-2522连接组装成载体pSI-2522ggpPS；
所述pSII-CM质粒骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述基因Syn7942-2522的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(3)构建下调蔗糖合成载体pSII-drfbA：
将pSII-CM质粒骨架与序列PpsbA2M-asrfbA-micC-TrbcL-Pcpc560-hfq连接组装成载体pSII-drfbA；
所述PpsbA2M-asrfbA-micC-TrbcL-Pcpc560-hfq核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(4)将所述载体pSI-2522ggpPS和pSII-drfbA依次转入聚球藻UTEX 2973中，获得能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。
2.权利要求1的方法构建的能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌。
3.权利要求2的能生物合成甘油葡萄糖苷且耐盐的聚球藻基因工程菌在生产甘油葡萄糖苷中的应用。
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Citations (2)

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CN104651287A (zh) * 2013-11-22 2015-05-27 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种用于合成甘油葡糖苷的工程菌和应用
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FRIEDRICH KIRSCH ET AL: "Salt-Regulated Accumulation of the Compatible Solutes Sucrose and Glucosylglycerol in Cyanobacteria and Its Biotechnological Potential", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 *

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