CN111676163A - 一种餐厨垃圾高温生物降解用的微生物菌剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种餐厨垃圾高温生物降解用的微生物菌剂与应用。所述微生物菌剂包括：保藏号为CCTCC NO：M 2019263的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB‑091、保藏号为CCTCC NO：M 2020014的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163、保藏号为CCTCC NO：M 2020015的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165、保藏号为CCTCC NO：M 2020016的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166。本发明提供的微生物菌剂不仅能够加速餐厨垃圾的生物降解，还能够消除异味，实现餐厨垃圾的无害化、减量化处理。各微生物菌种之间协同作用，在好氧条件下将餐厨垃圾中大分子的有机物快速降解为小分子物质，产生大量有机质和微量元素，实现废物资源化的转变。
Description
技术领域
本发明涉及垃圾处理技术领域，特别是涉及一种餐厨垃圾高温生物降解用的微生物菌剂与应用。
背景技术
餐厨垃圾，亦称泔水、剩食等，是食物在加工处理(包括烹煮)后所剩的部分(如菜叶、果皮、果渣等)，或在食用后所剩并被丢弃的食物的统称。伴着经济水平和社会资料的转变，人们对饮食越来越讲究，由此也造成了大量的浪费。据研究报道，全球有一半的食物被浪费掉。
餐厨垃圾主要成分包括米和面粉类食物残余、蔬菜、动植物油、肉骨等，从化学组成上，有淀粉、蛋白质、纤维素、脂类和无机盐等，这些组分由于其具有含水率高，营养丰富的特点，极易腐烂发臭，传播细菌和病毒，不仅影响市容市貌，还污染环境和危害人们的健康。然餐厨垃圾所蕴含的丰富营养又是极其宝贵的可再生资源，如果能有效合理地处理餐厨垃圾，必定能带来较高的价值。此外，由于餐厨垃圾本身的不均质性，致使其运输和处理也非常不便且成本较高。
随着环保、可持续发展理念的不断深入，传统的餐厨垃圾处理方式如焚烧、卫生填埋等因其不可逆的环境损耗性和资源无效性使得人们开始探寻新的处理方式，生物法处理餐厨垃圾因其独有的优点逐步成为研究和关注的热点。如公开号为CN105665417A的发明申请公开了一种餐厨垃圾高效降解复合微生物菌剂及其制备、使用方法。所述复合微生物菌剂由复合菌体和载体组成，所述复合菌体由东方伊萨酵母菌、枯草芽孢杆菌、异常威克汉姆酵母菌、黒木霉及放线菌混合组成，所述载体由豆粕、麸皮、稻壳粉、刨花组成等，这些菌剂都有较好的餐厨垃圾降解效果，然而由于饮食习惯的差异性，餐厨垃圾的微环境以及微生物产酶的特异性，高温微生物更有益于加速餐厨垃圾的降解，缩短生物反应时间、减少能耗。因此，有必要筛选具有较好降解餐厨垃圾能力且耐高温的优势菌株，加速餐厨垃圾的生物降解，从而进一步实现餐厨垃圾的无害化、减量化、资源化。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种餐厨垃圾高温生物降解用的微生物菌剂与应用。
一种餐厨垃圾高温生物降解用的微生物菌剂，包括：
(1)克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，株号ZJB-091，保藏号为CCTCC NO：M2019263；
(2)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，株号ZJB19163，保藏号为CCTCCNO：M 2020014；
(3)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)，株号ZJB19165，保藏号为CCTCCNO：M 2020015；
(4)副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)，株号ZJB19166，保藏号为CCTCC NO：M 2020016。
优选的，所述的微生物菌剂，克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166的质量比为1∶1～2∶1∶1～2。
更优选的，所述的微生物菌剂，克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166的菌体干重质量比为1∶1∶1∶1。
克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019263，保藏时间为2019年4月17日。克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)ZJB-091的18s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)ZJB-091的生物学特征为：白色至奶油色的菌落，湿润，粘稠，易挑起，菌落正、反面及中央与边缘的颜色一致，有假菌丝，生长过程中带果香味；球形或卵圆形；能产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020014，保藏时间为2020年1月6日。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZJB19163的16S rRNA序列如SEQ ID NO.2所示。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的生物学特征为：菌落呈圆形，淡黄色微泛白，表面光滑，粘稠，不透明，边缘整齐，无褶皱，能产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020015，保藏时间为2020年1月6日。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165的16S rRNA序列如SEQ ID NO.3所示。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)的生物学特征为：菌落呈圆形，淡黄色，表面光滑，不透明，边缘整齐，无褶皱，杆状，芽孢。
副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2020016，保藏时间为2020年1月6日。副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166的16S rRNA序列如SEQ ID NO.4所示。副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)的生物学特征为：菌落呈圆形，淡黄色，表面光滑，不透明，边缘整齐，无褶皱，杆状，芽孢，产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶。
本发明又提供了所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将4种菌株分别活化培养，
(2)将活化后的4种菌株分别进行种子培养获得种子液，
(3)将4种菌株的种子液分别发酵培养获得发酵液；
(4)将4种菌株的发酵液按比例混合，获得所述微生物菌剂。
该微生物菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091接种至PDA斜面培养基上恒温培养，进行菌株的活化培养；
(2)将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166分别接种至牛肉膏蛋白胨斜面培养基上恒温培养，进行菌株的活化培养；
(3)将活化后的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091接种至PDA液体培养基中，进行种子培养，得到克鲁维毕赤酵母种子液；将活化后的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，进行种子培养，分别得到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)ZJB19166种子液；
(4)所述克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091种子液，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166种子液分别接种至含发酵培养基的发酵罐内，进行发酵培养，分别得到克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091发酵液，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166发酵液；
(5)将克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091发酵液，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166发酵液按比例进行混合，用5～150目的小麦秸秆粉以1∶20固定化，低温干燥得到餐厨垃圾生物降解微生物菌剂。
步骤(1)中，PDA斜面培养基的组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1L；活化培养的条件为：25～40℃恒温培养24～48h。
步骤(2)中，牛肉膏蛋白胨斜面培养基的组分为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，水1L；活化培养的条件为：35～55℃恒温培养12～24h。
步骤(3)中，PDA液体培养基的组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L；种子培养的条件为：在25～40℃、150～200r/min的条件下摇床振荡培养24～48h。牛肉膏蛋白胨液体培养基的组分为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1L；种子培养的条件为：在35～55℃、150～200r/min的条件下摇床振荡培养24～48h。
步骤(4)中，克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)发酵培养基的组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L；发酵培养的条件为：在25℃～40℃、200～450r/min的条件下发酵培养36～80h。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringlensis)和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)发酵培养基的组分为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1L；发酵培养的条件为：在35℃～55℃、200～450r/min的条件下发酵培养36～80h。
本发明还提供了所述微生物菌剂在降解餐厨垃圾中的应用。
本发明还提供了一种降解餐厨垃圾的方法，将所述微生物菌剂加入到待降解的餐厨垃圾中进行生物降解。优选的，生物降解温度为55℃。
与现有技术相比，本发明所具有的有益效果：
(1)本发明提供的微生物菌剂不仅能够加速餐厨垃圾的生物降解，还能够消除异味，实现餐厨垃圾的无害化、减量化处理。
(2)本发明将复合微生物菌剂运用于处理餐厨垃圾中，各微生物菌种之间协同作用，在好氧条件下将餐厨垃圾中大分子的有机物快速降解为小分子物质，产生大量有机质和微量元素，实现废物资源化的转变。
(3)本发明提供的微生物菌剂在55℃下能有效抑制有害微生物的生长，实现餐厨垃圾的无害化处理。
(4)本发明提供的微生物菌剂作用于餐厨垃圾后，无异味产生，应用前景较好。
附图说明
图1为实施例7处理结束后的餐厨垃圾形态图。
图2为实施例8餐厨垃圾生物降解试验示意图。
具体实施方式
实施例1：餐厨垃圾高温降解菌的筛选与鉴定
取浙江工业大学毓秀餐厅附近的土样5g加入到已灭菌的带有小玻璃珠和50mL无菌水的锥形瓶中，55℃，180r/min震荡培养，富集培养一周后，于超净台中进行菌悬液梯度稀释，浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，吸取100μL各浓度的菌悬液分别接种于PDA斜面和牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，用封口膜将平板封口后倒置，放于28～40℃恒温培养箱中培养24～48h，选择菌落数合适的平板，挑取典型菌落，分离纯化后，分别接种至蛋白质、淀粉、脂肪、纤维素鉴别培养基平板并用已灭菌过的涂布棒涂布均匀，将培养皿用封口膜封口后倒置放于28～40℃恒温培养箱中培养48～37h，观察溶菌圈的直径和菌落直径比。选取菌圈较大的菌株，分别接种至PDA液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养24h后，取适量菌液用30％的甘油以1∶1的比例保藏于-80℃冰箱里；取部分菌液进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定。
用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，扩增引物为：
细菌采用16S rRNA通用引物：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
细菌PCR体系如表1所示。
表1
真菌釆用rDNA-ITS通用引物：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
真菌PCR体系如表2所示。
表2
PCR程序：在95℃进行预变性5min；95℃40s，55℃30s，72℃2min，30个循环延伸；72℃10min。
由杭州擎科生物技术有限公司进行PCR产物测序，获得的序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
将获得的DNA序列，输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比对；再结合形态、生理生化鉴定结果，确定筛选所得的菌株分别为克鲁维毕赤酵母，地衣芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌，分别命名为克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166。
克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166均已在位于中国典型培养物保藏中心进行保藏；具体信息如下：
(1)克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091：
保藏编码：CCTCC NO：M 2019263；
保藏时间：2019年4月17日。
(2)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163：
保藏编码：CCTCC NO：M 2020014；
保藏时间：2020年1月6日。
(3)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165：
保藏编码：CCTCC NO：M 2020015；
保藏时间：2020年1月6日。
(4)副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166：
保藏编码：CCTCC NO：M 2020016；
保藏时间：2020年1月6日。
中国典型培养物保藏中心CCTCC的地址为：湖北省武汉市洪山区珞珈山街道八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心。
上述方法中涉及的培养基成分如下：
PDA固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1L、pH自然。
PDA液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1L、pH自然。
牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，水1L，pH自然。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1L，pH自然。
蛋白质鉴别培养基：脱脂奶粉50g、可溶性淀粉10g、酵母提取物5g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、水1L、pH 7.0。
淀粉鉴别培养基：蛋白胨10g、可溶性淀粉2g、牛肉膏5g、NaCl 5g、琼脂20g、水1L、pH 7.0-7.2。
脂肪鉴别培养基：蛋白胨10g、K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、聚乙烯醇1.2g、维多利亚蓝B 0.04g、橄榄油10g、琼脂20g、水1L、pH 8.0。
纤维素鉴别培养基：K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、CMC-Na 2g、刚果红0.2g、琼脂16g、明胶2g、水1L、pH 7.0。
实施例2：菌株酶活测定
将分离得到的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091接种到PDA液体培养基中，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166于55℃摇床振荡培养48h，发酵液4℃，8000r/min离心10min，取上清液测定淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶酶活。淀粉酶活性测定用DNS法，酶活定义：1mL酶液每分钟生成1μg麦芽糖所需的酶量，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。蛋白酶活性测定用福林酚法，酶活定义：1mL酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。脂肪酶活性测定用国标GB/T 23535-2009，酶活定义：1mL酶液在一定温度和pH下(本实施例采用55℃、pH7.0)，1min水解底物(本实施例以橄榄油为底物)产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以“U/mL”表示；纤维素酶活性测定用3，5-二硝基水杨酸法，1mL酶液每分钟水解纤维素生成1μg葡萄糖所需的酶量，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。结果如表3所示。
表3
实施例3：菌剂的制备
①斜面培养
将克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091接种于PDA斜面，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166接种于牛肉膏蛋白胨斜面分别在25～40℃恒温培养24～48h，进行菌株活化；所用活化的PDA斜面组分：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1L、pH自然，115℃灭菌30min；所用的牛肉膏蛋白胨斜面组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，水1L，pH自然，121℃灭菌20min。
②种子液
将步骤①所得活化后的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091接种于马铃薯葡萄糖液体培养基；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)ZJB19166接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基；分别于25～40℃、150～200r/min摇床振荡培养24～48h，得克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166种子液。所用马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1L、pH自然，115℃灭菌30min；牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1L，pH自然，121℃灭菌20min。
③扩大培养：
在发酵罐内放置50～67％体积比的培养基，将步骤②所得的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)ZJB19166种子液分别接种到装有体积比为50～67％培养基的发酵罐内，于30℃～45℃、200～450r/min发酵培养36～80h；分别获得克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166菌液。
步骤③所用液体培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基以1L计，200g马铃薯加1L水煮20min，过滤，取滤液，加入20g葡萄糖，加水补至1L，115℃灭菌30min；牛肉膏蛋白胨液体培养基以1L计，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，121℃灭菌20min。
(2)复合菌剂的制备
将培养的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166菌液分别于台式高速冷冻离心机8000rpm离心10min，得到的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166菌体按照重量比(菌体干重)为(0.5∶1∶0.5∶1)或(1∶1∶1∶1)的比例加水混合，即得不同菌体比例的微生物菌液，然后选择5～150目的小麦秸秆粉以1∶20的比例进行固定化，低温干燥后即得复合微生物菌剂，干燥温度为30～50℃，活菌数≥3.0×109CFU/mL。
实施例4：微生物菌剂稳定性评价
将复合微生物菌剂置于实验室一角，室温下保存，每隔15天取样分析其活菌数的变化情况。利用稀释平板涂布法测定活菌数的数量。
表4
在微生物菌剂保存期间，环境的温度、菌剂的含水量、微生物菌种的类别等的不同都会影响微生物活菌数。其中，保存环境的温度是影响微生物菌剂中活菌数的关键之一。在温度较低的条件下，微生物的活性普遍偏低，其生长代谢速度相应减慢，从而有效地达到延长微生物菌种的保存时间的效果。然而，对复合微生物菌剂来说，若是长期将其保存在低温情况下，会增加其生产成本，进而限制其进一步的工业化和应用，故而选择在室温条件下保存。从表中可以发现微生物菌剂在45天内活菌数是基本维持稳定的。
实施例5：接种量的选择
分别以0.5％、1％、1.5％、2％、3％、5％的接种量(接种菌剂的质量与待处理餐厨垃圾的质量比)在餐厨垃圾处理设备中投放微生物菌剂，运行48h后测定不同接种量实验中餐厨垃圾淀粉、蛋白质、油脂的降解比例如表5所示。
表5
从实施结果中发现，优选1.5％的接种量作为投放复合微生物菌剂的比例是较为合适的，能在尽可能低的成本上达到较优的效果。
实施例6：温度的选择
微生物菌剂的降解处理结果(垃圾降解率)以重量减量效率来体现：
减重率(％)＝(A-B)÷A×100％
其中，A：投入的餐厨垃圾与微生物菌剂的总重(kg)；B：处理后残余物总重(kg)。
以浙江工业大学毓秀餐厅收集的餐厨垃圾进行试验，试验过程：去除餐厨垃圾中的骨头、塑料吸管等大块、坚硬的部分，测得餐厨垃圾含水率70～75％；用木屑调整含水率为55～65％后，分别以35℃、50℃、55℃加入上述实施例3制得1.5％的1∶1∶1∶1比例(菌体干重质量比)的微生物菌剂进行48h餐厨垃圾生物降解试验，结果发现温度为35℃时，餐厨垃圾减重率为58.12％；温度为50℃时，餐厨垃圾减重率为79.38％；温度为55℃时，餐厨垃圾减重率为82.35％。
实施例7：菌剂的应用
微生物菌剂的降解处理结果(垃圾降解率)以重量减量效率来体现：
减重率(％)＝(A-B)÷A×100％
其中，A：投入的餐厨垃圾与微生物菌剂的总重(kg)；B：处理后残余物总重(kg)。
以浙江工业大学毓秀餐厅收集的餐厨垃圾进行试验，试验过程：
(1)将采集回来的样品进行组分分析。步骤为：手动分拣出样本中的蔬菜、主食(米饭、面食)、肉类和其他杂质，然后用电子天平对分拣出来的各组分进行质量称量，根据称量的结果换算出各组分在食物垃圾样本总质量的占比(表6)。通过105℃烘干样品，直到24小时的质量损失低于0.5％，来测定水分含量。餐厨垃圾水分含量70～75％。
表6
| 组分 | 主食 | 蔬菜 | 肉类 | 其他 |
| 含量(％) | 51.48±5.49 | 18.89±1.78 | 10.73±1.15 | 18.85±6.19 |
(2)加入1.5％的上述实施例3制得的0.5∶1∶0.5∶1比例(菌体干重质量比)的微生物菌剂，置于垃圾降解处理机内，温度为55℃，加入5kg餐厨垃圾，用木屑调节体系水分为55～65％后通风运行24h后补料2kg，然后每隔48h补料一次(2kg)，运行240h后取出残余物称重，除去添加木屑的量后得2.15kg，减重率约为83.46％，采用酸水解法来检测残余物中的脂肪含量；采用凯氏定氮法来检测残余物中的蛋白质含量。油脂降解率9.36％，蛋白质降解率63.12％。残余物呈棕褐色颗粒或粉状，如图1所示。
实施例8：菌剂的应用
微生物菌剂的降解处理结果(垃圾降解率)以重量减量效率来体现：
减重率(％)＝(A-B)÷A×100％
其中，A：投入的餐厨垃圾与微生物菌剂的总重(kg)；B：处理后残余物总重(kg)。
以浙江工业大学毓秀餐厅收集的餐厨垃圾进行试验，试验过程：
(1)去除餐厨垃圾中的骨头、塑料吸管等大块、坚硬的部分，餐厨垃圾含水率70～75％；
(2)加入1.5％的上述实施例3制得的1∶1∶1∶1比例(菌体干重质量比)的微生物菌剂，置于垃圾降解处理机内，温度为55℃，加入15kg餐厨垃圾，用木屑调节水分为55％后通风运行48h后，利用五合一气体检测仪，检测氨气和硫化氢的含量，而后补料一次(15kg)，继续运行48h后，除去木屑的添加量后约为5.6kg，减重率约为81.3％。餐厨垃圾经微生物菌剂混合作用后，起初呈灰褐色糊状，随着降解时间的不断延长，餐厨垃圾被不断地分解利用，最终呈棕褐色颗粒或粉状。
气味检测：先通过嗅觉感受餐厨垃圾降解过程中产生的气体，判断有无臭气；再收集气体利用五合一气体检测仪，检测氨气和硫化氢的含量，如图2所示，ppm与mg/m3的转换公式：
ppm＝(22.4×mg/m3)/所测气体分子量
氨气的分子量为17.031，硫化氢的分子量为34.08。
气味阈值强度分级如表7所示。
表7
餐厨垃圾经48h生物降解后，残余物气味较弱，似梅干菜。而后利用气体检测仪，最终测得NH3含量为8.32mg/m3，H2S含量为0.53mg/m3,说明该微生物菌剂在餐厨垃圾降解过程中无明显异味产生。
实施例9：菌剂的应用
以浙江工业大学精弘食堂收集的餐厨垃圾进行试验，试验过程：
(1)去除餐厨垃圾中的骨头、塑料吸管等大块、坚硬的部分，餐厨垃圾含水率65～75％；
(2)加入1.5％的上述实施例3制得的1∶1∶1∶1比例(菌体干重质量比)的微生物菌剂，置于垃圾降解处理机内，加入10kg餐厨垃圾，用木屑调节水分为55％后先45℃通风运行12h后，将温度调整为55℃继续运行12h，降解残余物剩余约为0.75kg，减重率约为92.5％。淀粉降解率为87.51％，蛋白质降解率为91.35％，油脂降解率为29.12％。餐厨垃圾经微生物菌剂混合作用24h后，无明显异味产生，NH3含量为6.42mg/m3，H2S含量为0.46mg/m3。
实施例10：菌剂的应用
以浙江工业大学毓秀餐厅收集的餐厨垃圾进行试验，试验过程：
(1)去除餐厨垃圾中的骨头、塑料吸管等大块、坚硬的部分，餐厨垃圾含水率65～75％；
(2)加入1.5％的上述实施例3制得的1∶1∶1∶1比例(菌体干重质量比)的微生物菌剂，置于垃圾降解处理机内，加入10kg餐厨垃圾，用木屑调节水分为55％后先45℃通风运行12h后，将温度调整为55℃继续运行36h，降解残余物剩余约为0.53kg，减重率约为94.7％。淀粉降解率为90.37％，蛋白质降解率为91.35％，油脂降解率为27.58％。餐厨垃圾经微生物菌剂混合作用24h后，无明显异味产生，NH3含量为6.35mg/m3，H2S含量为0.33mg/m3。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种餐厨垃圾高温生物降解用的微生物菌剂与应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 449
<212> DNA
<213> 克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)
<400> 1
cttccgtagg gtgaacctgc ggaaggatca ttactgtgat ttatatctta tacacatgcg 60
tgagcgcacc aaacacctaa aattgtaata ccaccagtca gtaagtttta acaaaacaaa 120
actttcaaca acggatctct tggttctcgc atcgatgaag agcgcagcga aatgcgatac 180
ctagtgtgaa ttgcagccat cgtgaatcat cgagttcttg aacgcacatt gcgccccatg 240
gtattccatg gggcatgcct gtctgagcgt cgtttccttc ttgcgcaagc agagttgaga 300
acaggctatg cctttttcga aatggaacgt cgtggacgaa gtgaactaaa tttttagcac 360
gctttggccg ccgaactttt aactaagctc gacctcagat caggtaggaa tacccgctga 420
acttaagcat atcaataagc ggaggaaaa 449
<210> 2
<211> 1410
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 2
gctggctcca aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg gtgtgacggg 60
cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg 120
attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca gatttgtggg 180
attggcttag cctcgcggct tcgctgccct ttgttctgcc cattgtagca cgtgtgtagc 240
ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg 300
gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt tgcgctcgtt 360
gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac 420
tctgcccccg aaggggaagc cctatctcta gggttgtcag aggatgtcaa gacctggtaa 480
ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540
attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgtttgc 600
tgcagcacta aagggcggaa accctctaac acttagcact catcgtttac ggcgtggact 660
accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc agttacagac 720
cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg 780
tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac cctccccggt 840
tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgcgcgcttt acgcccaata 900
attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 960
gctttttggt taggtaccgt caaggtaccg ccctattcga acggtacttg ttcttcccta 1020
acaacagagt tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact 1080
ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca 1140
gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgttgcctt ggtgagccgt 1200
tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagct aaaagccacc 1260
ttttataatt gaaccatgcg gttcaatcaa gcatccggta ttagccccgg tttcccggag 1320
ttatcccagt cttacaggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc gctgacatca 1380
gggagcaagc tcccatcttc cgctcgactg 1410
<210> 3
<211> 1444
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)
<400> 3
ttggtacctt agcggctggc tccaaaaagg ttaccccacc gacttcgggt gttacaaact 60
ctcgtggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga 120
tccgcgatta ctagcgattc cagcttcatg taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg 180
agaacggttt tatgagatta gctccacctc gcggtcttgc agctctttgt accgtccatt 240
gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc 300
ctccggtttg tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact taatgatggc aactaagatc 360
aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc 420
atgcaccacc tgtcactctg ctcccgaagg agaagcccta tctctagggt tttcagagga 480
tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt 540
gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggag 600
tgcttaatgc gttaacttca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc 660
gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttccgcgcct 720
cagtgtcagt tacagaccag aaagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca tatctctacg 780
catttcaccg ctacaacatg gaattccact ttcctcttct gcactcaagt ctcccagttt 840
ccaatgaccc tccacggttg agccgtgggc tttcacatca gacttaagaa accacctgcg 900
cgcgctttac gcccaataat tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct 960
ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccagc ttattcaact 1020
agcacttgtt cttccctaac aacagagttt tacgacccga aagccttcat cactcacgcg 1080
gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg 1140
agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc 1200
gttgccttgg tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gacgcgggtc catccataag 1260
tgacagccga agccgccttt caatttcgaa ccatgcggtt caaaatgtta tccggtatta 1320
gccccggttt cccggagtta tcccagtctt atgggcaggt tacccacgtg ttactcaccc 1380
gtccgccgct aacttcataa gagcaagctc ttaatccatt cgctcgactg cagtatagca 1440
cccg 1444
<210> 4
<211> 1427
<212> DNA
<213> 副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)
<400> 4
ccttcggcgg ctggctccaa aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60
gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120
attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca 180
gatttgtggg attggcttag cctcgcggct tcgctgccct ttgttctgcc cattgtagca 240
cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300
tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420
cacctgtcac tctgcccccg aaggggaagc cctatctcta gggttgtcag aggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600
atgcgtttgc tgcagcacta aagggcggaa accctctaac acttagcact catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc 720
agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780
ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840
cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgcgcgcttt 900
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960
gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtaccg ccctattcga acggtacttg 1020
ttcttcccta acaacagagt tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 1080
ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140
ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgttgcctt 1200
ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagct 1260
aaaagccacc ttttataatt gaaccatgcg gttcaatcaa gcatccggta ttagccccgg 1320
tttcccggag ttatcccagt cttacaggca ggttacccac gtgttactca cccgtccgcc 1380
gctaacatca gggagcaagc tcccatctgt ccgctcgact tgcatgt 1427
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcctccgctt attgatatgc 20
Claims (10)
1.一种餐厨垃圾高温生物降解用的微生物菌剂，其特征在于，包括：
(1)克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，株号ZJB-091，保藏号为CCTCC NO：M2019263；
(2)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，株号ZJB19163，保藏号为CCTCC NO：M2020014；
(3)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)，株号ZJB19165，保藏号为CCTCC NO：M2020015；
(4)副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)，株号ZJB19166，保藏号为CCTCCNO：M 2020016。
2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166的质量比为1∶1～2∶1∶1～2。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)ZJB-091，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZJB19163，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringlensis)ZJB19165和副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZJB19166的菌体干重质量比为1∶1∶1∶1。
4.权利要求1～3任一所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将4种菌株分别活化培养，
(2)将活化后的4种菌株分别进行种子培养获得种子液，
(3)将4种菌株的种子液分别发酵培养获得发酵液；
(4)将4种菌株的发酵液按比例混合，获得所述微生物菌剂。
5.权利要求1～3任一所述微生物菌剂在降解餐厨垃圾中的应用。
6.一种降解餐厨垃圾的方法，其特征在于，将权利要求1～3任一所述微生物菌剂加入到待降解的餐厨垃圾中进行生物降解。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，生物降解温度为50℃～55℃。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，生物降解温度为55℃。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物菌剂的接种量为不少于餐厨垃圾质量的1％。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述微生物菌剂的接种量为不少于餐厨垃圾质量的1.5％。
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