CN112410268A - 一株副地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811，其保藏编号为CCTCC M 2020759。本发明的生防细菌ZYGT1811能够显著抑制甘蓝枯萎病病原菌生长，使病原菌菌丝出现膨大变形及分支节间缩短现象。该菌株可产生淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、β‑1,3‑葡聚糖酶、铁载体、NH₃及IAA，具有固氮作用，不具有解磷解钾能力。该菌株对常见植物病原菌(立枯丝核菌、核盘菌、辣椒疫霉菌、串珠镰刀菌、茄病镰刀菌和禾谷镰刀菌)均有抑制效果，具有一定的广谱活性。该菌株对甘蓝枯萎病的防效为57.73％，与对照的防效相比差异显著。

Description

一株副地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于植物枯萎病生物防治技术领域，具体涉及一株副地衣芽孢杆菌及其应用，尤其是在制备防治甘蓝枯萎病的菌剂或药物中的应用。

背景技术

甘蓝枯萎病是一种由尖孢镰刀菌引起的典型土传性病害，可在土壤中保留数年甚至数十年，严重影响甘蓝品质和产量。近年来，此病在我国各甘蓝种植区均有发生，随着种植面积增加和种植年限的延长，此病日趋严重。此病的化学防治尚未发现特效药剂，目前主要依赖于常见的杀菌剂，如福美双、代森锰锌、多菌灵等，但其防效并不十分理想。而生产中为追求防治效果，获得更大的经济利益，化学药剂滥用、超剂量使用等现象时有发生，易加重土壤中农药残留、诱导病原菌抗药性，对食品安全和环境安全产生严重的负面影响。物理防治如蒸汽消毒、热水消毒、太阳能消毒等方法费时费力且成本较高，在实际生产中不适用。选用抗病品种是防治此病最为经济和有效的手段，但优良的抗病品种的选育周期较长，目前我国筛选出来的抗枯萎病的优良品种相对较少。近年来，农业生产中化学物质减量增效技术被大力提倡，发展绿色友好的可持续农业越来越受到重视。

生物防治在一定程度上可补充甚至替代化学防治，达到化学物质减量的作用，是目前极具研究价值的绿色防治方法。有益的植物、微生物相互作用是决定植物健康和土壤肥力的重要因素，生防菌的有益作用在各种重要的农作物生产中已得到证实。生防菌通过各种机制不仅可以抑制病原菌生长，还可诱导植物激素的产生，并增加与植物防御有关的过氧化物酶、多酚氧化酶和超氧化物歧化酶等的水平，由此增强植株对病害的系统抗性。芽孢杆菌属是当前被广泛研究的一类生防菌，其许多菌株不仅对多种植物病原体均有较好的拮抗活性，且具有显著的合成大量有益物质的能力。芽孢杆菌的作用机制较为复杂，已证实的有效机制主要有吲哚乙酸的产生、磷酸盐溶解、非共生固氮、HCN的产生、铁载体、水解酶和抗生素的产生，目前使用的一些高效芽孢杆菌菌株通常具有以上描述的多个特性。

副地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌，菌体呈杆状，其基因组中具有多个编码蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶和参与氮代谢、负责固氮调节的基因。研究表明其分泌胞外产物的活性较强，具有抑制植物病原菌、固氮作用和促进植物生长的能力。因此，副地衣芽孢杆菌是一种极具研究价值的细菌。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一株副地衣芽孢杆菌及其在防治甘蓝枯萎病中的应用。该菌株在与甘蓝枯萎病菌Fusarium oxysporum的平板对峙试验中，表现出明显的拮抗作用，且可促进甘蓝植株生长。

本发明提供一株副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811，分离自甘肃省张掖市高台县的盐渍土壤，于2020年11月18日保存至中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏编号为CCTCC M2020759。

本发明还提供副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌液，将上述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811 CCTCC M 2020759用LB固体培养基活化，然后于28℃，用LB液体培养基振荡培养得种子液，将种子液接种于发酵培养基中，于28℃下摇床培养，得副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌液。

作为优选，所述发酵培养基配方为：

本发明还提供上述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌株或副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌液在制备防治植物病原菌的菌剂或药物中的应用。

作为优选，所述植物病原菌包括立枯丝核菌、核盘菌、辣椒疫霉菌、串珠镰刀菌、茄病镰刀菌和禾谷镰刀菌。

本发明还提供上述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌株或副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌液在制备防治甘蓝枯萎病、促进甘蓝生长的菌剂或药物中的应用。

本发明的生防细菌ZYGT1811在平板上能够显著抑制甘蓝枯萎病病原菌生长，使甘蓝枯萎病病原菌菌丝出现膨大变形及分支节间缩短现象。该菌株可产生淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、β-1,3-葡聚糖酶、铁载体、NH₃及IAA，具有固氮作用，不具有解磷解钾能力。该菌株对其他6种常见植物病原(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、串珠镰刀菌(Fusariumverticillioides)、茄病镰刀菌(F.solani)和禾谷镰刀菌(F.graminearum))均有抑制效果，具有一定的广谱活性。盆栽防效测定结果显示该菌株对甘蓝枯萎病的防效为57.73％，与对照的防效相比差异显著。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为菌株ZYGT1811对甘蓝枯萎病菌平板抑制效果及菌丝的影响效果示意图；其中，A、对照；B、菌株ZYGT1811平板抑制效果；C、正常菌丝；D、受抑制的菌丝。

图2为菌株ZYGT1811抑菌促生活性测定结果；其中，A、淀粉酶；B、蛋白酶；C、果胶酶；D、β-1,3-葡聚糖酶；E、铁载体；F、固氮作用；G、产NH₃；H、产IAA。

图3为生防细菌ZYGT1811发酵液对甘蓝枯萎病的盆栽防效效果示意图；其中，A、清水对照；B、菌株ZYGT1811发酵液；C、枯草芽孢杆菌。

图4为生防细菌ZYGT1811的菌落形态及革兰氏染色效果图；其中，A.菌落形态；B.革兰氏染色结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明使用的材料及其来源如下：

供试菌：

甘蓝枯萎病病原菌(尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum)：由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。

6种常见植物病原菌：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、串珠镰刀菌(Fusariumverticillioides)、茄病镰刀菌(F.solani)和禾谷镰刀菌(F.graminearum)由甘肃省农业科学院植物保护研究所提供。

甘蓝种子：中甘21(北京中蔬园艺良种研究开发中心)。

药剂：70％代森锰锌可湿性粉剂(南通宝叶化工有限公司)，10亿孢子/克枯草芽孢杆菌(台湾百泰生物科技股份有限公司)。

实施例1生防细菌ZYGT1811的分离、筛选及其对常见植物病原菌的抑制效果测定

1.1生防细菌ZYGT1811的分离

土壤样品采集于甘肃省张掖市高台县的盐渍化地块。采用五点采样法采样，将土样混合后用密封袋带回，用网筛除去土块和植物残体，室温风干。称取10g土壤样品放入盛有90mL灭菌水的三角瓶中，制成10^-1浓度的土壤悬浮液，静置待土粒沉淀后吸取1mL上清液移入盛有9mL灭菌水的试管中，依次进行梯度稀释制成最终浓度为10^-5的土壤悬浮液。选择10^-3，10^-4和10^-5三个浓度的悬浮液各吸取200μL，用涂布棒均匀涂布至含10％NaCl的LB培养基平板上，每个浓度重复3次。将培养皿在28℃恒温培养5天，选择不同形态的菌落转移到新的含10％NaCl的LB培养基平板上，进行纯化培养。将菌株用冻存管(甘油含量为20％)置于-80℃超低温冰箱中冷冻长期保存。

1.2生防细菌ZYGT1811的筛选

将保存的细菌菌液在LB平板上划线培养48h，在直径90mm的空白PDA平板距边缘2cm位置处接种甘蓝枯萎病病原菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum，在相对位置处接种细菌单菌落，每组设3个重复，倒置于25℃恒温培养箱中培养，以病原菌单独培养作为对照。记录各组病原菌半径及抑菌带宽度，计算抑菌率。从筛选时的试验平板中抑菌带边缘和对照平板病原菌菌落边缘挑取菌丝于光学显微镜下观察菌丝的形态，对比并拍照记录。

1.3生防细菌ZYGT1811对常见植物病原菌的抑制效果测定

参照1.2的方法分别用6种常见植物病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、串珠镰刀菌(Fusariumverticillioides)、茄病镰刀菌(F.solani)和禾谷镰刀菌(F.graminearum)替代甘蓝枯萎病菌进行抑制效果测定。进一步明确该菌是否具有一定的广谱活性。

筛选结果表明生防细菌ZYGT1811能够显著抑制甘蓝枯萎病菌病原菌生长，使病原菌菌丝出现膨大变形及分支节间缩短现象(图1)，对其他6种常见植物病原均有抑制效果，具有一定的广谱活性。其对7种病原菌的抑菌率及抑菌带宽度见表1。

表1生防细菌ZYGT1811对病原菌的抑制效果

注：表中抑菌率为平均值，抑菌带宽度为平均值±标准差。

实施例2生防细菌ZYGT1811的抑菌促生活性测定

1.体外产酶活性检测

1.1产淀粉酶能力检测

将生防细菌ZYGT1811细菌菌株接在含可溶性淀粉的LB固体培养基(可溶性淀粉10g、酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂15g、水1000mL)，28℃培养3-5d，用革兰氏碘溶液淹没淀粉酶检测培养基，产生淀粉酶的菌落周围可见一个清晰的透明水解圈。观察并记录菌落及透明圈直径大小，通过计算其差值，判断菌株的产淀粉酶能力。

1.2产蛋白酶能力检测

将生防细菌ZYGT1811细菌菌株接在含脱脂奶粉的LB固体培养基(酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂15g、水900mL，脱脂奶粉7g、水100mL)，28℃培养3-5d，观察菌落周围是否出现一个清晰的透明水解圈，若出现，则说明有蛋白酶产生。观察并记录菌落及透明圈直径大小，通过计算其差值，判断菌株的产蛋白酶能力。

1.3产果胶酶能力检测

将生防细菌ZYGT1811细菌菌株接至果胶酶检测培养基(NaNO₃ 1g、K₂HPO₄ 1g、KCl1g、MgSO₄ 0.5g、酵母膏0.5g、葡萄糖1g、琼脂18g、水1000mL、果胶10g)，28℃培养3-5d，用革兰氏碘溶液淹没果胶酶检测培养基，产生果胶酶的菌落周围可见一个清晰的透明水解圈。观察并记录菌落及透明圈直径大小，通过计算其差值，判断菌株的产果胶酶能力。

1.4产β-1,3-葡聚糖酶能力检测

将生防细菌ZYGT1811细菌菌株接至含羧甲基纤维素钠的LB固体培养基(羧甲基纤维素钠10g、酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂15g、水1000mL)，28℃培养3-5d，用0.01％(质量体积比)的刚果红溶液对培养基进行染色后水洗，如可见菌落周围出现一个清晰的色圈，说明该菌株产生β-1,3-葡聚糖酶。观察并记录菌落及色圈直径大小，通过计算其差值，判断菌株的产β-1,3-葡聚糖酶能力。

2.促生类物质检测

2.1产铁载体能力检测

用铬天青S琼脂比色法检测产铁载体能力，参照Schwyn等的方法制备CAS琼脂培养培养基，将生防细菌ZYGT1811细菌菌株接至CAS琼脂培养基上，28℃培养7d，观察有无黄橙色晕圈出现，如有则说明菌株具有产生铁载体的能力。观察并记录菌落及色圈直径大小，通过计算其差值，判断菌株的产铁载体能力。

2.2产NH₃能力检测

将生防细菌ZYGT1811细菌菌株接种至10mL蛋白胨氨化培养基(蛋白胨5.0g、K₂HPO₄0.5g、NaCl 0.25g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、水1000mL)。置于恒温振荡器中28℃，150r/min培养3d，加入1.0mL Nessler显色剂，如有褐黄色颜色变化，则说明有NH₃产生，以培养基作为对照。

2.3产IAA能力检测

将生防细菌ZYGT1811细菌菌株接种至含L-色氨酸的King's培养基(蛋白胨20g、MgSO₄·7H₂O 1.5g、K₂HPO₄ 1.5g、L-色氨酸1g、水1000mL)中，置于恒温振荡器中，28℃，150r/min培养72h，取培养液在离心机中以12000r/min的速度离心10min。取上清液2.0mL加入4.0mL Salkawski显色剂，室温下显色30min，如有粉色产生则说明有IAA产生，以培养基作为对照。用分光光度计测量530nm处的OD值，以10～100mg/L商品吲哚乙酸作标准曲线，计算菌株产生的IAA浓度。

3.解磷解钾及固氮能力测定

3.1解磷能力检测

将生防细菌ZYGT1811细菌菌株接种至PVK培养基(酵母膏0.5g、葡萄糖10g、Ca₃(PO₄)₂ 5g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、KCl 0.2g、MgCl₂ 0.1g、MnSO₄ 0.0001g、Fe₂SO₄ 0.0001g、琼脂15g、水1000mL。)上，置28℃培养箱培养14d，观察有无透明圈出现，如有则说明菌株具有溶磷能力。记录菌落及透明圈直径大小，通过计算其差值，判断菌株的解磷能力。

3.2解钾能力检测

将生防细菌ZYGT1811细菌菌株接种至含钾长石粉的Aleksandrov培养基(葡萄糖5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeCl₃ 0.005g、CaCO₃ 2g、琼脂15g、2g钾长石粉、水1000mL)上，置28℃培养箱培养14d，观察有无透明圈出现，如有则说明菌株具有解钾能力。记录菌落及透明圈直径大小，通过计算其差值，判断菌株的解磷能力。

3.3固氮作用检测

挑取生防细菌ZYGT1811细菌菌株点接至Ashby无氮培养基(K₂HPO₄ 0.5g、CaCO₃0.5g、MnSO₄ 0.2g、NaCl 0.2g、CaSO₄ 0.1g、葡萄糖10g、琼脂15g、水1000mL)上，置28℃培养箱培养14d，观察是否正常生长，若是则说明菌株具有固氮能力。

上述研究结果显示，生防细菌ZYGT1811可产生淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、β-1,3-葡聚糖酶、铁载体、NH₃及IAA，具有固氮作用，不具有解磷解钾能力(图2)，经测量计算得出该菌IAA产量为4.93mg/L。其活性测定结果(表2)显示，生防细菌ZYGT1811产果胶酶、蛋白酶及β-1,3-葡聚糖酶活性较强。

表2生防细菌ZYGT1811抑菌促生活性测定结果

注：表中“+”表示具有该活性，“-”表示不具有该活性。

实施例3生防细菌ZYGT1811发酵液防治甘蓝枯萎病的盆栽试验

1.1生防细菌ZYGT1811发酵液的制备

菌株ZYGT1811接种在LB固体培养基上，于28℃进行活化后，转接于装有50mL LB液体培养基的100mL的三角瓶中，28℃，150r/min振荡培养24h获得种子液。将种子液以体积比1:100比例接种于发酵培养基

于28℃、150r/min摇床上培养24h后即得生防细菌ZYGT1811发酵液。

1.2生防细菌ZYGT1811发酵液对甘蓝枯萎病的盆栽防治效果测定

将甘蓝枯萎病病原菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum接种至PLB液体培养基(马铃薯200g/L，乳糖20g/L，水1000mL)中，摇床上培养3d后收集菌液，将菌液浓度稀释为1×10⁵个孢子/mL。选用感病甘蓝品种中甘21号，种子播种在装满园艺土壤的105孔育苗盘里，每孔一粒种子，在20-30℃的无病虫温室中培养4周后进行移栽。采用拌土法接种病原菌，病原菌液与园艺土壤按质量比1：10混合均匀后装入塑料盆中(直径10cm)，将幼苗进行伤根处理，置于细菌发酵液中浸根处理后移栽至装满带菌土壤的盆中，再进行灌根，每盆1株设3个处理。处理如下：(1)接种病原菌液后用100mL清水灌根；(2)接种病原菌液后用100mL生防细菌ZYGT1811发酵液灌根；(3)接种病原菌液后使用100mL商品枯草芽孢杆菌400倍液灌根；每个处理10株，试验重复3次，以接种病原菌液后清水灌根的处理为对照。在移栽当日、第7日和第14日分别进行3次灌根处理。根据甘蓝枯萎病病情分级标准：0级：无症状；1级：1片叶叶脉轻微变黄；2级：1～2片叶叶脉轻至中度变黄；3级：除心叶外，其余叶中度变黄或萎蔫；4级：全部叶片重度变黄或萎蔫；5级：叶片完全萎蔫并死亡，观察记录移栽50d后甘蓝的病情级别，计算其病情指数。

盆栽试验结果(表3)表明，生防细菌ZYGT1811发酵液对甘蓝枯萎病的防治效果为57.73％，商品枯草芽孢杆菌药液的防效为38.45％，两者具有显著性差异。从盆栽中植株生长可见(图3)，2种处理对甘蓝植株均有一定的促生效果。

表3生防细菌ZYGT1811发酵液的盆栽防效试验结果

注：表中病情指数为平均值，防治效果为平均值±标准差。

实施例4生防细菌ZYGT1811的鉴定

1.1形态学及鉴定

将菌株ZYGT1811划线接种于LB固体培养基上，28℃培养24h，观察菌落颜色、形状、边缘、表面、透明度和菌体的形态特征并进行革兰氏染色。

1.2分子生物学鉴定

采用细菌基因组提取试剂盒(天根，北京)提取菌株ZYGT1811的基因组DNA，利用通用引物27F和1492R扩增16S rRNA基因，使用25μL体系在PCR热循环仪上进行扩增。PCR反应条件：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火55℃45s，延伸72℃1min，30个循环；终延伸72℃10min。

利用引物gyrA-F(5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3')和gyrA-R(5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3')扩增gyrA基因，使用25μL体系在PCR热循环仪上进行扩增。PCR反应条件：预变性94℃5min；变性94℃1min，退火61℃1min，延伸72℃2min，30个循环；终延伸72℃10min。

利用引物UP1(5'-GAAGTCATCATGACCGTTCT GCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3')和UP2r(5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3')扩增gyrB基因，使用25μL体系在PCR热循环仪上进行扩增。PCR反应条件：预变性94℃4min；变性94℃1min，退火60℃1min，延伸72℃2min，35个循环；终延伸72℃10min。

上述25μL PCR反应体系均为：2×EasyTap SuperPCR Mix 12.5μL，引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板2μL，ddH₂O 8.5μL。

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送至基因测序公司(上海生工，上海)进行序列测定，测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对。菌株ZYGT1811的16S rRNA、gyrB、gyrA基因序列提交至NCBI数据库。

菌株ZYGT1811在LB固体培养基上的菌落呈淡黄色，不透明，有凸起，表面有褶皱，革兰氏染色结果显示为阳性，菌体为杆状(图4)。经扩增测序得到16S rRNA、gyrB和gyrA基因的序列长度分别为1484bp、1110bp和915bp，将所得序列提交至GenBank数据库与NCBI数据库中一些菌株的16S rRNA、gyrB和gyrA基因序列进行Blast比对，结果表明菌株ZYGT1811的16S rRNA、gyrB和gyrA基因序列与副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)的相似性分别为97.37％、100％和100％。基于同源性比对分析结果，将菌株ZYGT1811鉴定为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis))，16S rRNA、gyrB和gyrA基因序列登录号分别为MW269690、MW295645、MW280448。并将其于2020年11月18日，保存至中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏编号为CCTCC M2020759。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一株副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811，其保藏编号为CCTCCM 2020759。

2.副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌液，其特征在于：将权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811 CCTCC M 2020759用LB固体培养基活化，然后用LB液体培养基于28℃下振荡培养得种子液，将种子液接种于发酵培养基中，于28℃下摇床培养，得副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformisZYGT1811菌液。

3.根据权利要求2所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌液，其特征在于：所述发酵培养基配方为：

4.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌株或权利要求2或3所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌液在制备防治植物病原菌的菌剂或药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物病原菌包括立枯丝核菌、核盘菌、辣椒疫霉菌、串珠镰刀菌、茄病镰刀菌和禾谷镰刀菌。

6.权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌株或权利要求2或3所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis ZYGT1811菌液在制备防治甘蓝枯萎病、促进甘蓝生长的菌剂或药物中的应用。

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