CN111635922A - 一种核桃低聚肽粉及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核桃低聚肽粉及其制备方法和用途。所述低聚肽粉肽含量在80wt％以上，其中95％以上核桃肽的分子量小于1500Dalton。所述方法包括使用高效逆流提取法提取核桃蛋白，过滤、酶解，再将蛋白酶解液依次经过微滤膜与超滤膜高效分离纯化，最后浓缩喷雾，得到低聚肽粉。所述核桃低聚肽粉有改善睡眠作用、酒精性脂肪肝的保护作用、抑制脂肪的吸收、调节肠道pH值以改善有益菌群、增强营养吸收的功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种高纯度、低分子量的核桃低聚肽肽产品。本发明还涉及到核桃肽的制备并酶解，生成低聚核桃肽粉的制备方法，该肽粉可用作食品、保健食品或者药品。
背景技术
核桃(Juglans regia L)又名胡桃，属于四大坚果之一，具有很高的营养药用价值。在我国古医药书籍中,有明确记载,李时珍《本草纲目》记述“补气养血、润燥化痰、益命门、利三焦，温肺润肠。治肺润肠。治虚寒喘咳，腰脚重疼，心腹疝痛，血痢肠风，散肿毒，……”宋刘翰《开宝本草》载“胡桃(即核桃)味甘、平、无毒。食之令人肥健，润肌黑发，取瓤烧令黑，未断烟，和松脂，研傅瘰疬疮”。唐化孟诜《食疗本草》中说，核桃仁能“通经脉、黑须发，常服骨肉细腻光润”。崔禹锡的《食经》说它“多食利小便，去五痔”。《医林纂要》一书的评价是，可以“补肾，润命门，固精，润大肠，通热秘，止寒泻虚泻。”等等。
核桃中含有丰富的蛋白质、脂肪等营养成分，含量比较均衡，属于比较理想的高蛋白、高脂肪的食物，据报导，核桃仁中含有高达52％-70％的油脂，其中大部分为不饱和脂肪酸，另外还含有约24％的蛋白质，12％-16％的碳水化合物，1.5％-2％的纤维素，以及1.7％-2％的矿物质。核桃中富含人体必需的氨基酸，且氨基酸比例比较合理，其中对人体生理作用有着重要功能的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量均较高，其中谷氨酸还是影响人体特别是青少年智力及记忆发育的重要功能物质。
为了获得比核桃原蛋白在营养、功能性及生物活性上更加优良的低聚肽粉，已尝试了多种制备方法。
专利CN 101228918 A将核桃粕粉碎，超声波法提取核桃蛋白，将核桃蛋白真空干燥后，再使用蛋白酶进行酶解，离心，使用透析袋对上清液进行透析，经浓缩透析液并真空干燥得到含量在60％～80％的肽粉。该方法操作复杂，肽含量较低，肽分子量的分布也不明确，同时使用超声提取蛋白，透析袋进行精致，无法进行大规模制备。
专利CN 102406050 A使用碱提酸沉方法提取蛋白质，经冷冻干燥得到核桃蛋白粉，蛋白粉经酶解后，用300Mpa高压处理10min，冷冻干燥得核桃肽粉。此制备方法需超高压设备和冷冻干燥机，成本高，不适宜大规模生产；该发明专利虽然提供了该法制备的核桃肽粉的分子量分布，但产品中肽含量不明确。
专利CN 103103244 B使用碱提酸沉的方法提取蛋白质，并用微波结合超声波处理后，酶解得到多肽粉。该法仍不适用大规模生产，并且没有对酶解产品中肽含量进行测定。
专利CN 104293870 A先使用CO2超临界萃取仪去除油脂后得到的核桃粕，碱提酸沉后喷雾得到核桃蛋白粉，再将蛋白粉制成悬浊液并煮沸破坏蛋白质的结构，使用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶分段四步酶解核桃蛋白液，经5000Dalton或者8000Dalton超滤膜精制后使用离子交换树脂脱盐，最后喷雾干燥得到核桃肽粉。此专利涉及到去除油脂时使用超临界萃取仪，增加成本，不易于大生产；涉及到4种酶分段四步酶解，步骤繁琐、成本高；涉及到酶解完成后，未经过微滤膜除杂，直接进行超滤膜，造成超滤膜易阻塞，超滤时间延长，降低多肽收率，同时缩短超滤膜使用寿命；此专利未涉及到多肽产品中肽的百分含量和肽的分子量分布。
可见，以上核桃多肽的制备条件苛刻，工艺步骤繁琐，很难实现大规模生产，因此寻找一套工艺简单、低成本、高含量、较高活性的核桃多肽的制备方法已经成为寻找大规模生产的研究热点之一。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高纯度、低分子量的核桃低聚肽粉。
本发明的另一目的是提供了一种高纯度、低分子量的核桃低聚肽粉的制备方法。
本发明的另一目的是提供了含有本发明核桃低聚肽粉的药物和食品组合物。
本发明的另一目的是提供了本发明核桃低聚肽粉用于改善或者治疗睡眠障碍、提高睡眠质量、镇静、助眠的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明核桃低聚肽粉用于制备调节肠道有益菌群、提高肠胃动力、促进营养吸收的食品、保健食品或药品的应用。
本发明的另一目的是提供了本发明核桃低聚肽粉用于制备减少机体脂肪的摄入、提高脂肪代谢的食品、保健食品或药品的应用，优选用于保护酒精性或非酒精性脂肪肝的食品、保健食品、药品或者化妆品的应用。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种核桃低聚肽粉，采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在80wt％以上，其中95％以上核桃肽的分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下：
数均分子量范围：170～3000
重均分子量范围：180～4000
所述核桃低聚肽粉是通过下述方法制备得到的：
(1)核桃粕的预处理：将核桃去壳、冷榨脱油，得到脱脂核桃粕。
(2)逆流提取法提取蛋白质：将一定量脱脂后的核桃粕(记录为A)，与水按重量比为1:5～1:15混合，调节pH至9～11于室温提取1～2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的核桃粕(记录为B)，调节pH至9～11于室温提取1～2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的核桃粕(记录为C)，调节pH至9～11于室温提取1～2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1～2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为3～5，静置0.5～2h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10～1:20的水，搅拌均匀。
(3)蛋白酶解：将上述核桃蛋白液加热至40～55℃，将pH值调节至中性，加入核桃粕重量的0.5～2％生物酶，搅拌酶解3～6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。
(4)分离纯化：将蛋白酶解液使用孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经2000～20000Dalton超滤膜处理后，在50～80℃下浓缩至固含为3～5wt％时，进行喷雾干燥，进口温度为140～160℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的淡黄色核桃肽粉，产率可达20～30wt％。
(5)肽含量与分子量分布测定：采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在80wt％以上，其中95％以上的核桃肽的分子量小于1500Dalton。
所述生物酶选自食品级的中性蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40万u/g)、菠萝蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、碱性蛋白酶(酶活力≥20万u/g)、胃蛋白酶(酶活力≥50万u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一种或者它们的混合物，优选地使用中性蛋白酶或复合酶，所述复合酶的中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:1，中性蛋白酶的活力为30万u/g，木瓜蛋白酶的活力为50万u/g。
一种组合物，其含有本发明所述的核桃低聚肽粉和，药物或食品上可接受的助剂。
根据现有技术，本发明可将所述的组合物制备成任意所述剂型，如，素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
用于改善或者治疗睡眠障碍、提高睡眠、镇静质量的食品、保健食品或药品的应用，优选地，所述睡眠障碍选自心理压力和神经性疲劳睡眠障碍、入睡困难、深度睡眠时间短、浅睡时间长；用于制备减少机体脂肪的摄入、提高脂肪代谢的食品、保健食品或药品的应用，优选用于制备保护酒精性或非酒精性脂肪肝的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节胃肠道有益菌群、提高胃肠动力、促进营养吸收的食品、保健食品或药品的应用，所述菌群优选短乳杆菌。
附图说明
图1是实施例1中性蛋白酶酶解后肽液相色谱图；
图2是实施例2中性木瓜蛋白复合酶酶解后肽液相色谱图；
图3是gabra1相对表达量图，与模型对照组相比，**p<0.01，***p<0.001；
图4是mtnr1aa相对表达量，与模型对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例中用到的所有原料和溶剂均为市售相应纯度产品。
制备实施例1：
将100kg冷榨脱脂后的核桃粕(记录为A)，与水按重量比为1:10混合，调节pH至10于室温提取2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的核桃粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的核桃粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10的水，搅拌均匀。将上述核桃蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入1kg中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，在80℃下浓缩至固含为3.4％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的淡黄色核桃肽粉(批号T-1)，产率为21wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为81wt％，小于1500Dalton分子量占97％。中性蛋白酶酶解后肽含量结果如下所示：
测试结果：
制备实施例2：
将100kg冷榨脱脂后的核桃粕(记录为A)，与水按重量比为1:10混合，调节pH至10于室温提取2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的核桃粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的核桃粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10的水，搅拌均匀。将上述核桃蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入核桃粕重量的1kg中性木瓜复合蛋白酶(两种蛋白酶的质量比为1:1，中性蛋白酶的活力为30万u/g，木瓜蛋白酶的活力为50万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，在80℃下浓缩至固含为4.1％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的淡黄色核桃肽粉(批号T-2)，产率为21wt％。采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为81.3wt％，小于1500Dalton分子量占96％。中性木瓜蛋白复合酶酶解后肽含量结果如下所示：
测试结果：
生物活性实施例1：
核桃肽对镇静催眠改善睡眠作用评价
1.1 实验方案:
随机选取受精后5天(5dpf)正常野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(即每实验组)30尾，分别水溶给予核桃低聚肽的222μg/mL、667μg/mL、2000μg/mL，阳性对照药奥沙西泮100μM浓度，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔(实验组)容量为3mL。供试品处理24h后，将斑马鱼转移至96孔板中，每孔(即每浓度组)1尾，除正常对照组外，其余实验组用PTZ(戊四唑)诱导斑马鱼建立失眠模型，每个实验组随机选择10尾斑马鱼，应用行为分析仪测定斑马鱼的失眠时间和运动距离，以运动距离和失眠时间评价供试品对PTZ诱导的斑马鱼失眠症的镇静催眠作用。供试品对失眠症斑马鱼的镇静作用和睡眠改善作用的计算公式如下：
用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。
1.2 镇静作用
模型对照组斑马鱼运动距离(1552mm)与正常对照组(133mm)比较p<0.001，表明模型建立成功；阳性对照药奥沙西泮100μM浓度组斑马鱼运动距离为432mm，与模型对照组比较p<0.001，镇静作用为79％，说明奥沙西泮对PTZ诱导的斑马鱼失眠具有明显的镇静作用。
核桃低聚肽(T-1)222μg/mL、667μg/mL、2000μg/mL浓度斑马鱼运动距离分别为1493mm、1028mm、650mm，镇静作用分别为4％、37％、64％，与模型对照组比较p>0.05&p<0.001&p<0.001。提示核桃低聚肽在667和2000μg/mL浓度下对PTZ诱导的斑马鱼失眠症具有明显的镇静作用。
表1.核桃低聚肽对斑马鱼镇静作用定量数据(n＝13)
与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001
1.3 睡眠改善作用
模型对照组斑马鱼失眠时间(44.4s)与正常对照组(5.8s)比较p<0.001，表明模型建立成功；阳性对照药奥沙西泮100μM浓度组斑马鱼失眠时间为19.6s，与模型对照组比较p<0.001，睡眠改善作用为64％，说明奥沙西泮对PTZ诱导的斑马鱼失眠具有明显的改善作用。
核桃低聚肽(T-1)222μg/mL、667μg/mL、2000μg/mL浓度斑马鱼失眠时间分别为31.7s、28.6s、17.9s，睡眠改善作用分别为33％、41％、69％，与模型对照组比较p<0.05&p<0.01&p<0.001。提示在本实验浓度条件下对PTZ诱导的斑马鱼失眠症具有明显的睡眠改善作用。
表2.核桃低聚肽对斑马鱼睡眠改善作用定量数据(n＝13)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
1.4 核桃低聚肽对改善睡眠作用机制评价
随机选取1080尾受精后5天(5dpf)野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)均处理30尾，分别水溶给予核桃低聚肽(T-1)222、667和2000μg/mL浓度，阳性对照药奥沙西泮100μM浓度，同时设置正常对照组(养鱼水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔药液容量为3mL，平行三次实验。核桃低聚肽处理斑马鱼24小时后，除正常对照组外，其余实验组用PTZ(戊四唑)诱导斑马鱼建立失眠模型。PTZ(戊四唑)诱导斑马鱼一段时间后，使用经典Trizol法提取各实验组斑马鱼总RNA后，利用Thermo超微量分光光度计对总RNA浓度和纯度进行测定。取2μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20μL cDNA置于-20℃保存。用β-actin作为基因表达的内参，计算gabra1和mtnr1aa基因的RNA相对表达量。
RNA相对表达量＝2^ΔΔC(t)
ΔC(t)＝C(t)目的基因-C(t)β-actin
用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差。
1.4.1 实验结果
1.4.2 RNA提取结果及引物序列信息
核桃低聚肽处理结束后，提取斑马鱼总RNA，用超微量分光光度计测定RNA的浓度及A260/A280比值(如下所示)，A260/A280比值均在1.88-2.02之间，表明提取得到斑马鱼总RNA质量较好，可用于后续q-PCR实验，引物序列信息见表4。
表3.核桃低聚肽总RNA的浓度
表4.引物序列信息
1.2 核桃低聚肽(T-1)对斑马鱼gabra1和mtnr1aa基因表达的影响
根据基因相对表达量公式计算，模型对照组gabra1相对表达量为1.00，与正常对照组(1.26)比较p<0.001，表明模型建立成功。阳性对照药奥沙西泮100μM浓度组gabra1相对表达量为1.16，与模型对照组(1.00)比较p<0.01，表明阳性对照药奥沙西泮具有促进gabra1基因的表达。核桃低聚肽的222、667和2000μg/mL浓度组gabra1相对表达量分别为0.98、1.19和1.37，与模型对照组(1.00)比较p>0.05&p<0.01&p<0.001，提示“GF159”(不同浓度核桃低聚肽的活性试验代号)能够促进gabra1基因的表达。
根据基因相对表达量公式计算，模型对照组mtnr1aa相对表达量为1.00，与正常对照组(1.19)比较p<0.01，表明模型建立成功。阳性对照药奥沙西泮100μM浓度组mtnr1aa相对表达量为1.23，与模型对照组(1.00)比较p<0.05，表明阳性对照药奥沙西泮具有促进mtnr1aa基因的表达。核桃低聚肽的222、667和2000μg/mL浓度组mtnr1aa相对表达量分别为0.90、0.93和1.38，与模型对照组(1.00)比较p>0.05&p>0.05&p<0.01，提示“GF159”(不同浓度核桃低聚肽的活性试验代号)能够促进mtnr1aa基因的表达。详见表5、图3和图4。
表5.核桃低聚肽(T-1)对斑马鱼gabra1和mtnr1aa基因表达的影响
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
生物活性实施例2：
核桃肽对酒精性脂肪肝的保护作用评价
随机选取受精后5天(5dpf)黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼，用无水乙醇诱导斑马鱼建立酒精性脂肪肝模型。分别水溶给予T-1(62.5μg/mL)和阳性对照药RU21(100μg/mL)，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每孔药液容量为3mL。除正常对照组外，其余实验组分别与无水乙醇共同处理30h。处理结束后，将斑马鱼置入4％多聚甲醛中固定，4℃过夜后取出，用PBS冲洗3遍，用丙二醇进行梯度脱水，再使用新鲜配制并过滤后的0.5％油红O工作液中染色过夜，染色结束后每组随机取10尾斑马鱼在解剖显微镜下观察斑马鱼肝脏，拍照并保存图片。用NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析并采集数据，分析统计斑马鱼肝脏中的脂肪信号强度(S)，以肝脏脂肪信号强度的统计学分析结果评价核桃肽对无水乙醇诱导的酒精性脂肪肝的保护作用，统计学处理结果用mean±SE表示，实验结果如表6所示。保肝作用计算公式如下：
用T-test检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。
表6.供试品处理后斑马鱼保肝作用结果(n＝10)
与正常对照组比较，***p<0.001；与模型对照组比较，△△p<0.01，△△△p<0.001
由表6可以看出，模型对照组斑马鱼肝脏脂肪信号强度(17863像素)与正常对照组(11883像素)比较p<0.001，表明模型建立成功。阳性对照药RU21(100μg/mL)浓度组斑马鱼肝脏脂肪信号强度为12742像素，与模型对照组比较p<0.001，保肝作用为86％，说明RU21对斑马鱼酒精性脂肪肝具有保护作用。
核桃低聚肽为62.5μg/mL浓度组，斑马鱼肝脏脂肪信号强度分别为16093像素，与模型对照组比较为p<0.01，保肝作用分别为30％。提示在本实验浓度条件下，核桃肽对斑马鱼酒精性脂肪肝均具有明显的保护作用。
生物活性实施例3：
核桃低聚肽(T-1)对斑马鱼肠道菌群调节作用评价
使用CM-DiI标记短乳杆菌，以6×106个/mL浓度短乳杆菌饲喂5dpf无菌野生型AB品系斑马鱼，建立斑马鱼肠道共生性细菌模型；将饲喂短乳杆菌的无菌斑马鱼放置35℃培养至6dpf。6dpf时，移除短乳杆菌并随机分配至6孔板中，每孔30尾，每孔养鱼水容量为3mL。分别水溶核桃低聚肽浓度为2000μg/mL浓度，同时设置模型对照组和正常对照组。将各实验组斑马鱼继续置于35℃培养6h后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下采集图片，计算斑马鱼肠道内短乳杆菌荧光强度(S，该荧光强度表示肠道短乳杆菌数量)，以荧光强度的统计分析结果评价核桃低聚肽对肠道菌群的调节作用，结果如表7所示。公式如下：
统计学分析采用单因素方差分析和T检验，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。
表7.核桃低聚肽对肠道内短乳杆菌调节作用(n＝10)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p＝0.001
模型对照组斑马鱼肠道荧光强度为4189048像素，与正常对照组(1517330像素)比较p<0.001，表明肠道内有短乳杆菌生存，模型建立成功。核桃肽2000μg/mL浓度组的斑马鱼肠道荧光强度为5971246像素，与模型对照组418904像素比较p＝0.001，肠道菌群调节作用分别为43％。表明核桃低聚肽能明显促进肠道内短乳杆菌的生长，均有明显的肠道菌群调节作用。
Claims (10)
1.一种核桃低聚肽粉，其特征在于：采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在80wt％以上，其中95％以上核桃肽的分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下：
分子量Dalton分布
优选地，肽含量在81wt％以上，其中97％以上核桃肽的分子量小于1500Dalton；或肽含量在81.3wt％以上，其中96％以上核桃肽的分子量小于1500Dalton；
更优选地，肽含量在80～81.3wt％以上，其中95％～97％以上核桃肽的分子量小于1500Dalton；
最优选地，肽含量在81wt％，其中97％核桃肽的分子量小于1500Dalton；或肽含量在81.3wt％以上，其中96％以上核桃肽的分子量小于1500Dalton。
2.权利要求1所述核桃低聚肽粉的制备方法，其特征包括下述步骤：将冷榨脱脂后的核桃粕，使用高效逆流提取法提取蛋白质，过滤、酶解，再将蛋白酶解液依次经过微滤膜与超滤膜高效分离纯化，最后浓缩喷雾，得到核桃低聚肽粉。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
核桃粕的预处理：将核桃去壳、冷榨脱油，得到脱脂核桃粕；
高效逆流提取法提取蛋白质：将一定量脱脂后的核桃粕，记录为A，与水按重量比为1:5～1:15混合，调节pH至9～11于室温提取1～2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的核桃粕，记录为B，调节pH至9～11于室温提取1～2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的核桃粕，记录为C，调节pH至9～11于室温提取1～2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取1～2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为3～5，静置0.5～2h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10～1:20的水，搅拌均匀，得到核桃蛋白液；
蛋白酶解：将上述核桃蛋白液加热至40～55℃，将pH值调节至中性，加入核桃粕重量0.5～2％的生物酶，搅拌酶解3～6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。
分离纯化：将蛋白酶解液使用孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经2000～20000Dalton超滤膜处理后，在50～80℃下浓缩至固含为3～5wt％时，进行喷雾干燥，进口温度为140～160℃，出口温度为55～65℃，得到核桃低聚肽粉，产率20～30wt％。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述生物酶选自食品级的中性蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40万u/g)、菠萝蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、碱性蛋白酶(酶活力≥20万u/g)、胃蛋白酶(酶活力≥50万u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一种或者它们的混合物，优选地使用中性蛋白酶或复合酶，所述复合酶的中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为1:1，中性蛋白酶的活力为30万u/g，木瓜蛋白酶的活力为50万u/g。
5.一种权利要求1所述的核桃低聚肽粉，其特征在于是由权利要求1-4任一所述的方法制备得到。
6.根据权利要求5所述的核桃低聚肽粉，其特征在于当采用GB/T22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为81wt％，小于1500Dalton分子量占97％时，是采用下述方法制备得到的：将100kg冷榨脱脂后的核桃粕(记录为A)，与水按重量比为1:10混合，调节pH至10于室温提取2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的核桃粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的核桃粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10的水，搅拌均匀。将上述核桃蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入1kg中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，在80℃下浓缩至固含为3.4％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的淡黄色核桃肽粉，产率为21wt％。
7.根据权利要求5所述的核桃低聚肽粉，其特征在于当采用GB/T22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量为81.3wt％，小于1500Dalton分子量占96％时，是采用下述方法制备得到的：将100kg冷榨脱脂后的核桃粕(记录为A)，与水按重量比为1:10混合，调节pH至10于室温提取2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入等量的核桃粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入等量的核桃粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1:10的水，搅拌均匀。将上述核桃蛋白液加热至45℃，将pH值调节至中性，加入核桃粕重量的1kg中性木瓜复合蛋白酶(两种蛋白酶的质量比为1:1，中性蛋白酶的活力为30万u/g，木瓜蛋白酶的活力为50万u/g)，搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，在80℃下浓缩至固含为4.1％时，进行喷雾干燥，进口温度为140℃，出口温度为55～65℃，得到高纯度、低分子量的淡黄色核桃肽粉，产率为21wt％。
8.一种组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的核桃低聚肽粉和，药物或食品上可接受的助剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于：其剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
10.权利要求1所述的核桃肽粉，权利要求8或9所述的组合物用于制备改善或者治疗睡眠障碍、提高睡眠质量、镇静、助眠作用的食品、保健食品或药品的应用，优选地，所述睡眠障碍选自心理压力和神经性疲劳睡眠障碍、入睡困难、深度睡眠时间短、浅睡时间长；用于制备减少机体脂肪的摄入、提高脂肪代谢的食品、保健食品或药品的应用，优选用于制备保护酒精性或非酒精性脂肪肝的食品、保健食品或药品的应用；用于制备调节胃肠道有益菌群、提高胃肠动力、促进营养吸收的食品、保健食品或药品的应用，所述菌群优选短乳杆菌。
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