TW202113085A - 一種核桃低聚肽粉、含彼之組合物、製備方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種核桃低聚肽粉及其製備方法和用途。所述低聚肽粉肽含量在80wt%以上，其中95%以上核桃肽的分子量小於1500 Dalton。所述方法包括使用高效逆流提取法提取核桃蛋白，過濾、酶解，再將蛋白酶解液依次經過微濾膜與超濾膜高效分離純化，最後濃縮噴霧，得到低聚肽粉。所述核桃低聚肽粉有改善睡眠作用、酒精性脂肪肝的保護作用、抑制脂肪的吸收、調節腸道pH值以改善有益菌群、增強營養吸收的功效。
Description
本發明涉及一種高純度、低分子量的核桃低聚肽肽產品。本發明還涉及到核桃肽的製備並酶解，生成低聚核桃肽粉的製備方法，該肽粉可用作食品、保健食品或者藥品。
核桃(Juglans regia L)又名胡桃，屬於四大堅果之一，具有很高的營養藥用價值。在我國古醫藥書籍中, 有明確記載, 李時珍《本草綱目》記述“補氣養血、潤燥化痰、益命門、利三焦，溫肺潤腸。治肺潤腸。治虛寒喘咳，腰腳重疼，心腹疝痛，血痢腸風，散腫毒，...”宋劉翰《開寶本草》載“胡桃(即核桃)味甘、平、無毒。食之令人肥健，潤肌黑髮，取瓤燒令黑，未斷煙，和松脂，研傅瘰鬁瘡”。唐化孟詵《食療本草》中說，核桃仁能“通經脈、黑鬚髮，常服骨肉細膩光潤”。崔禹錫的《食經》說它“多食利小便，去五痔”。《醫林纂要》一書的評價是，可以“補腎，潤命門，固精，潤大腸，通熱秘，止寒瀉虛瀉。”等等。
核桃中含有豐富的蛋白質、脂肪等營養成分，含量比較均衡，屬於比較理想的高蛋白、高脂肪的食物，據報導，核桃仁中含有高達52%-70%的油脂，其中大部分為不飽和脂肪酸，另外還含有約24%的蛋白質，12%-16%的碳水化合物，1.5%-2%的纖維素，以及1.7%-2%的礦物質。核桃中富含人體必需的氨基酸，且氨基酸比例比較合理，其中對人體生理作用有著重要功能的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量均較高，其中谷氨酸還是影響人體特別是青少年智力及記憶發育的重要功能物質。
為了獲得比核桃原蛋白在營養、功能性及生物活性上更加優良的低聚肽粉，已嘗試了多種製備方法。
專利CN 101228918 A將核桃粕粉碎，超聲波法提取核桃蛋白，將核桃蛋白真空乾燥後，再使用蛋白酶進行酶解，離心，使用透析袋對上清液進行透析，經濃縮透析液並真空乾燥得到含量在60%~80%的肽粉。該方法操作複雜，肽含量較低，肽分子量的分佈也不明確，同時使用超聲提取蛋白，透析袋進行精緻，無法進行大規模製備。
專利CN 102406050 A使用鹼提酸沉方法提取蛋白質，經冷凍乾燥得到核桃蛋白粉，蛋白粉經酶解後，用300 Mpa高壓處理10 min，冷凍乾燥得核桃肽粉。此製備方法需超高壓設備和冷凍乾燥機，成本高，不適宜大規模生產；該發明專利雖然提供了該法製備的核桃肽粉的分子量分佈，但產品中肽含量不明確。
專利CN 103103244 B使用鹼提酸沉的方法提取蛋白質，並用微波結合超聲波處理後，酶解得到多肽粉。該法仍不適用大規模生產，並且沒有對酶解產品中肽含量進行測定。
專利CN 104293870 A先使用CO2
超臨界萃取儀去除油脂後得到的核桃粕，鹼提酸沉後噴霧得到核桃蛋白粉，再將蛋白粉製成懸濁液並煮沸破壞蛋白質的結構，使用鹼性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和鳳梨蛋白酶分段四步酶解核桃蛋白液，經5000 Dalton或者8000 Dalton 超濾膜精製後使用離子交換樹脂脫鹽，最後噴霧乾燥得到核桃肽粉。此專利涉及到去除油脂時使用超臨界萃取儀，增加成本，不易於大生產；涉及到4種酶分段四步酶解，步驟繁瑣、成本高；涉及到酶解完成後，未經過微濾膜除雜，直接進行超濾膜，造成超濾膜易阻塞，超濾時間延長，降低多肽收率，同時縮短超濾膜使用壽命；此專利未涉及到多肽產品中肽的百分含量和肽的分子量分佈。
可見，以上核桃多肽的製備條件苛刻，工藝步驟繁瑣，很難實現大規模生產，因此尋找一套工藝簡單、低成本、高含量、較高活性的核桃多肽的製備方法已經成為尋找大規模生產的研究熱點之一。
本發明的目的之一是提供一種高純度、低分子量的核桃低聚肽粉。
本發明的另一目的是提供了一種高純度、低分子量的核桃低聚肽粉的製備方法。
本發明的另一目的是提供了含有本發明核桃低聚肽粉的藥物和食品組合物。
本發明的另一目的是提供了本發明核桃低聚肽粉用於改善或者治療睡眠障礙、提高睡眠品質、鎮靜、助眠的食品、保健食品或藥品的應用。
本發明的另一目的是提供了本發明核桃低聚肽粉用於製備調節腸道有益菌群、提高腸胃動力、促進營養吸收的食品、保健食品或藥品的應用。
本發明的另一目的是提供了本發明核桃低聚肽粉用於製備減少機體脂肪的攝入、提高脂肪代謝的食品、保健食品或藥品的應用，優選用於保護酒精性或非酒精性脂肪肝的食品、保健食品、藥品或者化妝品的應用。
本發明的目的是通過下述技術方案實現的：
一種核桃低聚肽粉，採用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量在80wt%以上，其中95%以上核桃肽的分子量小於1500 Dalton，其分子量分佈如下：
數均分子量範圍：170~3000
重均分子量範圍：180~4000
所述核桃低聚肽粉是通過下述方法製備得到的：
(1) 核桃粕的預處理：將核桃去殼、冷榨脫油，得到脫脂核桃粕。
(2) 逆流提取法提取蛋白質：將一定量脫脂後的核桃粕(記錄為A)，與水按重量比為1:5~1:15混合，調節pH至9~11於室溫提取1~2 h；提取完成後，過濾，濾渣進行二次提取，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為B)，調節pH至9~11於室溫提取1~2 h；B完成第一次提取後，濾液待用，濾渣繼續進行第二次提取；A完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為C)，調節pH至9~11於室溫提取1~2 h；B完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取1~2 h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取後，濾渣棄去，濾液待用；最後合併以上待用濾液，調節pH為3~5，靜置0.5~2 h，棄去上清液，最後往沉澱物中加入體積比為1:10~1:20的水，攪拌均勻。
(3) 蛋白酶解：將上述核桃蛋白液加熱至40~55o
C，將pH值調節至中性，加入核桃粕重量的0.5~2%生物酶，攪拌酶解3~6 h後，煮沸滅活30 min，離心，上清液即為蛋白酶解液。
(4) 分離純化：將蛋白酶解液使用孔徑為0.1~0.5 µm的微濾膜進行過濾，透過液再經2000~20000 Dalton超濾膜處理後，在50~80o
C下濃縮至固含為3~5wt%時，進行噴霧乾燥，進口溫度為140~160o
C，出口溫度為55~65o
C，得到高純度、低分子量的淡黃色核桃肽粉，產率可達20~30wt%。
(5) 肽含量與分子量分佈測定：採用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量在80wt%以上，其中95%以上的核桃肽的分子量小於1500 Dalton。
所述生物酶選自食品級的中性蛋白酶(酶活力≥30萬u/g )、木瓜蛋白酶(酶活力≥40萬u/g )、鳳梨蛋白酶(酶活力≥30萬u/g )、鹼性蛋白酶(酶活力≥20萬u/g )、胃蛋白酶(酶活力≥50萬u/g )、胰酶(酶活力≥3000u/g )中的一種或者它們的混合物，優選地使用中性蛋白酶或複合酶，所述複合酶的中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的質量比為1:1，中性蛋白酶的活力為30萬u/g ，木瓜蛋白酶的活力為50萬u/g。
| 分子量 Dalton分佈 | |
| 分子量範圍 | 峰面積百分比 %，λ 220 nm |
| ＞ 1500 | ＜ 1 |
| 1500 ~ 1300 | 7 ~ 8 |
| 1300 ~ 500 | 20 ~ 25 |
| 500 ~ 200 | 50 ~ 55 |
| ＜ 200 | ＜ 20 |
一種組合物，其含有本發明所述的核桃低聚肽粉和，藥物或食品上可接受的助劑。
根據現有技術，本發明可將所述的組合物製備成任意所述劑型，如，素片、薄膜包衣片、糖衣片、腸衣片、分散片、膠囊、顆粒劑、口服溶液或口服混懸液。
用於改善或者治療睡眠障礙、提高睡眠、鎮靜品質的食品、保健食品或藥品的應用，優選地，所述睡眠障礙選自心理壓力和神經性疲勞睡眠障礙、入睡困難、深度睡眠時間短、淺睡時間長；用於製備減少機體脂肪的攝入、提高脂肪代謝的食品、保健食品或藥品的應用，優選用於製備保護酒精性或非酒精性脂肪肝的食品、保健食品或藥品的應用；用於製備調節胃腸道有益菌群、提高胃腸動力、促進營養吸收的食品、保健食品或藥品的應用，所述菌群優選短乳桿菌。
下面通過實施例對本發明作進一步說明。應該理解的是，本發明實施例所述方法僅僅是用於說明本發明，而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明製備方法的簡單改進都屬於本發明要求保護的範圍。實施例中用到的所有原料和溶劑均為市售相應純度產品。
製備實施例1：
將100 kg冷榨脫脂後的核桃粕(記錄為A)，與水按重量比為1:10混合，調節pH至10於室溫提取2 h；提取完成後，過濾，濾渣進行二次提取，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為B)，調節pH至10於室溫提取2 h；B完成第一次提取後，濾液待用，濾渣繼續進行第二次提取；A完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為C)，調節pH至10於室溫提取2 h；B完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取2 h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取後，濾渣棄去，濾液待用；最後合併以上待用濾液，調節pH為5，靜置6 h，棄去上清液，最後往沉澱物中加入體積比為1:10的水，攪拌均勻。將上述核桃蛋白液加熱至45o
C，將pH值調節至中性，加入1 kg中性蛋白酶(酶活力為30 萬u/g)，攪拌酶解6 h後，煮沸滅活30 min，離心，上清液即為蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為0.1 µm的微濾膜進行過濾，透過液再經5000 Dalton超濾膜處理後，在80o
C下濃縮至固含為3.4%時，進行噴霧乾燥，進口溫度為140o
C，出口溫度為55~65o
C，得到高純度、低分子量的淡黃色核桃肽粉(批號T-1)，產率為21wt%。採用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量為81wt%，小於1500 Dalton分子量占97%。中性蛋白酶酶解後肽含量結果如下所示：
| 測試結果： | ||||
| 測試項目 | 單位 | 測試方法 | 測試結果 003 | 方法檢出限 |
| 肽含量 | g/100g | GB/T22492-2008 附錄B | 81.0 | - |
| 酸溶蛋白 | g/100g | GB/T22492-2008 附錄B | 86.7 | - |
| L-天東氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.05 | 0.01 |
| L-蘇氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.07 | 0.01 |
| 絲氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.25 | 0.01 |
| 谷氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.27 | 0.01 |
| 甘氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.08 | 0.01 |
| L-丙氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.40 | 0.01 |
| L-胱氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.29 | 0.01 |
| L-纈氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.23 | 0.01 |
| L-蛋氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.04 | 0.01 |
| L-異亮氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.22 | 0.01 |
| L-亮氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.63 | 0.01 |
| L-酪氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.53 | 0.01 |
| 苯基丙氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 1.79 | 0.01 |
| 賴氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | ND | 0.01 |
| L-組氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.16 | 0.01 |
| L-色氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.14 | 0.01 |
| L-精氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.99 | 0.01 |
| L-脯氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | ND | 0.01 |
| 總和 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 6.14 | 0.01 |
製備實施例2：
將100 kg冷榨脫脂後的核桃粕(記錄為A)，與水按重量比為1:10混合，調節pH至10於室溫提取2 h；提取完成後，過濾，濾渣進行二次提取，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為B)，調節pH至10於室溫提取2 h；B完成第一次提取後，濾液待用，濾渣繼續進行第二次提取；A完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為C)，調節pH至10於室溫提取2 h；B完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取2 h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取後，濾渣棄去，濾液待用；最後合併以上待用濾液，調節pH為5，靜置6 h，棄去上清液，最後往沉澱物中加入體積比為1:10的水，攪拌均勻。將上述核桃蛋白液加熱至45o
C，將pH值調節至中性，加入核桃粕重量的1 kg中性木瓜複合蛋白酶(兩種蛋白酶的質量比為1:1，中性蛋白酶的活力為30萬u/g，木瓜蛋白酶的活力為50萬u/g)，攪拌酶解6 h後，煮沸滅活30 min，離心，上清液即為蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為0.1 µm的微濾膜進行過濾，透過液再經5000 Dalton超濾膜處理後，在80o
C下濃縮至固含為4.1%時，進行噴霧乾燥，進口溫度為140o
C，出口溫度為55~65o
C，得到高純度、低分子量的淡黃色核桃肽粉(批號T-2)，產率為21wt%。採用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量為81.3wt%，小於1500 Dalton分子量占96%。中性木瓜蛋白複合酶酶解後肽含量結果如下所示：
| 測試結果： | ||||
| 測試項目 | 單位 | 測試方法 | 測試結果 004 | 方法檢出限 |
| 肽含量 | g/100g | GB/T22492-2008 附錄B | 81.3 | - |
| L-天東氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.13 | 0.01 |
| L-蘇氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.11 | 0.01 |
| 絲氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.32 | 0.01 |
| 谷氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.44 | 0.01 |
| 甘氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.43 | 0.01 |
| L-丙氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.52 | 0.01 |
| L-纈氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.21 | 0.01 |
| L-蛋氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.08 | 0.01 |
| L-異亮氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.15 | 0.01 |
| L-亮氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.79 | 0.01 |
| L-酪氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.61 | 0.01 |
| 苯基丙氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 1.24 | 0.01 |
| 賴氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.66 | 0.01 |
| L-組氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 0.13 | 0.01 |
| L-精氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 1.29 | 0.01 |
| L-脯氨酸 | g/100g | GB/T 22492-2008 | ND | 0.01 |
| 16項氨基酸總和 | g/100g | GB/T 22492-2008 | 7.11 | 0.01 |
| 酸溶蛋白 | g/100g | GB/T22492-2008 附錄B | 88.4 | - |
生物活性實施例1：
核桃肽對鎮靜催眠改善睡眠作用評價
1.1實驗方案:
隨機選取受精後5天(5 dpf)正常野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔(即每實驗組)30尾，分別水溶給予核桃低聚肽的222 μg/mL、667 μg/mL、2000 μg/mL，陽性對照藥奧沙西泮100 μM濃度，同時設置正常對照組(養魚用水處理斑馬魚)和模型對照組，每孔(實驗組)容量為3 mL。供試品處理24 h後，將斑馬魚轉移至96孔板中，每孔(即每濃度組)1尾，除正常對照組外，其餘實驗組用PTZ(戊四唑)誘導斑馬魚建立失眠模型，每個實驗組隨機選擇10尾斑馬魚，應用行為分析儀測定斑馬魚的失眠時間和運動距離，以運動距離和失眠時間評價供試品對PTZ誘導的斑馬魚失眠症的鎮靜催眠作用。供試品對失眠症斑馬魚的鎮靜作用和睡眠改善作用的計算公式如下：
鎮靜作用(%)=
×100%
睡眠改善作用(%)=
×100%
用方差分析和Dunnett’s T-檢驗進行統計學分析，p ＜ 0.05表明具有顯著性差異，提供具有代表性的實驗圖譜。
1.2鎮靜作用
模型對照組斑馬魚運動距離(1552 mm)與正常對照組(133 mm)比較p ＜ 0.001，表明模型建立成功；陽性對照藥奧沙西泮100 μM濃度組斑馬魚運動距離為432 mm，與模型對照組比較p ＜ 0.001，鎮靜作用為79%，說明奧沙西泮對PTZ誘導的斑馬魚失眠具有明顯的鎮靜作用。
核桃低聚肽(T-1)222 μg/mL、667 μg/mL、2000 μg/mL濃度斑馬魚運動距離分別為1493 mm、1028 mm、650 mm，鎮靜作用分別為4%、37%、64%，與模型對照組比較p ＞ 0.05 & p ＜ 0.001 & p ＜ 0.001。提示核桃低聚肽在667和2000 μg/mL濃度下對PTZ誘導的斑馬魚失眠症具有明顯的鎮靜作用。
表1. 核桃低聚肽對斑馬魚鎮靜作用定量資料(n=13)
與模型對照組比較，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001
| 組別 | 濃度(μg/mL) | 運動距離(mm) (mean ± SE) | 鎮靜作用(%) |
| 正常對照組 | - | 133 ± 29 | - |
| 模型對照組 | - | 1552 ± 111 | - |
| 奧沙西泮 | 100 μM | 432 ± 35*** | 79*** |
| T-1 | 222 | 1493 ± 102 | 4 |
| 667 | 1028 ± 88*** | 37*** | |
| 2000 | 650 ± 85*** | 64*** |
1.3睡眠改善作用
模型對照組斑馬魚失眠時間(44.4 s)與正常對照組(5.8 s)比較p ＜ 0.001，表明模型建立成功；陽性對照藥奧沙西泮100 μM濃度組斑馬魚失眠時間為19.6 s，與模型對照組比較p ＜ 0.001，睡眠改善作用為64%，說明奧沙西泮對PTZ誘導的斑馬魚失眠具有明顯的改善作用。
核桃低聚肽(T-1)222 μg/mL、667 μg/mL、2000 μg/mL濃度斑馬魚失眠時間分別為31.7 s、28.6 s、17.9 s，睡眠改善作用分別為33%、41%、69%，與模型對照組比較p ＜ 0.05 & p ＜ 0.01 & p ＜ 0.001。提示在本實驗濃度條件下對PTZ誘導的斑馬魚失眠症具有明顯的睡眠改善作用。
表2. 核桃低聚肽對斑馬魚睡眠改善作用定量資料(n=13)
與模型對照組比較，* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001
| 組別 | 濃度(μg/mL) | 失眠時間(S) (mean ± SE) | 睡眠改善作用(%) |
| 正常對照組 | - | 5.8 ± 1.3 | - |
| 模型對照組 | - | 44.4 ± 4.1 | - |
| 奧沙西泮 | 100 μM | 19.6 ± 1.5*** | 64*** |
| T-1 | 222 | 31.7 ± 2.8* | 33* |
| 667 | 28.6 ± 3.6** | 41** | |
| 2000 | 17.9 ± 2.2*** | 69*** |
1.4核桃低聚肽對改善睡眠作用機制評價
隨機選取1080尾受精後5天(5 dpf)野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾，分別水溶給予核桃低聚肽(T-1)222、667和2000 µg/mL濃度，陽性對照藥奧沙西泮100 μM濃度，同時設置正常對照組(養魚水處理斑馬魚)和模型對照組，每孔藥液容量為3 mL，平行三次實驗。核桃低聚肽處理斑馬魚24小時後，除正常對照組外，其餘實驗組用PTZ(戊四唑)誘導斑馬魚建立失眠模型。PTZ(戊四唑)誘導斑馬魚一段時間後，使用經典Trizol法提取各實驗組斑馬魚總RNA後，利用Thermo超微量分光光度計對總RNA濃度和純度進行測定。取2 μg斑馬魚樣品總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明操作，合成20 μL cDNA置於-20 ℃保存。用β-actin作為基因表達的內參，計算gabra1和mtnr1aa基因的RNA相對表達量。
用方差分析和Dunnett’s T-檢驗進行統計學分析，p ＜ 0.05表明具有顯著性差。
1.4.1實驗結果
1.4.2 RNA提取結果及引物序列資訊
核桃低聚肽處理結束後，提取斑馬魚總RNA，用超微量分光光度計測定RNA的濃度及A260/A280比值(如下所示)，A260/A280比值均在1.88-2.02之間，表明提取得到斑馬魚總RNA品質較好，可用於後續q-PCR實驗，引物序列資訊見表4。
表3. 核桃低聚肽總RNA的濃度
| 組別 | 濃度(μg/mL) | 平行對照組(濃度：μg/μL) | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| 正常對照組 | - | 1.30 | 1.19 | 0.91 |
| 模型對照組 | - | 1.30 | 1.15 | 1.09 |
| 奧沙西泮 | 100 μM | 1.29 | 1.18 | 1.12 |
| T-1 | 222 | 0.98 | 0.92 | 0.93 |
| 667 | 1.14 | 1.01 | 0.92 | |
| 2000 | 1.22 | 0.87 | 0.94 |
表4. 引物序列資訊
| 基因 | 引物序列 | |
| β-actin | Forward | 5’-TCGAGCAGGAGATGGGAACC-3’ |
| Reverse | 5’-CTCGTGGATACCGCAAGATTC-3’ | |
| gabra1 | Forward | 5’-CATTCCGGGTGAGTCAGAGAC-3’ |
| Reverse | 5’-GTGACCAGTAAACAGGCCCA-3’ | |
| mtnr1aa | Forward | 5’-TATTTCACCGGGGCTGGAAC-3’ |
| Reverse | 5’-CATACTGCAAGGAGCCCACA-3’ |
1.2 核桃低聚肽(T-1)對斑馬魚gabra1和mtnr1aa基因表達的影響
根據基因相對表達量公式計算，模型對照組gabra1相對表達量為1.00，與正常對照組(1.26)比較p ＜ 0.001，表明模型建立成功。陽性對照藥奧沙西泮100 µM濃度組gabra1相對表達量為1.16，與模型對照組(1.00)比較p ＜ 0.01，表明陽性對照藥奧沙西泮具有促進gabra1基因的表達。核桃低聚肽的222、667和2000 µg/mL濃度組gabra1相對表達量分別為0.98、1.19和1.37，與模型對照組(1.00)比較p ＞ 0.05 & p ＜ 0.01 & p ＜ 0.001，提示“GF159”(不同濃度核桃低聚肽的活性試驗代號)能夠促進gabra1基因的表達。
根據基因相對表達量公式計算，模型對照組mtnr1aa相對表達量為1.00，與正常對照組(1.19)比較p ＜ 0.01，表明模型建立成功。陽性對照藥奧沙西泮100 µM濃度組mtnr1aa相對表達量為1.23，與模型對照組(1.00)比較p ＜ 0.05，表明陽性對照藥奧沙西泮具有促進mtnr1aa基因的表達。核桃低聚肽的222、667和2000 µg/mL濃度組mtnr1aa相對表達量分別為0.90、0.93和1.38，與模型對照組(1.00)比較p ＞ 0.05 & p ＞ 0.05 & p ＜ 0.01，提示“GF159”(不同濃度核桃低聚肽的活性試驗代號)能夠促進mtnr1aa基因的表達。詳見表5、第3圖和第4圖。
表5. 核桃低聚肽(T-1)對斑馬魚gabra1
和mtnr1aa
基因表達的影響
與模型對照組比較，*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001
| 組別 | 濃度(μg/mL) | gabra1 (mean ± SE) | mtnr1aa (mean ± SE) |
| 正常對照組 | - | 1.26 ± 0.028 | 1.19 ± 0.010 |
| 模型對照組 | - | 1.00 ± 0.007 | 1.00 ± 0.029 |
| 奧沙西泮 | 100 μM | 1.16 ± 0.033** | 1.23 ± 0.047* |
| T-1 | 222 | 0.98 ± 0.028 | 0.90 ± 0.028 |
| 667 | 1.19 ± 0.019** | 0.93 ± 0.008 | |
| 2000 | 1.37 ± 0.040*** | 1.38 ± 0.104** |
生物活性實施例2：
核桃肽對酒精性脂肪肝的保護作用評價
隨機選取受精後5天(5 dpf)黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚于六孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚，用無水乙醇誘導斑馬魚建立酒精性脂肪肝模型。分別水溶給予T-1(62.5 μg/mL)和陽性對照藥RU21(100 µg/mL)，同時設置正常對照組(養魚用水處理斑馬魚)和模型對照組，每孔藥液容量為3 mL。除正常對照組外，其餘實驗組分別與無水乙醇共同處理30 h。處理結束後，將斑馬魚置入4%多聚甲醛中固定，4℃過夜後取出，用PBS沖洗3遍，用丙二醇進行梯度脫水，再使用新鮮配製並過濾後的0.5%油紅O工作液中染色過夜，染色結束後每組隨機取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下觀察斑馬魚肝臟，拍照並保存圖片。用NIS-Elements D 3.10高級影像處理軟體進行圖像分析並採集資料，分析統計斑馬魚肝臟中的脂肪信號強度(S)，以肝臟脂肪信號強度的統計學分析結果評價核桃肽對無水乙醇誘導的酒精性脂肪肝的保護作用，統計學處理結果用mean ± SE表示，實驗結果如表6所示。保肝作用計算公式如下：
保肝作用 (%) =
× 100%
用T-test檢驗進行統計學分析，p
＜ 0.05表明具有顯著性差異。
表6. 供試品處理後斑馬魚保肝作用結果(n
=10)
與正常對照組比較，***p
＜ 0.001；與模型對照組比較，ΔΔ p
＜ 0.01，ΔΔΔ p
＜ 0.001
| 組別 | 濃度 (µg/mL) | 肝臟脂肪信號強度 (圖元，mean ± SE) | 保肝作用 (%) |
| 正常對照組 | - | 11883 ± 437 | - |
| 模型對照組 | - | 17863 ± 366*** | - |
| RU21 | 100 | 12742 ± 450ΔΔΔ | 86 |
| T-1 | 62.5 | 16093 ± 427ΔΔ | 30 |
由表6可以看出，模型對照組斑馬魚肝臟脂肪信號強度(17863圖元)與正常對照組(11883圖元)比較p ＜ 0.001，表明模型建立成功。陽性對照藥RU21(100 μg/mL)濃度組斑馬魚肝臟脂肪信號強度為12742圖元，與模型對照組比較p ＜ 0.001，保肝作用為86%，說明RU21對斑馬魚酒精性脂肪肝具有保護作用。
核桃低聚肽為62.5 μg/mL濃度組，斑馬魚肝臟脂肪信號強度分別為16093圖元，與模型對照組比較為p ＜ 0.01，保肝作用分別為30%。提示在本實驗濃度條件下，核桃肽對斑馬魚酒精性脂肪肝均具有明顯的保護作用。
生物活性實施例3：
核桃低聚肽(T-1)對斑馬魚腸道菌群調節作用評價
使用CM-DiI標記短乳桿菌，以6×106
個/mL濃度短乳桿菌飼喂5 dpf無菌野生型AB品系斑馬魚，建立斑馬魚腸道共生性細菌模型；將飼喂短乳桿菌的無菌斑馬魚放置35℃培養至6 dpf。6 dpf時，移除短乳桿菌並隨機分配至6孔板中，每孔30尾，每孔養魚水容量為3 mL。分別水溶核桃低聚肽濃度為2000 μg/mL濃度，同時設置模型對照組和正常對照組。將各實驗組斑馬魚繼續置於35℃培養6 h後，每個實驗組隨機選擇10尾斑馬魚在螢光顯微鏡下採集圖片，計算斑馬魚腸道內短乳桿菌螢光強度(S，該螢光強度表示腸道短乳桿菌數量)，以螢光強度的統計分析結果評價核桃低聚肽對腸道菌群的調節作用，結果如表7所示。公式如下：
×100%
統計學分析採用單因素方差分析和T檢驗，p
＜ 0.05表明具有顯著性差異，提供具有代表性的實驗圖譜。
表7. 核桃低聚肽對腸道內短乳桿菌調節作用(n
=10)
與模型對照組比較，*p
＜ 0.05，**p
＜ 0.01，***p
= 0.001
| 組別 | 濃度(μg/mL) | 腸道螢光強度總和 (圖元，mean±SE) | 腸道菌群調節作用(%) |
| 正常對照組 | - | 1517330 ± 33201 | - |
| 模型對照組 | - | 4189048 ± 232843 | - |
| T-1 | 2000 | 5971246 ± 351230*** | 43*** |
模型對照組斑馬魚腸道螢光強度為4189048圖元，與正常對照組(1517330圖元)比較p
＜ 0.001，表明腸道內有短乳桿菌生存，模型建立成功。核桃肽2000 μg/mL濃度組的斑馬魚腸道螢光強度為5971246圖元，與模型對照組418904圖元比較p
= 0.001，腸道菌群調節作用分別為43%。表明核桃低聚肽能明顯促進腸道內短乳桿菌的生長，均有明顯的腸道菌群調節作用。
無
第1圖是實施例1中性蛋白酶酶解後肽液相色譜圖；
第2圖是實施例2中性木瓜蛋白複合酶酶解後肽液相色譜圖；
第3圖是gabra1
相對表達量圖，與模型對照組相比，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001；以及
第4圖是mtnr1aa
相對表達量，與模型對照組相比，*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記)
無
國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無
Claims (10)
- 一種核桃低聚肽粉：採用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量在80wt%以上，其中95%以上核桃肽的分子量小於1500 Dalton，其分子量分佈如下：
分子量 Dalton分佈 分子量範圍 峰面積百分比 %，λ 220 nm ＞ 1500 ＜ 1 1500 ~ 1300 7 ~ 8 1300 ~ 500 20 ~ 25 500 ~ 200 50 ~ 55 ＜ 200 ＜ 20 - 一種如請求項1所述的核桃低聚肽粉的製備方法，包括下述步驟：將冷榨脫脂後的核桃粕，使用高效逆流提取法提取蛋白質，過濾、酶解，再將蛋白酶解液依次經過微濾膜與超濾膜高效分離純化，最後濃縮噴霧，得到核桃低聚肽粉。
- 如請求項2所述的製備方法，包括下述步驟： 核桃粕的預處理：將核桃去殼、冷榨脫油，得到脫脂核桃粕； 高效逆流提取法提取蛋白質：將一定量脫脂後的核桃粕，記錄為A，與水按重量比為1:5~1:15混合，調節pH至9~11於室溫提取1~2 h；提取完成後，過濾，濾渣進行二次提取，濾液倒入等量的核桃粕，記錄為B，調節pH至9~11於室溫提取1~2 h；B完成第一次提取後，濾液待用，濾渣繼續進行第二次提取；A完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入等量的核桃粕，記錄為C，調節pH至9~11於室溫提取1~2 h；B完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取1~2 h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取後，濾渣棄去，濾液待用；最後合併以上待用濾液，調節pH為3~5，靜置0.5~2 h，棄去上清液，最後往沉澱物中加入體積比為1:10~1:20的水，攪拌均勻，得到核桃蛋白液； 蛋白酶解：將上述核桃蛋白液加熱至40~55o C，將pH值調節至中性，加入核桃粕重量0.5~2%的生物酶，攪拌酶解3~6 h後，煮沸滅活30 min，離心，上清液即為蛋白酶解液。 分離純化：將蛋白酶解液使用孔徑為0.1~0.5 µm的微濾膜進行過濾，透過液再經2000~20000 Dalton超濾膜處理後，在50~80o C下濃縮至固含為3~5wt%時，進行噴霧乾燥，進口溫度為140~160o C，出口溫度為55~65o C，得到核桃低聚肽粉，產率20~30wt%。
- 如請求項3所述的製備方法，其中所述生物酶選自食品級的中性蛋白酶(酶活力≥30萬u/g )、木瓜蛋白酶(酶活力≥40萬u/g )、鳳梨蛋白酶(酶活力≥30萬u/g )、鹼性蛋白酶(酶活力≥20萬u/g )、胃蛋白酶(酶活力≥50萬u/g )、胰酶(酶活力≥3000u/g )中的一種或者它們的混合物，優選地使用中性蛋白酶或複合酶，所述複合酶的中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的質量比為1:1，中性蛋白酶的活力為30萬u/g，木瓜蛋白酶的活力為50萬u/g。
- 一種如請求項1所述的核桃低聚肽粉，其是由如請求項1-4中任一項所述的方法製備得到。
- 如請求項5所述的核桃低聚肽粉，其中當採用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量為81wt%，小於1500 Dalton分子量占97%時，是採用下述方法製備得到的：將100 kg冷榨脫脂後的核桃粕(記錄為A)，與水按重量比為1:10混合，調節pH至10於室溫提取2 h；提取完成後，過濾，濾渣進行二次提取，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為B)，調節pH至10於室溫提取2 h；B完成第一次提取後，濾液待用，濾渣繼續進行第二次提取；A完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為C)，調節pH至10於室溫提取2 h；B完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取2 h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取後，濾渣棄去，濾液待用；最後合併以上待用濾液，調節pH為5，靜置6 h，棄去上清液，最後往沉澱物中加入體積比為1:10的水，攪拌均勻。將上述核桃蛋白液加熱至45o C，將pH值調節至中性，加入1 kg中性蛋白酶(酶活力為30 萬u/g)，攪拌酶解6 h後，煮沸滅活30 min，離心，上清液即為蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為0.1 µm的微濾膜進行過濾，透過液再經5000 Dalton超濾膜處理後，在80o C下濃縮至固含為3.4%時，進行噴霧乾燥，進口溫度為140o C，出口溫度為55~65o C，得到高純度、低分子量的淡黃色核桃肽粉，產率為21wt%。
- 如請求項5所述的核桃低聚肽粉，其中當採用GB/T 22492-2008附錄A與附錄B的檢測方法，測得肽含量為81.3wt%，小於1500 Dalton分子量占96%時，是採用下述方法製備得到的：將100 kg冷榨脫脂後的核桃粕(記錄為A)，與水按重量比為1:10混合，調節pH至10於室溫提取2 h；提取完成後，過濾，濾渣進行二次提取，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為B)，調節pH至10於室溫提取2 h；B完成第一次提取後，濾液待用，濾渣繼續進行第二次提取；A完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入等量的核桃粕(記錄為C)，調節pH至10於室溫提取2 h；B完成二次提取後，濾渣棄去，濾液倒入C完成第一次提取的濾渣中提取2 h，而C第一次提取的濾液待用；樣品C完成第二次提取後，濾渣棄去，濾液待用；最後合併以上待用濾液，調節pH為5，靜置6 h，棄去上清液，最後往沉澱物中加入體積比為1:10的水，攪拌均勻。將上述核桃蛋白液加熱至45o C，將pH值調節至中性，加入核桃粕重量的1 kg中性木瓜複合蛋白酶(兩種蛋白酶的質量比為1:1，中性蛋白酶的活力為30萬u/g，木瓜蛋白酶的活力為50萬u/g)，攪拌酶解6 h後，煮沸滅活30 min，離心，上清液即為蛋白酶解液。將蛋白酶解液使用孔徑為0.1 µm的微濾膜進行過濾，透過液再經5000 Dalton超濾膜處理後，在80o C下濃縮至固含為4.1%時，進行噴霧乾燥，進口溫度為140o C，出口溫度為55~65o C，得到高純度、低分子量的淡黃色核桃肽粉，產率為21wt%。
- 一種組合物，包含有如請求項1所述的核桃低聚肽粉和，藥物或食品上可接受的助劑。
- 如請求項8所述的組合物，其中該組合物的劑型選自素片、薄膜包衣片、糖衣片、腸衣片、分散片、膠囊、顆粒劑、口服溶液或口服混懸液。
- 一種如請求項1所述的核桃肽粉、如請求項8或9所述的組合物用於製備改善或者治療睡眠障礙、提高睡眠品質、鎮靜、助眠作用的食品、保健食品或藥品的應用，優選地，所述睡眠障礙選自心理壓力和神經性疲勞睡眠障礙、入睡困難、深度睡眠時間短、淺睡時間長；用於製備減少機體脂肪的攝入、提高脂肪代謝的食品、保健食品或藥品的應用，優選用於製備保護酒精性或非酒精性脂肪肝的食品、保健食品或藥品的應用；用於製備調節胃腸道有益菌群、提高胃腸動力、促進營養吸收的食品、保健食品或藥品的應用，所述菌群優選短乳桿菌。
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