CN111549024B - 一种核酸提取试纸条及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸提取试纸条及其使用方法，属于分子生物学检测技术领域；所述核酸提取试纸条包括手持区和核酸结合区；所述核酸提取试纸条以带有不干胶薄膜的PVC底板为主体；PVC底板的一端粘附有纤维素滤纸，为核酸结合区；PVC底板上未粘附纤维素滤纸的区域为手持区(疏水端)。本发明的核酸提取试纸条结构简单，使用过程中不需要复杂仪器。利用本发明的核酸提取试纸条能在25～50s内对生物样本中的核酸进行快速提取纯化，并基于该核酸提取试纸条，运用PCR、LAMP扩增技术对生物样品进行快速的分子检测技术。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种核酸提取试纸条及 其使用方法。
背景技术
生物样本的分子检测，一般先提取生物样本中的基因组，然后根据所需 检测的目的基因设计上下游引物并利用PCR技术扩增目的基因。PCR检测 首先需要提取样本中的DNA。目前实验室常用的DNA提取方法包括TPS 提取法、CTAB提取法以及SDS提取法等。以上DNA提取方法需要用到水 浴锅、离心机、移液器等实验设备以及氯仿、异丙醇、乙醇等有机试剂。提 取过程操作繁琐，难度系数较高，耗时较长；同时，有机试剂会对操作者的 身体健康造成危害。目前需要一种操作简便、提取时间短的核酸提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸提取试纸条及其使用方法，利用本发明 的核酸提取试纸条，提取时间短且操作简便。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种核酸提取试纸条，包括手持区和核酸结合区；所述核 酸提取试纸条以带有不干胶薄膜的PVC底板为主体；PVC底板的一端粘附 有纤维素滤纸，为核酸结合区；PVC底板上未粘附纤维素滤纸的区域为手持 区。
优选的，所述PVC底板的长×宽为：42～46mm×2mm；所述纤维素滤纸 的长×宽为：3.8～4.2mm×2mm。
本发明提供了上述方案所述核酸提取试纸条的使用方法，包括以下步 骤：
1)将生物样品加入到核酸提取液中，得到混合液，对所述混合液研磨 8～15s，得到核酸粗提液；
2)将上述方案所述核酸提取试纸条的核酸结合区浸入到步骤1)所述核 酸粗提液中8～15s，得到第一试纸条；
3)将步骤2)所述第一试纸条浸入到洗脱液中3～8s，得到第二试纸条；
4)将步骤3)所述第二试纸条浸入到扩增体系中3～8s，释放提取到的 核酸，得到完整扩增体系，进行扩增反应；所述扩增体系中缺少扩增模板。
优选的，步骤1)中所述核酸提取液包括以下摩尔浓度的组分：Tris 90～110mM、KCl0.8～1.2M和EDTA8～12mM；所述核酸提取液的pH值为 7.8～8.2。
优选的，步骤1)中所述生物样品的质量和核酸提取液的体积的比例为 20mg：300μL。
优选的，步骤3)中所述洗脱液包括以下浓度的组分：Tris9～11mM和 体积百分含量为0.05％～0.15％的Tween-20。
优选的，步骤4)中所述扩增体系包括PCR扩增体系或LAMP扩增体 系。
优选的，缺少扩增模板的LAMP扩增体系以24μL计，包括以下组分： 2×HNB LAMPMix 12.5μL，10×LAMP Primer Mix 2.5μL，5M Betain 3μL， Bst2.0DNA Polymerase 1μL和ddH2O 4μL；扩增程序为：65℃，1h。
本发明的有益效果：本发明提供了一种核酸提取试纸条，所述核酸提取 试纸条包括手持区和核酸结合区；所述核酸提取试纸条以带有不干胶薄膜的 PVC底板为主体；PVC底板的一端粘附有纤维素滤纸，为核酸结合区；PVC 底板上未粘附纤维素滤纸的区域为手持区(疏水端)。本发明的核酸提取试 纸条结构简单，使用过程中不需要复杂仪器。利用本发明的核酸提取试纸条 能在25～50s内对生物样本中的核酸进行快速提取纯化，并基于该核酸提取 试纸条，运用PCR、LAMP扩增技术对生物样品进行快速的分子检测技术。 相较于常用的DNA提取方法，本发明的核酸提取试纸条能够节省大量的时 间和资金，能够广泛地应用于未来的生物样品的现场分子检测上，推动了分 子检测走出实验室迈入市场的进程。
附图说明
图1-A为核酸提取试纸条的结构示意图；图1-A中的1为手持区 示意图，2为结合区示意图；
图1-B为核酸提取试纸条的结构剖视示意图；图1-B中的1为手持区示 意图，2为结合区示意图，3为PVC材质的底板，4为纤维素滤纸；
图2为本发明利用核酸提取试纸条对生物样品进行分子鉴定的流程图；
图3-A为实施例1中核酸提取试纸条的实物图，手持区域采用PVC底 板，规格为44mm×2mm；DNA结合区域采用纤维素滤纸，规格为4mm×2mm；
图3-B为实施例1中核酸提取试纸条产品图；每只桶装有200条核酸提 取试纸条；
图4-A为实施例2中用川贝母特异性鉴定引物对样品的鉴定结果，浙贝 母超微粉的占比分别为25％、20％、15％、10％、5％；C表示颜色对照(不 加酶以及模板DNA)；B表示空白对照(无菌水作为模板DNA)；NZ表示阴 性对照(模板DNA为核酸提取试纸条纯化的浙贝母超微粉的DNA)；1～5 分别表示5份混有浙贝母超微粉的川贝母超微粉样品的鉴定结果，浙贝母超 微粉的占比分别为25％、20％、15％、10％、5％；
图4-B为实施例2中用浙贝母特异性鉴定引物对样品的鉴定结果；图4-B 中的C表示颜色对照(不加酶以及模板DNA)；B表示空白对照(无菌水作 为模板DNA)；NC表示阴性对照(模板DNA为核酸提取试纸条提取纯化的 川贝母超微粉的DNA)；1～5分别表示5份混有浙贝母超微粉的川贝母超微 粉样品的鉴定结果，浙贝母超微粉的占比分别为25％、20％、15％、10％、 5％；
图5是实施例3中利用核酸提取试纸条对转基因材料的外源基因的鉴定 结果；序号1～8分别对应表3中的6种外源基因的扩增结果。M表示DL2000 的marker；P表示用核酸提取试纸条提取纯化的转基因材料的DNA并进行 扩增的结果；+表示阳性对照(模板DNA为10ng/μL的相对应的转基因材 料的基因组)；－表示阴性对照(模板DNA为相对应的非转基因材料的基因 组)；
图6-A是实施例4中用提取试纸条转移的浓度为100ng/μL、10ng/μL、 1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL的DNA的PCR产物的凝胶电泳结果；序号 1～8分别对应表2中的6种外源基因的扩增结果；M表示DL2000的marker； B表示空白对照(模板DNA为无菌水)；N表示阴性对照(模板DNA为相 对应的非转基因材料的基因组)；
图6-B是实施例4中用移液枪转移的浓度为100ng/μL、10ng/μL、1 ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL的DNA的PCR产物的凝胶电泳结果；序号 1～8分别对应表2中的6种外源基因的扩增结果；M表示DL2000的marker； B表示空白对照(模板DNA为无菌水)；N表示阴性对照(模板DNA为相 对应的非转基因材料的基因组)；
图7为实施例5中核酸提取试纸条能够提取纯化较长的DNA的检测结 果；
图8中的A图是实施例6中R2期转基因大豆的根、茎、叶、花、种子 中g10-3序列的扩增结果(g10-3是基因g10-epsps的一段序列)；M表示1000 bp的marker；+表示阳性对照(相对应的组织的基因组，浓度为10ng/μL)； P1～P3表示各个组织用核酸提取试纸条提取的DNA的三次重复的扩增结果； B表示空白对照(模板DNA为无菌水)，－表示阴性对照(模板DNA用非 转基因大豆：华春三号的基因组)；
图8中的B图是实施例6中基因ACTIN部分片段的扩增结果；M表示 1000bp的marker；+表示阳性对照(相对应的组织的基因组，浓度为10 ng/μL)；P1～P3表示各个组织用核酸提取试纸条提取的DNA的三次重复的 扩增结果；B表示空白对照(模板DNA为无菌水)，－表示阴性对照(模板 DNA用非转基因大豆：华春三号的基因组)；
图9为实施例7中核酸提取试纸条与LAMP技术相结合对转基因大豆各 组织进行分子鉴定的结果；C表示颜色对照(不加酶以及模板DNA)；B表 示空白对照(模板DNA为无菌水)；N表示阴性对照(模板DNA为核酸提 取试纸条提取纯化的华春大豆叶片的基因组)；R、S、L、F、G分别表示转 基因大豆ZUTS-33的五个组织：根、茎、叶、花、种子；阳性扩增样品的颜色为天蓝色，阴性扩增样品的颜色为紫罗兰。
具体实施方式
本发明提供了一种核酸提取试纸条，包括手持区和核酸结合区；所述核 酸提取试纸条以带有不干胶薄膜的PVC底板为主体(底部4mm处可以撕开 胶带，用于粘贴纤维素滤纸)；PVC底板的一端粘附有纤维素滤纸，为核酸结合区；PVC底板上未粘附纤维素滤纸的区域为手持区，作为疏水端。在本 发明中，所述PVC底板的长×宽优选为：42～46mm×2mm，更优选为44mm×2 mm；所述纤维素滤纸的长×宽优选为：3.8～4.2mm×2mm，更优选为4mm×2mm，厚度优选为0.34mm；对应的手持区的规格优选为44mm×2mm。在本 发明中，所述带有不干胶薄膜的PVC底板和纤维素滤纸来源于常规市售。
本发明中，所述核酸提取试纸条的结构示意图如图1-A所示，核酸提取 试纸条的结构剖视示意图如图1-B所示；图1-A和图1-B中的1为手持区示 意图，2为结合区示意图，3为PVC材质的底板，4为纤维素滤纸。
本发明所述核酸提取试纸条优选的采用以下方法制备得到：
将长×宽为20cm×3.8～4.2mm的纤维素滤纸粘贴于长×宽为20 cm×42～46mm的PVC底板上的一端，纤维素滤纸的长边和PVC底板的长边 吻合，按垂直于纤维素滤纸长边的方向裁切成长×宽为42～46mm×3.8～4.2 mm的核酸提取试纸条；在本发明中，所述裁切的设备优选为切条机。
本发明还提供了上述方案所述核酸提取试纸条的使用方法，包括以下步 骤：
1)将生物样品加入到核酸提取液中，得到混合液，对所述混合液研磨 8～15s，得到核酸粗提液；
2)将上述方案所述核酸提取试纸条的核酸结合区浸入到步骤1)所述核 酸粗提液中8～15s，得到第一试纸条；
3)将步骤2)所述第一试纸条浸入到洗脱液中3～8s，得到第二试纸条；
4)将步骤3)所述第二试纸条浸入到扩增体系中3～8s，释放提取到的 核酸，得到完整扩增体系。
本发明首先将生物样品加入到核酸提取液中，得到混合液，对所述混合 液研磨8～15s，优选的研磨10s，得到核酸粗提液；所述生物样品优选为植 物样品；所述植物样品优选的经过粉碎处理；所述粉碎的方式优选为超微粉 碎；所述植物样品的粒径优选为25～48μm。在本发明中，所述核酸提取液 优选的包括以下摩尔浓度的组分：Tris90～110mM、KCl0.8～1.2M和EDTA 8～12mM；更优选的，所述核酸提取液包括以下摩尔浓度的组分：Tris100 mM、KCl1M和EDTA10mM；所述核酸提取液的pH值优选为7.8～8.2，更优选为8。在本发明中，所述生物样品的质量和核酸提取液的体积的比例 为20mg：300μL；所述研磨采用的设备优选为高通量组织研磨机(TL2010S， DHS)，研磨技术参数优选为1600rpm，10s；所述研磨的作用是使核酸充 分地释放到核酸提取液中。
得到核酸粗提液后，本发明将上述方案所述核酸提取试纸条的核酸结合 区浸入到所述核酸粗提液中8～15s，优选为10s，核酸粗提液吸附到核酸结 合区，得到第一试纸条；本发明要求核酸结合区完全浸入到核酸粗提液中。
得到第一试纸条后，本发明将所述第一试纸条浸入到洗脱液中3～8s， 优选为5s，得到第二试纸条；所述洗脱液优选的包括以下浓度的组分：Tris 9～11mM和体积百分含量为0.05％～0.15％的Tween-20；更优选的，所述洗 脱液包括以下浓度的组分：Tris 10mM和体积百分含量为0.1％的Tween-20； 所述洗脱液的pH值优选为7.8～8.2，更优选为8；这步骤的作用是除去核酸 中的杂质，对核酸进行纯化。
得到第二试纸条后，本发明将所述第二试纸条浸入到扩增体系中3～8s， 释放提取到的核酸，优选为5s，得到完整扩增体系，进行扩增反应。在本 发明中，所述扩增体系优选的包括PCR扩增体系或LAMP扩增体系。在本发明中，缺少扩增模板的LAMP扩增体系以24μL计，包括以下组分：2×HNB LAMP Mix 12.5μL，10×LAMP Primer Mix 2.5μL，5M Betain 3μL，Bst2.0 DNA Polymerase 1μL和ddH2O 4μL；所述LAMP扩增的扩增程序优选为： 65℃，1h。在本发明中，缺少扩增模板的PCR扩增体系以19μL计，包括 以下组分：2×TaqMasterMix(CWBio)10μL，前、后引物各0.4μL和无菌水8.2μL；所述前、后引物的浓度分别优选为10μM；所述PCR扩增的扩增 程序优选为：95℃、5min；95℃、30s，55℃～60℃、30s，72℃、20s， 40个循环；72℃再延伸10min。
本发明在进行扩增反应，得到扩增产物后，优选的还包括对扩增产物进 行检测。在本发明具体实施过程中，PCR扩增产物通过凝胶电泳进行检测； LAMP扩增情况通过体系中HNB指示剂的颜色变化来判断；用于凝胶电泳 的琼脂糖凝胶的浓度优选为1％，电泳的电压优选为150V，电泳时间优选为 30min。
本发明利用核酸提取试纸条对生物样品进行分子鉴定的流程图参见图 2。通过手摇或者机器研磨的方式，充分释放生物样品中的核酸到核酸提取 液中；利用核酸提取试纸条对核酸进行快速的吸附和纯化，最后通过 PCR/LAMP技术对目的基因进行扩增，PCR扩增结果用凝胶电泳进行检测。 LAMP扩增结果用体系内指示剂进行指示。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整 地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的 实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳 动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中采用的核酸提取试剂的配方参见表1。
表1核酸提取试剂
实施例1：核酸提取试纸条的制备方法
将纤维素滤纸(WhatmanNo.1)以及PVC底板分别裁切成规格为20 cm×4mm和20cm×44mm的长方形纸条。将裁切好的纤维素滤纸贴于裁切 号的PVC底板的底部。利用切条机将组装好的大板切成规格为44mm×2mm 的试纸条，即为核酸提取试纸条。核酸提取试纸条的实物图参见图3-A，手持区域采用带有不干胶薄膜的PVC底板(底部4mm处可以撕开胶带，用于 粘贴纤维素滤纸)，规格为44mm×2mm；DNA结合区域采用纤维素滤纸， 规格为4mm×2mm；核酸提取试纸条产品图参见图3-B；每只桶装有200条 核酸提取试纸条。
实施例2：核酸提取试纸条与LAMP技术相结合快速鉴定中药超微粉成 分
核酸提取试纸条与LAMP技术结合能够对中药超微粉中的成分进行快 速鉴定。以川贝母为例，往川贝母超微粉中混杂浙贝母超微粉是比较常见的 现象。该方法能够对川贝母超微粉的真假以及是否掺杂浙贝母超微粉进行快 速检测。对得到的5种混合了浙贝母超微粉的川贝母超微粉样品进行两方面 的鉴定。首先对样品是否为川贝母超微粉进行鉴定，其次对川贝母超微粉中 是否掺杂浙贝母超微粉进行鉴定。5种样品中的浙贝母超微粉在川贝母超微 粉中的占比分别为：25％、20％、15％、10％、5％。具体操作如下：用核酸 提取试纸条挑取待检测样品约20mg于核酸提取液中，稍搅拌，使核酸充分地释放到核酸提取液中；核酸提取试纸条在核酸提取液中静置10s；于洗脱 液中洗除杂质5s；于LAMP扩增体系中静置5s，释放所提取纯化的核酸至 体系中，反应于64℃金属浴中进行。LAMP扩增体系为2×HNB LAMP Mix 12.5μL，10×LAMP Primer Mix 2.5μL(10×LAMP Primer Mix由表2中的ZB或CB引物混合而成，FIP、BIP在反应体系中的终浓度为1.6μM，F3、B3 在反应体系中的终浓度为0.2μM)，5MBetain3μL，Bst2.0 DNA Polymerase1μL，模板DNA的体积默认为1μL，ddH2O补加到25μL，观察反应体系 的颜色是否变化为天蓝色来判断待测样品是否为川贝母超微粉或判断样品 里面是否混有浙贝母超微粉。检测结果表明，5种待测样品均为川贝母超微粉并且能检测到样品中混有浙贝母超微粉。川贝母(CB)和浙贝母(ZB) 的鉴定引物信息如表2所示，LAMP扩增结果如图4-A和图4-B所示；其中 图4-A为用川贝母特异性鉴定引物对样品的鉴定结果，浙贝母超微粉的占比分别为25％、20％、15％、10％、5％；图4-B为用浙贝母特异性鉴定引物对 样品的鉴定结果；图4-A中和图4-B中的C表示颜色对照(不加酶以及模板 DNA)；B表示空白对照(无菌水作为模板DNA)；NC表示阴性对照(模板 DNA为核酸提取试纸条提取纯化的川贝母超微粉的DNA)，NZ表示阴性对 照(模板DNA为核酸提取试纸条纯化的浙贝母超微粉的DNA)；1～5分别 表示5份混有浙贝母超微粉的川贝母超微粉样品的鉴定结果，浙贝母超微粉 的占比分别为25％、20％、15％、10％、5％。阳性扩增样品的颜色为天蓝色， 阴性扩增样品的颜色为紫罗兰。图4-A表明利用用于鉴定川贝母的LAMP 引物可以鉴定含有5％-25％的浙贝母的川贝母超微粉样品；图4-B表明利用 鉴定浙贝母的LAMP引物可以鉴定混合样品中所含有5％-25％的浙贝母超微 粉。因此，图4-A和图4-B表明利用核酸提取试纸条能够快速确认所检测的 川贝母超微粉以及其中混杂的浙贝母超微粉。
表2浙贝母的LAMP鉴定引物信息
实施例3：利用核酸提取试纸条对转基因作物的外源基因进行快速鉴定
利用核酸提取试纸条对5种转基因材料的6种外源基因进行检测，转基 因材料的具体信息如表3所示。其中，转基因水稻材料T51及非转基因水稻 材料MH63由浙江大学农业与生物技术学院提供；转基因玉米材料ZC-1以 及非转基因玉米材料HiⅡ、转基因大豆材料GC-1以及非转基因大豆材料 Wandou28由浙江大学应用昆虫所提供；转基因大豆材料ZUTS-33以及非转 基因大豆材料HC3、转基因大豆材料SWEET15以及非转基因材料W82来 自浙江大学植物生物学研究所。
提取方法如下：取植株幼嫩的叶片10mg于300μL核酸提取液中，加 入研磨珠，采用高通量组织研磨仪(TL2010S，DHS)进行研磨，转数为1600 rpm，研磨时间为10s；将核酸提取试纸条伸入核酸提取溶液中对核酸进行 吸附，吸附10s；转移核酸提取试纸条至200μL洗脱液中，洗脱5s；核酸 提取试纸条于PCR扩增体系中浸润5s；PCR扩增；凝胶电泳观察PCR产物。以常规DNA提取方法(CTAB提取方法)所提取的浓度为10ng/μL的 5种转基因材料的DNA的扩增结果为阳性对照。以上的PCR扩增体系为2× TaqMasterMix(CWBio)10μL，前后引物(浓度为10μM)各0.4μL，模 板DNA的体积1μL，无菌水补足到20μL。PCR程序为95℃预变性5min， 95℃变性30s，55℃-60℃退火30s，72℃延伸20s，72℃再延伸10min，扩增40个循环。检测结果如图5所示，序号1～8分别对应表3中的6种外 源基因的扩增结果。M表示DL2000的marker；P表示用核酸提取试纸条提 取纯化的转基因材料的DNA并进行扩增的结果；+表示阳性对照(模板DNA 为10ng/μL的相对应的转基因材料的基因组)；－表示阴性对照(模板DNA 为相对应的非转基因材料的基因组)。
结果表明，核酸提取试纸条能够对6种外源基因进行检测，同时，通过 比较凝胶电泳图的条带的大小与明暗，发现在所检测的植株叶片是幼嫩的情 况下，核酸提取试纸条检测的结果与常规PCR的检测结果无显著差异。
表3转基因材料及扩增引物信息表
注：g10-1和g10-2是基因g10-epsps的两个不同的DNA片段。
实施例4：利用核酸提取试纸条能够对浓度为0.1ng/μL的DNA进行检 测
同时，利用5种转基因材料对核酸提取试纸条检测方法的灵敏度进行检 测。用CTAB法提取各个材料中的DNA，并且将DNA浓度按照梯度稀释， 浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL。滴加1μL 各个浓度的DNA溶液至核酸提取试纸条的核酸结合区，并经过杂质洗脱液 进行洗涤后将核酸提取试纸条伸入PCR扩增体系中释放核酸以进行目的基因的扩增。以常规PCR作为正对照，即利用移液枪往PCR扩增体系中分别 加入1μL的5种浓度的DNA溶液。PCR扩增体系为2×Taq MasterMix (CWBio)10μL，前后引物(浓度为10μM)各0.4μL，模板DNA的体积 1μL，无菌水补足到20μL。PCR程序为95℃预变性5min，95℃变性30s， 55℃-60℃退火30s，72℃延伸20s，72℃再延伸10min，扩增40个循环。 检测结果如图6-A和图6-B所示，其中图6-A是用提取试纸条转移的浓度为 100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL的DNA的PCR产物 的凝胶电泳结果；图6-B是用移液枪转移的浓度为100ng/μL、10ng/μL、1 ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL的DNA的PCR产物的凝胶电泳结果。序号1～8分别对应表2中的6种外源基因的扩增结果。M表示DL2000的marker； B表示空白对照(模板DNA为无菌水)；N表示阴性对照(模板DNA为相 对应的非转基因材料的基因组)。
结果表明，核酸提取试纸条的检测方法的灵敏度可达到0.1ng/μL，与常 规PCR的检测的灵敏度相同；并且凝胶电泳图表明，经核酸提取试纸条转 移的DNA的扩增检测结果与常规PCR扩增检测结果无显著差异。
实施例5：核酸提取试纸条能够提取纯化长度为3000bp的DNA
以大豆的编码肌动蛋白的管家基因ACTIN为例，该基因总长度为3372 bp。在这段基因上面分别设计引物，以分别扩增500bp、1000bp、1500bp、 2000bp、2500bp以及3000bp的片段长度。取自V3期大豆的刚长出来的新 叶进行实验，称取10mg叶片装入含300μL核酸提取液以及两颗研磨珠的2mL离心管中，通过手摇研磨10s，待溶液呈现深绿色，即样品已经被震碎； 放入核酸提取试纸条吸附核酸10s；抽出核酸提取试纸条于200μL洗脱液中 洗脱杂质5s；将核酸试纸条放入预先配制好的PCR扩增体系中，浸润5s； PCR扩增，凝胶电泳观察结果。PCR扩增体系是：
GXLPremix (TAKARA)10μL，前后引物(10μM)各0.4μL，模板DNA的体积默认 为1μL，加无菌水补足至20μL。扩增程序是：98℃预变性5min，98℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸30s～3min，68℃再延伸10min，扩增 40个循环。扩增结果如图7所示，M表示250bp ladder的marker(250～4500 bp)；B表示空白对照(无菌水作为模板DNA)；1～6分别代表来自大豆ACTIN 基因片段长度为500bp、1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp的 片段的扩增结果。500～3000bp长度的DNA的PCR产物在浓度为1％的琼脂糖凝胶上显示出明亮的条带，这表明核酸提取试纸条有能力吸附长度为3000 bp的DNA。引物信息如表4所示。
表4大豆ACTIN基因引物信息表
实施例6：核酸提取试纸条对转基因大豆各组织进行快速分子鉴定
核酸提取试纸条能够对植物的各个组织的核酸进行快速提取。以大豆为 例，采用核酸提取试纸条快提核酸的方法对转基因大豆ZUTS-33的根、茎、 叶、花以及种子五个组织的核酸进行快速提取，并对长度为246bp的ACTIN 基因部分片段进行扩增作为对照，以证明核酸提取试纸条所提取的DNA的 有效性，以及对外源插入基因g10-epsps部分片段，记为g10-3进行扩增，扩增产物大小分别为246bp以及469bp。取自大豆R2期的鲜嫩的根、茎、 叶、花各20mg进行核酸提取试纸条快提，考虑到根和茎较难研磨，采用高 通量组织研磨仪(TL2010S，DHS)进行研磨，转速为1600rpm，研磨时间 10s。用微型电钻(P-500-3，施力特)，钻头的直径大小为1mm，对干种子 进行钻孔，收集粉末并进行核酸提取试纸条快提。以用CTAB法提取的浓度为10ng/μL的DNA的PCR扩增结果作为阳性对照。PCR扩增体系为2×TaqMasterMix(CWBio)10μL，前后引物(浓度为10μM)各0.4μL，模板DNA 的体积默认为1μL，无菌水补足到20μL。PCR程序为95℃预变性5min， 95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，72℃再延伸10min，扩增 40个循环。扩增结果如图8所示，图8中的A图和图8中的B图分别是R2期转基因大豆的根、茎、叶、花、种子中ZUTS-33-LB序列以及基因ACTIN 部分片段的扩增结果；M表示1000bp的marker；+表示阳性对照(相对应 的组织的基因组，浓度为10ng/μL)；P1～P3表示各个组织用核酸提取试纸 条提取的DNA的三次重复的扩增结果。B表示空白对照(模板DNA为无菌 水)，－表示阴性对照(模板DNA用非转基因大豆华春三号的基因组)
结果表明核酸提取试纸条能够稳定地对大豆的根、茎、叶、花和种子中 的DNA进行有效地提取并用于扩增，且其扩增结果与的常规方法的提取扩 增结果无显著差异。引物信息如表5所示。
表5引物信息表
实施例7：核酸提取试纸条与LAMP技术相结合对转基因大豆各组织进 行快速分子鉴定
我们将核酸提取试纸条和LAMP相结合以达到对基因进行快速检测的 目的。以转基因大豆ZUTS-33为例，对转入的外源基因g10-epsps基因序列设计LAMP引物，利用核酸提取试纸条提取、纯化、转移大豆各组织中的 DNA，并采用新海基因公司的LAMP-HNB试剂盒对提取的核酸进行检测。 按照试剂盒所提供的说明书配制LAMP体系：2×HNB LAMP Mix12.5μL， 10×LAMP Primer Mix2.5μL(10×LAMP Primer Mix由表6中的引物混合而 成，FIP、BIP在反应体系中的终浓度为1.6μM，F3、B3在反应体系中的终 浓度为0.2μM)，5M Betain 3μL，Bst2.0 DNA Polymerase 1μL，模板DNA 的体积默认为1μL，ddH2O补加到25μL。体系于65℃金属浴中进行目的 基因的扩增反应。引物信息如表6所示，检测结果如图9所示，C表示颜色对照(不加酶以及模板DNA)；B表示空白对照(模板DNA为无菌水)；N 表示阴性对照(模板DNA为核酸提取试纸条提取纯化的华春大豆叶片的基 因组)；R、S、L、F、G分别表示转基因大豆ZUTS-33的五个组织：根、茎、叶、花、种子。阳性扩增样品的颜色为天蓝色，阴性扩增样品的颜色为紫罗 兰。检测结果表明，核酸提取试纸条与LAMP技术相结合能够对转基因作物 的各个组织进行快速的分子鉴定。
表6基因g10-epsps的LAMP引物信息
综上所述，本发明提供了一种不依赖于仪器的快速、简便的核酸提取试 纸条以及其使用方法，核酸提取试纸条能够适用于广大的分子检测实验室； 同时，核酸提取试纸条与PCR或LAMP技术相结合可应用于生物样品的快速的现场检测上，即在1h内就可以对食品、药品、转基因作物等生物样品 完成现场检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省中药研究所有限公司
浙江大学
<120> 一种核酸提取试纸条及其使用方法
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagaggagcg tgggactt 18
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcttccgcc cttatgttcc tctttaccgg tgagtctaag ttcga 45
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggaccggaa acggagatag ggtttgaaag acttggtgct tgggt 45
<210> 5
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<212> DNA
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acgatccaca gaccaggtc 19
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gcccttgaaa gattctggta 20
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ctaagggagt agtgaaactg gtgttttttg gatgcctgtt cag 43
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agatgttggc gacctcgtat t 21
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gacaacaacc ccaacatcaa cgagtg 26
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gtcaaccact acatcgagac aagc 24
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tctaaggtca tcggaggcag tagct 25
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tagagcacag ccatccaaga actac 25
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tctcacctct ggcaccactt tcg 23
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ccacgttctc ccaggtggtg t 21
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tttgatgagc ctttgtacac agc 23
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aagcaataaa ataaaatgaa gacaaggt 28
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accatcctta acattattta tgt 23
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agcatcgtca ccagcaaatc ctg 23
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atagattggt acagtgtgac tca 23
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ggtggagcta caaccttaat ctt 23
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tacaaaaaga aaatggagga aaaagagatc 30
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tggaccggaa acggagatag ggtttgaaag acttggtgct tgggt 45
Claims (5)
1.一种核酸提取试纸条的使用方法，包括以下步骤：
1)将生物样品加入到核酸提取液中，得到混合液，对所述混合液研磨8~15s，得到核酸粗提液；所述生物样品为植物样品；所述研磨采用的设备为高通量组织研磨机；
2)将核酸提取试纸条的核酸结合区浸入到步骤1)所述核酸粗提液中8~15s，得到第一试纸条；
3)将步骤2)所述第一试纸条浸入到洗脱液中3~8s，得到第二试纸条；
4)将步骤3)所述第二试纸条浸入到扩增体系中3~8s，释放提取到的核酸，得到完整扩增体系，进行扩增反应；所述扩增体系中缺少扩增模板；
步骤1)中所述核酸提取液由以下摩尔浓度的组分组成：Tris 90~110mM、KCl 0.8~1.2M和EDTA8~12mM；所述核酸提取液的pH值为7.8~8.2；
步骤3)中所述洗脱液包括以下浓度的组分：Tris 9~11mM和体积百分含量为0.05％~0.15％的Tween-20；
所述核酸提取试纸条，包括手持区和核酸结合区；所述核酸提取试纸条以带有不干胶薄膜的PVC底板为主体；PVC底板的一端粘附有纤维素滤纸，为核酸结合区；PVC底板上未粘附纤维素滤纸的区域为手持区。
2.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于，所述PVC底板的长×宽为：42~46mm×2mm；所述纤维素滤纸的长×宽为：3.8~4.2mm×2mm。
3.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于，步骤1)中所述生物样品的质量和核酸提取液的体积的比例为20mg：300μL。
4.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于，步骤4)中所述扩增体系为LAMP扩增体系。
5.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述LAMP扩增体系以24μL计，包括以下组分：2×HNB LAMP Mix 12 .5μL，10×LAMP Primer Mix 2.5μL，5M Betain 3μL，Bst2.0DNAPolymerase 1μL和ddH2O 4μL；扩增程序为：65℃，1h。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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