CN111039976A - 梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，包括如下步骤：（1）配置待洗脱溶液；（2）程序梯度洗脱；（3）TLC检测含有大豆磷脂酰胆碱的洗脱液；（4）提纯。本发明梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，以市售纯度为90%的大豆磷脂酰胆碱为原料，以正己烷/异丙醇为流动相，以硅胶层析柱为固定相层析柱，采用梯度洗脱，通过逐步改变流动相中记性溶剂异丙醇的比例，实现对大豆磷脂酰胆碱的有效分离提纯，实现一次纯化将纯度提高到98%以上，纯化效果好，收率高，纯化所得的大豆磷脂酰胆碱能够满足氢化大豆磷脂酰胆碱的质量要求。
Description
技术领域
本发明涉及层析柱纯化物质技术领域，特别是涉及一种梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法。
背景技术
氢化大豆磷脂酰胆碱，简称HSPC，其作为脂质体药物的重要辅料，纯度要求在98%以上。氢化大豆磷脂酰胆碱的制备工艺由原料大豆磷脂酰胆碱（简称SPC）经过催化氢化还原成饱和的产物。由于对氢化大豆磷脂酰胆碱的产品质量要求较高，因此工艺上就必须采用纯度较高的原料大豆磷脂酰胆碱（SPC）。因此，制备得到98%以上纯度的大豆磷脂酰胆碱对于制备符合纯度要求的氢化大豆磷脂酰胆碱至关重要。
而大豆磷脂胆碱作为大豆磷脂的提取物，其主要成份除了大豆磷脂酰胆碱（SPC）外，还包括其它磷脂，诸如磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酸（PA）等主要几种杂质。由于这几种物质的结构相似，性质相似，使用常规的提取方法，将磷脂纯化至一定含量后，就无法将微量杂质去除到极低的限度了。
一般市售的大豆磷脂酰胆碱为采用溶剂提取法、超临界流体萃取法、酶催化精制法或膜分离法等进行分离得到，其含量最高仅可达90%。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，能够在市售纯度为90%的大豆磷脂酰胆碱的基础上，进一步去除其中的杂质，使其纯度提升到98%以上。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配置待洗脱溶液：将纯度为90%的大豆磷脂酰胆碱溶于异丙醇中，得到大豆磷脂酰胆碱溶液，作为待洗脱溶液；
（2）程序梯度洗脱：在硅胶层析柱内，以不同体积比混合的A相和B相作为流动相，按照设定的洗脱程序逐步洗脱去除大豆磷脂酰胆碱溶液中的杂质；
（3）TLC检测含有大豆磷脂酰胆碱的洗脱液；
（4）提纯：将测试合格的洗脱液汇集，蒸除溶剂，所得浓缩物再用有机溶剂洗涤、析晶，干燥，得到纯化的大豆磷脂酰胆碱。
在本发明一个较佳实施例中，纯化后的所述大豆磷脂酰胆碱的纯度为98%以上。
在本发明一个较佳实施例中，所述大豆磷脂酰胆碱溶液中的大豆磷脂酰胆碱与所述硅胶的质量比为1:30～40。
在本发明一个较佳实施例中，所述硅胶层析柱内填充的硅胶的目数为300～400目。
在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（2）中，所述洗脱程序包括12个程序，在第1个程序中，所述A相以10ml/min的流速洗脱15min；在第2和第3个程序中，A相分别以9.5ml/min和9.0ml/min的流速，B相分别以0.5 ml/min和1.0ml/min的流速分别洗脱20min；在第4至10个程序中，洗脱时间均为30min，其中，A相的流速在各程序中以0.5ml/min的流速递减，B相的流速在各程序中以0.5ml/min的流速递增，各个程序内，A相的流速和B相的流速不变；在第11个程序中，A相和B相分别以5ml/min的流速洗脱120min；在第12个程序中，B相以10ml/min的流速洗脱30min。
在本发明一个较佳实施例中，所述A相为正己烷；所述B相为异丙醇。
在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（3）中，所述TLC检测的方法为：取活化后的硅胶薄板，并在其上点SPC标准对照样和洗出液样品，在展开剂的作用下展开，晾干后用碘蒸气显色。
在本发明一个较佳实施例中，所述展开剂为：氯仿、甲醇和水的质量比为65：25：10。
在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（4）中，所述有机溶剂为丙酮；所述洗涤、析晶的方法为：先在50～60℃下保温搅拌1h，再冷却至室温，搅拌3h，过滤，并用丙酮淋洗。
在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（4）中，所述干燥的条件为：真空度-0.08～0.08MPa，温度50～60℃，时间4h。
本发明的有益效果是：本发明梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，以市售纯度为90%的大豆磷脂酰胆碱为原料，以正己烷/异丙醇为流动相，以硅胶层析柱为固定相层析柱，采用梯度洗脱，通过逐步改变流动相中记性溶剂异丙醇的比例，实现对大豆磷脂酰胆碱的有效分离提纯，实现一次纯化将纯度提高到98%以上，纯化效果好，收率高，纯化所得的大豆磷脂酰胆碱能够满足氢化大豆磷脂酰胆碱的质量要求。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明实施例包括：
为适应产品工艺要求，本发明开发了从市售的纯度为90%的大豆磷脂酰胆碱为原料纯化制备达到纯度98%以上的大豆磷脂酰胆碱工艺。
本发明利用磷脂分子包含极性和非极性基团的特性，利用各杂质结构极性基团的分子差异特性，通过层析法硅胶对各组份的吸附差异和在流动相中的分配系数的不同，将各组份进行分离。
大豆磷脂酰胆碱的分子结构如下：
本发明的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，包括如下步骤：
（1）配置待洗脱溶液：将纯度为90%的大豆磷脂酰胆碱溶于异丙醇中，得到大豆磷脂酰胆碱溶液，作为待洗脱溶液；
（2）程序梯度洗脱：在层析柱内填充目数为300～400目的硅胶，制备硅胶层析柱，控制硅胶的填充量，确保洗脱时，大豆磷脂酰胆碱溶液中的大豆磷脂酰胆碱与所述硅胶的质量比为1:30～40；
在硅胶层析柱内，以不同体积比混合的A相（正己烷）和B相（异丙醇）作为流动相，按照设定的洗脱程序逐步洗脱去除大豆磷脂酰胆碱溶液中的杂质；
所述洗脱程序包括12个程序，所述洗脱程序包括12个程序，在第1个程序中，所述A相以10ml/min的流速洗脱15min；在第2和第3个程序中，A相分别以9.5ml/min和9.0ml/min的流速，B相分别以0.5 ml/min和1.0ml/min的流速分别洗脱20min；在第4至10个程序中，洗脱时间均为30min，其中，A相的流速在各程序中以0.5ml/min的流速递减，B相的流速在各程序中以0.5ml/min的流速递增，各个程序内，A相的流速和B相的流速不变；在第11个程序中，A相和B相分别以5ml/min的流速洗脱120min；在第12个程序中，B相以10ml/min的流速洗脱30min；
（3）TLC检测含有大豆磷脂酰胆碱的洗脱液；取活化后的硅胶薄板，并在其上点SPC标准对照样和洗出液样品，在展开剂（氯仿：甲醇：水的质量比为65：25：10）的作用下展开，晾干后用碘蒸气显色。
（4）提纯：将测试含有大豆磷脂酰胆碱的洗脱液汇集，蒸除溶剂，所得浓缩物再用丙酮洗涤、析晶，干燥，得到纯化的大豆磷脂酰胆碱，纯化后的所述大豆磷脂酰胆碱的纯度为98%以上。
实施例1
（1）将10g 纯度为90%的市售大豆磷脂酰胆碱SPC加热至60℃，溶解于10ml的异丙醇中，保温备用；
（2）将300g过筛的层析硅胶干法装填入直径为3cm，长度为50cm的层析柱中；
（3）用500ml正己烷循环冲洗硅胶至层析柱致密，无气泡，均匀备用；
（5）将层析柱液面调至硅胶层上5mm高，将步骤（1）中制备的待分离液加到层析柱内。
（6）流动相的A相为正己烷，B相为异丙醇，A相和B相分别采用微量输液泵，按照下表的程序和流速对待分离的大豆磷脂酰胆碱进行进液洗脱；
（7）执行至程序11时，开始TLC检测，收集有SPC检出的液体。检测方法为：取活化后的硅胶GF254薄板，点SPC标准对照样和洗出液样品，在氯仿－甲醇－水为展开剂进行展开，晾干后用碘蒸气显色；其中，所述展开剂中，氯仿、甲醇和水的体积比为65：25：10。
（8）将收集的含有SPC成份的洗脱液汇集，在-0.08ＭPa的真空减压条件下蒸干溶剂，至无液体流出为止；
（9）将蒸得的浓缩物加70ml丙酮（为投料量的7倍），升温至50～60℃保温1小时，冷却至室温再搅拌3小时，过滤，用丙酮20ml淋洗抽干；
（10）将上述过滤物在-0.08ＭPa的真空下50～60℃下干燥4小时，得产品7.5g，收率为75%。
所得的纯化物用高效液相色谱（HPLC）进行测试，测试条件为：
硅胶柱，5μm，φ4.6×250mm；
流动相，正己烷：异丙醇：水＝1：4：1；
柱温，35℃；
流速，0.8ml/min；
进样量，20μl
再用示差折光检测器检测，得到产品大豆磷脂酰胆碱的纯度≥98%。
本发明为了得到高纯度的大豆磷脂酰胆碱用于制备高纯度的氢化大豆磷脂酰胆碱，以市售纯度为90%的大豆磷脂酰胆碱为原料，以正己烷/异丙醇为流动相，以硅胶层析柱为固定相层析柱，采用梯度洗脱，通过逐步改变流动相中记性溶剂异丙醇的比例，实现对大豆磷脂酰胆碱的有效分离提纯，实现一次纯化将纯度提高到98%以上，纯化效果好，收率高，纯化所得的大豆磷脂酰胆碱能够满足氢化大豆磷脂酰胆碱的质量要求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配置待洗脱溶液：将纯度为90%的大豆磷脂酰胆碱溶于异丙醇中，得到大豆磷脂酰胆碱溶液，作为待洗脱溶液；
（2）程序梯度洗脱：在硅胶层析柱内，以不同体积比混合的A相和B相作为流动相，按照设定的洗脱程序逐步洗脱去除大豆磷脂酰胆碱溶液中的杂质；
（3）TLC检测含有大豆磷脂酰胆碱的洗脱液；
（4）提纯：将测试合格的洗脱液汇集，蒸除溶剂，所得浓缩物再用有机溶剂洗涤、析晶，干燥，得到纯化的大豆磷脂酰胆碱。
2.根据权利要求1所述的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，纯化后的所述大豆磷脂酰胆碱的纯度为98%以上。
3.根据权利要求1所述的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述大豆磷脂酰胆碱溶液中的大豆磷脂酰胆碱与所述硅胶的质量比为1:30～40。
4.根据权利要求3所述的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述硅胶层析柱内填充的硅胶的目数为300～400目。
5.根据权利要求1所述的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述洗脱程序包括12个程序，在第1个程序中，所述A相以10ml/min的流速洗脱15min；在第2和第3个程序中，A相分别以9.5ml/min和9.0ml/min的流速，B相分别以0.5 ml/min和1.0ml/min的流速分别洗脱20min；在第4至10个程序中，洗脱时间均为30min，其中，A相的流速在各程序中以0.5ml/min的流速递减，B相的流速在各程序中以0.5ml/min的流速递增，各个程序内，A相的流速和B相的流速不变；在第11个程序中，A相和B相分别以5ml/min的流速洗脱120min；在第12个程序中，B相以10ml/min的流速洗脱30min。
6.根据权利要求5所述的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述A相为正己烷；所述B相为异丙醇。
7.根据权利要求1所述的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述TLC检测的方法为：取活化后的硅胶薄板，并在其上点SPC标准对照样和洗出液样品，在展开剂的作用下展开，晾干后用碘蒸气显色。
8.根据权利要求7所述的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述展开剂为：氯仿、甲醇和水的质量比为65：25：10。
9.根据权利要求1所述的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述有机溶剂为丙酮；所述洗涤、析晶的方法为：先在50～60℃下保温搅拌1h，再冷却至室温，搅拌3h，过滤，并用丙酮淋洗。
10.根据权利要求1所述的梯度法纯化大豆磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述干燥的条件为：真空度-0.08～0.08MPa，温度50～60℃，时间4h。
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