DK166364B - Fremgangsmaade til isolering af ledsagephospholipidfrit phosphatidylcholin fra en vegetabilsk lipidblanding - Google Patents

Description

i

DK 166364B

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til isolering af højrent l,2-diacyl-glycero-3-phosphocholin (phosphatidylcholin), som er frit for ledsagephospholipider, ved chromatografi af en li-pidopløsning på silicagel.

5 Inden for farmacien anvendes vegetabilsk phosphatidylcholin som ak tivt stof og som hjælpestof.

Til anvendelsen som aktivt stof kræves phospholipider med højt phosphatidylcholinindhold (oral applikation) eller næsten lysophosphati-dylcholi nfrit phosphatidylcholin med høj renhed (intravenøs applika-10 tion).

Til anvendelsen som hjælpestof, for eksempel som emulgator ved fremstilling af fedtemulsioner til parenteral applikation eller ved dannelsen af liposomer eller blandingsmiceller, må phosphatidylcholinet være frit for hæmolytisk virkende lysophosphatidylcholin.

15 Som udgangsmateriale for udvindingen af vegetabilsk phosphatidylcholin anvendes det ved sojaolie- eller spiseoliefremstillingen opståede såkaldte råsphosphatid, der også betegnes rålecithin, handelssojaleci-thin eller handelslecithin.

(Kirk-Othmer, Encycl. Chem. Technol. Vol. 14, side 250-269/P.H.

20 List, Pharm. Verfahrenstechn. heute 1 (7) 1-8 (1980)).

Sojalecithin (sojaråphosphatid) indeholder: 60 - 70 % polære 1ipider (phospholipider/glykolipider) 27 - 37 % sojaolie 25 1,5 - 2 % vand 0,5 - 2 % forskellige ledsagestoffer.

De polære 1ipider, der også betegnes som renlecithin, og som opnås ved fjernelse af olie fra rålecithinet eller sojalecithinet, har følgen-30 de sammensætning (cirkaværdier): 35

DK 166364B

2 30 % phosphatidylcholin (PC) 2 % lysophosphatidylcholin (LPC) 22 % phosphatidylethanolamin (PE) 2 % ' lysophosphatidylethanolamin (LPE) 5 3 % phosphatidyl serin (PS) 15 % phosphatidylinosit (PI) 1 % lysophosphatidylinosid (LPI) 13 % phytoglykolipider (PGL) 8 % phosphatidsyre (PA) 10 4 % ledsagel ipider

Et sojalecithin (sojaråphosphatid) af dårlig kvalitet kan indeholde indtil 5% lysophosphatidylcholin.

Der kendes en række fremgangsmåder til fremstilling af berigede 15 phosphatidylcholi nfraktioner. Således opnås ved fjernelse af olie fra sojaråphosphatid med acetone (US patentskrift nr. 3.268.335) en blanding af polære lipider (renlecithin). Ved alkoholisk ekstraktion af sojar.å-phosphatid (DE patentskrift nr. 1.492.952) opnås en olieholdig blanding af phosphatidylcholinberigede polære lipider.

20 I den seneste tid er der beskrevet nye teknologier til udvinding af polære lipider for eksempel i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.011.185, hvor olie fjernes fra sojaråphosphatid ved ekstraktion med overkritisk CO2, eller i europapatentansøgning nr. 0049914, hvor der ved hjælp af ultrafiltrering opnås phosphatidylcholinberigede fraktioner fra opløs-25 ninger af phospholipider i hexan/2-propanol (75/25). Hvis der ved denne fremgangsmåde anvendes olieholdige phospholipidblåndinger såsom sojaråphosphatid, er hverken oliefjernelse med acetone eller anvendelse af en opløsningsmiddelgradient nødvendig.

Udvindingen af et ledsagephospholipidfrit phosphatidylcholin forud-30 sætter en chromatografisk adskillelse af phospholipiderne. Derved får kombinationen af adsorptionsmidlet og elueringsmidlet og elueringstempe-raturen en udslaggivende betydning.

Således opnår man, ved at gå ud fra sojaråphosphatid, ved en flertrinsproces et 3 - 4% lysophosphatidylcholinholdigt rent phosphatidyl-35 cholin ved chromatografi på aluminiumoxid med ethanol som elueringsmid-del (US patentskrift nr. 3.031.478). Aluminiumoxidet opfyldes med phospholipider såsom phosphatidylethanolamin, phosphatidylinosit, phosphatidsyre og glykolipider. Da det ikke kan regenereres, må det.kasseres.

DK 166364 B

3

Silicagel anvendes hyppigt som adsorptionsmiddel til adskillelse af phospholipider. DE offentliggørelsesskrift nr. 2.915.614 beskriver en fremgangsmåde til adskillelse af olie og steroler fra sojaråphosphatider med det formål, at udvinde renlecithin ved chromatografi af en petro-5 leumsetheropløsning på silicagel. Herved bliver olie og steroler på si-licagelen, og de må elueres med polære opløsningsmidler i en anden høst.

Ud fra alkoholiske opløsninger tilbageholdes phospholipider af silicagel ved stuetemperatur (H. Richter et al. Pharmazie 1977, 32, 164). Adskillelsen eller den selektive desorption af phosphatiderne sker enten med 10 al kohol/ammoniak (Japan Kokai 49093400) eller med blandinger af chloro-form/methanol eller chloroform/methanol/vand (DDR patentskrift nr. 79 916). Principielt er det muligt at udvinde et lysophosphatidylcholinfrit phosphatidylcholin ved chromatografi på silicagel under anvendelse af en elueringsmiddelgradient af chloroform/methanol eller chloroform/metha-15 nol/vand. Genvindingen og fjernelsen af sådanne opløsningsmiddel bl åndinger fra slutproduktet er meget bekostelig, specielt når der er tale om en gradienteluering (til dels azeotrope blandinger).

Den i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.047.048 beskrevne fremgangmåde til isolering af phosphatidylcholin fra alkoholiske phospholipidop-20 løsninger ved hjælp af silicagelsøjlechromatografi ved forhøjet temperatur består af to trin: 1. ekstraktion fra sojaråphosphatid phosphatidylcholinudbytte: ca. 60% 25 2. søjlechromatografisk rensning phosphatidylcholi nudbytte: ca. 73%

Over begge trin foreligger et phosphatidylcholinudbytte på ca. 44% 30 af det teoretiske beregnet ud fra sojaråphosphatid. Denne virkningsgrad er utilfredsstillende. Phosphatidylcholinet indeholder desuden spor af phosphatidyl ethanolamin og lysophosphatidylcholin. Da lysophosphatidyl-cholinet på grund af fremgangsmåden ikke kan fraskilles, er kun et sojaråphosphatid af bedste kvalitet med et lysophosphatidylcholi nindhold på 35 0,5% egnet som udgangsmateriale.

Alle hidtil beskrevne fremgangsmåder til isolering af ledsagephos-phatidfrit phosphatidylcholin fra sojaråphosphatid er mere eller mindre behæftet med mangler såsom:

DK 166364 B

4 fremgangsmåder i flere trin ringe phosphatidylcholinudbytter anvendelse af kun vanskeligt regenererbare 5 opløsningsmiddelblandinger til den søjlechromatografiske adskillelse, til dels med elueringsmiddelgradienter anvendelse af toxiske opløsningsmidler selektivt valg af udgangsmaterialer med hensyn til lysophos-phatidylcholin 10 - ikke regenererbare adsorptionsmidler tilstedeværelse af ledsagephospholipider såsom phosphatidyl-ethanolamin og lysophosphatidylcholin i slutproduktet lavere phosphatidylcholinindhold 15 Disse ulemper indvirker nødvendigvis på fremstillingsomkostningerne eller fører ikke til det ønskede ledsagephospholipidfrie phosphatidyl-cholin.

Den foreliggende opfindelse har som formål at tilvejebringe en simpel fremgangsmåde til isolering af et ledsagephospholipidfrit, navnlig 20 lysophosphatidylcholinfrit phosphatidylcholin fra råphosphatider (soja, raps, solsikke).

Det har nu overraskende vist sig, at man ved en et-trins proces opnår et ledsagephospholipidfrit phosphatidylcholin ud fra en råphospha-tidopløsning ved hjælp af silicagelsøjlechromatografi.

25 Den foreliggende opfindelse angår i overensstemmelse hermed en sær lig fremgangsmåde til isolering af ledsagephospholipidfrit phosphatidylcholin fra en vegetabilsk lipidblanding, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man opløser lipidblandingen med en opløsningsmiddel-blanding af en 1averekogende petroleumsetherfraktion (40-80°C), en Cj-C^ 30 lavere al kano! og vand, kommer opløsningen på en med silicagel fyldt søjle ved en temperatur i området fra 20-50'C, ved denne temperatur elu-erer med samme opløsningsmiddel bl ånding og derved opnår et ledsagephospholipidfrit phosphatidylcholin i hovedløbet. Der anvendes fortrinsvis en opløsningsmiddel bl ånding af 1 volumendel letbenzin (65-730C), 1 volu-35 mendel 2-propanol og 0,175 volumendele vand.

I for- og efterløbet fraskilles de i råphosphatidet forekommende lipider. Det har overraskende vist sig, at det ud fra en sådan blanding . af mange stoffer er muligt ved en et-trins proces at isolere højrent

DK 166364 B

5 phosphatidylcholin (hovedløb), som kun fortsat er forurenet med spor af glykolipider.

Glykolipiderne kan fjernes på kendt måde for eksempel ved ekstraktion af phosphatidylcholin med ethanol (glykolipider er uopløselige i 5 ethanol). Man opnår således et ledsagestof-, navnlig lysophosphatidyl-cholinfrit phosphatidylcholin i høj renhed.

Phosphatidylcholinvirkningsgraden udgør for eksempel ved rent soja-phosphatidylcholin 88% af det teoretiske eller ved phosphatidylcholin af høj renhed 86% af det teoretiske beregnet ud fra det anvendte sojarå-10 phosphatid og ligger dermed i en ikke tidligere opnået størrelsesorden.

Ud over den simple fremgangsmåde frembyder den nye fremgangsmåde også den fordel, at også mindreværdige råphosphatider kan anvendes. Dette gælder også for de ud fra mindreværdige råphosphatider ved kendte måder fremstillede phosphatidylcholiner, som er forurenet med lysophospha-15 tidylcholin.

Som silicagel kan anvendes sædvanlige produkter til chromatografi af forskellig kornstørrelse eller presset silicagel, som kan være aktiveret eller desaktiveret. Der anvendes fortrinsvis neutral silicagel.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres ved en temperatur i områ-20 det fra 20-50°C og kan udføres ved normaltryk eller ved overtryk.

En ganske speciel fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at man efter udført chromatografi igen kan anvende sil i cage!en. Samtlige forureninger opfanges i forløbet eller i efter!øbet. Der kan desuden ses bort fra efterløbet, da de i søjlen værende forureninger ved 25 fornyet belastning af denne bliver elueret med det næste forløb.

En yderligere fordel ligger i anvendelsen af en let destillerbar opløsningsmiddelbl ånding.

Sammenligningen med kendte fremgangsmåder viser de omkostningsmæssige fordele ved den nye et-trinsfremgangsmåde. Sojaphosphatidylcholinet 30 udvindes for eksempel fra sojaphosphatid med en virkningsgrad på 88%.

Ved en søjlechromatografisk adskillelse adskilles 110 g sojaråphosphatid over 200 g silicagel, hvortil der kun kræves 4,4 1 samlet el uat. Fremgangsmåden har snarere karakter af en filtrering end af en søjlechromatografisk rensning i sædvanlig forstand.

35 Opfindelsen belyses nærmere i de efterfølgende eksempler nr. 1, 2, 4 og 5. Eksempel 3 er et sammenligningseksempel.

DK 166364 B

6

Analysemetode

Phospholipiderne analyseredes ved hjælp af tyndt!agschromatografi. Olieindholdet blev sat lig med den dialyserbare del. Vandet bestemtes efter Karl Fischer, og restopløsningsmiddel indholdet bestemtes gaschro-5 matografisk.

Opløsnings- og elueringsmiddelbl ånding

Der anvendtes en blanding af 1 volumendel letbenzin (65-73°C), 1 volumendel 2-propanol og 0,175 volumendele vand.

10 Søjlechromatografi

Der anvendtes en dobbeltkappechromatografisøjle (indvendig diameter 4,5 cm, højde 37 cm). En varmeveksler var indskudt før søjlen. Søjlen fyldtes med en opslæmning af 200 g silicagel.(Woelm) i den angive opløs-15 ningsmiddelbl ånding. Efter udført chromatografi kan silicagelen benyttes igen.

Udgangsmateriale

Der anvendtes råphosphatider med følgende sammensætning: 20

Soja Raps Solsikke phosphatidylcholin (PC) 16% 18% 22% phosphatidyl ethanol amin (PE) 17% = 13% 13% 25 lysophosphatidylcholin (LPC) 2,5% 2,6% 1,0% phosphatidylinosit (PI) 9% 12% 13% N-acyl-phosphatidyl - ethanolamin (N-acyl-PE) 2% 1% 1% phosphatidsyre (PA) 8% 7% 5% 30 olie 35% 36% 30%

Rest: andre lipi der

Eksempel 1 450 ml af en opløsning af 110 g sojaråphosphatid (med 16% PC og 35 2,5% LPC) i den angivne opløsningsmiddelblanding sættes til en med silicagel (200 g) fyldt chromatografisøjle og elueres med samme opløsningsmiddelblanding ved stuetemperatur. Det samlede el uat inddeles i tre fraktioner. Fraktionerne inddampes, og remanensen analyseres.

DK 166364 B

7 1. fraktion 0 - 1,6 1 Remanens: 89,5 g

indeholder neutrallipider, glykolipider og phospholipider såsom PE, N-acyl-PE, PA, PI

5 og spor af PC

2. fraktion 1,8 - 4,4 1 Remanens: 18 g (rent phos- phatidylcholin) PC-indhold: 86% 10 olieindhold: 0,5%

Tyndtlagschromatografisk undersøgelse viser ud over PC kun glykolipider som forurening. PC-virkningsgrad: 88% af det teoretiske beregnet i forhold til sojaråphosphatid.

15 3. fraktion 4,4 1 - 5,0 1 Remanens: 2 g indeholder PC, LPC og spor af glykolipider

En ringe PC-mængde bliver tilbage i silicagelen.

20 18 g af fraktion 2 med 86% phosphatidylcholin røres sammen med 200 ml 95%-ig ethanol ved stuetemperatur i en time. De uopløselige glykolipider frafiltreres over 1 g aluminiumoxid som filterhjælpemiddel. Filtratet inddampes og remanensen analyseres.

25 Remanens: 15,8 g (phosphatidylcholin med høj renhed) PC-indhold: 96 % vand: 1,6 % olie: 0,5 % ethanol: 0,8 % 30 PC-virkningsgrad: 86 % af det teoretiske beregnet i forhold til sojaphosphatid renhed (TLC): der påvistes ingen yderligere forureninger.

Eksempel 2 35 Et forsøg svarende til eksempel 1 gennemførtes med en søjletemperatur på 50*C. Der foretoges samme fraktionsopdelinger med uforandret samlet eluatvolumen. Den anden fraktion indeholdt 16,5 g faststof med 87% PC (rent phosphatidylcholin). Renheden ved tyndtlagschromatografi svare-

DK 166364 B

8 de til produktet i eksempel 1.

Eksempel 3 (sammenligningseksempel, fremgangsmåde ifølge DE offentliggørelseskrift 5 nr. 3.047.048) 344 g sojaråphosphatid (16,5% PC og 2,5% LPC) røres sammen med 1032 ml 96 %-ig ethanol ved 75°C i 5 minutter. Sedimentet fraskilles ved stuetemperatur, og den overstående ethanol fase inddampes.

10 Remanens: 110 g PC-indhold: 30% PC-virkningsgrad: 60% af det teoretiske beregnet i forhold til sojaphosphatid 15 110 g remanens opløses i 350 ml 95%-ig ethanol og adskilles i hen hold til DE offentliggørelsesskrift nr. 3.047.048 (eksempel 1) ved hjælp af søjlechromatografi over silicagel ved 70°C under anvendelse af 96%-ig ethanol som elueringsmiddel. Hovedløbet inddampes, og remanensen analyseres.

20

Remanens: 27,7 g PC-indhold: 87 % LPC-indhold: 5 % PC-virkningsgrad: 73 % 25 30 g af remanensen fra hovedløbet med phosphatidylcholinet med 87% PC og 5% LPC opløses i 150 ml af en blanding af 1 volumendel letbenzin (65-73T), 1 volumendel 2-propanol og 0,175 volumendele vand, kommes på en med silicagel (200 g) fyldt chromatografisøjle og elueres med samme 30 opløsningsmiddel bl ånding ved stuetemperatur. Efter 400 ml forløb opfanges 3,5 1 hovedløb.

Hovedløbet inddampes, og remanensen analyseres.

35 9

DK 166364 B

Remanens: 22 g PC-indhold: 95% olieindhold: < 0,5% LPC-indhold: < 0,2% (påvisningsgrænse) 5 PC-virkningsgrad: 80% af det teoretiske beregnet i forhold til det anvendte materiale vand: 1,5%

Eksempel 4 10 500 ml af en opløsning af 125 g solsikkeråphosphatid med 22% PC og 1,0% LPC i den angivne opløsningsmiddelblanding sættes til en med si 1 i -cagel (200 g) fyldt chromatografisøjle og elueres med samme opløsningsmiddelblanding ved stuetemperatur. Det samlede eluat inddeles i to fraktioner. Fraktionerne inddampes, og remanensen analyseres.

15 1. fraktion 0 - 1,0 1 Remanens: 97 g indeholder neutrallipider, glykolipider og phospholipider såsom PE, N-acyl-PE, PA, PI og spor af PC.

20 2. fraktion 1,0 - 4,0 1 Remanens: 26 g PC-indhold: 87 % olieindhold: 0,7% 25 Undersøgelse ved tyndtlagschromatografi viser, at der ud over PC kun er glykolipider som forurening. PC-virkningsgrad: 83% af det teoretiske beregnet ud fra solsikkeråphosphatid.

Der bliver en lille smule PC tilbage i silicagelen.

26 g af 2. fraktion med 87% phosphatidylcholin røres sammen med 200 30 ml 95%-ig ethanol ved stuetemperatur i en time. De uopløselige glykolipider filtreres over 1 g aluminiumoxid som filterhjælpemiddel. Filtratet inddampes, og remanensen analyseres.

35

DK 166364 B

10

Remanens: 23,2 g (phosphatidylcholin i høj renhed) PC-indhold: 97 % olieindhold: 0,7 % tørstoftab: 1,5 % 5 PC-virkningsgrad: 82 % af det teoretiske beregnet i forhold til solsikkephosphatid renhed (TLC): der påvistes ingen yderligere forureninger

Eksempel 5 10 500 ml af en opløsning af 160 g rapsråphosphatid (18% PC, 2,6% LPC) i den angivne opløsningsmiddel bl ånding behandledes som i eksempel 4.

Remanens: 20,7 g (phosphatidylcholin i høj renhed) PC-indhold: 96 % 15 olieindhold: 1,3 % tørstoftab: 2,0 % PC-virkningsgrad: 69 % af det teoretiske beregnet i forhold til solsikkephosphatid renhed (TLC): der påvistes ingen yderligere forureninger

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til isolering af ledsagephospholipidfrit phos-phatidylcholin fra en vegetabilsk lipidblanding, KENDETEGNET ved, AT man 5 opløser lipidblandingen med en opløsningsmiddel bl ånding af en laverekog-ende petroleumsetherfraktion (40-80°C), en Cj-C^ lavere alkanol og vand, kommer opløsningen på en med silicagel fyldt søjle ved en temperatur i området fra 20-50eC, ved denne temperatur eluerer med samme opløsningsmiddelblanding og derved opnår et ledsagephospholipidfrit phosphatidyl- 10 cholin i hovedløbet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT man anvender en opløsningsmiddel bl ånding af 1 volumendel af en petroleumsetherfraktion (65-73°C), 1 volumendel 2-propanol og 0,175 volumendele vand. 15

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT lipidblandingen kan være sammensat af polære og upolære vegetabilske lipi-der, således som de forekommer i råphosphatider (rålecithiner).

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, AT lipidblandingen består af phosphatidylcholinholdige phospholipider. 25 30