SE501697C2 - Förfarande för utvinning av sfingomyelin - Google Patents

Description

501 10 15 20 25 30 35 697 2 - Fosfolipider från mjölk anses skydda mot magsår. De har ytaktiv verkan och bildar ett hydrofobt skikt på tarm- slemhinnan, vilket skyddar mot magsyra.

Tänkbara råvarukällor för sfingomyeliner är bl a mjölkprodukter, blodprodukter och äggprodukter.

Ca O,6% av det totala fettinnehållet i mjölk utgöres av fosfolipider. Fem olika fosfolipider förekommer i mjölkfett, med följande ungefärliga procentuella fördel- ning: fosfatidylkolin 34%, fosfatidyletanolamin 32%, sfingomyelin 25%, fosfatidylinositol 5% och fosfatidyl- serin 3%.

Fosfatidylkolin och fosfatidyletanolamin är de van- ligaste fosfolipiderna både i växtvävnader och animalie- vävnader. Sfingomyeliner finns däremot enbart i animalie- vävnader och är en av huvudkomponenterna i alla animala cellmembran.

De olika fosfolipiderna liknar varandra kemiskt och fysikaliskt och är därför svåra att separera från varand- ra (se fig 1).

För de tilltänkta användningarna av sfingomyelin är det mycket viktigt att kunna utvinna sfingomyelin i så ren form som möjligt och väsentligen fritt från övriga fosfo- lipider.

Hittills kända metoder för utvinning av fosfolipider ur fettblandningar inbegriper separation genom utfällning eller genom kromatografi (kolonnteknik).

En välkänd metod för separering av fosfolipider från ett lipidinnehållande koncentrat är utfällning ur iskall aceton. Detta förfarande beskrivs bl a av Andrews, A. G., J. Chromatogr. 336 (1984) 139, och av Baumy, J. J. et al, Process No 1047, p 29-33. Genom denna metod faller alla fosfolipider i koncentratet ut i form av en blandning.

Många publikationer beskriver separation av fosfoli- pider med hjälp av kolonnteknik, både i analysskala och preparativ skala. Som kolonnfyllningsmassa används vanli- gen kiseldioxidgel, men även en bunden polär massa kan användas, t ex DIOL- eller CN-kolonnmassa. De två vanli- 10 15 20 25 30 35 501 697 3 gaste förekommande elueringssystemen är hexan/isopropa- nol/vatten och acetonitril/vatten. Christie, W. W., J.

Soc. Dairy Tech. 40, 1 (1987) p 10-12 beskriver en HPLC- -metod för analys av fosfolipider i mjölk och mejeripro- dukter. Metoden innebär att ett koncentrat av fosfolipider sätts på en kolonn av kiseldioxidgel och elueras med ett gradientsystem. 1 I DE patentskriften 3 445 949 A1 (Nattermann & Cie GmbH) beskrivs en process för isolering av fosfatidylkolin ur en lipidblandning från växter. En kolonn med kiseldi- oxidgel används och lipidblandningen löses i samma lös- ningsmedelsblandning som sedan används som elueringsmedel, nämligen petroleumeter:isopropanolzvatten. Denna process är en ren kromatografiprocess.

I SU patentskriften 1 133 275 beskrivs en teknik för separation av sfingomyelin från animaliskt material. Meto- den innebär att lipider extraheras från animaliskt mate- rial med kloroform:metanol (1:l). Sfingomyelin upprenas genom att det bringas att passera genom en kolonn med ki- (2:8). Detta Metoden omfat- seldioxidgel, eluerad med kloroformzmetanol är också en rent kromatografisk separation. tar även tvättningssteg med syra/alkali.

I EP patentskriften O 455 528 beskrivs kärnmjölk för erhållande av en blandning av komplexa lipi- användning av der innehållande 66% fosfolipider. Komplexa lipider sepa- reras från neutrallipider med hjälp av adsorptionskroma- tografi. Produkten är en blandning av fosfolipider från mj ölk.

I SU patentskriften 1 289 440 A beskrivs en metod för utvinning av fosfolipider ur animaliskt råmaterial (kärn- mjölk). Metoden inbegriper extraktion av surgjord kärn- mjölk med organiskt lösningsmedel följt av kolonnkromato- grafi för ökning av utbytet. Som extraktionsmedel används en blandning av kloroform och metanol. Metoden omfattar kromatografi respektive fällning ur aceton för att skilja fosfolipider från neutralfett. Någon separation av enskil- da fosfolipider erhålles ej. 501 10 15 20 25 30 35 697 4 I JP patentskriften 030 47192 A2 beskrivs en metod för upprening av fosfolipider från mjölk och mejeriproduk- ter, varvid man utnyttjar centrifugal-vätske-fördelnings- kromatografi (CPC). Från ett skummjölkspulverextrakt iso- lerades 99% ren fosfatidyletanolamin med hjälp av en l0O:90:l0. 97% rent fosfatidylkolin och 98% rent sfingomyelin isolerades med blandning av hexanzetanolzvatten = hjälp av en blandning av hexan:dietyleter:metanol:vatten = l0O:l0O:80:20 och en blandning av hexan:metanol:vatten = 200:90:l0. Detta är en ren kromatografisk metod som ej är lämplig för utvinning av fosfolipider i industriell skala.

Kolonnseparationstekniken har flera nackdelar. Inves- teringskostnaderna är höga för processutrustningen, såsom kolonner, kolonnmassa, pumpar. Det går åt mycket stora lösningsmedelsvolymer för eluering av fosfolipider. Detta i sin tur ställer krav på en anläggning för återvinning av lösningsmedlen.

I DE patentskriften 3 800 468 A beskrivs en teknik för avlägsnande av fosfolipider ur vassle genom höjning av pH-värdet, tillsats av kalcium och värmning. Genom denna process erhålles en vassle med bättre kvalitet. Metoden går således ut på att avfetta vassle och någon separation av de avlägsnade fosfolipiderna beskrivs ej.

I JP patentskriften 030 58944 A beskrivs en process för separation av fosfolipiderna fosfatidyletanolamin och fosfatidylkolin. Som råmaterial används äggula, soja eller majs. Lipidfraktionen löses i ett icke-polärt eller svagt polärt lösningsmedel (kloroform, hexan, aceton, etanol, etylacetat etc). Lösningen kyls till mellan -30°C och -20°C. Genom att värma lösningen till 0-lO°C erhålls en fällning innehållande fosfatidyletanolamin och en super- natant innehållande fosfatidylkolin. Genom denna process erhålles inget sfingomyelin. Ändamålet med föreliggande uppfinning är att åstad- komma ett industriellt användbart förfarande för ekono- miskt tillvaratagande av sfingomyelin ur fettkoncentrat som härrör från olika animalieprodukter, såsom mjölkpro- 10 15 20 25 30 35 501 697 5 dukter, blodprodukter och äggprodukter. Följande krav kan ställas på ett sådant förfarande: 1. Det skall ge ett högt utbyte av sfingomyelin i kombina- tion med hög renhet på produkten. 2. Det skall vara ett ekonomiskt förfarande. 3. Förfarandet skall vara hygieniskt. Ändamålet med föreliggande uppfinning uppfylles genom ett förfarande för utvinning av sfingomyelin ur ett fosfo- lipidinnehållande fettkoncentrat, vilket förfarande känne- tecknas av att A. fettkoncentratet löses i en lösningsmedelsblandning av ett huvudsakligen polärt organiskt lösningsmedel och ett huvudsakligen opolärt organiskt lösningsmedel, B. en fas bestående huvudsakligen av det huvudsakligen opolära organiska lösningsmedlet med däri lösta fosfo- lipider avskiljes, varvid sfingomyelin föreligger i en koncentration av 2-20 mg/ml av det huvudsakligen opolä- ra organiska lösningsmedlet, C. till den i B avskiljda fasen sättes ett organiskt lös- ningsmedel med intermediär polaritet i ett volymförhål- lande till det huvudsakligen opolära lösningsmedlet av inom området 1:1-2:1 och vid en temperatur av ca 13-25°C, varvid en fällning omfattande huvudsakligen sfingomyelin bildas tillsammans med en viskös fas och en lösningsmedelsfas, varefter D. fällningen och den viskösa fasen avskiljes och sepa- reras från varandra.

En stor fördel med uppfinningen är den begränsade lösningsmedelsåtgàngen jämfört med kolonnseparationsmeto- der. Förfarandet kräver vidare en förhållandevis enkel och därmed billig utrustning.

Genom uppfinningen åstadkommas ett sätt att utvinna en anrikad fraktion av sfingomyelin i industriell skala med hjälp av ett utfällningsförfarande. Rena fraktioner av sfingomyelin har hittills inte framställts i industriell skala. Tidigare kända metoder för utvinning av sfingomye- lin har utnyttjat kolonnkromatografiteknik och har endast avsett små kvantiteter. 501 10 15 20 25 30 35 697 6 Som utgångsprodukt för förfarandet enligt uppfinning- en används fettkoncentrat som härrör från olika typer av animalieprodukter, såsom mjölkprodukter, blodprodukter och äggprodukter.

En lämplig mjölkràvara är kärnmjölk, som är den vat- tenfas som erhålles som biprodukt vid tillverkning av smör. Kärnmjölkspulver erhålls efter indunstning och tork- ning av denna vattenfas. Även icke indunstad kärnmjölk kan användas som råvara till fettkoncentratet. Kärnmjölkens fettdel koncentreras därvid med hjälp av ett mikrofiltre- ringsförfarande.

En annan mjölkràvara utgörs av vassle. Fetthalten i separerad vassle är ca 0,05%. En tredjedel av detta fett utgöres av fosfolipider. Denna fettfraktion kan avskiljas ur vassle med olika kända metoder och kan därefter använ- das som råvara vid uppfinningen.

Fosfolipidsammansättningen i blod är mycket lik den i mjölk. En fettfraktion från blod är därför också användbar som råvara för uppfinningen. Även fettfraktionen från hönsägg kan användas som rå- vara för uppfinningen.

För bättre förståelse av vilka lösningsmedel som kan komma ifråga vid förfarandet enligt uppfinningen ges föl- jande kemiska bakgrund.

En sfingomyelinmolekyl (se fig 1) är uppbyggd av en fosforylkolingrupp, en fettsyra och en sfingoidbas (SPhB).

Fettsyran är bunden till den primära aminogruppen på kol- atom nr 2 i SPhB via en amidbindning. Naturligt förekom- mande sfingomyeliner varierar beträffande SPhB och acyl- grupp. Den vanligaste SPhB är en amindiol med 18 kolatomer kal- lad sfingosin (se fig 1), har en transdubbelbindning mel- (1,3-dihydroxi-2-amino-4-oktadecen). Denna förening, lan kolatomerna 4 och 5. De vanligaste acylgrupperna i sfingomyeliner är i avtagande grad: C16, C24:l, C22 och C24. Fettsyrorna är vävnadsspecifika. Exempelvis innehåller vit vävnad från human hjärna C24:l, medan brun vävnad innehåller C18. 10 15 20 25 30 35 501 697 7 Molekylstrukturen hos både sfingomyeliner och glyce- rofosfolipider utmärks av en geografisk segregation mellan polära och opolära delar. Molekylerna består av ett polärt "huvud" och en eller två hydrofoba “svansar" sammanbundna av en region med intermediär polaritet. På grund av denna segregation inuti molekylen finns det inget lösningsmedel som är lämpligt för både huvud- och svansdelen. Resultatet härav är att molekyler av denna typ, betecknade amfifila, kommer att bilda komplexa strukturer för att minimera oönskade kontakter med lösningsmedel. Aggregatens struktur beror både på den amfifila molekylen och lösningsmedlet. I vatten, som är dessa molekylers biologiska miljö, bildar sfingomyeliner och fosfatidylkoliner spontant bi-skikt ("bilayers"). I dessa lamellära strukturer, som är två mo- lekyler tjocka, bildar de hydrofoba svansarna en hydrofob kärna medan de polära huvudena bildar ett ytskikt.

Fosforylkolin är polär huvudgrupp i både sfingomyeli- ner och fosfatidylkoliner, men övriga delar av molekylerna uppvisar olika distinkta kännetecken (se fig 1). De hydro- foba delarna skiljer sig bl a i längden på kolvätekedjorna och antalet dubbelbindningar.

Skillnaden mellan sfingomyelin och fosfatidylkolin är ännu större i mellanregionen. I sfingomyelinerna ger bl a amidbindningen mellan acylkedjan och den primära amino- gruppen på kol 2 och hydroxylgruppen bunden till kol 3 upphov till stor kapacitet som vätebindningsdonator. Denna kapacitet återfinns inte i fosfatidylkolin. Hos fosfati- dylkolin kan i stället karboxylsyret fungera som vätebind- ningsmottagare. Skillnaderna i vätebindningskapacitet återspeglas i dessa lipiders interaktioner med andra lipi- der och med membranproteiner. Strukturdifferenserna inne- bär också skillnader i fysikaliska egenskaper för sfingo- myeliner och fosfatidylkoliner i bistrukturer. I många system är den sammanlagda mängden av de två kolinlipiderna ungefär hälften av den totala mängden fosfolipider, men förhållandet mellan dem kan variera mycket. Variationer i detta förhållande har betydelse för blandningens egenska- per. 501 10 15 20 25 30 35 697 8 En av de tydligaste skillnaderna mellan fosfatidyl- koliner och sfingomyeliner är temperaturen för övergången från gelfas till flytande kristallin fas. De flesta sfingomyeliner har en övergångstemperatur i det fysiolo- giska temperaturområdet (ca 37°C), medan nästan alla na- turligt förekommande fosfatidylkoliner har en betydligt lägre övergångstemperatur och därför befinner sig klart över sin övergångstemperatur vid 37°C. Blandade fosfati- dylkolin/sfingomyelinbiskikt som innehåller mer än 50% sfingomyeliner har en övergång nära 37°C, medan biskikt med mindre andel sfingomyeliner inte visar någon övergång vid så hög temperatur. Detta återspeglas också i mikro- viskositeten hos blandade biskikt vid 37°C, vilken ökar med ökande halt sfingomyeliner.

Förfarandet enligt uppfinningen för utvinning av sfingomyelin grundar sig på att lösligheten av sfingomye- liner i en blandning av ett organiskt lösningsmedel med intermediär polaritet och ett huvudsakligen opolärt orga- niskt lösningsmedel är lägre än för övriga fosfolipider i blandningen.

Principen för isolering av sfingomyelin är således att till en blandning av neutralfett och fosfolipider löst i ett huvudsakligen opolärt organiskt lösningsmedel sätta ett organiskt lösningsmedel av intermediär polaritet i lämplig mängd, varvid sfingomyeliner faller ut medan övri- ga fosfolipider och neutralfett förblir i lösning.

Vid en föredragen utföringsform av uppfinningen kan resten av fosfolipiderna efter avskiljningen av sfingomye- linfällningen fällas ut genom sänkning av temperaturen.

Den mängd av det organiska lösningsmedlet med inter- mediär polaritet som åtgår för att fälla ut sfingomyeli- nerna är beroende av koncentrationen av sfingomyelinerna och övriga fosfolipider i fasen av huvudsakligen opolärt, organiskt lösningsmedel samt av temperaturen.

Ett koncentrat löses i ett tvåfassystem bestående av ett huvudsakligen opolärt organiskt lösningsmedel och ett huvudsakligen polärt organiskt lösningsmedel. Sfingomye- 10 15 20 25 30 35 501 697 9 liner kan inte, såsom förklaras ovan, lösas optimalt i en- bart ett opolärt organiskt lösningsmedel på grund av den amfifila karaktären. Lösligheten förbättras därför med in- blandning av ett polärt lösningsmedel. Tvåfassystemet in- nebär en tvätt av fettkoncentratet eftersom laktos, salt och protein övergår till den polära fasen.

Neutralfett och fosfolipider återfinns efter separa- tion i fasen av opolärt organiskt lösningsmedel.

Fasen av huvudsakligen opolärt organiskt lösningsme- del blandas med ett organiskt lösningsmedel med interme- diär polaritet i lämplig mängd och vid lämplig temperatur, varvid sfingomyelinerna selektivt faller ut, medan övriga fosfolipider koncentreras till en viskös, "brun fas" vil- ken efter undersökning i mikroskop med planpolariserat ljus synes vara en flytande kristallin fas. Neutralfett och en del av de övriga fosfolipiderna förblir i lösning.

Sfingomyelinfällningen och “den bruna fasen" avskiljs. För att om så önskas fälla ut resten av övriga fosfolipider, dvs fosfatidyletanolamin och fosfatidylkolin, sänks tempe- raturen på den kvarvarande lösningen.

För att lösa de amfifila fosfolipiderna används såsom nämnts ovan en blandning av ett huvudsakligen opolärt or- ganiskt lösningsmedel och ett huvudsakligen polärt orga- niskt lösningsmedel. Det huvudsakligen opolära organiska lösningsmedlet kan exemplifieras med n-heptan, n-hexan, cyklohexan, isooktan, toluen, kloroform. Det huvudsakligen polära organiska lösningsmedlet kan exemplifieras med en alkohol, såsom etanol, metanol, propanol, butanol. I det polära lösningsmedlet är molekylens huvud lösligt och i det opolära lösningsmedlet är svansarna lösliga. Organiska lösningsmedel med intermediär polaritet löser varken det polära huvudet eller de hydrofoba svansarna. Detta torde vara förklaringen till att sfingomyelin och övriga fosfo- lipider kan utfällas med hjälp av ett organiskt lösnings- medel av intermediär polaritet. Exempel på ett sådant lös- ningsmedel är aceton, 2-butanon, 2-pentanon, 3-pentanon, metylacetat, etylacetat, varvid särskilt aceton föredra- ges. 501 10 15 20 25 30 35 697 10 De olika fosfolipiderna faller ut vid olika tempera- turer på grund av den ovan beskrivna skillnaden i över- gångstemperatur för övergång från gelfas till flytande kristallin fas. Genom att hålla lösningsmedelsblandningen vid en temperatur av ca 13-25°C fälles huvudsakligen sfingomyelin ut. Efter avskiljning av lösningen kan res- terande fosfolipider utfällas genom att temperaturen på lösningsmedelsblandningen sänks till ca 0-5°C.

Sfingomyelinfällningen kan efter avskiljning tvättas med ytterligare mängd av samma lösningsmedelsblandning som används vid utfällningen vid en temperatur som ligger nå- got över utfällningstemperaturen, t ex ca 25°C, och under omröring. Efter temperering av blandningen vid en tempera- tur inom utfällningsområdet, dvs ca 13-25°C, centrifugeras fällningen ifrån och torkas. Därvid löses övriga fosfoli- pider ut från sfingomyelinfällningen och fällningens ren- het stiger till 70%.

Utfällningen av sfingomyeliner genomförs alltså vid ca 13-25°C, dvs vid ungefär rumstemperatur eller strax därunder. Företrädesvis genomförs utfällningen vid ca 15-2l°C, särskilt vid ca 20°C.

Sfingomyelinprodukten kan renas ytterligare med an- vändning av en förenklad kromatografiteknik. Fällningen löses i en lämplig lösningsmedelsblandning (se ovan) under uppvärmning och pumpas därefter igenom en kolonn med lämplig fyllmassa. Härigenom kan en så hög renhetsgrad som 95% sfingomyelin erhållas.

Förhållandet mellan det organiska lösningsmedlet med intermediär polaritet och det huvudsakligen opolära orga- niska lösningsmedlet skall ligga inom området 1:1-2:1.

En annan faktor som påverkar effektiviteten i utfäll- ningen av sfingomyeliner är sfingomyelinernas koncentra- tion i fasen av huvudsakligen opolärt organiskt lösnings- medel. Denna koncentration skall ligga inom området 2-20 mg/ml för högsta effektivitet. 10 15 20 25 30 35 501 697 ll En viktig råvara för fosfolipider är kärnmjölk. Kärn- mjölk erhålles i stora mängder som biprodukt vid fram- ställning av smör. Kärnmjölken kan torkas till ett gulvitt pulver, kärnmjölkspulver. Kärnmjölkspulver har följande ungefärliga sammansättning: Vikt% Laktos 49 Protein 34 Aska 7 Fett 5 Torrsubstans 96 Fettdelen, som utgör ca 5% av pulvret, är sammansatt av neutrallipider (ca 75% av fettdelen) och komplexa lipi- der fràn fettkulemembranen (ca 25% av fettdelen). De komp- lexa lipiderna utgörs framför allt av fosfolipider.

Fettet i kärnmjölkspulver kan t ex utvinnas genom extraktion av pulvret med etanol. Tekniken för utvinning av fett ur kärnmjölkspulver (eller med andra ord avfett- ning av pulvret) genom extraktion finns beskriven t ex i SE patentskriften 7801821-5.

Vid etanolextraktionen erhålles ett råextrakt inne- hållande fosfolipider med följande sammansättning: Vikt% Torrsubstans 70 Protein 3 Laktos 10 Salt 6 Aska 9 Fett 35 I fetthalten ingår fosfolipider: Fosfatidylkolin 3 Fosfatidyletanolamin 3 Sfingomyelin 2 Detta ràextrakt kan användas som utgångsprodukt för förfarandet enligt uppfinningen. 501 10 15 20 25 30 35 697 12 De bifogade figurerna visar följande: Fig l visar molekylformler för olika fosfolipider och den vanligaste sfingomyelinbasen (sfingosin).

Fig 2 visar ett flödesschema för en utföringsform av uppfinningen enligt exempel 1.

Fig 3-7 visar kromatogram, i vilka ökningen av sfingomyelinets renhetsgrad i de olika stegen i förfaran- det enligt uppfinningen framgår.

Fig 8-10 visar resultaten av utfällning av tre fos- folipider enligt exempel 2.

Uppfinningen kommer nu att beskrivas närmare med hjälp av följande utföringsexempel.

Exemgel 1 21 kg fettextrakt från kärnmjölkspulver blandades med 42 liter 75% etanol och 21 liter n-heptan. Efter fassepa- ration erhölls 24,5 liter heptanfas, innehållande neutral- fett och fosfolipider. Kromatografi (fig 3) av heptanfasen visade följande fosfolipidsammansättning: Fosfatidyletanolamin PE: 14 mg/ml Totalt: 343 g Fosfatidylkolin PC: 14 mg/ml Totalt: 343 g Sfingomyelin SM: 10 mg/ml Totalt: 245 g Heptanfasen blandades med 38 liter aceton (förhållan- de acetonzhepan 1,5:l). Blandningen fick stå i 3 h vid 20°C, varvid en vit fällning innehållande sfingomyelin bildades.

Blandningen centrifugerades, varvid ett bottenskikt med fällning erhölls. Ovanför fällningen låg en viskös "brun fas" och ovanför denna en klar lösning.

Fällningen separerades ifrån och torkades, varvid 309 g fällning erhölls. Sammansättning: 60% sfingomyelin, 3% fosfatidyletanolamin, 3% fosfatidylkolin (kromatogram, se fig 4). 2,2 liter s k "brun fas 1" avskiljdes, vilken inne- höll ett koncentrat av fosfolipider (kromatogram, fig 5) med följande sammansättning: PE: 98 mg/ml Totalt 216 g PC: 98 mg/ml 216 g SM: 24 mg/ml 53 g 10 15 20 25 30 35 501 697 13 Undersökning av fasen i mikroskop med planpolariserat ljus visar tydlig dubbelbrytning, vilket indikerar att det är en flytande kristallin fas, sannolikt en omvänt hexago- nal fas.

Ovanlösningen, 56 liter, innehöll låga halter fosfo- lipider: PE: 1,7 mg/ml Totalt 95 g PC: 1,7 mg/ml 95 g SM: 0,2 mg 11 g Genom att sänka temperaturen i ovanlösningen till 5°C kunde mer fosfolipider avskiljas i form av fällning och brun fas: Fällning från heptan/acetonfas, efter 18 h vid 5°C (66 g): PE: 218 mg/g Totalt 14 g PC: 218 mg/g 14 g SM: 119 mg/g 8 g "Brun fas 2" efter 18 h vid 5°C (390 ml): PE: 96 mg/ml Totalt 36 g PC: 96 mg/ml 36 g SM: 10 mg/ml 4 g Heptan/acetonfas, efter 18 h vid 5°C (ca 55 1iter): PE: 0,7 mg/ml Totalt 38 g PC: 0,7 mg/ml 38 g SM: - - Sfingomyelinfällningen tvättades med 2 liter ace- tonzheptan (volymförhállande 1,4:1) vid 25°C under om- röring i 3 h. Blandningen tempererades sedan i 1 h vid 20°C, varefter fällningen centrifugerades ifrån och tor- kades. Vi denna tvätt löstes övriga fosfolipider ut från sfingomyelinfällningen. Fällningens sammansättning efter tvätt (kromatogram, fig 6): 70% sfingomyelin, andra fosfo- lipider mindre än 1%, övriga lipider 25% (kolesterol, ceramidhexosider, kardiolipin).

För att erhålla en ännu renare sfingomyelinprodukt utnyttjades kromatografiteknik. Kolonn: Buchi 100 x 460 mm (3750 ml). Fyllmassaz Bondesil Si 40 um. 501 10 15 20 25 30 35 697 14 Lipiderna eluerades med två olika lösningsmedels- blandningar. 150 g fällning löstes i 1,5 liter heptanzisopropanol (volymförhållande 2:1) under uppvärmning till 40°C. Lös- ningen pumpades på kolonnen och elueringen startades.

Eluering: Lösningsmedel Volym heptan:isopropanolzvatten Lösning 1 61 36 3 16 liter Lösning 2 31 58 ll 18 liter Sfingomyelin eluerades med lösning 2. Fraktionen in- dunstades och torkades. 110 g produkt erhölls, med en sfingomyelinhalt av 95% (kromatogram, fig 7).

Exempel 2 Undersökning av hur variation av försöksbetingelser påverkar utfällning av sfingomyelin ur ett heptanextrakt.

Variabler: Volymförhållande aceton/heptan: l,5:l och l,25:l 15°C Och 20°C Som utgångslösning användes ett heptanextrakt inne- hållande 29 mg/ml fosfatidyletanolamin (PE), 32 mg/ml fosfatidylkolin (PC), 21 mg/ml sfingomyelin (SM). Av detta Temperatur: extrakt togs 20, 15, 10, 5 resp 2,5 ml. Samtliga prover späddes till 20 ml med n-heptan. 25 resp 30 ml aceton sat- tes till proverna och de förvarades i 18 h vid 20 resp l5°C. Fällningen avskiljdes genom centrifugering och mäng- den "brun fas" uppmättes. "Den bruna fasen" blev större ju mer koncentrerad den använda heptanfasen var. Fördelningen av fosfolipider mellan fällning, "brun fas" och ovanlös- ning framgår av diagrammen i fig 8-10.

Resultaten visar att de studerade variablerna har stor betydelse framförallt för fördelningen av sfingomye- lin mellan de tre faserna.

Exempel 3 En jämförelse mellan olika lösningsmedel för utfäll- ning av sfingomyelin genomfördes. 10 15 20 25 30 35 501 697 15 Andra lösningsmedel än aceton kan användas för ut- fällning av sfingomyelin. Jämförande försök har gjorts med etylacetat och 2-pentanon. Som utgàngsmaterial användes ett heptanextrakt med följande fosfolipidsammansättning: PE 22 mg/ml, PC 28 mg/ml och SM 16 mg/ml. 30 ml av respek- tive utfällningslösningsmedel sattes till 20 ml heptanext- rakt (volymförhàllande l,5:1). Samtliga prover utfälldes under 3 h men vid olika temperaturer: aceton vid 20°C, etylacetat vid 8°C och 2-pentanon vid 5°C. Fällningarna avskiljdes genom centrifugering.

Fördelning av fosfolipider mellan olika faser: % SM % PE/PC fäll- "brun lös- fäll- "brun lös- ning fas" ning ning fas" ning Aceton 89 9 1 25/23 53/48 22/28 Etylacetat 54 46 0/3 100/97 2-pentanon 62 38 0/7 ,l00/93 Resultaten visar att etylacetat och 2-pentanon var betydligt mindre effektiva än aceton för utfällning av sfingomyelin. "Brun fas" erhölls bara med aceton. Aceton- fällningen innehöll mer fosfatidyletanolamin och fosfati- dylkolin än de andra fällningarna. I ett tvättsteg, såsom beskrivs i exempel 1, kan dessa effektivt tvättas bort.

Exempel 4 1000 liter separerad och pastöriserad vassle med en fetthalt av 0,050% filtrerades genom 0,1 pm keramiskt mikrofilter (Ceraver) i "cross-flow" enligt förfarandet för avfettning av vassle, enligt Alfa Lavals teknik"BACTO CATCH". 40 liter retentat erhölls. Vasslens fetthalt efter mikrofiltreringen var < 0,01%. Retentatet hade följande sammansättning: Protein 9,0% Fett 2,l% varav 0,7% fosfolipid Aska ca l,0% Laktos ca 5,0% Torrsubstans ca l7,l% 501 10 15 20 25 30 35 697 16 Retentatet indunstades i vakuumindunstare till en slutvolym av 13,7 liter, motsvarande en TS-halt av ca 50%. 7,0 liter n-heptan och 7,0 liter 95% etylalkohol tillsattes, varefter blandningen omrördes. Till den av- skiljda heptanfasen sattes 10,0 liter aceton. Efter om- röring fick blandningen stå i 3 h vid rumstemperatur. Vid dessa betingelser erhölls en selektiv utfällning av sfingomyelin.

Fällningen avskiljdes genom centrifugering och tvät- tades med 500 ml aceton/heptan i förhållandet l,4:l vid 25°C. Efter temperering till 20°C avskiljdes fällningen på nytt. Den torkade fällningen vägde 71 g och innehöll 70% sfingomyelin och mindre än 1% övriga fosfolipider.

Exempel 5 (Jämförande exempel) Som jämförelse genomfördes en separation av fosfoli- pider med användning av ren kolonnteknik.

Kolonn: Buchi 100 x 460 mm (3750 ml). Packmaterial: Bondesil 40 um.

Lipiderna eluerades med tre olika lösningar. 500 g fettkoncentrat blandades med 1 liter n-heptan och 1 liter 75% etanol. Efter fasseparation erhölls 1,2 liter heptan- fas som applicerades på kolonnen.

Heptanfasens fosfolipidsammansättning: Fosfatidyletanolamin (PE): 12 mg/ml Totalt: 14 g Fosfatidylkolin (PC): 12 mg/ml Totalt: 14 g Sfingomyelin (SM): 7 mg/ml Totalt: 8 g Eluering: Lösningsmedel Förbrukning n-heptan : 2-propanol : vatten totalt Lösning 1 65 35 0 12,5 liter Lösning 2 61 36 3 23 liter Lösning 3 31 58 ll 22 liter Lipiderna eluerades och uppsamlades i fraktioner.

Neutrallipidfraktionen (ll liter) eluerades med lösning 1, fosfatidyletanolaminfraktionen (12 liter) med lösning 2, fosfatidylkolin/sfingomyelinfraktionen (15 liter) med lösning 3. Totalt åtgick 29 liter n-heptan, 26 liter iso- 10 15 20 25 30 35 501 697 17 propanol och 3 liter vatten. Fraktionerna indunstades i rotationsindunstare.

Utbyte: Fraktion 1 130 g neutrallipider Fraktion 2 12 g fosfatidyletanolamin Fraktion 3A 13 g fosfatidylkolin och 5 g sfingomyelin Fraktion 3B 0,4 g fosfatidylkolin och 2,9 g sfingomyelin.

Med 40 um kolonnmassa erhölls ingen separation mellan fosfatidylkolin och sfingomyelin. För att erhålla ren sfingomyelin erfordrades ytterligare ett kromatografisteg: Kolonn: Buchi 15 x 460 mm. Kolonnmassaz Apex Prepsil Si 20 pm (Sorbent). Fraktion 3 löstes i 0,6 liter heptanziso- propanol (2:l) under uppvärmning till 40°C. Lösningen pum- pades på kolonnen och fosfolipiderna eluerades sedan med lösning 3 enligt ovan. 3 liter av lösning 3 åtgick för elueringen.

Exempel 6 Jämförelse mellan separationsförfarandet enligt förelig- gande uppfinning (A) och enbart kromatografiteknik (B).

Som utgàngsmaterial användes ett fettextrakt i hep- tanfas (framtaget enligt exempel 1). Jämförelsen gjordes för 10 liter heptanfas innehållande 150 g fosfatidyleta- nolamin (PE), 150 g fosfatidylkolin (PC) och 100 g sfingo- myelin (SM).

Lösningsmedelsåtgång (liter): Teknik B Steg 1 Steg 2 Lösningsmedel Teknik A Steg 1 Steg 2 Aceton 15 Heptan 13 320 11 Isopropanol 14 290 21 Vatten 3 34 4 Teknik A motsvarar exempel 1 och teknik B motsvarar exempel 5.

Såsom tabellen visar är det stor skillnad i lösnings- medelsåtgång mellan de två separationsförfarandena. Den stora fördelen med separationsförfarande enligt uppfin- 501 10 15 20 25 30 35 697 18 ningen är den lilla àtgången av lösningsmedel. En annan fördel med separationsförfarandet enligt uppfinningen är att enklare processutrustning kan användas, varför investeringskostnaderna blir lägre.

Det är svårt att på kromatografisk väg separera PC och SM. Såsom framgår av kromatogrammet i fig 3, eluerar de mycket nära varann. I teknik B ovan har två kolonnsteg använts. Den första separationen, steg l, gjordes på 40 pm kiseldioxidmassa, varvid erhölls en fraktion med PC och SM i blandning. Denna fraktion sattes sedan på en kolonn med 20 pm kiseldioxidmassa, steg 2, för separation av de två fosfolipiderna.

I teknik A innebär steg l utfällning av sfingomyelin med aceton. Steg 2 innebär kolonnseparation med 40 pm kiseldioxidmassa. Eftersom de föreningar som ska separeras med detta kolonnsteg eluerar långt från varann (kromato- gram, fig 6), kan en grövre och därmed billigare kiseldi- oxidmassa användas. Om bara ett steg utnyttjas erhålles en betydligt renare sfingomyelinprodukt med teknik A (utfäll- ning enligt uppfinningen) än om teknik B används (kromato- grafi).

Claims (10)

lO 15 20 25 30 35 SÛ1 697 19 PATENTKRAV

1. Förfarande för utvinning av sfingomyelin ur ett fosfolipidinnehàllande fettkoncentrat, k ä n n e - t e c k n a t av att A. fettkoncentratet löses i en lösningsmedelsblandning av ett huvudsakligen polärt organiskt lösningsmedel och ett huvudsakligen opolärt organiskt lösningsmedel, B. en fas bestående huvudsakligen av det huvudsakligen opolära organiska lösningsmedlet med däri lösta fosfo- lipider avskiljes, varvid sfingomyelin föreligger i en koncentration av 2-20 mg/ml av det huvudsakligen opolä- ra organiska lösningsmedlet, C. till den i B avskiljda fasen sättes ett organiskt lös- ningsmedel med intermediär polaritet i ett volymför- hållande till det huvudsakligen opolära lösningsmedlet av inom omrâdet 1:1-2:1 och vid en temperatur av 13-25°C, varvid en fällning omfattande huvudsakligen sfingomyelin bildas, tillsammans med en viskös fas och en lösningsmedelsfas, varefter D. fällningen och den viskösa fasen avskiljes och separe- ras från varandra.

2. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att fällningen av huvudsakligen sfingomyelin tvättas med en lösningsmedelsblandning av ett organiskt lösnings- medel av intermediär polaritet och ett huvudsakligen opo- lärt organiskt lösningsmedel, varvid rester av andra fos- folipider än sfingomyelin löses och därefter avskiljes.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av att fällningen av huvudsakligen sfingomyelin renas ytterligare med hjälp av kromatografi.

4. Förfarande enligt ett eller flera av kraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t av att lösningsmedlet med inter- mediär polaritet väljes bland aceton, 2-butanon, 2-penta- non, 3-pentanon, metylacetat, etylacetat. 501 10 15 20 25 30 35 697 20

5. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att lösningsmedlet av intermediär polaritet är aceton.

6. Förfarande enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att det huvudsakligen polära organiska lösningsmedlet är en alkohol, företrädes- vis etanol, metanol, propanol, butanol. _

7. Förfarande enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att det huvudsakligen opolära organiska lösningsmedlet väljes bland n-heptan, n-hexan, cyklohexan, isooktan, toluen, kloroform.

8. Förfarande enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att temperaturen på lösningsmedelsfasen som avskiljes i steg D sänks till 0-5°C för utfällning av kvarvarande fosfolipider.

9. Förfarande enligt ett eller flera av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att fettkoncentratet härstammar från mjölkprodukter, blodprodukter eller äggprodukter.

10. Förfarande enligt krav 9, k ä n n e t e c k - n a t av att fettkoncentratet utgöres av kärnmjölk eller vassle.