JPS61145189A - ホスフアチジルコリンの単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、卵粉抽出液をシリカゲル上のクロマドグラフ
ィを行なうことによって、リゾリン脂質（’１ｙｓｏｐ
ｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）を含まない純粋な１，２−ジ
アシル−グリセロ−３−ホスフォコリン（ホスファチジ
ルコリン）を単離する新規の方法に関する。

リン脂質は、とりわけ食品工業、動物用栄養物、化粧品
、製薬業において使用されている。

製薬業において純粋なホスファチジルコリンは、活性薬
剤として、また非経口投与用の脂肪乳懸液の調製および
リポゾームの生成のために用いられる乳化剤のような助
剤として使用されている。特に１非経口投与用として、
溶血的に作用する（ｈｅａｍｏｌｙｔｉｃａ：ｕｙ　ａ
ｃｔｉｎｇ）リゾリン脂質を含まない卵ホスファチジル
コリンは広く使用されている。

卵リン脂質の調製および回収のための出発材料として、
概ね下記の成分を有する生の卵黄が使用されている。

水　　　　　　５０チ 非脂質　　５１係 蛋白質　　１６俤 灰　　分　　　　　３俤 卵脂質部分は、中性脂質（トリグリセリド、コレステリ
ン等）およびりん脂質よりなる。卵脂質部分の単離は、
例えばジメチルエーテルを用いる卵黄の直接抽出法（西
独国特許第２．８３！１，３７１号明細書に開示）によ
り、または乾燥卵黄（卵黄の粉末）の抽出法によって実
施されている。

乾燥卵黄は、リン脂質の回収に好適に用いられる。それ
は下記のような成分を有する〇蛋白質　　　　　　　　
　　　３２ｑｂトリグリセリド／コレステリフ　　　　
　５０９Ｇリン脂質　　　　　　　　　　　１８９６リ
ン脂質は、好適には、石油エーテル、ニーチル、クロロ
ホルム、メタノールまたはエタノールによる抽出法およ
びアセトンによる沈殿法によって回収される。これらの
方法は、米国特許第２，０１４８０４号、西独国特許第
２６０，８８６号、同第２６１，２１２号、同第２７２
，０５７号、同第４８７，３３５号、特開昭５４−６１
２００号明細書に開示されている。リン脂質部分は、ケ
ー・オルシンガー（Ｋ、　Ｏｒｓｉｎｇｅｒ）によるｒ
８ｅｉｆｅｎ−０１ｅ−Ｆｅｔｔｅ−ＷａｃｈｓｅＪ１
０９．４９５〜４９９（１９８５）によると、ホスファ
チジルコリン（ＰＣ’）　　　　　　　　　　７３％リ
グホスファチジルコリン（ＬＰＧ）　　　　５〜６チホ
スフアチジルエタノールアミン（ｐｗ）　　　１５％リ
ソースファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）　　　２
〜３％ホスファチジルイノシトール（Ｐ工）　　　　　
１％スフィンゴミエリン（ＥＩＨＡ）　　　　　　　２
〜５％プラスマローゲン（ＰＬＡ　）　　　　　　　　
　　１チの成分よりなる。

このリン脂質混合物は、ビー・エイチ・リスト（Ｐ、Ｈ
，ＬＩＢｔ）らによるｒＰｈａｒｍａｚｅｕｔｉａｃｈ
ｅ　Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ−ｓｔｅｃｈｎｉｋ　ｈｅｕｔ
ｅＪ　１　（７）　１〜８　（１９８０）に記載されて
いるように「純粋な卵レシチン」とも称されている。ま
たこの卵レシチンな食品工業および製薬業において使用
されている。

このリン脂質混合物を単一のリン脂質に分離する方法は
極めて複雑であるので大規模には実施されていないが、
リゾリン脂質を含有しない純粋なホスファチジルコリン
は、特に製薬業における使用が望まれている。純粋なホ
スファチジルコリン回収のための複雑な実験室方法が数
多く知られている。例えばエム、マーシュ（Ｍ。

Ｍａｒｓｈ）等によるｒｃｌｌｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃ
ａ　ＡｃｔａＪ４３．８７〜９０（１９７５）によれば
、複雑な二重カラムクロマトグラフィによってリグホス
ファチジルコリンを含まないホスファチジルコリンが４
られるが、この方法は勾配溶出を行うものであり製菓業
においては毒物学的に問題となり得るクロロホルム／メ
タノールのような溶剤混合物が使用される。さらに溶剤
・（共沸混合物）の回収が不可能である。

エヌーｚス、ラデイン（Ｎ、８．Ｒａｄｉｎ）は、［、
ｒ、ＬｉｐｉｄＲｅｅ、Ｊｉｊ、９２２〜９２４に記載
したように卵レシチンを出発材料とした。卵レシチンを
エタノール中に溶解させ、アルミニウムクロマトグラフ
ィ用カラムに注入し、エタノールとともに溶離してホス
７アチジルエタノールアミンを分離した。ホスファチジ
ルコリン、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエ
リンおよび中性脂質を含む蒸発後の流出液をヘキサン、
インプロパノールおよび水よりなる溶質混合物中に溶解
させ、　８１０２−カラムに注入し同じ溶剤混合物によ
って溶離する方法であるが収率は４０乃至４３優である
。リゾホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリン
の不純物を少量含有するホスファチジルコリンが得られ
るが、本方法は、複雑な４段階よりなる操作を行ない各
々４つの異なる溶剤および溶剤混合物を使用することに
よってのみ実施可能である。さらに、この方法によると
ホスファチジルコリンの効率は卵粉に対してわずか４４
チである。

本発明の目的扛、リン１ホスフアチジルコリンを含まな
い高純度のホスファチジルコリンを卵粉から直接単離す
るための簡単な方法を提供することにある。

驚くべきことであるが石油エーテル、プロパノール−２
および水よりなる溶剤混合物によりて卵粉を抽出した後
に、同じ溶剤混合物を使用　　　　゛・してその抽出物
をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィを行なうこと
によって、リゾホスファチジルコリンを含まない高純度
のホスファチジルコリンが得られることが発見されたの
である。

本発明の方法の特徴は、低沸点の石油エーテル留分（４
０℃乃至８０℃ン、自−ｃ４の低級アルカノールおよび
水よりなる溶剤混合物、好適には１容積部の石油エーテ
ル（６５℃乃至７３℃）、１容積部の２−プロパノール
および０．１７５容積部の水よりなる混合物で、卵粉を
抽出する点にある。即ち、卵粉を上記溶剤混合物で処理
（例えば攪拌）シ、溶解されなかった物質を溶液相より
分離し、その溶液相を２０℃乃至５０℃の範囲内の温度
においてシリカゲルを充填したカラムに注入し、同じ溶
剤混合物によって同じ温度において溶離を行ない、主流
出液を採集し、それよりリグホスファチジルコリンを含
まないホスファチジルコリン７を常法によって単離する
方法である。初期流出液においては、トリグリセリド、
コレステリンおよびホスファチジルエタノールアミンが
、主流出液においてはホスファチジルコリンが、さらに
、終期流出液においてはりグホスファチジルコリンおよ
びスフィンゴミエリンが採集された。ホスファチジルエ
タノールアミンは、周知の方法によれば前流出液より純
粋な形態で単離することができる。

出発材料として、予め精製した卵リン脂質、例えば脱油
した卵リン脂質を用いることもできる。

クロマトグラフィには、様々な粒子寸法を有するシリカ
ゲル晋及品若しくは活性化または非活性化され得る圧縮
型のシリカゲルを用いることもできる。中性のシリカゲ
ル製品を用いることが望ましい。

本発明の方法は常圧または大気圧より高い圧カニにおい
て、その圧力に対して許容できる温度、好適には２０℃
乃至２５′ｃにおいて実施される。

本発明による方法の第１の利点は、クロマトグラフィを
行なった後に常にシリカゲルを再利用できる点にある。

全ての不純物が初期流出液および、終期流出液内に含ま
れている。終期流出液の採集は省略することもできる。

それは、カラムが再充填された場合は、その中に含まれ
る不純物がその後に続く初期流出液とともに溶離される
からである。

第２の利点は、カラムクロマトグラフィによる抽出およ
び分離に用いられるのは、１種類の容易に蒸留されうる
溶剤混合物である点にある。

周知の方法と比較して、本発明による新規な方法の特徴
に、実質的に操作が容易である点にある。

ホスファチジルコリンは、非役に対して９２チの効率で
回収される。カラムクロマトグラフィによる分離におい
ては、卵脂質９ｔｌｆをシリカゲル２００を上で分離す
る際に必要な溶出ｉはわずか４．２ｔである。即ち本発
明による方法は。

カラムクロマトグラフィでの一般的な精製よりもむしろ
濾過の性質を有するものである。

本発明を以下の実施例によって詳しく説明するが、これ
に限定されるものではない。

分析 リン脂質を薄膜クロマトグラフィによって分析した。油
含有ｊｋハ透析可能な物質に管しいとした。

カラムクロマトグラフィ、溶剤混合物 内径４．５３および高さ５７ｃｍのクロマトグラフィカ
ラムを使用した。熱交換器をカラムの前に設けた。カラ
ムに、石油エーテル（６５℃乃至７３℃）／プロパノー
ルー２／水（容積比１：１：Ｇ、１７５）よりなる溶剤
混合物中シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ社製）２０Ｃ１のスラ
リーを充填した。同じ溶剤混合物を非役の抽出および溶
離に用（・た。なおりロマトグラフイの終了後にシリカ
ゲルを再利用することができる。

出発材料 下記の成分よりなる非役を用いた。

ホスファチジルコリン　　　　　　　　　１１％スフィ
ンゴミニリフ　　　　　　　　　　　　４％ホスファチ
ジルエタノールアミン　　　　　３％リグホスファチジ
ルコリン　　　　　１．５係他のリン脂質　　　　　　
　　　ｎ、ｓｓ中性脂質／コレステリン　　　　　　４
８％蛋白質　　　　　　　　　　　　３２％実施例　１ 第１段階 非役１５０ｆを１０分間の間４０℃において溶剤混合物
３００−とともに攪拌した。蛋白質を吸引し、少量の溶
質混合物で洗浄した。卵黄９０ｔを含む戸液６００−が
得られた。

第２段階 ｐ液をシリカゲル（２ｏｏｙ）を充填したクロマトグラ
フィのカラムへ注入し、室温において同一の溶剤混合物
によって溶離した。全溶出液（５ｔ）を５つのフラクシ
ョンに分けた。フラクションを蒸発させ、残留物を分析
した。

第１フジクションＯ乃至１．６を残留物：６９？（コレ
ステリンを含有する）中性脂質、ｐｇ、ＬＰＥｉ、　Ｐ
Ｉならびに痕跡量のＰＣおよび痕跡量の８ＰＨを含有し
た。

第２フラクション１．６乃至４．２を残留物：１６．Ｉ
Ｐｐｃ含有量　　９４チ ８ＰＨ含有量　　く２チ ＬＰＧ含有量：　≦α３％ 油分含有量：　５０．５％ 残り：　　　脂質、水その他 ＰＣ効率：　　非役に対して理論値の９２１第３７ラク
シヨン４．２乃至５．Ｏｔ残留物：４ｆ３ＰＨ％　ＬＰ
Ｃおよび痕跡量のＰＣを含有していた。

第２７ラクシヨンを採集した後に、卵脂質を再充填した
。それによって第３フラクシヨン中の生成物を第１７ヲ
クシヨン中の生成物とともに溶離することかできる。

実施例　２（比較例２ 第１段階 特開昭５４−６１２００号明細書に記載の方法によって
実施した。

非役１５５２を室温において９５％エタノール１３５０
−とともに攪拌した。不溶性成分を一過し９５チエタノ
ールで洗浄した後に採集したエタノールｐ液を蒸発させ
、分析した。

固体収量二部脂質５６１ ホスファチジルコリン含有量：　４２チスフインゴミエ
リン含有ｉＬ：　　　３％リゾホスファチジルコリン含
有量：２壬ホスフアチジルエタノールアミン含有ｉ：ａ
ｓ残りコ　トリグリセリド、コレステリン等第２段階 ＤＩｌｉ−Ｏ８へ０４４０４８号明細書に記載の方法に
従って実施した。

６５℃の温度においてエタノールを溶離剤としてカラム
クロマトグラフィ（シリカゲル１００？）を行なった。

カラム充填物：９５％エタノール５０〇−中卵脂質３６
　Ｆ　　　　　　　　　　　　”・溶離剤：１）第１溶
離剤として９５チェタノール１．７ｔ２）第２溶離剤と
してａＯＳエタノール１．２ｔ１．７ｔの第１流出液を
採集した後に、第２の流出液１．２Ｌを採集した。第２
の流出液を蒸発させ分析した。結果は以下のとおりであ
った。

固体収量：１α４２ ホスファチジルコリン含有量二　８５％スフィンゴミエ
リン含有量：　　　６チリグホスフアチジルコリン含有
ｉ：ｓｓ油含有量：０．５チ 残り：水、エタノール等 ホスファチジルコリン効率二非役に対する理論値の５４
％第３段階 再使用する前に、９５チエタノールを用いてカラムを再
び平衡に達せさせなければならない。

実施例　６（比較例） エヌ・ニス・ラブイン（Ｎ、８．Ｒａｄｉｎ）による「
Ｊ　、　ＬｉｐｉｄＲｅｓＪ１９’９２２〜９２４（１
９７８）に記載の方法に従って実施した。

第１段階 非役１５０１を室温において９５チエタノール１、３５
１により佃出し、抽出物を濾過し蒸発させた。下記の成
分を有する生の卵レシチン３６ｆが得られた。

ホスファチジルコリン　　　　　４２係ホスフアチジル
エタノールアミン　　　　８％リゾホスファチジル：ｆ
　ＩＪ　７　　　　　　２１スフインゴミエリン　　　
　　　　３係残りニトリグリセリド、コレステリン等第
２段階 卵し′シチン１０ｔを無水エタノール中に溶解し、　　
Ａｔ２ｏ３１ｏｏｒ上のカラムクロマトグラフィを行な
った。溶離剤として無水エタノールを使用した。流出液
を蒸発させて、下記の成分を有するリン脂質混合物（５
ｆ）が得られた。

ホスファチジルコリン　　　　　　５１％リゾホスファ
チジルコリン　　３％ スフイ／ゴミエリン　　　　　５９ｇ 残り：中性脂質、コレステリフ等 第３段階 第２段階で得られたリン脂質混合物２．５ｆをヘキサン
／イソプロパノール／水（体積比１：１．３：０．２）
の混合物２．５コ中に溶解し、シリカゲル１００ｔを充
填したカラム中に注入した。同一の溶剤混合物をさらに
１００ｍ注入した後に、ヘキサン／イソプロパノール／
水１積比１：１．３：α２５）の混合物１．４ｔで溶離
した。初期流出液（トリグリセリド／コレステリン）が
流出した後主流出液を採集し蒸発させた。結果は下記の
とおりであった。

収　量：１．１ｆ 成分 ホスファチジルコリン含有量　９１％ スフィンゴミエリン含有量　２％ リゾホス７アチジルコリ７　１％ 水、残留溶剤、トリグリセリド　６俤 ＰＣ効率：非役に対して　４４係 第４段階 再使用する前に、ヘキサン／イソプロパノール／水（体
積比１：ｔ３：α２）の溶剤混合物とともにカラムを再
び平衡に達せさせた。以上の実施例を要約すると下記の
ようになる。

出発材料：　卵　粉 でに必要な操作段階数 非役に対するＰＣ効率　　９２９１　　５４％　　４４
チ溶剤および混合物のそ　　　１　　　２　　　４れぞ
れの数 ｐ（’含有量　　　　　９４％　　８５％　　９１％実
施例を比較すると明らかであるように、本発明によれば
、溶剤混合物を１種類だけ使用しかつ２段階よりなる簡
単な方法によって、高純度のホスファチジルコリンが高
収率で得られる。

ベシュレンクテル・ハフラング 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）卵粉を、低沸点（４０℃乃至８０℃）の石油エーテ
   ル留分とＣ＿１〜Ｃ＿４の低級アルカノールと水とから
   なる溶剤混合物で処理し、不溶性物質を溶液相より分離
   し、溶液相を、２０℃乃至５０℃の範囲内の温度におい
   てシリカゲルを充填したカラムに注入し、溶離をその温
   度において同じ溶剤によつて行ない、主な流出液を採集
   し、そして溶解しているホスファチジルコリンをそれよ
   り常法により単離することを特徴とするリゾリン脂質を
   含有しないホスファチジルコリンを卵粉から単離する方
   法。 ２）軽質ペトロール（６５乃至７３℃）とプロパノール
   と水とよりなる溶剤混合物を使用することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５）１容積部の軽質ペトロール（６５℃乃至７３℃）と
   １容積部のプロパノール−２と０．１７５容積部の水と
   からなる溶剤混合物を使用することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 ４）出発材料である卵粉の処理を１０分間乃至２０分間
   の間２０℃乃至５０℃において行なうことを特徴とする
   特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の方
   法。 ５）カラムクロマトグラフィを２０℃乃至２５℃におい
   て行なうことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第
   ４項のいずれかに記載の方法。