CN104262387B - 一种硅胶柱色谱分离纯化溶血磷脂酰乙醇胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用硅胶色谱柱分离纯化溶血磷脂酰乙醇胺的方法，属于分离纯化领域。本发明是以含溶血磷脂酰乙醇胺纯度为30％以上的溶血磷脂混合物为原料，以硅胶为固定相，氯仿与甲醇体积比1:2-3:1的溶液作为洗脱剂，收集洗脱有溶血磷脂酰乙醇胺的级分，去除溶剂，干燥得到高纯度溶血磷脂酰乙醇胺产品。本发明提供的硅胶柱层析法分离纯化LPE的方法，工艺简单，得到的溶血磷脂酰乙醇胺产品纯度为98％以上，能够为未来商业生产高纯度LPE提供技术支持。

Description

一种硅胶柱色谱分离纯化溶血磷脂酰乙醇胺的方法

技术领域

本发明涉及一种硅胶柱色谱分离纯化溶血磷脂酰乙醇胺的方法，属于分离纯化技术领域。

背景技术

溶血磷脂酰乙醇胺(Lysophosphatidylethanolamine，LPE)是磷脂酰乙醇胺(PE)在磷脂酶A1的作用下水解失去一分子脂肪酸而生成的产物，其天然存在于动物细胞或植物细胞中。与PE相比，LPE保留了PE的两性分子结构，减少了疏水基团和易氧化的不饱和双键结构，从而大大提高了LPE的亲水性和乳化稳定性，使其在高温、低pH、高离子浓度环境下都具有优良的乳化性和稳定性。LPE在食品、化妆品、医药行业等方面都有很大的应用前景，但是由于天然的LPE含量比较少，尚无高纯LPE，所以建立制备高纯度的LPE纯化技术具有重要的医药、社会及经济价值。

目前国内外学者研究LPE分离纯化的方法主要有：溶剂处理法、薄层色谱法、超临界流体萃取法等。溶剂处理法是用特定有机溶剂和水的混合物处理含LPE的溶血磷脂混合物，在-5℃～6℃的低温范围下使混合物结晶，经离心去除杂质后过滤上清液，干燥可得到高纯度的LPE。这种方法繁琐，过程中两个重要的工艺参数，溶剂分级分离的反应温度和反应pH不易控制，重复多组试验才能得到比较理想的分离效果。薄层色谱法，简称TLC，是一种方便、快捷、直观经典的分离检测方法，安永祥等采用氯仿-无水甲醇-三乙胺-水(10:10:5:3)为展开剂，用溴百里酚蓝染液为显色剂，通过将样品与各标准品在薄层板上的迁移值对照比较，可以很好的分离出LPE，但是这种方法对LPE的工业化制备有一定局限性，同时试验干扰因素多，展开剂存在安全性问题。超临界流体萃取对设备要求比较高，生产成本大，而且所提磷脂仍需进一步分离，纯度不高，一般用于粗提。而由于溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine，LPC)和LPE迁移率比较相近，硅胶柱色谱纯化方法也很难分离出LPE。目前，也没有关于硅胶柱色谱纯化制备高纯LPE及工艺参数优化的报道。

发明内容

为克服目前LPE分离纯化中存在的纯度不高、设备要求严格、成本大、环境污染等一系列的问题，本发明提供的硅胶柱层析法分离纯化LPE的方法，工艺简单，所用原料中几乎不含LPC，避免了LPC和LPE难分离的问题，且吸附与解析过程的重复性好，产品纯度高，能够为未来商业生产高纯度LPE提供技术支持。

本发明提供的硅胶柱色谱柱分离纯化溶血磷脂酰乙醇胺的方法，是以含溶血磷脂酰乙醇胺(纯度为30-99％)的溶血磷脂混合物为原料，以硅胶为固定相，氯仿与甲醇体积比为1:2～3:1的混合溶液为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱有溶血磷脂酰乙醇胺的级分，去除溶剂，干燥得到溶血磷脂酰乙醇胺产品。

所述方法主要包括以下步骤：

(1)称取含溶血磷脂酰乙醇胺(纯度为30-99％)的溶血磷脂混合物为原料，即上样样品；

(2)取与上样样品重量比10:1-50:1的硅胶，加入氯仿：甲醇＝1:2～3:1(v/v)的混合溶剂中，搅拌成浆状，使用常规方法装柱；

(3)将步骤1中的样品加入步骤2的硅胶柱中；

(4)待样品上液面离开柱层液面前，用氯仿:甲醇＝1:2～3:1(v/v)的洗脱液进行洗脱，同时控制流速1-3.5mL/min；

(5)收集洗脱有溶血磷脂酰乙醇胺的级分，去除溶剂，干燥，得到溶血磷脂酰乙醇胺产品。

所述步骤1中的上样样品，溶于氯仿：甲醇＝1:2～3:1(v/v)的溶液中，配制成浓度为10-50mg/mL的溶液。

所述步骤1中的溶血磷脂混合物原料，是以大豆粉末磷脂中的醇不溶物作为粗磷脂酰乙醇胺(PE)原料，使用硅胶色谱分离粗PE原料得到纯度在70％以上的磷脂酰乙醇胺混合物，再将该磷脂酰乙醇胺混合物用磷脂酶A1酶解，即得到纯度在30％以上的溶血磷脂混合物原料。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤2中的硅胶的规格为100-200目。

在本发明的另一种实施方式中，所述步骤2中的硅胶，使用前经预处理，预处理方法为：取适量硅胶置于120℃烘箱中活化40-60min。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤2中的装柱所用的硅胶柱长径比为18:1的硅胶柱。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤2中上样样品量与硅胶的质量比为1:40-1:30。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤4中洗脱液氯仿和甲醇的体积比为1:1-2:1。

在本发明的一种实施方式中，所述含溶血磷脂酰乙醇胺的溶血磷脂混合物原料中溶血磷脂酰乙醇胺的纯度为30-60％。

本发明提供的硅胶柱层析法分离纯化LPE的方法，工艺简单，得到的溶血磷脂酰乙醇胺产品纯度为98％以上，能够为未来商业生产高纯度LPE提供技术支持。

附图说明

图1是溶血磷脂酰乙醇胺的分子式；

图2是原料样品的HPLC-ELSD图；

图3是所得LPE的HPLC-ELSD图；

图4是不同固定相种类对LPE洗脱效果的影响；

图5是不同洗脱液比例对LPE产品纯度的影响，其中(a)为氯仿:甲醇＝3:1，(b)为氯仿:甲醇＝2:1，(c)氯仿:甲醇＝1:1，(d)氯仿:甲醇＝1:2。

具体实施方式

溶血磷脂酰乙醇胺的浓度检测方法：取待测样品溶于2mL氯仿:甲醇(2:1，v:v)中，经涡旋振荡器混匀，在10000r/min下离心5min，然后取上清液存放在-20℃下的冰箱中，待HPLC-ELSD分析检测。具体色谱条件为：硅胶柱，ZORBAXRX-SIL(4.6×250mm，5μm)，柱温35℃，漂移管温度30℃；进样量20μL；检测方法：采用二元梯度洗脱，流动相A(甲醇:水＝8:1，v:v)，流动相B(甲醇)，流速1.0mL/min；A相的梯度，开始10min，以40％梯度增加到60％，保持5min，之后3min，以60％梯度降低到40％。

实施例1

用适量无水乙醇于20℃下浸提食品级大豆粉末磷脂(磷脂含量为96％，主要成分有30％磷脂酰胆碱(PC)、25％磷脂酰乙醇胺(PE)、25％磷脂酰肌醇(PI)、0.5％溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)，购自天津市博帅工贸有限公司)数次至浸提液为浅黄色，弃去上清液，将浸提后醇不溶物经真空浓缩后得粗PE备用。然后以硅胶为吸附介质，粗PE为原料采用氯仿:甲醇(2:l，v:v)进行等度洗脱，收集含PE的淋洗液，经真空浓缩干燥后得到高纯PE(磷脂酰乙醇胺纯度为70％以上的混合物)。准确称取0.5g的高纯PE于50mL圆底烧瓶中，加入一定量的去离子水，在一定温度的水浴中加热20min，通过机械搅拌(450r/min)混匀，然后快速加入一定量的无水CaCl₂和磷脂酶A1进行酶解反应，即得到含溶血磷脂酰乙醇胺纯度为30％以上的溶血磷脂混合物。

实施例2

称取磷脂酰乙醇胺纯度为70％以上的混合物，加入与磷脂酰乙醇胺混合物质量比为4:1-14:1的去离子水，30℃-50℃加热10-20min，然后快速加入与磷脂酰乙醇胺混合物质量比为0.004：1-0.1：1的CaCl₂和酶活(U)与磷脂酰乙醇胺混合物质量(g)比与180-1200的磷脂酶A₁，30℃-50℃反应0.5-2h，浓缩去水，即得到含溶血磷脂酰乙醇胺纯度为30％以上的溶血磷脂混合物。

实施例3

称取0.5g磷脂酰乙醇胺纯度为70％的混合物，加入3mL的去离子水，50℃下加热10min，然后快速加入0.002gCaCl₂和0.01mL磷脂酶A₁(9500U/mL)，50℃水浴反应30min，然后70℃下真空浓缩去水，即制得含溶血磷脂酰乙醇胺纯度为40％的混合物原料。

实施例4

称取1.5g溶血磷脂酰乙醇胺纯度为40％的溶血磷脂混合物，溶于氯仿:甲醇体积比为3:1的溶液中，配成浓度为50mg/mL的样品，备用。取100-200目活化硅胶15g加入氯仿:甲醇＝3:1的洗脱液搅拌成浆状，采用一次性装柱(规格Ф15mm×45cm)，加入氯仿:甲醇＝2:1的洗脱剂洗脱2-3次后静置，使填料充分均匀沉降。将制备好的样品沿层析柱内壁缓慢均匀加入，待样品液面离柱层液面1-2cm时，用配置好的洗脱液(氯仿:甲醇＝2:1)洗脱，同时控制流速3.5mL/min，收集含有溶血磷脂酰乙醇胺的级分，去除溶剂，干燥后得到纯度为99.05％的溶血磷脂酰乙醇胺产品。

实施例5

称取1.5g溶血磷脂酰乙醇胺纯度为60％的溶血磷脂混合物，溶于乙醇质量分数为80％的乙醇溶液中，配成浓度为50mg/mL的样品，备用。取100-200目活化硅胶15g加入氯仿:甲醇＝3:1的洗脱液搅拌成浆状，采用一次性装柱，加入氯仿:甲醇＝2:1的洗脱剂洗脱2-3次后静置，使填料充分均匀沉降。将制备好的样品沿层析柱内壁缓慢均匀加入，待样品液面离柱层液面1-2cm时，用配置好的洗脱液(氯仿:甲醇＝2:1)洗脱，同时控制流速2mL/min，收集含有溶血磷脂酰乙醇胺的级分，去除溶剂，干燥后得到纯度为98.25％的溶血磷脂酰乙醇胺产品。

实施例6

准确称取0.3g溶血磷脂酰乙醇胺纯度为30％的溶血磷脂混合物，溶于氯仿:甲醇＝1:2中，配成浓度为10mg/mL的样品，备用。取200-300目的活化硅胶15g加入氯仿:甲醇＝1:2的洗脱液搅拌成浆状，采用一次性装柱，使填料充分均匀沉降。将制备好的样品沿层析柱内壁缓慢均匀加入，待样品液面离柱层液面1-2cm时，用配置好的洗脱液(氯仿:甲醇＝1:2)洗脱，同时控制流速1.0mL/min，收集洗脱液，去除溶剂，干燥后得到纯度为98.7％的溶血磷脂酰乙醇胺产品。

实施例7

选用硅胶或者氧化铝作为色谱柱填料。以溶血磷脂酰乙醇胺纯度为40％的溶血磷脂混合物为原料，在色谱柱填料15g、洗脱液为氯仿:甲醇＝2:1(v/v)、上样量为0.5g、上样浓度为30mg/mL、洗脱液流速2.5mL/min的条件下，所得洗脱效果如图4所示。从图4可看出，以硅胶为固定相远高于以氧化铝为固定相所得溶血磷脂酰乙醇胺的纯度，而且完全将溶血磷脂酰乙醇胺从硅胶柱上洗脱所需的体积要比从氧化铝柱用的少。氧化铝柱色谱存在洗脱时间长、所需洗脱液多、洗脱谱带分布宽，以及最终得率低、柱效低、拖尾现象严重等问题。而硅胶作为固定相能够很好地分离纯化溶血磷脂酰乙醇胺。

实施例8

以溶血磷脂酰乙醇胺纯度为40％的溶血磷脂混合物为原料，在色谱柱填料15g、上样量与硅胶重量比为1:40、上样浓度为30mg/mL、洗脱液流速2.5mL/min的条件下，分别选用氯仿:甲醇＝3:1、氯仿:甲醇＝2:1、氯仿:甲醇＝1:1、氯仿:甲醇＝1:2四种洗脱模式进行硅胶柱色谱纯化。不同洗脱液比例对LEP洗脱效果如图5所示。从图5可看出，当氯仿和甲醇比例为2:1洗脱样品时，溶血磷脂酰乙醇胺能够得到很好的分离，纯度达到98.463％，所消耗的洗脱体积也比较少。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种分离纯化溶血磷脂酰乙醇胺的方法 ，其特征在于，以含溶血磷脂酰乙醇胺纯度为30％以上的溶血磷脂混合物为原料，以硅胶为固定相，氯仿与甲醇体积比1:2-3:1的溶液作为洗脱剂，收集洗脱有溶血磷脂酰乙醇胺的级分，去除溶剂并干燥；

所述方法包括以下具体步骤：(1)称取含溶血磷脂酰乙醇胺纯度为30％以上的溶血磷脂混合物为上样样品；(2)取与上样样品重量比10:1-50:1的硅胶，加到氯仿与甲醇体积比为1:2-3:1的混合溶剂中，搅拌成浆状，装柱；(3)将步骤1中的上样样品加入步骤2的硅胶柱中；(4)用氯仿与甲醇体积比为1:2-3:1的洗脱液进行洗脱，同时控制流速1-3.5mL/min；(5)收集洗脱有溶血磷脂酰乙醇胺的级分，去除溶剂，干燥，得到溶血磷脂酰乙醇胺产品；

所述溶血磷脂混合物，是以大豆粉末磷脂中的醇不溶物作为粗磷脂酰乙醇胺原料，使用硅胶色谱分离粗磷脂酰乙醇胺原料得到纯度在70％以上的磷脂酰乙醇胺混合物，再将该磷脂酰乙醇胺混合物用磷脂酶A1酶解，即得到含溶血磷脂酰乙醇胺纯度在30％以上的溶血磷脂混合物。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的上样样品，溶于氯仿与甲醇体积比为1:2～3:1的溶液中，配制成浓度为10-50mg/mL的溶液。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱剂中氯仿与甲醇的体积比为1:1-2:1。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硅胶的规格为100-200目。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中上样样品与硅胶的质量比为1:30-1:40。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述装柱选用的硅胶柱的长径比为18:1。