DK166363B - Fremgangsmaade til isolering af lysophospholipidfrit phosphatidylcholin fra aeggepulver - Google Patents

Description

i

DK 166363B

Den foreliggende opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til isolering af højrent l,2-diacyl-glycero-3-phosphocholin (phosphatidylcho-lin), som er frit for lysophospholipider, ved ekstraktion af æggepulver og efterfølgende chromatografi af den fremkomne æggepulverekstraktopløs-5 ning på silicagel.

Phospholi pi der finder blandt andet anvendelse inden for levnedsmiddelindustrien, til dyreernæring, til kosmetik og inden for farmacien.

Inden for farmacien anvendes rent phosphatidylcholin som aktivt stof og som hjælpestof, for eksempel som emulgator ved fremstilling af fedtemul-10 sioner til parenteral applikation samt til fremstilling af liposomer.

Specielt til den parenterale anvendelse anvendes overvejende æggephos-phatidylcholin, som skal være frit for hæmolytisk virkende lysophospholipider.

Ved fremstilling eller udvinding af æggephospholipider går man ud 15 fra rå æggeblomme, der ca. har følgende sammensætning: 50 % vand 31 % æggelipider 16 % proteiner 20 3 % askebestanddele Æggel i pi dandel en består af neutral!ipider (triglycerider, cholesterol og lignende) og phospholipiderne. Isoleringen af æggelipidandelen sker ved direkte ekstraktion af æggeblommen for eksempel med dimethyl -25 ether (DE-PS 28 33 371) eller ved ekstraktion af den tørrede æggeblomme (æggeblommepulver).

Til udvinding af phospholipiderne anvendes fortrinsvis den tørrede æggeblomme der ca. har følgende sammensætning: 30 31 % proteiner 50 % triglycerider/cholesterol 18 % phosphol ipider

Phospholipiderne udvindes fortrinsvis ved ekstraktion med petro-35 leumsether, ether, chloroform, methanol eller ethanol og udfældning med acetone: USP 20 13 804, DE-PS 260 886, DE-PS 261 212, DE-PS 272 057, DE-PS 487 335, Jap Koka; 7961200. Phospholipidandelen består ifølge K. Or-singer, Seifen-Ole-Fette-Wachse 109, 495-499 (1983) af:

DK 166363 B

2 73 % phosphatidylcholin (PC) 5-6% lysophosphatidylcholin (LPC) 15 % phosphatidylethanolamin (PE) 5 2-3% lysophosphatidylethanolamin (LPE) 1 % phosphatidylinosit (PI) 2-3% sphingomyelin (SHA) 1 % plasmalogen (PLA) 10 Denne phospholipidblånding betegnes også rent æggelecithin, P.H.

List et al., Pharmazeutische Verfahrenstechnik heute 1 (7) 1-8 (1980).

Dette æggelecithin finder anvendelse inden for næringsmiddelindustrien og farmacien.

Adskillelsen af denne phospholipidblånding i de enkelte phospholi -15 pider er meget bekostelig og gennemføres derfor ikke i stor målestok, selv om specielt rent lysophospholipidfrit phosphatidylcholin ville være ønskværdigt navnlig til anvendelse inden for farmacien. Der kendes en række bekostelige laboratoriemetoder til udvinding af rent phosphatidylcholin. Således fås lysophosphatidylcholinfrit phosphatidylcholin ifølge 20 M. Marsh et al., Clinica Chimica Acta 43, 87-90 (1973) via en bekostelig dobbelt søjlechromatografi, ved hvilken der blandt andet gennemføres en gradienteluering, hvortil der benyttes opløsningsmiddelblandinger, som. er toxikologi sk betænkelige inden for farmacien såsom chloroform/metha-nol. Genvinding af opløsningsmidlerne er umulig (azeotrope blandinger).

25 N.S. Radin, J. Lipid Res. 13, 922-924 går ud fra æggelecithin. Æg-gelecithinet opløses i ethanol og sættes til en aluminiumchromatografi-søjle og elueres med ethanol, hvorved phosphatidylethanolamin fraskilles. Det inddampede el uat, som indeholder phosphatidylcholin, lysophosphatidylcholin, sphingomylin og neutrallipider, opløses i en opløsnings-30 middel bl ånding af hexan, isopropanol og vand og sættes til en S^-søjle og elueres med samme opløsningsmiddelblanding, hvorved der kan opnås et udbytte på 40-43%. Der opnås således et phosphatidylcholin med ringe forureninger af lysophosphatidylcholin og sphingomylin, men dette er kun muligt via en bekostelig fremgangsmåde med fire trin og dertil kun med 35 fire forskellige opløsningsmidler eller opløsningsmiddelblandinger. Desuden er phosphatidylcholinvirkningsgraden ved denne fremgangsmåde kun 44% beregnet i forhold til det anvendte æggepulver.

Den foreliggende opfindelse har som formål at udvikle en simpel

DK 166363 B

3 fremgangsmåde til isolering af lysophospholipidfrit phosphatidylcholin med høj renhed direkte fra æggepulver.

Det har nu overraskende vist sig, at man kan udvinde lysophospholipidfrit phosphatidylcholin i høj renhed ved ekstraktion af æggepulver 5 med en opløsningsmiddel bl ånding af petroleumsether, 2-propanol og vand og efterfølgende silicagelsøjlechromatografi af ekstrakten med samme op-1øsningsmiddelbl ånding.

Den foreliggende opfindelse angår i overensstemmelse hermed en særlig fremgangsmåde til isolering af lysophospholipidfrit phosphatidylcho-10 lin fra æggepulver, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man ekstraherer æggepulveret med en opløsningsmiddelblanding af en lavtkog-ende petroleumsetherfraktion (kogepunkt 40-80°), en lavmolekulær alkohol og vand, kommer ekstraktfasen på en med sil i cage! fyldt søjle ved en temperatur i området fra 20-50°C, ved denne temperatur eluerer 15 med samme opløsningsmiddelblanding og derved i hovedløbet opnår et lysophospholipidfrit phosphatidylcholin. I forløbet opfanges blandt andet triglycerider, cholesterol og phosphatidylethanolamin, i hovedløbet phosphatidylcholin og i efterløbet lysophosphatidylcholin og sphingomyelin. Fra forløbet kan phosphatidylethanolamin isoleres i ren form ved 20 hjælp af kendte fremgangsmåder.

Som sil i cage! kan anvendes sædvanlige produkter til chromatografi af forskellig kornstørrelse eller presset silicagel, som kan være aktiveret eller desaktiveret. Der anvendes fortrinsvis neutrale silicagel-produkter.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres ved en temperatur i områ det fra 20-50°C, fortrinsvis 20-25°C, og kan udføres ved normaltryk eller ved overtryk.

En ganske speciel fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at man hele tiden kan genanvende silicagelen efter udført chro-30 matografi. Samtlige forureninger opsamles enten i forløbet eller i efterløbet. Der kan endda ses bort fra efterløbet, da de i søjlen værende forureninger ved fornyet belastning af denne vil blive elueret i det næste forløb.

En yderligere fordel ligger i anvendelsen af kun én, let gendestil-35 lerbar opløsningsmiddelblanding til ekstraktionen og den søjlechromato-grafiske adskillelse.

I sammenligning med kendte fremgangsmåder udmærker den nye fremgangsmåde sig ved en væsentligt simplere fremgangsmåde. Phosphatidylcho-

DK 166363B

4 linet udvindes med en virkningsgrad på 92% i forhold til æggepulveret.

Ved en søjlechromatografisk adskillelse med 200 g silicagel adskilles 90 g æggelipid, hvorved der kun kræves et samlet·el uat på 4,2 1. Fremgangsmåden har snarere karakter af en filtrering end af en søjlechromatogra-5 fisk rensning i sædvanlig forstand.

Opfindelsen belyses nærmere i det efterfølgende eksempel nr. 1. Eksempel 2 og 3 er sammen-ligningseksempler.

Analysemetode 10 Phosphatiderne analyseredes ved hjælp af tyndtlagschromatografi.

Olieindholdet blev sat lig med den dialyserbare andel.

Søjlechromatografi, opløsningsmiddel bl ånding

Der anvendtes en chromatografisøjle med en indvendig diameter på 15 4,5 cm og en højde på 37 cm.

Søjlen fyldtes med en opslæmning af 200 g silicagel (Merck) i en opløsningsmiddelbl ånding af letbenzin (65-73°C)/2-propanol/vand i volumenforholdet 1/1/0,175. Samme opløsningsmiddel bl ånding anvendtes til ekstraktionen af æggepulveret og til elueringen. Efter udført chromato-20 grafi kan silicagelen benyttes igen.

Udgangsmateriale

Der anvendtes en sædvanlig æggepulverhandelsvare med følgende sammensætning: 25 11 % phosphatidylcholin 4 % sphingomyelin 3 % phosphatidylethanolamin 1,5 % lysophosphatidylcholin 30 0,5 % andre phospholipider 48 % neutrallipider/cholestero1 32 % proteiner

Eksempel 1 35 1. trin 150 g æggepulver røres sammen med 300 ml opløsningsmiddel bl ånding i 10 minutter ved 40°C. Proteinerne frasuges og eftervaskes med lidt op-

DK 166363 B

5 løsningsmiddel bl ånding. Der opnås 300 ml filtrat med 90 g æggelipider.

2. trin

Filtratet kommes på en med silicagel (200 g) fyldt søjle og elue-5 res med samme opløsningsmiddel bl ånding ved stuetemperatur.

Det samlede eluat (5 1) inddeles i 3 fraktioner. Fraktionerne inddampes, og remanenserne analyseres.

1. Fraktion 0-1,6 1 Remanens: 69 g 10 indeholder neutral 1ipider (inklusive cholesterol),

PE, LPE, PI, spor af PC og spor af SPH

2. Fraktion 1,6 1 - 4,2 1 Remanens: 16,1 g PC-indhold: 94 % 15 SPH-indhold: <2 % LPC-indhold: <0,3 %

Olieindhold: <0,5 %

Rest: Lipider, vand etc.

PC-virkningsgrad: 92 % af det teoretiske beregnet ud 20 fra æggepulveret 3. Fraktion 4,2-5,0 1 Remanens: 4 g

indeholder SPH, LPC og spor af PC

25 Efter udtagning af den 2. fraktion kan der på ny tilsættes æggel i - pider, hvorved produkterne i 3. fraktion elueres sammen med produkterne i 1. fraktion.

Eksempel 2 (sammen!iqningseksempel) 30 1. trin

Fremgangsmåde ifølge Japan kokai 7961200.

150 g æggepulver røres sammen med 1350 ml 95%-ig ethanol ved stuetemperatur. Efter frafiltereing af de uopløselige bestanddele og vask 35 med 95%-ig ethanol inddampes de samlede ethanol fil trater.

DK 166363 B

6 faststofudbytte: 36 g æggel ipider phosphatidylcholin-indhold: 42 % sphingomyelin-indhold: 3 % lysophosphatidylcholin-indhold: 2 % 5 phosphatidyl ethanol amin-indhold: 8 % rest: triglycerider, cholesterol etc.

2. trin ifølge DE-OS 30 47048

Der gennemføres en søjlechromatografi (100 g silicagel) ved 65°C 10 under anvendelse af ethanol som elueringsmiddel.

Søjletilsætning: 36 g æggelipider i 500 ml 95% i ethanol

Elueringsmiddel: 1) 95%-ig ethanol til 1,7 1 førsteeluat 15 2) 80%-ig ethanol til 1,2 1 andeteluat

Efter 1,7 1 førsteeluat opsamles 1,2 1 andeteluat. Det andet el uat inddampes og analyseres.

20 faststofudbytte: 10,4 g phosphatidylcholin-indhold: 85 % sphingomyelin-indhold: 6 % lysophosphatidylcholin-indhold: 5 % olieindhold: 0,5% 25 rest: vand, ethanol etc.

phosphatidylcholinvirkningsgrad: 54% af det teoretiske be regnet ud fra æggepulveret 3. trin 30 Søjlen må før genanvendelse bringes i ligevægt med 96%-ig ethanol.

Eksempel 3

Sammen!igningseksempel

Fremgangsmåde ifølge N.S. Radin, 0. Lipid Res. 19, 922-924 (1978).

35 1. trin 150 g æggepulver ekstraheres med 1,35 1 95%-ig ethanol ved stuetemperatur, og ekstrakten frafiltreres og.inddampes. Der opnås 36 g rå æg-

DK 166363 B

7 gelecithin med følgende.sammensætning: 42 % phosphatidylcholin 8 % phosphatidyl ethanolamin 5 2 % lysophosphatidylcholin 3 % sphingomyelin

Rest: triglycerider, cholesterol etc.

2. trin 10 10 g af dette æggelecithin opløses i absolut ethanol og underkastes en søjlechromatografi med 100 g A^O^. Som elueringsmiddel anvendes absolut ethanol.

Eluatet inddampes, og der opnås en phospholipidblånding (5 g) med følgende sammensætning: 15 51 % phosphatidylcholin 3 % lysophosphatidylcholin 5 % sphingomyelin rest: neutrallipider, cholesterol etc.

20 3. trin 2,5 g af den efter det 2. trin udvundne phospholipidblånding opløses i 2,5 ml af en blanding af hexan/isopropanol/vand (1/1,3/0,2 på volumenbasis) og sættes til en med 100 g sil i cage! fyldt søjle. Efter ti 1 -25 sætning af yderligere 100 ml af samme opløsningsmiddelblanding elueres der med 1,4 1 af en blanding af hexan/isopropanol/vand (1/1,3/0,25 på volumenbasis). Efter forløbet (triglycerider/cholesterol) opfanges hovedløbet og inddampes.

30 Remanens: 1,1 g Sammensætning: 91 % phosphatidylcholin 2 % sphingomyelin 1 % lysophosphatidylcholin 35 6 % vand, restopløsningsmiddel, triglycerider PC-virkningsgrad: 44 % beregnet ud fra æggepulver

DK 166363B

8 4. trin Søjlen må, før den anvendes igen, bringes i ligevægt med hexan/iso-propanol/vand (1/1,3/0,2 på volumenbasis).

5 Sammensætning:

Udgangsmateriale: æggepulver

Eksempel 1 Eksempel 2 Eksempel 3 10 Antal nødvendige trin før genanvendelse af silicagelen 234 PC-virkningsgrad beregnet i forhold til æggepulver: 92% 54% 44% 15

Antal opløsningsmidler eller opløsningsmiddel bl åndinger: 12 4 PC-indhold: 94% 85% 91% 20 _

Som sammenligningen af eksemplerne viser, kan der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved en simpel fremgangsmåde over 2 trin og med kun én opløsningsmiddelblanding udvindes phosphatidylcholin i højt ud-25 bytte og høj renhed.

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til isolering af lysophospholipidfrit phosphatidyl cholin fra æggepulver, KENDETEGNET ved, AT man ekstraherer æggepulve- 5 ret med en opløsningsmiddelblanding af en lavtkogende petroleumsether-fraktion (40-80°C), en Cj-C^ lavere alkanol og vand, kommer ekstraktfasen på en med sil i cage! fyldt søjle ved en temperatur i området fra 20-50°C, ved denne temperatur eluerer med samme opløsningsmiddelblanding og derved opnår lysophospholipidfrit phosphatidylcholin i hovedløbet. 10

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT man anvender en opløsningsmiddelblanding af letbenzin (65-73eC), propanol og vand.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT man 15 anvender en opløsningsmiddelblanding af en volumendel letbenzin (65- 73°C), en volumendel 2-propanol og 0,175 volumendele vand.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, KENDETEGNET ved, AT man gennemfører ekstraktionen i 10-20 minutter ved 20- 20 50eC.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, KENDETEGNET ved, AT man gennemfører søjlechromatografien ved 20-25°C.

25 A. Nattermann & Cie. GmbH ved TH. OSTENFELD PATENTBUREAU A/S Birgitte Bagger-Sørensen 30 København, den 16. november 1992